JP5131552B2 - 顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は、照明光を投光する投光光学系の対物レンズと、前記照明光に基づく戻り光を検出する検出光学系の対物レンズとが、それぞれの主軸が互いに平行移動した位置にあり、かつそれぞれの焦点面が一致するように配置された顕微鏡装置に関する。

顕微鏡観察において、生体の深部観察を行う際には、焦点面以外からの戻り光の影響により、画像のSNは劣化する。この現象はたとえ共焦点顕微鏡を用いたとしても充分取り除くことはできていない。

この、問題点を解消するための技術（USP5,973,828、USP5,969,854、USP6,423,956、DE4326473）が提案されている。

これらの技術では、二つの対物レンズを用いて、それぞれの焦点領域が交差するように配置することと共焦点顕微鏡技術を組み合わせるによって、それらの交差領域のみの情報が得られることにより、水平分解能は少々悪くなるが、主として深度方向の分解能を向上させるものである（USP5,973,828の図２参照）。

また、これらの構成を比較的低ＮＡのレンズで構成した場合には次の効果があることが非特許文献２に記載されている。
（１）光軸方向の分解能が向上する。
（２）ＮＡが小さいため、生体深部観察においても収差が発生しにくい。
（３）小さい径のものが製作しやすい。
（４）ＷＤを長くできて深部観察に適する。
（５）二つの光路が別々のため、深部観察を行っても観察面以外からの戻り光などのノイズ光の影響を受けにくい。

また、USP5,973,828の図７には、二つの対物レンズの位置関係を保ったまま焦点位置を走査する走査機構が開示されている。また、非特許文献１、非特許文献２には、対象物をステージ等で移動させて走査する方法が開示されている。
米国特許第5,973,828号明細書 米国特許第5,969,854号明細書 米国特許第6,423,956号明細書 独国特許第4326473号明細書 「Confocal microscope with large field and working distance」, Applied Optics, Vol.38, No.22, pp.4870 「Dual-axis confocal microscope for high-resolution in vivo imaging」,Optics Letters,Vol.28,No.6,pp414

しかしながら、角度のついた二つの対物レンズを通る光の焦点の位置関係を保ったまま焦点位置を走査する機構は複雑な上に、走査に時間がかかることが考えられる。また、ステージ等を移動させて走査する方法を適用する場合も、実際には極めて長時間の走査時間がかかると考えられる。

本発明の目的は、照明光を容易に走査でき、生体深部の観察に適した顕微鏡装置を提供することにある。

本発明の顕微鏡装置は、照明光を投光する投光光学系の対物レンズと、前記照明光に基づく戻り光を検出する検出光学系の対物レンズとが、それぞれの主軸が互いに平行移動した位置にあり、かつそれぞれの焦点面が一致するように配置された顕微鏡装置において、前記投光光学系の集光点と、前記検出光学系が検出する検出点が一致しているとともに、前記集光点と前記検出点を一致させた状態で、前記集光点と前記検出点により前記焦点面を走査することを特徴とする。
この顕微鏡装置によれば、投光光学系の集光点と、検出光学系が検出する検出点が一致しているとともに、集光点と検出点を一致させた状態で、集光点と検出点により焦点面を走査するので、照明光を容易に走査でき、生体深部の観察に適した顕微鏡装置を得ることができる。

前記投光光学系の光軸と、前記検出光学系の光軸とが、前記焦点面において９０度で交差してもよい。

前記戻り光のうち投光光学系に入る光の検出を抑制する手段を備えてもよい。

前記投光光学系と、前記検出光学系が光路を共有しなくてもよい。

前記投光光学系と、前記検出光学系がその光路の一部を共有し、前記戻り光が蛍光であり、前記蛍光のうち前記投光光学系に入る光の検出を抑制する手段として、波長特性を有するフィルタもしくはミラーを用いてもよい。

前記投光光学系と、前記検出光学系がその光路の一部を共有し、前記戻り光が反射、散乱光であり、前記の反射、散乱光のうち前記投光光学系に入る光の検出を抑制する手段として、偏光特性を有する光学部品を用いてもよい。

