JP2002323660A

JP2002323660A - 試料の光学的深部分解による光学的把握のための方法および装置

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Publication number: JP2002323660A
Application number: JP2002099436A
Authority: JP
Inventors: Ralf Wolleschensky; ヴォレシェンスキーラルフ; Michael Kempe; ケンぺミケール
Original assignee: Carl Zeiss Jena GmbH
Current assignee: Jenoptik AG
Priority date: 2001-04-07
Filing date: 2002-04-01
Publication date: 2002-11-08
Anticipated expiration: 2022-04-01
Also published as: EP1248132B1; EP1248132A3; HK1052220A1; DE50214827D1; ATE493683T1; JP4747243B2; EP1248132A2

Abstract

(57)【要約】【課題】プレパラートをリアルタイムで、高い光学分解
性を持って結像させることのできる新しい方法【解決手段】照明光が少なくとも一空間方向に変調を示
し、走査動作および当走査動作に組み込まれた検出が、
変調における少なくとも第１および第２の異なった位相
位置において行われ、および／または変調における第１
または第２の周期性周波数において行なわれ、試料／試
料の１部から少なくとも１つの光学切断像が算定される
という、試料全体または少なくとも試料の１部に対し
て、試料上または試料中に分布した少なくとも１波長の
照明光を走査動作させて行なう、試料の深部分解による
光学的把握方法および特に試料との相互作用により影響
を受けた光、特に蛍光および／または反射光および／ま
たはルミネセンス光および／または散乱光および／また
は透過光の検出方法

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、主として生物学上
の試料、プレパラートおよびそれらの付属構成成分の顕
微鏡検査、特に蛍光レーザ走査型顕微鏡検査の方法およ
び装置に関するものである。そのほか、作用物質を検査
するための蛍光検出に基づく方法（ハイ・スループット
・スクリーニング）およびその他コントラストメカニズ
ムに基づくレーザ走査型顕微鏡検査法も含まれる。

【０００２】

【従来の技術】生物プレパラートを検査するための光学
顕微鏡の古典的利用分野の１つに蛍光顕微鏡法（文献：
Ｐａｗｌｅｙ「生物共焦点顕微鏡法ハンドブック」、プ
レーナム・プレス１９５５年）がある。この場合では特
定の色素が細胞部分への特殊標識付けのために使用され
る。

【０００３】色素分子は、入射した一定エネルギーを持
つ光子１個の吸収により光子基底状態から励起状態へ励
起される。この励起は一般に１光子吸収と称される（図
１ａ）。色素分子は、このように励起された状態からさ
まざまな方法で基底状態に戻ることができる。蛍光顕微
鏡法では蛍光光子の放出下での移行が最も重要である。
放出される光子の波長はストークス変位のため励起放射
に比較して原則的に赤側にずれる。すなわち長波長側で
ある。ストークス変位が蛍光光線の励起光線からの分離
を可能にする。

【０００４】蛍光は、ブロックフィルタと組み合わせた
適当なダイクロイック・ビームスプリッタによって励起
放射から分離し別途観察する。そうすることによって、
さまざまな色素で着色された個々の細胞部分の描写が可
能である。しかし原則的には、プレパラートのいくつか
の部分を、独特な堆積の仕方をするさまざまな色素で同
時に着色することもできる（多重蛍光）。個々の色素か
ら送出される蛍光信号を区別するために、ここでも特殊
なダイクロイック・ビームスプリッタを使用する。

【０００５】高いエネルギーを持つ１光子による色素分
子の励起（1光子吸収）のほかに、より小さいエネルギ
ーを持つ複数の光子による励起も可能である（図１
ｂ）。この場合、個々の光子のエネルギー総和は高エネ
ルギー光子の何倍にも相当する。この種の色素励起は多
光子吸収と称される（文献：Ｃｏｒｌｅ、Ｋｉｎｏ；
「共焦点走査型光学顕微鏡法と関連画像システム」；ア
カデミック・プレス１９９６年）。

【０００６】図１ｂは近赤外波長領域での２光子の同時
吸収による励起を示している。しかし、色素放出はこの
種の励起によっては影響されない。すなわち、多光子吸
収の場合放出スペクトルは負のストークス・シフトを起
すため、励起放射に比較するとその波長は短い。励起光
線を放出光線から分離するのは1光子吸収の場合と同じ
方法で行う。

【０００７】以下に現状技術を共焦点レーザ走査型顕微
鏡（ＬＳＭ）の例で説明する（図２）。ＬＳＭは大きく
分けて次の４モジュールから成っている：光源Ｌ、走査
モジュールＳ、検出ユニットＤＥおよび顕微鏡Ｍ。これ
らのモジュールは以下により詳しく説明する。それに加
え、ＤＥ１９７０２７５３Ａ１、ＵＳ６１６７１７３も
参考になる。

【０００８】プレパラート中にあるさまざまな色素の個
別励起には、さまざまな波長のレーザをＬＳＭ内で使用
する。励起波長の選択は検査対象色素の吸収特性に従っ
て行う。励起光線は光源モジュール（光源Ｌ）内で生成
される。この場合さまざまなレーザＡ〜Ｄ（アルゴン、
アルゴン・クリプトン、ＴｉＳａレーザ）が使用の対象
になる。そのほか、光源モジュールでは波長の選択およ
び必要な励起波長の強度調整を、たとえば音響光学変調
器の使用により行う。それに続き、レーザビームはファ
イバまたは適当なミラー装置を通じて走査モジュールＳ
内に導かれる。

【０００９】光源Ｌで生成されたレーザビームは対物レ
ンズ（２）を通り、回折の抑制下でスキャナ、走査レン
ズ系、円筒レンズを経由してプレパラート（試料３）内
へ集束される。試料３に焦点を当ててｘ−ｙ方向にドッ
ト走査する。試料走査における画素上滞留時間は多くの
場合マイクロ秒未満ないし数秒の範囲とする。

【００１０】蛍光の共焦点検出（デスキャン検出）の場
合、焦平面（試料３）からおよびその上・下にある平面
から放出された光は、スキャナを通りダイクロイック・
ビームスプリッタ（ＭＤＢ）に達する。ＭＤＢは蛍光を
励起光から分離する。続いて、蛍光は、ダイクロイック
・ビームスプリッタＤＢＳ１−３およびピンホール光学
系を経由して、対物レンズ２の焦平面と共役な平面内に
正確に位置する絞り（共焦点絞り／ピンホール）（ＰＨ
１、２、３、４）で焦点を結ぶ。

【００１１】これによって焦点外の蛍光成分が遮断され
る。絞りの寸法をさまざまに変化させることによって、
顕微鏡の光学分解度を調節することが可能である。絞り
の後ろに別のダイクロイック・ブロックフィルタ（ＥＦ
１−４）があり、これが再度励起ビームを差し止める。
蛍光は、ブロックフィルタを通過した後、点像検出器
（ＰＭＴ１−４）によって測定される。

