JP5699421B2

JP5699421B2 - 顕微鏡装置

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Publication number: JP5699421B2
Application number: JP2009147313A
Authority: JP
Inventors: 山宮　広之; 広之山宮
Original assignee: Yokogawa Electric Corp
Current assignee: Yokogawa Electric Corp
Priority date: 2008-09-16
Filing date: 2009-06-22
Publication date: 2015-04-08
Anticipated expiration: 2029-06-22
Also published as: JP2010197986A

Description

本発明は、試料に照明光を照射し、照明光に基づく試料からの戻り光を検出する顕微鏡装置に関する。

顕微鏡観察において、生体の深部観察を行う際には、焦点面以外からの戻り光の影響により、画像のＳＮ比は劣化する。この現象はたとえ共焦点顕微鏡を用いたとしても充分取り除くことはできていない。

この、問題点を解消するための技術（USP5,973,828、USP5,969,854、USP6,423,956、DE4326473）が提案されている。

これらの技術では、二つの対物レンズを用いて、それぞれの焦点領域が交差するように配置することと共焦点顕微鏡技術を組み合わせるによって、それらの交差領域のみの情報が得られることにより、水平分解能は少々悪くなるが、主として深度方向の分解能を向上させるものである（USP5,973,828の図２参照）。

また、これらの構成を比較的低ＮＡのレンズで構成した場合には次の効果があることが非特許文献２に記載されている。
（１）光軸方向の分解能が向上する。
（２）ＮＡが小さいため、生体深部観察においても収差が発生しにくい。
（３）小さい径のものが製作しやすい。
（４）ＷＤを長くできて深部観察に適する。
（５）二つの光路が別々のため、深部観察を行っても観察面以外からの戻り光などのノイズ光の影響を受けにくい。

また、USP5,973,828の図７には、二つの対物レンズの位置関係を保ったまま焦点位置を走査する走査機構が開示されている。また、非特許文献１、非特許文献２には、対象物をステージ等で移動させて走査する方法が開示されている。

米国特許第5,973,828号明細書米国特許第5,969,854号明細書米国特許第6,423,956号明細書独国特許第4326473号明細書

「Confocal microscope with large field and working distance」, Applied Optics, Vol.38, No.22, pp.4870 「Dual-axis confocal microscope for high-resolution in vivo imaging」,Optics Letters,Vol.28,No.6,pp414

このように、角度を付けて配置した２つの対物レンズを用いて、一方から光を投光して他方から光を検出することにより、信号のＳＮ比が向上し、深部観察が可能となっている。しかしながら、より深部からの情報を得たいという要望には対応できない。

本発明の目的は、従来の装置よりもさらに深部からの情報を得ることができ、生体深部の観察に適した顕微鏡装置を提供することにある。

本発明の顕微鏡装置は、試料に照明光を照射し、前記照明光に基づく前記試料からの戻り光を検出する顕微鏡において、可干渉性を有する照明光を少なくとも２つに分離する分離手段と、前記分離手段により分離された前記照明光の少なくとも一方に一定周波数での変調を加える変調手段と、前記分離された照明光を前記試料において光路が重なるように導く対物レンズと、前記光路が重なった部分で起こる干渉光によって生じる光を、戻り光として検出する検出手段と、を備え、分離されたそれぞれの照明光の前記試料への入射角度が互いに異なり、前記照明光の少なくとも２つに互いに異なる一定周波数の変調を加えると共に、前記試料の焦点において起こる干渉光に前記少なくとも２つの変調周波数の和もしくは差の周波数で変化する強度変調を起こさせ、この強調変調の周波数成分を抽出することを特徴とする。
この顕微鏡装置によれば、分離された照明光の少なくとも一方に変調を加え、分離されたそれぞれの照明光について試料において光路が重なるように導くとともに、この光路が重なった部分で起こる干渉光を、戻り光として検出するので、従来の装置よりもさらに深部からの情報を得ることができ、生体深部の観察に適している。