前記集光点と前記検出点により前記焦点面を走査する手段として、可動ミラーを用いてもよい。

前記集光点と前記検出点により前記焦点面を走査する手段として、所定のパターンが形成されたマスクパターン部材を用いてもよい。

前記マスクパターン部材にはピンホールパターンが形成され、当該マスクパターン部材を回転させることにより走査を行ってもよい。

前記投光光学系の前記集光点の集合がライン状であるとともに、前記検出光学系が検出する検出点の集合も前記集光点の集合に一致したライン状であってもよい。

前記照明光が近赤外レーザ光であってもよい。

本発明の顕微鏡装置によれば、投光光学系の集光点と、検出光学系が検出する検出点が一致しているとともに、集光点と検出点を一致させた状態で、集光点と検出点により焦点面を走査するので、照明光を容易に走査でき、生体深部の観察に適した顕微鏡装置を得ることができる。

以下、本発明による顕微鏡装置の実施形態について説明する。

以下、図１〜図３を参照して実施例１の顕微鏡装置について説明する。

図１は実施例１の顕微鏡装置の構成を示すブロック図である。

本実施例の顕微鏡装置１は、近赤外のレーザ光源２を有し、その前面には電動シャッタ３が配置されている。さらに、レーザの向きを変えるためのダイクロイックミラー４と、レーザ光を走査するための走査光学ユニット５と、を備えている。

ダイクロイックミラー４はレーザ光の波長を反射し、レーザ光により励起された蛍光を透過させる特性を有する。走査光学ユニット５は、一本の軸の周りに回転可能な可変ミラー５ａと、可変ミラー５ａの軸にほぼ直交する一本の軸の周りに回転可能な可変ミラー５ｂとを備えている。

また、図１に示すように、光を収束させる瞳投影レンズ６と、レーザビームを偏向するミラー７と、結像レンズ８と、レーザ光を反射して蛍光を透過するダイクロイックミラー９と、３枚のミラー１０，１１，１５とが配置されている。

さらに２つの対物レンズ１２、１３は、それぞれの主軸が互いに平行で、かつ焦点面が一致するように配置されている。ここでダイクロイックミラー９からミラー１０で反射して対物レンズ１２に到達する光路の長さと、ダイクロイックミラー９からミラー１５、ミラー１１で反射して、対物レンズ１３に到達する光路の長さは概ね等しくなっている。

また、ダイクロイックミラー４の近傍には、試料１２から発生した蛍光を選択的に透過する蛍光フィルタ１６と、蛍光ビームを収束させるレンズ１７と、ピンホール１８と、ピンホール１８を通過した光を検出する検出器１９とが設けられる。

さらに顕微鏡装置１はコントローラ２０と表示モニタ２１とを有し、コントローラ２０は、電動シャッタ３の開閉の制御、光学走査ユニット５の走査の制御を実行するとともに、光検出器１９からの信号を取得する。また、コントローラ２０は表示モニタ２１に情報を出力する。

次に、本実施例の顕微鏡装置の動作について説明する。

図示しない試料は、レーザ光源２からの光によって励起される蛍光指示薬が導入された状態で、顕微鏡装置の焦点位置１４に配置されている。

レーザ光は電動シャッタ３が開いている時には、電動シャッタ３を通過し、ダイクロイックミラー４によって光走査ユニット５へと導かれ、光走査ユニット５によって任意の方向に走査される。

レーザ光はさらに瞳投影レンズ６、反射ミラー７、結像レンズ８を通過する。投光の光学系では、レーザ光はダイクロイックミラー９で反射した後、ミラー１０で反射して、対物レンズ１２に平行光として斜めに入射する。このレーザ光は対物レンズ１２によって収束されるとともに、光走査ユニット５によってこの収束点は焦点面２２上を走査される。このレーザ光によって試料の蛍光指示薬が励起され、蛍光を発する。

励起された蛍光は対物レンズ１３によって捕らえられて平行光に変換され、ミラー１１、ミラー１５で反射した後にダイクロイックミラー９を透過して、その光路は再びレーザ光の光路と重なる。また、対物レンズ１２で捕らえられた蛍光は、レーザ光と同じ光路を戻るが、ダイクロイックミラー９を通過してしまうので、結像レンズ８の方向には行かない。

このように投光光学系と検出光学系は分離されている。

図２は、光走査ユニット５で走査を行った場合の光線の様子を示す図である。

図２において実線および点線によりレーザ光の光束の変化を示している。図２に示すように、可変ミラー５ａ，５ｂによってレーザ光の向きが変わることにより、対物レンズ１２の瞳位置への入射光の角度が変化し、焦点位置１４が変化する。焦点位置１４の集合が焦点面２２を形成する。上記のように、焦点面２２は対物レンズ１３の焦点面でもある。