【００１２】多光子吸収を利用した場合、色素蛍光の励
起は励起強度が特に強い小ボリューム部分に起こる。こ
の領域は、共焦点装置を使用した場合の検出領域より極
僅かに大きいだけである。したがって共焦点絞りの使用
は省くことができ、Ｔ−ＰＭＴ、ＰＭＴ５を通じての検
出は検出方向で見て対物レンズの直後で、または対物レ
ンズに背を向けた側で行うことができる（ノンデスキャ
ン検出）。多光子吸収によって励起される色素蛍光を検
出するための別の装置（図示してない）では、さらに１
つのデスキャン検出が行われるが、この場合、対物レン
ズのひとみはピンホール光学系ＰＨから検出ユニット内
へ結像する（非共焦点デスキャン検出）。

【００１３】３次元照明による像のうち、対応する1光
子吸収もしくは多光子吸収と接続している当該検出器の
装置によって、対物レンズの焦平面内に存在する平面
（光学的断面）のみが再現される。それに続いて、試料
のさまざまな深さｚにおけるｘ−ｙ平面内のいくつかの
光学的断面の描画により、コンピュータでサポートされ
た試料３次元像が生み出される。

【００１４】したがって、ＬＳＭは厚いプレパラートを
検査するのに適している。励起波長は使用色素の固有吸
収特性で決定される。色素の放出特性に合わせたダイク
ロイックフィルタにより、それぞれの色素から送出され
る蛍光のみが確実に点像検出器で測定されることにな
る。

【００１５】現状技術では点スキャナの代わりにいわゆ
るラインスキャナも使用されている（文献：Ｃｏｒｌ
ｅ、Ｋｉｎｏ「共焦点走査型光学顕微鏡法と関連画像シ
ステム」アカデミック・プレス、１９９６年刊）。その
原理構造は本質的には図２のＬＳＭに一致する。但し、
点フォーカスではなくラインが試料（３）に結像するも
のであり、その場合検査試料は一方向（ｘまたはｙ方
向）にのみ走査される。

【００１６】ラインフォーカスの形成は、その焦点距離
に顕微鏡装置のひとみ平面がある−図２に波線で描かれ
た−視準化照明光路内の少なくとも１つの円筒レンズ
（ＺＬ）によって行なわれる。このような構造では共焦
点絞り（ＰＨ）としてはピンホールの代わりにスリット
絞りＰＨ１〜４が用いられる。多光子吸収の適用による
ノンデスキャン検出はこの装置でも行なえる。この場
合、共焦点絞り（ＰＨ）は省くこともできる。

【００１７】検出には点像検出器（ＰＭＴ）の代わりに
ＣＣＤカメラ（ノンデスキャン）あるいは１０２４また
はそれ以上の画像点を含む走査ライン（デスキャン）が
使用される。点走査の代わりにライン走査にすることに
よって、画像記録率を相当拡大させることができる。そ
れにより、この走査法はリアルタイムでの迅速経過過程
の観察（リアルタイム顕微鏡検査）に使用できる。

【００１８】

【発明が解決しようとする課題】この方法の欠点は、ス
リット絞りであるためレーザ点走査型顕微鏡に比べて深
部分解度が１.４ポイント劣る点である。つまり、共焦
点スリット絞りは共焦点切断面以外の蛍光成分を走査ラ
インに垂直な方向で遮断するだけである。加えて、側面
分解度も劣っている。

【００１９】現状技術に基づくリアルタイム顕微鏡検査
のためのまた別な装置では、拡大光源によって検査対象
フィールドが完全に照明されるものがある。しかし、走
査フィールド全体の中で特殊な点パターンだけは迅速回
転ディスクでは捕らえられずに漏れている。この方法は
文献では殆どがニポーディスク法と称されている（文
献：Ｃｏｒｌｅ、Ｋｉｎｏ「共焦点走査型光学顕微鏡法
と関連画像システム」アカデミック・プレス、１９９６
年刊）。

【００２０】いわゆる構造化照明による、現状技術に基
づくまた別な方法では（図３参照）、振幅構造（例えば
格子）の光学結像における変調度が焦点深度の判定基準
として利用されている。この場合の画像は周期性構造
で、その変調周波数および変調位相位置（画像位相）が
優れている。光学軸に対し垂直に構造位相シフトするこ
とにより様々な投影画面を得ることができる。

【００２１】縞のない、深度差のある光学切断面を算定
するためには、一般には少なくとも０°、１２０°およ
び２４０°の３つの位相画像ＰＢが必要である。これら
の位相画像（ＰＢ）から、続いて画像プロセッサにおけ
る次式を用いた算定より（共焦点）光学切断画像が得ら
れる：

【式３】但し、式中Ｉ（ｘ、角度）は当該位相画像の各画素にお
ける強度を表わしている。

【００２２】最も簡単な例では３またはそれ以上の位相
画像記録が、逐次的に行なわれる。その場合、画像測定
中には試料は動かさないものとする。そのように位相画
像から算定された切断画像または断面成層は、続いて３
次元評価ソフトウェアにより標準ＰＣおよびモニタに表
示することができる。

【００２３】光学軸に沿った方向での位置分解度は、光
の波長、対物レンズの開口数および変調振動数に依存し
ている。算定アルゴリズムに関する詳細については、
Ｔ．Ｗｉｌｓｏｎおよび協働者の「従来型顕微鏡での構
造化光線の使用による光学切断面の形成法」（光学レポ
ート２２（Ｎｏ．２４）１９９７年刊）が参考になる。

【００２４】従来型のリアルタイム顕微鏡検査法ではさ
らに、複数色素の同時検査の場合には検出器も複数台必
要になるという欠点がある。それによってデータ伝送の
必要性が高まり、当該機器のコストが増大する。それ
故、今日では各種色素蛍光に対して逐次的に画像形成す
るタイプの顕微鏡しか使用されていない。ＤＥ１９８２
９９８１Ａ１には、励起波長および／または強度を走査
過程で変える方法が記述されている。

【００２５】

【課題を解決するための手段】本発明の課題は、プレパ
ラートをリアルタイムで、高い光学分解性を持って結像
させることのできる新しい方法を実現することである。
この課題は独立請求項に基づく装置および方法によって
解消される。その他の主要な実施態様は従属請求項に記
述されている。本発明の対象は、多重蛍光の要求される
適用例には特に適している。それは、複数同時にリアル
タイムの記録ができる上に、好ましいことに点走査型Ｌ
ＳＭに比べて遜色のない光学分解性を持っているからで
ある。

【００２６】当方法は、レーザ走査型顕微鏡など画像形
成顕微鏡システムにおいて光学空間分解能２００ｎｍま
での精度で行なわれる生物学系プレパラートの３次元検
査にも、また例えば蛍光相関分光計などの分析顕微鏡シ
ステムにおいても使用できる。さらに、蛍光検出をベー
スにした、例えばいわゆるチップリーダなどによる色素
検査法も用途として含まれるが、それらの場合はレーザ
走査型顕微鏡検査法に比べて、特に画像フィールドが一
段と大きな点が異なっている。