前記対物レンズは、前記分離された照明光を前記試料において同一の焦点を結ばせるとともに、前記検出手段は、前記焦点で起こる干渉光によって生じる光を、戻り光として前記対物レンズを介して取得し、検出してもよい。

前記分離された照明光は、前記対物レンズを出てから焦点を結ぶまでの光路が互いに分離され、重ならなくてもよい。

前記変調が位相変調、強度変調、周波数変調のいずれかであると共に、前記干渉光によって発生する光の信号を取得し、前記少なくとも２つの変調周波数の和もしくは差の周波数成分を抽出してもよい。

前記戻り光が蛍光であり、前記検出手段は前記干渉光によって生じる蛍光を検出してもよい。

前記少なくとも２つの照明光は前記対物レンズの瞳位置において、前記対物レンズの瞳径よりも小さい光で互いに重ならない位置に平行光として入射させてもよい。

前記照明光の焦点を前記対物レンズの焦点面で走査するとともに、前記検出手段は走査された各々の焦点からの戻り光を検出してもよい。

本発明の顕微鏡装置によれば、分離された照明光の少なくとも一方に変調を加え、分離されたそれぞれの照明光について試料において同一焦点を結ばせるとともに、焦点で起こる干渉光を、戻り光として検出するので、従来の装置よりもさらに深部からの情報を得ることができ、生体深部の観察に適している。

実施例１の顕微鏡装置の構成を示すブロック図。変調装置の構成を示す図。収束点が走査される様子を示す図。異なる周波数での変調を受けた光が重なる領域を示す図。実施例２の顕微鏡装置の構成を示すブロック図。変調装置の構成を示す図であり、（ａ）および（ｂ）は、それぞれ別の変調装置の構成を示す図。変調装置の構成等を示す図であり、（ａ）は別の変調装置を光源の方向からみた図、（ｂ）は光の交差領域を示す図。対物レンズ周辺の変形例を示す図。実施例３の顕微鏡装置の構成を示すブロック図。

以下、本発明による顕微鏡装置の実施形態について説明する。

以下、図１〜図４を参照して、実施例１の顕微鏡装置について説明する。

図１は、実施例１の顕微鏡装置の構成を示すブロック図である。図１に示すように、本実施例の顕微鏡装置１は、近赤外の波長を有するコリメート光を発するレーザ光源２を有し、その前面には変調装置３が配置されている。

図２は、変調装置３の構成を示す図である。図２に示すように、変調装置３は図２においてレーザ光の右側一部を周波数ｆ１＝１０．１ＭＨｚで変調する第１のＡＯＭ（音響光学素子）３ａと、図２においてレーザ光の左側一部を周波数ｆ２＝１０ＭＨｚで変調する第２のＡＯＭ３ｂと、を有する。変調は、強度変調でも位相変調でも周波数変調でもよく、同様の効果が得られる。

図１に示すように、変調装置３の先には、レーザ光の向きを変えるためのダイクロイックミラー４と、レーザ光を走査するための走査光学ユニット５とが配置されている。

ダイクロイックミラー４は、波長により異なる反射性・透過性を示し、レーザ光を反射し、レーザ光により励起された蛍光を透過させる特性を有する。

走査光学ユニット５は、一本の軸の周りに回転可能な可変ミラー５ａと、可変ミラー５ａの軸にほぼ直交する一本の軸の周りに回転可能な可変ミラー５ｂとを備えている。

さらに、顕微鏡装置１は、光を収束させる瞳投影レンズ６と、レーザ光を偏向するミラー７と、結像レンズ８と、対物レンズ９とを備えている。また、対物レンズ９の先には、試料１２を載せるステージ１１が設けられている。

また、ダイクロイックミラー４の近傍には試料１２から発生した蛍光を選択的に透過する蛍光フィルタ１３が設けられるとともに、蛍光フィルタ１３の先には、蛍光ビームを収束させるレンズ１４と、ピンホールが形成されたピンホール部材１５と、ピンホール部材１５のピンホールを通過した光を検出する検出器１６と、が順次、設けられる。検出器１６からの信号はバンドパスフィルタ１９を介してコントローラ１７に与えられる。