焦点位置１４からの蛍光は、図２に示すように対物レンズ１３によって平行光に変換される。図１に示すように、この蛍光はミラー１１、１５で反射した後にダイクロイックミラー９を通過する。この際、この蛍光は走査されたレーザ光と同じ方向を戻るように構成されている。

この蛍光は走査によるレーザ光の向きにかかわりなく、レーザ光と同じ光路を戻り、光走査ユニット５を介してダイクロイックミラー４へ導かれる。蛍光はダイクロイックミラー４を透過して、蛍光フィルタ１６によって特定の波長成分が選択的に透過されて、レンズ１７と、ピンホール１８とによって焦点面２２からの光のみが選択されて検出器１９へ入る。

光検出器１９からの出力信号は、コントロールユニット２０へ導かれ、走査制御に同期してデジタル信号に変換され、走査位置と対応させて画像データを作成して表示モニタ２１上に表示し、あるいは画像データを内部のメモリに記憶する。

また、図示しないＺステージによって試料を垂直方向（図１において上下方向）に移動することによって、所望の深さの観察が可能である。

図３は、対物レンズ１２および対物レンズ１３の収束点近傍を示す図である。

図３に示すように、左側からのレーザ光により蛍光物質を励起して、励起された蛍光を右側から検出しており、二つの光路の重なったハッチング領域の蛍光が検出されるために、深さ方向分解能が優れている。このとき、レーザ光の光軸と検出蛍光の光軸が概ね９０度となるように構成するときに、図３に示すハッチング領域が小さくなるので分解能が良好になる。分解能は、投光系の光軸と検出系の光軸が９０度を成すときに最も良くなる。なお、ハッチング領域のみの蛍光が戻ってくるので、ピンホール１８を用いなくても共焦点効果は得られるが、ピンホールを挿入することで一層ＳＮが良くなる。

また、２つの対物レンズを用いることにより、レーザ光の光路と蛍光の光路とを分離したので、レーザ光により励起された図３に示すハッチング領域以外の蛍光が、容易には検出されなくなっており、深部観察時に良好なＳＮ比で画像が撮影できる。

このように、本実施例の顕微鏡装置では、２つの対物レンズを用いることで、レーザ光を投光する光学系と、蛍光を検出する光学系とを分離したので、光軸方向の分解能を高めることができる。また、投光系の光学系と検出系の光学系が別々に構成されているので、投光系の光学系の通る様々な場所からのノイズとなる蛍光が、検出系の光路に入り難い構成となっており、極めてＳＮ比が良く、組織の深部観察に適している。さらに、光源に近赤外レーザを用いたので、照明光の生体透過に優れ深部観察に適している。

以下、図４を参照して実施例２の顕微鏡装置について説明する。本実施例の顕微鏡装置１Ａは、投光光学系と検出光学系を完全に分離した構成をとる。

図４は実施例２の顕微鏡装置の構成を示すブロック図である。実施例１と同一要素には同一符合を付し、その説明は省略する。

図４に示すように、顕微鏡装置１Ａにおける投光系の光学系は、その光路中に実施例１で使用したダイクロイックミラー４、ミラー７を用いていない。また、結像レンズ８の光は、図４に示すように対物レンズ１２に入射するよう構成されている。また対物レンズ１３で回収される光は、投光系と対照となり、結像レンズ２４、瞳投影レンズ２５、および、回転軸が互いに直交する２枚の可変ミラー２６ａ、２６ｂを有する光走査ユニット２６を備える。実施例１と同様、２つの対物レンズ１２、１３は、それぞれの主軸が互いに平行で、かつ焦点面が一致するように配置されている。また、蛍光フィルタ１６よりも後の光路は、実施例１と同様に構成される。

以下、本実施例の顕微鏡装置の動作について説明する。

レーザ光源２の光は、図４に示す光路を通り対物レンズ１２によって焦点位置１４に焦点を結ぶ。焦点からの蛍光は対物レンズ１３で回収される。このとき実施例１と同様の効果で図３に示すハッチング領域のみがから蛍光が回収される。この蛍光は対物レンズ１３で平行光に変えられて結像レンズ２４と瞳投影レンズ２５とによって、再び平行光に変換される。この平行光は光走査ユニット２６を通り、蛍光フィルタ１６で波長成分を選択され、レンズ１７の作用でピンホール１８に集光されてレンズ１７と、ピンホール１８とによって焦点面１４からの光のみが選択されて検出器１９へ入る。