【００２７】主としてリアルタイムで画像形成する方法
において空間検出分解能を改善するに当り、その検討対
象になるのは、線状励起および試料から反射、散乱およ
び／または透過した励起光線および／または励起された
蛍光である。この目的には、後に詳しく触れている適当
な光学系により試料中に励起光線のラインフォーカスを
形成する。

【００２８】図４は測定経過の図式例である。左側には
走査フィールドがラインフォーカスと共に描かれてい
る。ラインフォーカスは適当な補助手段（一方向に走査
ミラー設置）により矢印に沿って移動させることができ
る。軸方向および側面方向の光学分解能の強化は、ライ
ンフォーカスの構造化によって行なう。

【００２９】構造化は、光路中に例えば正弦曲線パター
ンの格子を設置して作った周期性構造を走査線に重ね合
わせることによって行なう。コヒーレントな照明光の場
合は、構造の生成は試料内での２つのコヒーレント部分
光線の干渉によっても可能である（文献：Ｗｉｌｓｏｎ
著ＷＯ９８／４５７４５）。画像としては、周期性構造
の位相位置が異なるものを少なくとも２つ記録する。原
則として、光学的切断面の構成は当構造の異なった変調
周波数を持つ画像を記録することによっても行なえる。

【００３０】試料の照明は、空間的および時間的にコヒ
ーレントなまたはインコヒーレントな照明光によって行
なうことができる。また、例えば散乱ディスクの使用に
より空間的にコヒーレントなレーザ光源を使用すること
も、あるいは試料に複数の個別フォーカスを並列させる
ことによりインコヒーレントな照明を使用することもで
きる。

【００３１】一励起波長使用の場合は、画像プロセッサ
で光学切断画像を算定するには、例えば０°および１８
０°の画像位相を持つ少なくとも２種類の位相画像ＰＢ
を用意するのが好ましい。励起波長数ｎの場合、ｎ＋１
の位相画像が必要である。一励起波長適用の場合、走査線に沿って試料から放出さ
れる信号は次式で表わされる： Isig(x)=C(x)・cos(k・x)＋B(x)

【００３２】但し、Ｃ（ｘ）は共焦点光学切断面内のポ
ジションｘにおいてラインフォーカスに沿った、当該励
起波長についての本来の対象物情報（例えば色素の濃
度、作用態様、または局部反射係数）を含んでおり、算
出対象の求める値である。Ｂ（ｘ）は共焦点領域外の対
象物情報を含んでいる。Ｂ（ｘ）の場合、構造体が共焦
点領域外ではシャープに結像しないので、変調されてい
ない。ｋは構造化励起の逆変調周波数である。上式は２
つの未知数Ｃ（ｘ）、Ｂ（ｘ）を含んでいる。Ｃ（ｘ）
の値を求めるには２つの位相画像記録が必要である。

【００３３】位相画像はｌ_１（ｘ）、ｉ＝０、１・・・・ｎ
で表わし、変調時の相対位相シフトｉ・Δψ（画像位
相）で特徴付けされるが、その場合次式が成り立つ： I0(x)=C(x)・cos(k・x)＋B(x) I1(x)=C(x)・cos(k・x＋Δψ)＋B(x) 求める対象物情報は、次のように連立方程式をＣについ
て解くことによって得られる：

【式４】Ｃ（ｘ）は、異なる変調周波数ｋ_０およびｋ_１を持つ２
画像の記録からも同様に求めることができる。

【００３４】周波数画像を同じようにｌ_１（ｘ）、ｉ＝
０、１、…ｎとすれば、次式が成り立つ：

【式５】

【００３５】求める対象物情報は、次のように連立方程
式をＣについて解くことによって得られる：

【式６】Ｃ（ｘ）は、異なる変調位相、変調周波数を持つ少なく
とも２画像の記録から得ることもできる。

【００３６】走査ラインに伴うこれらの対象物情報か
ら、少なくとも一試料平面の光学切断面が合成され、さ
らには、現状技術におけるのと同様に少なくとも一画像
成層から成る少なくとも一画像へ加工することができ
る。一励起波長しか利用されずに、少なくとも３つの位相画
像（例えば０°、１２０°および２４０°の相体位相位
置とする）が記録されるという場合、現状技術で説明さ
れる対象物情報獲得のためのアルゴリズム（文献：Ｔ．
Ｗｉｌｓｏｎおよび協働者「従来型顕微鏡での構造化光
線の使用による光学切断面の形成法」光学レポート第２
２巻／第２４号、１９９７年刊）も、ここで説明したあ
らゆる装置に適用することができる。

【００３７】複数波長による同時励起の場合、それに続
き、変調構造の特殊な位相コーディングまたは周波数コ
ーディングにより様々な励起波長毎に試料の信号分離が
行なわれる。同時励起波長数がｎの場合、一般にはｎ＋
１の位相画象が必要である。

【００３８】その場合、各種励起波長は定義付け通りの
波長別変調位置シフト（コーディング位相）および／ま
たはそれぞれ特徴的な変調周波数（コーディング周波
数）によって互に分離される。各波長の励起光と試料と
の相互作用によって発生する試料からの放出光（例えば
蛍光）は、励起波長に依存した特殊なコーディング位相
および／またはコーディング周波数を有しており、従っ
て下記アルゴリズムに基づき分離させることができる。

【００３９】例えば、蛍光励起のためにそれぞれの波長
（Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３）を必要とする様々な色素（１、
２、３）により、図５に描かれているように試料を走査
フィールドで着色すれば、励起走査線のコーディング周
波数（ｆ_１、ｆ_２、ｆ_３）および／またはコーディング
位相（φ_１、φ_２、φ_３）はそれぞれの領域（１、…
ｎ）の検出蛍光に伝送される（図６参照）。

【００４０】好ましい例では、すべての励起波長が同じ
コーディング周波数を有しているが、しかし、変調周波
数の場合ではコーディング位相が異なっている。以下の
説明では位相コーディングのなされた例に限定する。そ
の場合、変調周波数によるコーディングも同様に検討し
ていき、本発明の対象とする。

【００４１】２励起波長適用の場合、走査線に沿って試
料から放出される信号は次式で表わされる：

【式７】但し、Ｃ_１（ｘ）およびＣ_２（ｘ）は、共焦点光学切断
面内のポジションｘにおいてラインフォーカスに沿っ
た、当該両励起波長についての求める対象物情報（例え
ば、色素の濃度、作用特性）を表わしている。

【００４２】Ｂ_１（ｘ）およびＢ_２（ｘ）は共焦点領域
外の対象物情報を含んでいる。Ｂ_１（ｘ）およびＢ
_２（ｘ）の場合、構造体が共焦点領域外ではシャープに
結像しないので、変調されていない。φ_１およびφ_２は
それぞれ当該励起波長に対応するコーディング位相であ
り、ｋは構造化励起の逆変調周波数である（本例では両
励起波長に対して同じ）。上式は４つの未知数Ｃ
_１（ｘ）、Ｂ_１（ｘ）、Ｃ_２（ｘ）およびＢ_２（ｘ）を
含んでいる。