コントローラ１７は、光学走査ユニット４の走査制御、光検出器１６からの信号の取得、変調装置３の制御等を実行する。また、表示モニタ１８に情報を出力する。

以下、本実施例の顕微鏡装置１の動作について説明する。

レーザ光源２からの光によって励起される蛍光指示薬が導入された試料１２は、ステージ１１上に配置される。

レーザ光源２からのレーザ光は、変調装置３に入射し、レーザ光の右側の一部はＡＯＭ３ａによって周波数ｆ１＝１０．１ＭＨｚで変調され、レーザ光の左側の一部はＡＯＭ３ｂによって周波数ｆ２＝１０ＭＨｚで変調される。これらの光はダイクロイックミラー４によって光走査ユニット５へと導かれ、光走査ユニット５によって任意の方向に走査される。

レーザ光はさらに瞳投影レンズ６、反射ミラー７、結像レンズ８を通過し、対物レンズ９に入射される。対物レンズ９によってこのレーザ光は収束されるとともに、光走査ユニット５によってこの収束点は焦点面上を走査される。

図３は収束点が走査される様子を示す図である。図３において、実線および点線は走査されるレーザ光の光束を示している。

図３に示すように、光走査ユニット５によって対物レンズ９に入射するレーザ光の入射角度が変化し、これにより収束点１０が焦点面１０Ａで走査される。周波数ｆ１で変調されたレーザ光と、周波数ｆ２で変調されたレーザ光は、対物レンズ９に対し互いに異なる角度で入射し、対物レンズ９を出てから焦点を結ぶまでの光路が互いに分離され、重ならない。

図４は、異なる周波数での変調を受けた光が重なる領域を示す図である。

図４におけるハッチングで示した領域が２つの光の交差領域を示す。図４に示すように、この交差領域においてのみ、それぞれの変調を受けた光が重なる。この領域において、２つの光は干渉を起こし、２つの差の周波数である１００ｋＨｚで強度変調される。この変調がかかったレーザ光によって試料１２の蛍光指示薬が励起されて、蛍光が生じる。

この蛍光は対物レンズ９の全領域で捕らえられてレーザ光とは逆向きに進み、結像レンズ８、反射ミラー７、瞳投影レンズ６、光走査ユニット５を介してダイクロイックミラー４へ導かれる。この蛍光はダイクロイックミラー４を透過して、蛍光フィルタ１３によって特定の波長成分が選択的に透過され、レンズ１４と、ピンホール１５とによって焦点面からの光のみが選択されて、検出器１６へ入る。

光検出器１６からの出力信号は、バンドパスフィルタ１９に送られ、ここで差の周波数１００ｋＨｚ近傍の周波数のみが抽出される。さらに信号はコントローラ１７へ導かれ、走査制御に同期してデジタル信号に変換され、走査位置と対応させて画像データが作成される。この画像データは、画像として表示モニタ１８上に表示され、あるいは、コントローラ１７内部のメモリに記憶される。

また、図示しないアクチュエータによって、対物レンズもしくは試料を対物レンズの光軸方向に移動させて、別の深さの画像を観察することもできる。さらに、光走査ユニット５とアクチュエータを連動させて、任意の断面画像を観察したり、３次元情報を観察したりすることが可能である。

このように、本実施例の顕微鏡装置１では、焦点の交差領域のみで、互いに異なる周波数で変調した光の干渉を起こさせ、その差の周波数で交差領域のみで強度変調を加えているので、この領域のみの蛍光がこの差の周波数成分を有する。本実施例の顕微鏡装置１では、バンドパスフィルタ１９でこの周波数成分のみを抽出するので、交差領域の蛍光情報がＳＮ比良く検出できるようになり、生体の深部の蛍光情報も得ることができる。

また、レーザ光の右側の光路と左側の光路が対物レンズ９を出た後に、互いの光軸が概ね９０度で交差するように構成するときに図３に示す交差領域が最も小さくなるので、この場合に分解能が最良となる。