また、コントロールユニット２０は光走査ユニット５で焦点面１４上を走査させる時には、同期して光走査ユニット２６を制御して、光走査ユニット２６に入る平行光の向きが変化しても、ピンホール１８に向かう光の向きが変化しないように制御を行う。

検出器１９からの出力信号は、コントロールユニット２０へ導かれ、走査制御に同期してデジタル信号に変換され、走査位置と対応させて画像データを作成し、表示モニタ２１上に表示し、あるいは画像データを内部のメモリに記憶する。

本実施例の顕微鏡装置では、光路を完全に分離したので、実施例１の効果に加えて、投光系の戻り光などの迷光を確実に除くことができ、一層画像のＳＮ比が良くなるという利点がある。

以下、図５を参照して実施例３の顕微鏡装置について説明する。本実施例の顕微鏡装置１Ｂは、実施例２と同様、投光光学系と検出光学系を完全に分離した構成をとる。

図５は実施例３の顕微鏡装置の構成を示すブロック図である。実施例１および実施例２と同一要素には同一符合を付し、その説明は省略する。

図５に示すように、顕微鏡装置１Ｂにおける投光系の光学系は、図示しないレーザ光源からのレーザ光を照射するファイバ２９を有する。ファイバ２９の先には、コリメートレンズ３０と、シリンドリカルレンズ３１と、図５において紙面に垂直方向に開口のあるスリット３２と、結像レンズ３３とが配置される。光走査ユニット５Ａは紙面に垂直な回転軸で回転する可変ミラー５aを有する。また、実施例１にける可変ミラー５ｂの代わりに、固定ミラー３４が配置されている。同様に、光走査ユニット２６Ａは図５において紙面に垂直な回転軸で回転する可変ミラー２６aを有する。実施例２における可変ミラー２６ｂの代わりに、固定ミラー３４が配置されている。

また、実施例２におけるピンホール１８に代えて、図５において紙面に垂直方向に延びる開口のあるスリット３６が配置され、検出器３７として、紙面に垂直方向について光の強度分布を検出するラインＣＣＤが用いられている。

次に、本実施例の顕微鏡装置１Ｂの動作について説明する。

図５に示すように、レーザ光源からの光は、光ファイバ２９によって点光源として伝えられ、コリメートレンズ３０で平行光に変換され、シリンドリカルレンズ３１によってライン状に集光される。この集光点に配置されたスリット３２を通過した光は、結像レンズ３３を通過する。

レーザ光は電動シャッタ３が開いている時には、電動シャッタ３を通過し、光走査ユニット５Ａによって走査される。レーザ光はさらに瞳投影レンズ６、結像レンズ８を通過し、対物レンズ１２によって焦点面３８に結像され、紙面に垂直なライン状となる。このラインからの蛍光は対物レンズ１３で回収されるが、ライン上の個々の点は、実施例１と同様の効果で図３に示すハッチング領域のみの蛍光が回収される。この蛍光はレンズ系によってスリット３６に再び結像され、スリット３６を通過した焦点面３８からの光のみがラインＣＣＤ３７で検出される。

さらに、可変ミラー５ａ、２６ａを同期して制御することにより、ラインは焦点面３８上を走査して、この情報はラインＣＣＤ（検出器３７）で検出されて、コントローラ２０で画像化される。

本実施例の顕微鏡装置１Ｂでは、ラインを１方向に走査する構成にしたので、実施例２の効果に加えて、走査時間をより短縮できるという利点がある。

以下、図６〜図７を参照して実施例４の顕微鏡装置について説明する。本実施例の顕微鏡装置１Ｃは、走査手段としてピンホールディスクを用いる構成を採用したものである。

図６は実施例４の顕微鏡装置の構成を示すブロック図である。実施例１と同一要素には同一符合を付し、その説明は省略する。

図６に示すように、本実施例の顕微鏡装置１Ｃは、図示しないレーザ光源に接続された光ファイバ端面４１と、その前方に配置されたコリメータレンズ４２と、を備える。レーザ光源は近赤外レーザが望ましい。また、上記の光ファイバは点光源とみなせるシングルモードファイバなどが好適である。

さらにコリメートレンズ４２の先には、アレイ状にマイクロレンズが配置されたマイクロレンズディスク４３と、マイクロレンズの配置パターンと同じパターンでピンホールが配置されたピンホールディスク４５とが設けられる。マイクロレンズディスク４３およびピンホールディスク４５は連結ドラム４６で互いに連結されるとともに、モータ４７で連結ドラム４６の軸周り方向に一体的に回転可能とされている。ピンホールディスク４５はマスクパターン部材を構成する。