【００４３】Ｃ_１（ｘ）およびＣ_２（ｘ）の値を求める
には３つの位相画像記録が必要である。位相画像はｌ_１
（ｘ）、ｉ＝０、１・・・・ｎで表わし、変調時の相対位相
シフトｉ・Δψ（画像位相）で特徴付けされるが、その
場合次式が成り立つ：

【式８】

【００４４】求める対象物情報は、次のように連立方程
式をＣ_１およびＣ_２について解くことによって得られ
る：

【式９】但し、

【式１０】および

【式１１】とする。

【００４５】対象物情報の取得には、このように、それ
ぞれの個別励起波長についてコーディング位相（φ_１）
および逆変調周波数（ｋ）が既知であることが前提とな
る。連立方程式を解くには、つまりそれぞれの励起波長
によって明らかにされた対象物情報を分離するには、２
色励起の場合では３つの位相画像が必要である。その場
合個別画像間の画像位相シフト（Δψ）は最も簡単な例
で１２０°である。

【００４６】共焦点領域外の対象物情報については、全
励起波長の関与する総和情報しか取得できない。本例で
のバックグラウンドは

【式１２】で、Ｃ_１およびＣ_２が既知であれば算出可能である。

【００４７】３励起波長に拡大しても、対応の連立方程
式の解から同等の値が得られる。その場合、Ｃ_３（ｘ）
およびＢ_３（ｘ）は共焦点切断面内、切断面外の第３の
波長によって励起された対象物情報を表わしている。個
別波長に対する対象物情報は次のようになる：

【式１３】但し、φ_３（ｘ）は第３の励起波長における変調コーデ
ィング位相であり、

【式１４】である。

【００４８】３色素励起の場合、個別波長によって励起
された対象物情報の分離には、４つの位相画像の記録が
必要である。画像位相ステップ幅は例えば９０°とする
ことができる。予備設定したコーディング位相およびコ
ーディング周波数を持つ装置の値Ｃijは一定なので、信
号加工による対象物情報の取得は簡単な操作で済む。

【００４９】この操作は、標準化画像信号Δｌ_ｊ（ｘ）
＝ｌ_ｊ（ｘ）−ｌ_０（ｘ）を、Ｃ_ｉ _ｊ（ｘ）から求めて
定数として整理した係数ｆｋ（ｘ）で変換することによ
って表わすことができる。例えば上記等式からは３波長
についてそれぞれ次式が得られる：

【式１５】

【００５０】一般的には、ｎ種波長による同時励起には
励起変調時にそれぞれ独自の位相および／または周波数
を持つｎ＋１の画像ｌ_０〜ｌ_ｎを記録することが必要で
ある。励起波長（φ_ｊ）の位相コーディングを持つ位相
画像（画像位相：ψ_１）の場合、それぞれｊ番目の波長
により励起された、準共焦点切断面（Ｃ_ｊ）およびバッ
クグラウンド（Ｂ_ｊ）に関する画像情報を含む次の画像
が得られる：

【式１６】

【００５１】それより得られる連立方程式は

【式１７】但し、

【式１８】

【００５２】準共焦点切断面内の求める画像情報につい
て、公知の数学的方法（例えばクラーマーの公式）によ
り個別励起波長毎に解くことができる。さらに、すべて
の波長で励起された準共焦点切断面外の画像情報は式

【式１９】で求められる。

【００５３】各種波長および／または画像のコーディン
グに位相の代わりに、あるいはそれに加えて周波数を使
用する場合も同様の関係が成り立つ。その場合では係数
Ｃ_ｉ _ｊを然るべき形に修正する。

【００５４】係数Ｃ_ｉｊは、画像コーディングまたは波
長コーディングに位相および／または変調周波数が使用
されるかどうかには関わりなく、下記の測定法によって
決めることができる。参照周波数（例えば４８８ｎｍ）
に対しては、検度の意味合いでコーディング周波数およ
びコーディング位相を求める（例えばガラスプレートま
たはミラーなどの検査対象物による）。

【００５５】それには、検査対象物に周期性構造を結像
させて検出器で測定し、試料の然るべき位置での固定画
像位相についてコーディング周波数およびコーディング
位相を測定して決定する。この参照波長との比較で、他
の波長のコーディング位相およびコーディング周波数を
同様に固定画像位相について測定することができる。

【００５６】照明方向で見て、その前に配置されている
振幅格子（構造Ｓ）の担体にもなっている平面平行なプ
レートＰにおける分散（平行シフト）により位相コーデ
ィングが実現されるという装置も可能である（図７Ａ参
照）。

【００５７】軸Ａの中心からここでは若干傾倒した平面
平行なプレートＰ（傾斜度：γ、厚さ：ｄ）を多色励起
光が透過することにより、回転軸および光学軸に垂直な
平面において次式で表わされるような、波長に依存した
ごく僅かな平行シフトが生じる：

【式２０】

【００５８】プレートが顕微鏡装置の中間画像平面（図
９Ａ参照）にある場合、このシフトは個々の励起光線ラ
インフォーカスの振幅変調間の位相シフトとして表われ
る。図８は走査フィールド内のラインフォーカスを図式
化したものである。右側のグラフには３種類の励起波長
を例に振幅変調の位相位置が描かれている。グラフのｘ
軸はラインフォーカスに沿う座標に一致している。図８
の右側の図には、コーディング位相を明瞭に図解するた
め走査線の一断片だけが描かれている。対応波長によっ
て励起された信号の確実な分離には、５°の位相シフト
があれば十分である。

【００５９】表１はコーディング位相の具体例を示した
ものである。表１：厚さ１０ｍｍのＢＫ７プレートにおいて５０ライ
ン／ｍｍの振幅格子で分散した場合の主要レーザ光線ラ
インの位相シフト。プレートは法線に対して５°傾斜し
ているので、４８８ｎｍの参照波長については光学軸に
対して約３００μｍの平行シフトが発生する。

【表１】

【００６０】波長に依存する位相シフト（位相コーディ
ング）の実行装置には、顕微鏡装置のひとみ平面または
スキャナに投入される光学格子が使用される。

【００６１】

【発明の実施の形態】以下では例えば、蛍光用およびＤ
ＩＣ画像形成用のものでありながら、その他の光学コン
トラスト法への転用制限のない有利な装置について説明
する。

【００６２】装置１：構造化された単一走査線照明第１の装置は図９に示されている通りである。波線で描
かれているのは顕微鏡装置のひとみ光路である。実線は
対象物光路を表わしている。図９Ａ（ｘｙ平面）では光
源（ＬＱ）の光は、その焦点距離の位置が顕微鏡装置の
ひとみ平面にある、例えば円筒レンズ（ＺＬ）によって
中間画像平面（ＺＢ）のラインフォーカスとして形成さ
れる。円筒レンズの前または後の位置にある（円筒レン
ズの前として描かれている）中間画像平面には走査線に
沿って振幅の変調を喚起する素子（ＳＴ）が配置されて
いる。ＳＴとしては、例えば透過格子がある。