なお、図４に示す交差領域のみの蛍光がバンドパスフィルタ１９により抽出されるため、ピンホール部材１５を用いなくても共焦点効果は得られるが、ピンホールを挿入することで一層ＳＮ比が向上する。

本実施例では、変調装置３をレーザ光前面に配置したが、その位置は限定されない。例えば、ダイクロイックミラー４で反射した後の光路に挿入しても良いし、対物レンズの瞳近傍に挿入しても良い。また、瞳位置がリレーされる、走査光学ユニット５の近傍に挿入しても良い。

また、変調装置３に代えて、２つの電気光学変調素子（ＥＯＭ）によって位相変調もしくは周波数変調を加えるように構成しても、同様の効果が得られる。また、他の変調手段を用いても構わない。

また、ＡＯＭ３ａ、３ｂを周波数シフタとして使用しても構わない。この場合、互いに異なる一定周波数で駆動されるＡＯＭに光を入射し、周波数変調の加わった回折光を用いても同様の効果が得られる。

また、照明のための光源としては干渉距離の短い光源がより好ましく、近赤外光のＳＬＤ（スーパールミネッセンスダイオード）や白色光、ＬＥＤなどを用いることによって、焦点付近以外の光路長が異なる領域では干渉が起こらなくなり、さらにＳＮ比が向上する。

また、ＳＬＤの代わりに、極短パルス光を用いても同様の効果が得られる。

また、本実施例では１つの対物レンズを用いて、２つの変調光を重ね合わせたが、これに限らず、焦点位置を合わせた複数の対物レンズを用いて変調光を重ねても良い。

さらに、交差領域において差の周波数で変調される励起光によって生じる非線形現象を利用しても良い。例えば、変調される励起光によって生じる多光子蛍光を検出しても良く、また、変調される励起光の波長が半分になる２次高調波やさらに高次の高調波を検出しても良い。さらに、励起光による蛍光の変調周波数が２倍となる周波数の高調波を検出しても良い。

また、本実施形態では、出力信号の中の２つの変調周波数の差の成分を抽出したが、用いる変調周波数によっては、和の成分を抽出しても構わない。

また、光走査手段として可変ミラーを示したが、これに限らず音響光学偏向素子、電気変調偏向素子を用いても良い。また、資料を走査しても良く、顕微鏡の一部または全体を走査しても構わない。

以上のように、本実施例の顕微鏡装置１によれば、試料を照明するレーザ光を対物レンズの瞳の別の領域から、それぞれ違う周波数で変調を加えて投光し、２つの光の集光点が交差する領域で差周波数の強度変調を起こさせて、その光で励起を行い、そこで発生する蛍光の差周波成分のみを抽出したので、極めてＳＮ比が良く、組織の深部観察に適している。

以下、図５を参照して、実施例２の顕微鏡装置について説明する。実施例２の顕微鏡装置は、蛍光ではなく反射、散乱光を検出するものである。

図５は、実施例２の顕微鏡装置の構成を示すブロック図である。実施例１と同一要素には同一符合を付し、その説明は省略する。

実施例２の顕微鏡装置１Ａでは、光源としてコリメート光を発する近赤外光のＳＬＤ２１（スーパールミネッセンスダイオード）を使用する。また、実施例１におけるダイクロイックミラー４の代わりに偏光ビームスプリッタ２２が用いられ、蛍光フィルタ１３の代わりに偏光フィルタ２４が用いられる。さらに対物レンズ１０の前には、１/４波長板２３が挿入されている。

変調装置３は実施例１と同様、図２においてレーザ光の右側一部を周波数ｆ１＝１０．１ＭＨｚで変調する第１のＡＯＭ（音響光学素子）３ａと、図２においてレーザ光の左側一部を周波数ｆ２＝１０ＭＨｚで変調する第２のＡＯＭ３ｂと、を有する。

次に、本実施例の顕微鏡装置１Ａの動作について説明する。

ＳＬＤ２１からの光は、直線偏光を有する。変調装置３で変調を加えられ偏光ビームスプリッタ２２で反射された後、同様の光路を通り、１/４波長板２３でそれぞれ円偏光へと変換され、対物レンズ９によって焦点を結ぶ。