図７はマイクロレンズディスク４３およびピンホールディスク４５の構造を示す斜視図である。

図７に示すように、マイクロレンズディスク４３に設けられたマイクロレンズ４３ａおよびピンホールディスク４５に形成されたピンホール４５ａは、ともに４条の螺旋状パターンに配置されている。

図６に示すように、これらのディスクの先には、結像レンズ８が配置され、その先にはレーザ光を反射して蛍光を透過するダイクロイックミラー９、および３枚のミラー１０，１１，１５が配置されている。さらに２つの対物レンズ１２，１３が、それぞれの主軸が平行で、かつ焦点面が一致するように配置されている。ここでダイクロイックミラー９からミラー１０で反射して対物レンズ１２に到達する光路の長さと、ダイクロイックミラー９からミラー１５、ミラー１１で反射して、対物レンズ１３に到達する光路の長さは概ね等しくなっている。

また、マイクロレンズディスク４３およびピンホールディスク４５の間にはダイクロイックミラー４４が配置されている。ダイクロイックミラー４４の先には蛍光フィルタ４９、カメラレンズ５０が配置されており、その先には高感度カメラ５１が配置されている。

また、モータ４７、高感度カメラ５１は破線で示す信号線によってコントローラ５２に接続され、さらに、コントローラ５２にはモニタ５３が接続されている。

次に、本実施例の顕微鏡装置の動作について説明する。

光源からの光は光ファイバ端面４１から出射され、コリメートレンズ４２によって平行光へと変換される。この光はマイクロレンズディスク４３に照射され、個々のマイクロレンズ４３ａの作用によって、各マイクロレンズ４３ａに対応するピンホールディスク４５上の各ピンホール４５ａで焦点を結ぶように構成されている（図７）。

ピンホールディスク４５を通過した光は、結像レンズ８において、通過したピンホール４５ａの位置に対応した傾きを有する平行光に変換される。

投光の光学系では、レーザ光はダイクロイックミラー９で反射した後、ミラー１０で反射して、対物レンズ１２に平行光として斜めに入射する。このレーザ光は対物レンズ１２によって収束される。このレーザ光によって試料の蛍光指示薬が励起されて蛍光が発する。この蛍光は対物レンズ１３によって捕らえられて平行光に変換され、ミラー１１、ミラー１５で反射した後にダイクロイックミラー９を透過して、再びレーザ光の光路と重なる。

また、対物レンズ１２で捕らえられた蛍光は、レーザ光と同じ光路を戻るが、ダイクロイックミラー９を通過してしまうので、結像レンズ８の方向には行かない。

このように投光光学系と検出光学系は分離されている。また、実施例１と同様の効果で図３に示すハッチング領域のみから蛍光が回収される。また、ここでモータ４７により、マイクロレンズディスク４３とピンホールディスク４４をＰ方向に回転させることによって、光が走査される。

走査された光線の例を図６における点線で示す。ピンホールの違う場所からの光は結像レンズ８で向きの異なる平行光となり、対物レンズ１２の瞳位置に入射して、先ほど（実線で示す光）とは異なる点に集光する。この点からの蛍光は図のように対物レンズ１３によって平行光に変換される。この蛍光はミラー１１、１５で反射した後にダイクロイックミラー９を通過する。この際、この蛍光は走査されたレーザ光と同じ方向を戻るように構成されている。

この蛍光は結像レンズ８によって、再び同じピンホール４５ａを通過して、ダイクロイックミラー４４で反射した後（図７）、蛍光フィルタ４９によって、その波長成分が選択され、カメラレンズ５０よって、高感度カメラ５１に結像される。ここでコントローラ５２によって、マイクロレンズディスク４３とピンホールディスク４５を一体的に回転させると、ピンホール４５ａを通過する光が焦点面上で走査されるとともに、焦点面からの蛍光が高感度カメラ５１の撮像素子上で走査される。この動作によって焦点面の情報が高感度カメラ５１に投光されて焦点面観察が可能となる。また、この際に焦点面以外の光は、ピンホール４５ａをほとんど通過できないために高感度カメラ５１に到達することができない。これによって、高感度カメラ５１は焦点面の光のみの共焦点画像を撮影することになる。撮影された画像はコントローラ５２に保存され、あるいはモニタ５３に表示される。