【００６３】図７Ｂおよび７Ｄに例示されているよう
に、ブラック・ストロークとして図示された格子線の方
向（Ｙ）に垂直なＸ方向において周期性の変化が進行す
る。このＸ方向でのシフト、例えば図９に描かれている
ような位置設定ユニットＰＥを用いてのシフトにより、
位相位置の変更が可能になる。図７Ｄに基づくＹ方向で
の構造シフト（構造シフトは図示されていない）によ
り、光学的断面密度（ずっと後の本文参照）の適合化の
ため、または光学切断画像算定のための個別画像記録時
における変調周波数変更のため、振幅変調の周波数に変
化が起きる。

【００６４】このシフトは、光学軸上にある旋回点を中
心にＹ方向の回転軸の周りを傾倒させることによっても
同様に生まれる。格子を、例えば光学軸に一致するＺ方
向の回転軸に沿って回転させることによっても位相シフ
トが起こるが（図１６参照）、空間的に離れた複数のラ
インを試料上に結像させる場合（Ｘ方向のライン列）で
はこれは様々な形で現われる。

【００６５】続いて、構造的走査線はメイン・ビームス
プリッタ（ＭＤＢ）、およびこれも顕微鏡装置のひとみ
内にあって結像ラインに対して垂直に走査線を移動させ
る（ｙ座標）、スキャナ（ｙ）を経由し、さらに走査光
学系（ＳＯ）、鏡胴レンズ（ＴＬ）および対物レンズ
（Ｏ）を通って試料（ＰＲ）に結像する。この場合、中
継光学系（ＲＬ）が円筒レンズ（ＺＬ）の焦点をスキャ
ナ（ｙ）に結像させる。中継光学系は現状技術による特
殊な装置によれば、省くことも可能である。

【００６６】例えば両スキャナｘ、ｙの距離を短縮した
場合、または両スキャナｘ、ｙをカルダン懸架式単一ス
キャナに代えた場合である。円筒レンズについても、原
則としてその焦点がスキャナ（ｘ）上にある円筒ミラー
に代えることもできる。円筒ミラーは図９Ｃに描かれた
ｘｚ平面上４５°で配置する。この平面では当ミラーは
フォーカシング作用も有している。また、このミラーは
光路を光源に対し９０°転回させている。そのパターン
は図９Ｃに図示されている。

【００６７】対物レンズ（Ｏ）によって集束された放出
光は、例えばメイン・カラースプリッタ（ＭＤＢ）によ
り励起光から分離される。続いて、試料からの光は共焦
点検出の場合では結像光学系（ＰＯ）の使用のもとスリ
ット絞り（ＳＢ）（スリット長軸方向の位置：図面Ｚ座
標方向）によってフォーカシングされる。それにより、
焦点外に生じた蛍光は阻止される。

【００６８】ノンデスキャン検出の場合は絞りを省くこ
とができる。スリット絞りの後には、位置分解のもとで
（ラインフォーカスに沿って）蛍光検出を行なうライン
／面積検出器（ＤＥ）（Ｚ方向での走査ラインの位置）
が配置されている。加えて、メイン・カラースプリッタ
（ＭＤＢ）の後ろに、励起光線の検出光路への侵入阻止
用として放出光フィルタ（図示されていない）を設置す
ることもできる。ラインフォーカスの場合、ガルボスキ
ャナ（ｙ）により一空間方向に走査する。ｘスキャナは
画像位相の調整に使用されない場合、零位の位置に留ま
ったままである。

【００６９】図９Ｂも同じ装置を表わしているが、それ
は９０°転回した場合である（ＹＺ平面）。この空間方
向では円筒レンズ（ＺＬ）が作用しないので、試料上に
おける観察対象はラインでなくて焦点である。原則的に
はスリット絞りも省くことができる。位置分解により蛍
光寿命を測定（ラビジョン、ピコスター）するに当り、
蛍光の結像をスキャナでのデスキャンによるのではな
く、直接ＣＣＤカメラまたはゲート式カメラに対して行
なうべき場合では、これがとりわけ大きな意味を持って
くる。

【００７０】この場合ＣＣＤカメラは中間画像平面Ｚ
Ｂ、例えば顕微鏡装置のＴＬとＳＯ間の中間画像平面を
観察する。現状技術に基づく顕微鏡の場合これはＴＶポ
ート（図１９ＴＶポートの位置参照）に接続される。Ｃ
ＣＤカメラは、そのほか顕微鏡装置の透過光路内で（例
えば図１に記載されているＴ−ＰＭＴの代わりとして）
使用することもできる。そうすることで、試料を透過し
た励起光線を共焦点分解機能により検出することができ
る。加えて共焦点ＤＩＣ結像も可能になる。

【００７１】現状技術では、そのためにはＴＬと対物レ
ンズＯ間の対物レンズひとみにＤＩＣプリズムが設置さ
れる。そのようにＤＩＣで得られた画像は、さらに試料
から反射、散乱および／または放出された信号から生成
された画像と共に一画像として重ね合わせて表現するこ
ともできる。共焦点切断面の算定は、例えば少なくとも
２つの位相画像を記録することによって行なう（図４ま
たは本文始めの既出箇所参照）。

【００７２】その場合、少なくとも２つの位相画像にお
けるラインの照明強度は、構造ＳＴによりｘ方向に周期
的に−例えば正弦波状に−変化する。３構造ライン使用
の場合、相対画像位相はそれぞれ１２０°ずれることに
なる。３つの位相画像は逐次的に形成される。即ち、３
画像がｙガルボスキャナ（ｙ）によって逐次走査され
る。当構造（ＳＴ）は、例えば透過格子状とすることが
できる。画像位相のシフトは例えば、透過格子と連結し
た位置設定ユニット（ＰＥ）で行なうことができるの
で、検査試料の各位置を明度変化させながら観察するこ
とができる。

【００７３】さらに、一波長の場合では、画像位相の調
整は図７Ａにあるような原形構造／印加構造の回転式プ
レート（ＰＬ）によって行うこともできる。そのために
は、当プレートは図９に描かれているように顕微鏡装置
の中間画像平面に配置しなければならない。これに使用
される平面平行なプレートは中間画像平面にあって、プ
レートに直接構造ＳＴ（図７Ｂに描かれている）が施さ
れているのが好ましい。

【００７４】別な装置として、画像位相の調整を別なガ
ルボスキャナ（Ｘ）で行なうこともできる。その場合、
スキャナ（Ｘ）がｘ方向の走査線をシフトさせ、それに
よって画像位相を変化させるのである。これには、検出
側の光線転向と連結した円筒レンズ（ＺＬ）、および透
過格子の接続（転回またはスライド）によって、点走査
型ＬＳＭと構造的照明による線走査型ＬＳＭ間で点像検
出器からライン検出器（ＤＥ）への切換が行なえるとい
う利点がある。スキャナＸは画像位相の調整に使用され
ない場合、零位の位置に留まったままである（従って、
電流の流れない接続状態）。