実施例１と同様、焦点の交差領域でのみ干渉を起こして差周波数（１００ｋＨｚ）での強度変調が与えられる。焦点からの反射、散乱光は対物レンズ９で集められて、もう一度１/４波長板２３を通過することにより、入射光とは９０度偏光方向の異なる偏光となり、照明光の光路を逆方向に戻り、今度は偏光ビームスプリッタ２２を透過した後に、偏光フィルタ２４でその偏光成分を選択され、さらに、ピンホール部材１８を介して検出器１９で検出される。

本実施例の顕微鏡装置１Ａで使用されるＳＬＤ２１の光は、約１０μｍ程度の可干渉距離を有しているため、光路長が等しくなる場合のみ干渉が生じる。光は試料１２において、様々な散乱するが、光路長が等しくなる焦点近傍でしか干渉が生じない。この焦点近傍の干渉光による戻り光のみを抽出できるので、反射、散乱光でも、焦点の情報をＳＮ比良く検出できる。

なお、上記差周波数（１００ｋＨｚ）を抽出する代わりに、非線形現象によって交差領域でおきるｆ１−ｆ２の成分の高調波を検出しても良い。

以上のように、本実施例の顕微鏡装置１によれば、試料を照明する可干渉光を対物レンズの瞳の別の領域から、それぞれ違う周波数で変調を加えて投光し、２つの光の集光点が交差する領域で差周波数の強度変調を起こさせて、そこで発生する反射、散乱光の差周波成分のみを抽出したので、生体深部の反射、散乱光を極めてＳＮ比が良い状態で検出でき、組織の深部観察に適している。

以下、変調装置の種々の形態について説明する。実施例１または実施例２の顕微鏡装置において、以下の変調装置を変調装置３に代えて使用することができる。

図６（ａ）は、別の変調装置３０の構成を示す図である。

図６（ａ）に示すように、変調装置３０は、光路の右側一部に位相変調を加える電気光学変調素子（ＥＯＭ）３０ａと、中心部付近を遮光するマスク３１とを備える。位相変調された光は、交差領域で変調されていない光と重なって干渉を起こすことによって、変調を加えた周波数の強度変調となり、この光で励起を行うので蛍光もこの変調周波数を有する。これをこの変調周波数のみを通過させるバンドパスフィルタ１９で抽出する。このような構成によっても、変調装置３（図２（ａ））を使用する場合と同様の効果を得ることができる。また、ＥＯＭ３０ａの代わりにＡＯＭを挿入して、周波数シフトを行う周波数変調を加えても同様の効果が得られる。

図６（ｂ）は別の変調装置４０の構成を示す図である。

変調装置４０は４枚のミラー４１，４２，４３，４４と、２つの台形プリズム４５，４６と、台形プリズム４５，４６に振動を加える２つの圧電素子４７，４８とを備える。

図６（ｂ）において光束の右側の一部は、ミラー４３、台形プリズム４６、ミラー４４で順次、反射され、下向きに射出する。また、図６（ｂ）において光束の左側の一部は、ミラー４１、台形プリズム４５、ミラー４２で順次、反射され、下向きに射出する。

変調装置４０では、ミラー４３で光路の右側の一部を抽出し、圧電素子４８を周波数ｆ１で振動させることによって、図６（ｂ）において左右に台形ミラー４６を往復移動させ、この光に周波数ｆ１の位相変調を与える。同様に、ミラー４１で光路の左側の一部を抽出し、圧電素子４７を周波数ｆ２で振動させることによって、図６（ｂ）において左右に台形ミラー４５を往復移動させ、この光に周波数ｆ２の位相変調を与える。