また、図示しないＺ方向駆動ステージを駆動することによって、観察する面の深さを変更することが可能とされている。

また、深さ方向の分解能は投光系の光軸と検出系の光軸が９０度を成すときに分解能が最も良くなり、そのように構成することが好ましい。さらに、投光系の光学系と検出系の光学系が分離されているので、投光系の光学系の通る様々場所からのノイズとなる蛍光が検出系の光路に入り難い構成となっており、極めてＳＮ比が良くなる。

また、本実施例ではマイクロレンズディスクを用いる例を示したが、必ずしも用いる必要は無い。また、ピンホールディスクではなく、スリットを設けたディスクを用いても良い。この場合スリットに集光するようにマイクロレンズディスクにはスリットに対応する位置にシリンドリカルレンズを用いると好適である。また、他のマスクパターンを用いても構わない。

本実施例の顕微鏡装置では、光の走査方法としてピンホールディスクを回転させて走査させる構成としたので、実施例１の効果に加えて、走査速度が極めて速いという利点がある。

以下、図８〜図１０を参照して実施例５の顕微鏡装置について説明する。本実施例の顕微鏡装置１Ｄは、照明光と戻り光とで、ピンホールディスク４５上の別のピンホールを通過させる構成例を示す。

図８は実施例５の顕微鏡装置の構成を示すブロック図である。実施例４と同一要素には同一符合を付し、その説明は省略する。

図８に示すように、本実施例の顕微鏡装置１Ｄでは、実施例４に示したダイクロイックミラー４４は用いない。また、結像レンズ５５として径の大きいレンズを用いるとともに、結像レンズ５５の中心軸とピンホールディスク４５の回転軸とがほぼ等しくされている。

結像レンズ５５の先には実施例２と同様、２つの対物レンズ５６ａ、５６ｂが配置されている。また、対物レンズ５６ｂ近傍には、像を回転させる像回転プリズム５９が挿入されている。図９は像回転プリズム５９の構造を示す図である。

戻り光の光路には、ピンホールディスク４５とマイクロレンズディスク４３との中間にダイクロイックミラー６０が配置されており、蛍光の光路を高感度カメラ５１側へと曲げるように構成されている。

次に、本実施例の顕微鏡装置１Ｄの動作について説明する。

光源からの光は光ファイバ端面４１から出射され、コリメートレンズ４２によって平行光へと変換される。この光はマイクロレンズディスク４３に照射され、個々のマイクロレンズ４３ａの作用によって、各マイクロレンズ４３ａに対応するピンホールディスク４５上の各ピンホール４５ａで焦点を結ぶ。

ピンホールディスク４５を通過した光は、結像レンズ８で角度を持った平行光に変換され、さらに対物レンズ５６ａの作用で焦点５７を結ぶ。焦点５７からの蛍光は対物レンズ５６ｂによって角度を持った平行光に変換され、像回転プリズム５９によってその向きが１８０度回転される。図１０は、像を回転させるプリズムの原理を示す模式図である。

像回転プリズム５９で回転された光は、結像レンズ５５によってピンホールディスク４５上の投光側光学系で通過した位置と対向する位置（通過した位置から１８０度回転した位置）に結像される。図７に示すように、ピンホールディスク４５は９０度ごとの回転対照のパターンとなっているので、ピンホールディスク４５上の投光光学系の位置のパターンと、検出光学系の位置のパターンは１８０度ずれた関係にある。また、像回転プリズム５９の作用で像が１８０度回転されているので、光学系を調整することによって、蛍光の焦点をピンホールディスク４５上のパターンに一致させて、戻り光を通過させることができる。

ここでピンホールディスク４５を通過した戻り光は、ダイクロイックミラー６０によって向きを変えられ、蛍光フィルタ４９で波長成分を選択された後、カメラレンズ５０に向けられ高感度カメラ５１で撮影される。

なお、像回転プリズムは投光光学系に挿入しても良い。他の動作は実施例４と同様である。

本実施例の顕微鏡装置では、投光系と検出系の光路を完全に分けたので、実施例４の効果に加え、よりＳＮ比が向上するという利点がある。

以下、図１１〜図１２を参照して実施例６の顕微鏡装置について説明する。本実施例の顕微鏡装置１Ｅは、実施例５と走査手段が異なる構成例を示す。

図１１は実施例６の顕微鏡装置の構成を示すブロック図、図１２はマイクロレンズディスクおよびピンホールディスクの構造を示す斜視図である。実施例５と同一要素には同一符合を付し、その説明は省略する。