【００７５】装置２：構造化された単一走査線照明およ
び変調位相または変調周波数のコーディング第２の装置では、走査線の構造化の際、励起波長に依存
して様々なコーディング位相が使用される。それによ
り、個別波長によって励起された蛍光の信号がデジタル
方式で分離することができる。

【００７６】図１０ＡはＸＺ平面において可能な図式構
造を示している。光源（ＬＱ）から出た様々な波長の光
が、構造（ＳＴ）によって振幅変調を起こす。その場
合、構造は顕微鏡装置の中間画像平面内にある。構造は
位置設定ユニット（ＰＥ）によってシフト可能なように
配置されているので、構造は走査線に沿ってシフトで
き、様々な画像位相が設定できる。それに続き、円筒光
学系（ＺＬ）内の構造化光線は顕微鏡装置のひとみ平面
でラインを形成する。その場合、円筒レンズ（ＺＬ）は
ひとみ（スキャナＸ）から焦点距離分離れた位置に配置
される。画像位相の調整はさらに、顕微鏡装置のひとみ
平面内にあるスキャナ（Ｘ）によっても行なえる。

【００７７】図１０ＢはＸＺ平面に一スキャナ（Ｙ）だ
けを持つ簡略型装置である。この場合では画像位相の調
整は位置設定ユニットＰＥによって行なう。走査線に振
幅変調が印加された後に、その光線は、波長に依存して
構造シフトを行い、延いてはコーディング位相を変える
という素子を通過する。位相コーディング装置について
は既に図７Ａに基づいてその可能性を述べた。その場合
使用される平面平行プレートは中間画像平面にある。
尚、周期性構造ＳＴ（特に図７Ｂに描かれている）が直
接プレートに施されているのが好ましい。

【００７８】励起光線は、振幅変調の位相コーディン
グ、および周波数コーディングに続き、メイン・カラー
スプリッタ（ＭＤＢ）、Ｙスキャナ、走査光学系（Ｓ
Ｏ）、鏡胴レンズ（ＴＬ）および対物レンズ（Ｏ）を経
由して試料（ＰＲ）に達する。Ｙスキャナは走査線を発
してｙ座標における位相画像を記録する。使用色素に依
存して、それに対応する波長で蛍光励起が行なわれる。
励起波長に依存する走査線の変調周波数、および変調位
相がこのようにして蛍光信号へと伝送される。

【００７９】デスキャン検出の場合、蛍光は対物レンズ
に集束され、鏡胴レンズ、走査光学系およびＹスキャナ
を経てメイン・カラースプリッタ（ＭＤＢ）に到達す
る。これが蛍光を励起光線から分離する。それに続き蛍
光は、スリット絞りを通ってライン検出器（ＤＥ）上に
結像する。励起光線遮断のために、ライン検出器の前に
ブロックフィルタを追加接続することもできる。特に多
光子励起の場合はスリット絞りを省くことができる。

【００８０】様々な波長によって生成された個別信号成
分の分離および光学切断面の算定は、上記アルゴリズム
を基に例えば同一変調周波数におけるコーディング位相
の使用下で行なう。その場合個別波長のコーディング位
相は平面鏡などの検査対象物により予め決めておく。そ
うすることで、様々な色素で着色された領域が区別でき
るようになる。

【００８１】別な装置の場合では分散素子（ＤＧ）、例
えば透過格子が使用され、顕微鏡装置のひとみ平面に配
置される。その光学図式は図１１にＸＺ平面で描かれて
いる。透過格子は個別走査線をその波長に相応して図平
面内でシフトさせる（一波長のみ描画）。それにより、
個別走査線にはその波長に応じて、様々な変調構造ＳＴ
の位相位置（コーディング位相）が印加される。

【００８２】画像位相のシフトは、位置設定ユニット
（ＰＥ）および同一ステップ幅を持つ各波長毎の変調構
造Ｓによって行なわれる。それにより、例えば３つの位
相画像の記録では各励起波長に対する画像位相シフトは
１２０°となることを保証する。

【００８３】以下では、周波数コーディング形成用およ
び光学分解調整用の有利な装置について詳しく取り上げ
る。各励起波長に対する変調周波数を変更することによ
って、個別波長に対するピンホールの有効寸法、即ち個
々の波長別に光学切断幅を適合化することができる。

【００８４】図７Ｃは、装置１および２（例えば図９）
において顕微鏡装置の中間画像平面に構造ＳＴの代わり
に有利に組み込むことのできる変調周波数の波長別調整
装置を図示したものである。その場合では、多色光源を
分散素子（ＤＧ１）により該素子分光成分に空間分離さ
せる。続いて、当分光成分は第１レンズ（レンズ１、焦
点距離ｆ）により軸平行にさせられる。即ち、ＤＧ１は
当レンズの焦点位置にある。レンズの画像側焦平面に
は、振幅変調を行なうための構造体（ＳＴ）が設置され
ている。図７Ｄには、ｙ方向において周波数に直線的に
依存する構造形態例が図示されている。

【００８５】図７Ｃに基づいて行なうレンズＬ１、Ｌ
２、Ｌ３への分離により、当周期性構造においてｙ方向
でのラインの位置が異なることから変調周波数に差異が
発生する。従って、波長に対して直線的依存性の関係に
ある多色光源の空間分離を、例えば透過格子によって行
なえば、適当な格子構造である限りは個別分光成分の変
調周波数も波長に依存して変化する。それにより、例え
ば光学上同一の切断厚さを異なった波長で実現すること
が可能になる。

【００８６】次に、個別分光成分を第２レンズ（レンズ
２、焦点距離ｆ、但しレンズ１の焦点距離と同じである
必要はない）および別な分散素子（ＤＧ２、例えば透過
格子、但しＤＧ１と同じである必要はない）により再度
空間的に重ね合わせる。レンズ１および２の焦点距離を
適合させることによって、光線の拡大を制御し、それに
より顕微鏡対物レンズの照明を最適化することができ
る。

【００８７】以上のような構造により、本発明から下記
のような全体として有利な派生的方法が生まれる：ａ）構造ＳＴのｘ方向でのシフトにより、個別ライン毎
に（予備検度測定に基づき）定義付けされた様々な位相
変化が発生する。その場合異なった位相位置においてそ
れぞれのラインにより試料を完全に走査し、波長別に切
断画像を算定する。切断の厚さは、ｙ方向でのシフトに
伴う周波数の特定変位により変更することができる。ｂ）ｙ方向での（少なくとも１回の）シフトにより変調
周波数が特定量変化するので、個別波長に対し異なった
変調周波数で複数回走査することにより切断画像の算定
をすることができる。

【００８８】さらに、構造体の持つ様々な変調周波数を
通じて、共通走査線での全波長結像の際に異なった波長
の別に周波数コーディング、および位相コーディングを
作成することができる（装置４参照）。ｙ方向での変調
周波数の連続的変化を伴う図７Ｄに示された構造に代わ
って、異なった変調周波数を持つ複数の部分構造から構
成されている構造（図１６参照）を使用することができ
る。