このように、変調装置４０によれば、内部の光路長を変化させることで、変調装置３と同様の変調を与えることができる。

図７（ａ）は、別の変調装置５０を光源の方向からみた図である。

光軸中心部には第１のＥＯＭ５１が、光軸周辺部には第２のＥＯＭ５２が、それぞれ設けられ、両者の間には遮光マスク５３が設けられる。

変調装置５０では、光軸中心部にある第１のＥＯＭ５１で周波数ｆ１の変調を加え、周辺部にある第２のＥＯＭ５２で周波数ｆ２の変調を加える。

図７（ｂ）は光の交差領域を示す図である。このように、対物レンズ９の中心部から周波数ｆ１の変調を受けた光が、対物レンズ９の周辺部から周波数ｆ２の変調を受けた光が、それぞれ入射し、中心部で交差する。これにより、ハッチングで示す交差領域でのみ差周波数の強度変調を起こさせることができる。これにより、変調装置３を使用した場合と同様の効果を得ることができる。

光路の分け方はこれに限らず、同様の効果が得られればどのようなパターンでも構わない。また、３つ以上の周波数で変調を加えた光を用いても良い。

図８は対物レンズ９の周辺の変形例で、結像レンズ８より先端の部分のみを表す。図のように光はプリズム６０によって２方向に分割され、それぞれミラー６１、６２に反射されて、光軸が平行に配置された２つの対物レンズ９a、９ｂに入射される。２つの対物レンズ９a、９ｂを通過した光は図のように同じ焦点１０を結ぶ。ここで２つの対物レンズ９a、９ｂはその焦点面が一致するように配置されているので、光を走査した際に焦点が一致したまま走査され、実施例１もしくは２と同様の効果が得られる。

図９は、実施例３の顕微鏡装置の構成を示すブロック図である。実施例１、２と同一要素には同一符合を付し、その説明は省略する。

図９に示すように、本実施例の顕微鏡装置１Ｂは、可干渉距離の短い近赤外の波長を有する発散光を発するＳＬＤ素子７０を有し、その前面にはコリメートレンズ７１が配置されており、その先には光を２分岐するビームスプリッタ７２が配置されている。

ビームスプリッタ７２で反射された光は二つの変調装置のうちの第１のＥＯＭ（電気光学変調素子）３ａ通過するように構成されている。また、ビームスプリッタ７２を通過した光は、その先のミラー７３で反射した後に第２のＥＯＭ３ｂ通過するように構成されている。

ここでＥＯＭ３ａは周波数ｆ１＝１０．１ＭＨｚで通過する光に位相変調を加え、ＥＯＭ３ｂは周波数ｆ１＝１０ＭＨｚで通過する光に位相変調を加えるように構成されている。これらのＥＯＭ３ａ、ＥＯＭ３ｂは電気的にコントローラ１７に接続されている。

ＥＯＭ３ａの先には、ミラー７５、ウェッジプリズム７６、第１の対物レンズ７７が図のように配置されている。また、ＥＯＭ３ｂの先には、ミラー７８、ウェッジプリズム７９、第２の対物レンズ７９が配置されている。

また、二つの対物レンズ７７，７９はその焦点位置が概ね同じ位置になるように配置されており、焦点１０で交差する構成になっている。また、焦点１０には試料を走査するＸＹＺ方向に移動可能な電動ステージ８２に載せられた試料１２が設けられている。ＳＬＤ素子７０を出てから焦点１０までの二つの光路長は等しくなるように構成されている。

また、二つの対物レンズ７７，７９の間には、検出用レンズ８０、蛍光フィルタ８１、検出器１６が配置されている。また、検出器１６はバンドパスフィルタ１９を介してコントローラ１７と接続されている。

コントローラ１７は、電動ステージ８２の走査制御、光検出器１６からの信号の取得、変調装置３の制御等を実行する。また、表示モニタ１８に情報を出力する。

以下、本実施例の顕微鏡装置１Ｂの動作について説明する。

ＳＬＤ素子７０からの光によって励起される蛍光指示薬が導入された試料１２は、電動ステージ８２上に配置される。

ＳＬＤ素子７０からの光は、コリメートレンズ７１によってコリメートされ、ビームスプリッタで分岐された後に、それぞれ二つのＥＯＭ３a、３ｂに入射される。ＥＯＭ３ａを通過した光は周波数ｆ１＝１０．１ＭＨｚで位相変調され、ＥＯＭ３ｂを通過した光は周波数ｆ２＝１０ＭＨｚで変調される。