図１１に示すように、マイクロレンズディスク６４およびピンホールディスク６５は、連結部材６７で互いに結合されるとともに、１軸ステージ６８によって矢印Ｑ方向に往復移動可能とされている。

図１２に示すように、マイクロレンズディスク６４には、所定の配置パターンをとるマイクロレンズ群６４ａが設けられ、ピンホールディスク６５には、マイクロレンズ群６４ａとそれぞれ同一の配置パターンとされたピンホール群６５ａおよびピンホール群６５ｂが形成されている。マイクロレンズ群６４ａによる焦点は、ピンホール群６５ａに結ばれる。また、試料からの戻り光は、ピンホール群６５ｂを通過する。

本実施例の顕微鏡装置１Ｅでは、マイクロレンズディスク６４とピンホールディスク６５を１軸ステージ６８によってＱ方向に走査することによって、対応する焦点５７が焦点面上で走査される。それぞれの戻り光は再びピンホールディスク６５のピンホール群６５ａを通過し、蛍光フィルタ４９を介して、カメラレンズ５０によって高感度カメラ５１上に結像され、適当な露光時間を取ることにより、焦点面の画像が撮影される。

なお、本実施例ではマイクロレンズディスク６４とピンホールディスク６５により照明光を走査する例を示しているが、本発明はこのような構成に限られない。

例えば、投光光路においてピンホールディスクを通った光を第１のガルバノミラーで微小の角度走査を行うと共に、戻り光にも第２のガルバノミラーなどで同等の微小角度走査を与えて対応するピンホールを通過する構成とし、さらに戻り光のピンホールを通過した光も、第３のガルバノミラーなどで焦点が対象物上と対応しながら高感度カメラ上を走査するように構成しても良い。

また、ピンホールディスクを移動させるのではなく、観察対象物を移動させても良い。この場合戻り光のピンホールを通過した光を、ガルバノミラーなどで焦点が対象物上と対応しながら高感度カメラ上を走査するように構成しても良いし、もしくは高感度カメラを移動走査させても良い。
本実施例の顕微鏡装置は、実施例５と同様の効果を有する。

以下、図１３を参照して実施例７の顕微鏡装置について説明する。本実施例の顕微鏡装置１Ｅは、蛍光の検出ではなく反射、散乱光を検出する構成例を示すものである。

図１３は実施例７の顕微鏡装置の構成を示すブロック図である。実施例１と同一要素には同一符合を付し、その説明は省略する。

図１に示すように、本実施例の顕微鏡装置１Ｆでは、実施例１におけるダイクロイックミラー４（図１）に代えて偏光ビームスプリッタ７１が用いられるとともに、蛍光フィルタ１６（図１）に代えて偏光フィルタ７２が用いられる。また、ダイクロイックミラー９（図１）に代えて、偏光ビームスプリッタ７３が用いられ、ミラー１０と対物レンズ１２の間には、１/４波長板７４が、ミラー１１と対物レンズ１３の間には、１/４波長板７５が、それぞれ挿入されている。

次に、本実施例の顕微鏡装置１Ｆの動作について説明する。

光源２から射出されるレーザ光は直線偏光を有し、偏光ビームスプリッタ７１で反射された後、実施例１と同様の光路を通り、偏光ビームスプリッタ７３で反射される。この光はミラー１０で反射された後に１/４波長板７４で円偏光へと変換され、対物レンズ１２によって焦点１４を結ぶ。

焦点１４からの反射、散乱光は対物レンズ１３で集められて、もう一度１/４波長板７５を通過することにより、入射レーザとは９０度偏光方向の異なる偏光となり、ミラー１１、１５で反射した後に、今度は偏光ビームスプリッタ７３を透過する。

対物レンズ１２で回収された光は、同様に偏光面が変わることによって偏光ビームスプリッタ７３を透過するので、結像レンズ８の方向へ向かわないため回収されない。従って本実施例でも図３に示すハッチング領域の光のみが回収される。

対物レンズ１３側からの光は、レーザ光の光路を逆方向に戻り、今度は偏光ビームスプリッタ７１を透過した後に、偏光フィルタ７２でその偏光成分を選択され、ピンホール１８を介して検出器１９で検出される。