【００８９】しかしこの場合には、その構造が固定した
励起波長だけを対象に調整されているという欠点があ
る。また最も簡単な例では、それぞれ異なった変調周波
数を持つ各種格子ＳＴを装置１および２に向けて配置す
ることも可能である。

【００９０】図には示されていない、また別な配置構成
として、光線が構造化された後に、波長に依存して構造
を拡大させ、同時に波長に依存して変調周波数を変化さ
せる、即ち周波数コーディングを行なう素子を通過する
というのもある。

【００９１】ある装置では、走査線がダイクロイック・
ビームスプリッタにより個別波長成分に分離されて、次
に部分光路において拡大設定用ズーム光学系の付属する
望遠鏡によりそれぞれ波長に依存して拡大設定が行なわ
れる。その後、別な２色器により個別走査線が再度重ね
合わされる。そのほか、また別な装置として、波長に依
存して走査線を拡大させる特殊回折素子を使用すること
もできる。

【００９２】走査線は、出力部では使用波長に依存して
特殊な振幅変調コーディング周波数を有している。画像
位相のシフトは、位置設定ユニット（ＰＥ）および同一
ステップ幅を持つ各波長用の可動構成体ＳＴにより行な
われる。それにより、例えば３つの位相画像の記録では
各励起波長に対する画像位相シフトは１２０°となるこ
とを保証する。

【００９３】位相画像を記録する代わりに、光学切断面
を、励起線当りの変調周波数が互に異なる２画像から算
定することもできる。全波長または一波長に対する変調
周波数の変更は、図７Ｄに基づき透過格子のｙ方向にお
ける異なった位置で２画像を記録するという方法による
のが好ましい。

【００９４】上記の装置によれば、例えば顕微鏡の軸方
向光学分解能が様々な波長に対して同等であることが保
証される。それにより、単一ラインスキャナによりいわ
ゆる共同位置測定が可能になる。加えて、例えば極めて
弱い蛍光信号の場合では、構造をＹ方向においてシフト
（図７Ｄ参照、ここでは下方照準シフト）することによ
りピンホール有効域を拡大することができる。それによ
って確かに光学分解能は低下するが、しかし信号対雑音
比は改善させることができる。

【００９５】そのほか、図示してないが上述したズーム
光学系は結像光学系の縦方向色収差を補正したり、延い
ては同一対象物平面において確実な光学的切断を行なう
のに利用できる。そのため、個別ズーム光学系のレンズ
はそれぞれ１つずつ、使用する顕微鏡対物レンズに応じ
て軽く調整解除の状態にしておく。そうすれば、光線が
個別波長毎に発散または収斂しながらズーム光学系出力
部で対物レンズのひとみに行き当たった際に、焦点を励
起波長に応じて軸方向にシフトさせることが、即ちすべ
ての励起波長に対応させることができる。

【００９６】さらに装置１および２については、別な分
散素子（ＰＲ）を蛍光信号の追加的スペクトル分割のた
めに照明光線に垂直に設置することができる（マルチス
ペクトル・ラインスキャナ）。図１２はＸＺ平面におけ
るマルチスペクトル・ラインスキャナのＣＣＤ画面に見
られる検出パターンを示したものである。検出器（Ｄ
Ｅ）のｘ方向にはそれぞれの波長毎に、構造を持つ放出
信号が結像している。

【００９７】ここでもＰＥによる位相位置シフトに代え
て、Ｘスキャナによって画像位相の調整を行うこともで
きる。走査線のスキャニング毎に、様々な検出波長につ
いて図に描かれているような画像記録を行なう。選択検
出器素子に対するプログラミング可能な制御（走査線）
および検出器マトリクス空隙への検出器素子の組み合わ
せにより、蛍光放出のスペクトル領域をフレキシブルに
選択することが可能になる。その目的には、その波長に
応じて様々な蛍光信号が結像する検出器の複数走査線を
電子的に繋ぐという方法が取れる。

【００９８】蛍光放出線のマルチスペクトル検出の場合
もやはり、構造化照明と組み合わせることができる。そ
の際、線状励起光は例えば透過格子（ＳＴ）により構造
化される。その後、図１２の結像に対応したそれぞれの
波長分布の検出下で走査線の完全なスキャニング、およ
び格子構造を持つ画像位相の変更下でさらに別なスキャ
ンニングを行なう。波長依存性シフトを求めるために、
例えば使用の平板ＰＬを然るべき角度だけ傾倒させたの
で、位相位置の変更は傾倒角一定とすればＰＥによるシ
フトによって行なうことができる。様々な励起画像位相
を持つ構造化対象物の画像を逐次検出し、続いて算出す
ることによって深度コントラストを最大限上げることも
できる。

【００９９】図１２はマルチスペクトル型ラインスキャ
ナ（ｙ平面で、つまり図平面に入り込んでスペクトル分
割を行なう）と構造ＳＴを通じて構造化された照明の組
み合わせを表わしている。その場合位相コーディングは
やはり、光学軸に対して垂直にシフトされた傾倒状態の
平行平面プレート（図には描かれていない）か、または
分散素子（本文前記参照）で行なう。それによって画像
位相が逐次変化することになる。異なったスペクトル成
分がＣＣＤアレーにより同時平行に検出される。

【０１００】ここではスペクトル分割のための入射スリ
ットとして用いられているスリット絞り（ＳＢ）は、ラ
インスキャナでのデスキャン検出では省くことができ
る。それによりスペクトル分解能は確かに低下するが、
しかし技術コストは相当軽減する。通常ならシフト可能
な個別スリット絞りを使用しなければならないからであ
る。

【０１０１】図１３は、ライン検出器を持つ信号検出用
電子機器の構造を図式化したものである。検出器Ｋ１〜
Ｎの信号はそれぞれ電流／電圧変換器（Ａ）により増幅
され、続いて画素滞留の間に集積される（Ｉ）。当信号
はアナログ／デジタル変換器（ＡＤＣ）へのレベル適合
化のためにさらに増幅された後、ＡＤＣにおいてデジタ
ル信号に変換され、コンピュータ（ＰＣ）に伝送され
る。ＣＣＤマトリクスによる検出に関しては文献により
公知になっている。

【０１０２】装置３：位相画像の準同時記録を伴う構造
化照明縞柄画像の検出は、１ラインでなく平行な複数ライン
（例えばＬ１、Ｌ２、Ｌ３）を結像させることによって
準同時に行なうこともできる。その時の強度構造（画像
位相）は、例えば図４のように３ライン使用した場合そ
れぞれ１２０°ずつシフトすることになる（図１４）。
このように、１回の試料走査で既にデータ評価のための
情報がすべて生成される。

【０１０３】図１５はＹＺ平面の光学構造を図式化した
ものである。焦点はそれぞれラインフォーカスのｙ軸に
沿って描かれている。励起光はビームスプリッタ装置
（Ｔ）で分割することができる。図１６Ａ、Ｂにはビー
ムスプリッタ装置（Ｔ）の２構造形態が、円筒レンズの
前に設置された配置で描かれている。円筒レンズと共同
作業する第１の装置では、平行に配置された２つのミラ
ーにより複数の不連続ラインフォーカスが生成される。
その場合第１ミラーは完全ミラーで、第２ミラーは部分
透過ミラーとする。部分透過ミラーの透過率は各部分光
線（ｉ）に同調していて、１００％／（ｎ−ｉ）から求
められる。但し、ｎは個別フォーカスの総数である。