ＥＯＭ３ａを通過した光は、ミラー７５で反射した後にウェッジプリズム７６で向きを変えられた後に、第１の対物レンズ７７によって焦点１０を結ぶ。また、ＥＯＭ３ｂを通過した光は、ミラー７８で反射した後にウェッジプリズム７９で向きを変えられた後に、第２の対物レンズ７９によって同じ位置の焦点１０を結ぶように構成されている。

この焦点１０の近傍において、２つの光は干渉を起こし、２つの差の周波数である１００ｋＨｚで強度変調される。この変調が加わった光によって試料１２の蛍光指示薬が励起されて、蛍光が生じる。

この蛍光は、検出用レンズ８０で集められ、蛍光フィルタ８１で蛍光の波長成分のみが選択されて、検出器１６で検出される。検出器１６からの信号はバンドパスフィルタ１９によって１００ｋＨｚ周辺の周波数成分のみが抽出されてコントローラ１７に与えられる。

また、コントローラ１７は電動ステージ８２を走査して、水平方向断面や、垂直方向断面などの所望の断面の蛍光情報を取得して、表示モニタ１８に出力する。

本実施例では実施例１と同様の効果を有する。
さらに本実施例は実施例２と同様に可干渉距離が１０μｍ程度のＳＬＤ光源を用いている。このため光路長が等しくなる場合のみ干渉が生じる。光は試料１２において、様々に散乱するが、光路長が等しくなる焦点近傍でしか干渉が生じない。この焦点近傍の干渉によって生じる蛍光の情報のみを抽出できるので、焦点の情報をＳＮ比良く検出できる。

本実施例では二つの対物レンズの焦点位置が等しくなる例を示したが、これに限らず焦点近傍において二つの光が交差するような構成を取っても同様の効果が得られる。

本発明の適用範囲は上記実施形態に限定されることはない。本発明は、試料に照明光を照射し、照明光に基づく試料からの戻り光を検出する顕微鏡装置に対し、広く適用することができる。

３変調装置（変調手段）
９対物レンズ
１２試料
１６検出器（検出手段）
１９バンドパスフィルタ（検出手段）
３０変調装置（変調手段）
４０変調装置（変調手段）
５０変調装置（変調手段）

Claims

試料に照明光を照射し、前記照明光に基づく前記試料からの戻り光を検出する顕微鏡において、
可干渉性を有する照明光を少なくとも２つに分離する分離手段と、
前記分離手段により分離された前記照明光の少なくとも一方に一定周波数での変調を加える変調手段と、
前記分離された照明光を前記試料において光路が重なるように導く対物レンズと、
前記光路が重なった部分で起こる干渉光によって生じる光を、戻り光として検出する検出手段と、
を備え、
前記分離手段により分離されたそれぞれの照明光の前記試料への入射角度が互いに異なり、
前記照明光の少なくとも２つに互いに異なる一定周波数の変調を加えると共に、前記試料の焦点において起こる干渉光に前記少なくとも２つの変調周波数の和もしくは差の周波数で変化する強度変調を起こさせ、この強調変調の周波数成分を抽出することを特徴とする顕微鏡装置。
前記対物レンズは、前記分離された照明光を前記試料において同一の焦点を結ばせるとともに、前記検出手段は、前記焦点で起こる干渉光によって生じる光を、戻り光として前記対物レンズを介して取得し、検出することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
前記変調が位相変調、強度変調、周波数変調のいずれかであると共に、前記干渉光によって発生する光の信号を取得し、前記少なくとも２つの変調周波数の和もしくは差の周波数成分を抽出することを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡装置。
前記戻り光が蛍光であり、前記検出手段は前記干渉光によって生じる蛍光を検出することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
前記少なくとも２つの照明光は前記対物レンズの瞳位置において、前記対物レンズの瞳径よりも小さい光で互いに重ならない位置に平行光として入射されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
前記照明光の重なった部分を走査するとともに、前記検出手段は走査された各々の焦点からの戻り光を検出することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。