以上のように、本実施例の顕微鏡装置１Ｆでは、２つの対物レンズ１２，１３を用いることで、レーザ光を投光する光学系と、反射、散乱光を検出する光学系とを分離したので、光軸方向の分解能を高めることができる。また、投光系の光学系と検出系の光学系が別々に構成されているので、投光系の光学系の通る様々な場所からのノイズとなる光が、検出系の光路に入り難い構成となっており、極めてＳＮ比が良く、組織の深部観察に適している。さらに、光源に近赤外レーザを用いたので、照明光の生体透過に優れ、生体深部の反射、散乱光をＳＮ比良く検出できる。

本発明の適用範囲は上記実施形態に限定されることはない。本発明は、照明光を投光する投光光学系の対物レンズと、前記照明光に基づく戻り光を検出する検出光学系の対物レンズとが、それぞれの主軸が互いに平行移動した位置にあり、かつそれぞれの焦点面が一致するように配置された顕微鏡装置に対し、広く適用することができる。

実施例１の顕微鏡装置の構成を示すブロック図。 光走査ユニットで走査を行った場合の光線の様子を示す図。 対物レンズの収束点近傍を示す図。 実施例２の顕微鏡装置の構成を示すブロック図。 実施例３の顕微鏡装置の構成を示すブロック図。 実施例４の顕微鏡装置の構成を示すブロック図。 マイクロレンズディスクおよびピンホールディスクの構造を示す斜視図。 実施例５の顕微鏡装置の構成を示すブロック図。 像回転プリズムの構造を示す図。 像を回転させるプリズムの原理を示す模式図。 実施例６の顕微鏡装置の構成を示すブロック図。 マイクロレンズディスクおよびピンホールディスクの構造を示す斜視図。 実施例７の顕微鏡装置の構成を示すブロック図。

符号の説明

４ ダイクロイックミラー
５ａ 可変ミラー
５ｂ 可変ミラー
９ ダイクロイックミラー
１２ 対物レンズ
１３ 対物レンズ
１４ 焦点（集光点、検出点）
１６ 蛍光フィルタ
２２ 焦点面
２６ａ 可変ミラー
２６ｂ 可変ミラー
４４ ダイクロイックミラー
４５ ピンホールディスク（マスクパターン部材）
４９ 蛍光フィルタ
５６ａ 対物レンズ
５６ｂ 対物レンズ
５７ 焦点（集光点、検出点）
５８ 焦点面
６５ ピンホールディスク（マスクパターン部材）
７１ 偏光ビームスプリッタ
７２ 偏光フィルタ
７３ 偏光ビームスプリッタ
７４ １／４波長板
７５ １／４波長板

Claims (11)

1. 照明光を投光する投光光学系の対物レンズと、前記照明光に基づく戻り光を検出する検出光学系の対物レンズとが、それぞれの主軸が互いに平行移動した位置にあり、かつそれぞれの焦点面が一致するように配置された顕微鏡装置において、
   前記投光光学系の集光点と、前記検出光学系が検出する検出点が一致しているとともに、前記集光点と前記検出点を一致させた状態で、前記集光点と前記検出点により前記焦点面を走査することを特徴とする顕微鏡装置。
2. 前記投光光学系の光軸と、前記検出光学系の光軸とが、前記焦点面において９０度で交差することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
3. 前記戻り光のうち投光光学系に入る光の検出を抑制する手段を備えることを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡装置。
4. 前記投光光学系と、前記検出光学系が光路を共有しないことを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡装置。
5. 前記投光光学系と、前記検出光学系がその光路の一部を共有し、
   前記戻り光が蛍光であり、前記蛍光のうち前記投光光学系に入る光の検出を抑制する手段として、波長特性を有するフィルタもしくはミラーを用いることを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡装置。
6. 前記投光光学系と、前記検出光学系がその光路の一部を共有し、
   前記戻り光が反射、散乱光であり、前記の反射、散乱光のうち前記投光光学系に入る光の検出を抑制する手段として、偏光特性を有する光学部品を用いることを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡装置。
7. 前記集光点と前記検出点により前記焦点面を走査する手段として、可動ミラーを用いることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
8. 前記集光点と前記検出点により前記焦点面を走査する手段として、所定のパターンが形成されたマスクパターン部材を用いることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
9. 前記マスクパターン部材にはピンホールパターンが形成され、当該マスクパターン部材を回転させることにより走査を行うことを特徴とする請求項８に記載の顕微鏡装置。
10. 前記投光光学系の前記集光点の集合がライン状であるとともに、前記検出光学系が検出する検出点の集合も前記集光点の集合に一致したライン状であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
11. 前記照明光が近赤外レーザ光であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。

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