【０１０４】続いて、成分（ｉ）は図１６Ａに図解され
ている特殊格子構造（ＳＴ）へ別々に到達する。当構造
では部分格子は然るべき位相シフトのもとで変調されて
いる。部分格子の合成から成る構造の代わりに、図１６
Ａに描かれている図７Ｂに基づく透過格子をゆがめた形
で使用することもできる。それにより、それぞれ同一変
調周波数のもとで個々の走査線に対して構造位相シフト
の調整が照準通り行なえる。

【０１０５】装置の検度、即ち変調周波数および走査線
位相位置の測定は上記の方法に従って行なう。構造体は
顕微鏡装置の中間画像平面に設置される。スプリッタ
は、例えば顕微鏡装置のひとみ平面で使用することもで
きる。その場合両ミラーは互に傾倒させるので、それに
より同様に複数のラインフォーカスが生成される。

【０１０６】図１６の第２装置（図１６Ｂ）は、２重ラ
インフォーカス生成のための特殊装置形態である。当形
態の場合も平行に配置された２つのミラー（ＳＰ１およ
びＳＰ２）が使用される。そのうちの１つ（ＳＰ１）は
それ自体構造ＳＴを有している。当構造は低透過性の部
分では反射する。当構造は顕微鏡装置の中間画像の位置
に配置される。

【０１０７】スプリッタの出力部には、その振幅変調が
全く逆位相になっている２ラインが生成される。ライン
１はライン２に対して丁度１８０°シフトした振幅変調
を有している。構造体はガラスプレート１に設置されて
いる。複数波長使用の場合、平面平行なガラスプレート
によるｙ方向での波長依存性平行シフトは、９０°の角
度で配置された同じ厚さの第２ガラスプレートで補正さ
れる。加えて、上記位相コーディング生成のために、ス
プリッタ・ユニット（Ｔ）全体についてｙ軸の周りを少
し傾倒させることができる。両装置の場合構造（ＳＴ）
のシフトは省くことができる。

【０１０８】Ｙスキャナの走査作動は、試料の各検査点
がそれぞれ構造の異なった位相位置にあるラインにより
１回ずつ照射されるように、本来の検査対象である画像
フィールドを越えてなされる。この装置は迅速に変化す
る試料の検査には特に有利である。この場合では、試料
内の動きや迅速な変化がもはや測定結果を損なうことは
なく、ラインスキャナが持つ最大限の画像記録速度が逐
次式データ記録によって減退することはないからであ
る。

【０１０９】この場合、同時平行に励起されたラインの
検出はマトリクス検出器で行なわれる。例えば３ライン
の場合、３つのライン検出器による。それに代わり、試
料上に分離された全ラインを同時に検出するライン検出
器を使用することもできる。各ラインの情報分離は、各
種変調（位相および／または周波数に関して）を基礎と
する上記アルゴリズムによって行うことができる。

【０１１０】装置４：準同時のマルチスペクトル励起を
伴う構造化照明第４の装置では、複数の不連続励起波長が様々な走査線
に空間分離して（例えば３レーザ線の場合：ｘ方向にＬ
１、Ｌ２、Ｌ３）試料に結像する。その場合、分散素子
（ＰＲ）（例えば透過格子、ｘ方向の格子線）により波
長の異なる平行な複数励起線が生成され（図１７参
照）、それがｙガルボスキャナ（ｙ）および後続の光学
結像系により、対象走査フィールドの各点が各ラインに
少なくとも１回走査されるように、試料上を動かされ
る。光学構造は図１８にＹＺ平面として図示されてい
る。それぞれラインフォーカスの中心が描かれている。

【０１１１】蛍光信号の励起線からの分離もメイン・カ
ラースプリッタ（ＭＤＢ）で行なう。異なった励起線に
よって生成された蛍光信号は、ｘ方向にスリット絞りの
前置されたマトリクス検出器のｚ方向における別々な位
置Ｌ１〜Ｌ３に到達する。その場合、照明光線に垂直な
軸は当該蛍光波長に対応している。マトリクス検出器
上、照明光線に沿う方向の軸は位置座標に対応してい
る。

【０１１２】さらに、装置１および２に対応した位相コ
ーディング、周波数コーディングを行なうこともでき
る。例えば位相コーディングには、Ｙ軸を中心に構造
（ＳＴ）を傾倒させる。周波数コーディングは、例えば
図７Ｄに示された特殊構造によって行なうことができ
る。位相コーディングまたは周波数コーディング適用の
場合では、スペクトル成分も、すべての走査線を同時に
捕獲する検出器マトリクスによって同時に検出すること
ができる。

【０１１３】最も簡単な例では、その場合矩形画素を持
つＣＣＤ走査線（または集合走査線）が使用される。そ
の画素の長辺は、例えば走査線Ｌ１〜Ｌ３が検出走査線
で一緒に検出されるように、ｚ方向（図１８参照）に向
けておくのが好ましい。異なった走査ラインフォーカス
で励起された信号を分離する際も、上記のアルゴリズム
を基に行なう。当装置の場合、個々の走査線はもはや検
出器アレー上で別々に検出する必要はなく、１次元検出
器によって捕獲できるところに利点がある。

【０１１４】加えて、追加の分散素子を配置して、蛍光
信号を照明光線に垂直な方向へ追加的にスペクトル分割
するのに用いることもできる。この目的にもまた、図１
２に示されたマルチスペクトル・ラインスキャナの検出
方式が適用できる。検出器の一方向に１つの位置座標が
結像する。選択された検出器素子（走査線）のプログラ
ミング自由な制御、および検出器素子と検出器マトリク
ス空隙との組み合わせにより、蛍光放出スペクトル領域
のフレキシブルな選択が可能になる。

【０１１５】その目的には、波長に応じた様々な蛍光信
号が結像する検出器の複数走査線を電子的に集結合させ
ることができる。蛍光放出のマルチスペクトル検出も構
造化照明と組み合わせることができる。そのためには、
線状励起を追加的に例えば透過格子によって構造化させ
る。様々な画像位相を持つ構造化対象物の画像を順次検
出し、続いて算出することによって深度コントラストを
最大限上げることもできる。

【０１１６】図１８はマルチスペクトル・ラインスキャ
ナと構造化照明との組合せを表わしている。画像位相は
構造が変わるに従って順次変化する。異なったスペクト
ル成分が、例えばＣＣＤアレーにより平行に検出され
る。共焦点スリット絞りとしては、現状技術による場合
当装置では個々の走査線に対して共役位置に配置される
自由可動型絞りを使用しなければならないが、走査線の
構造化によってそれは省くことができる。それにより技
術コストが相当軽減化する。

【０１１７】装置５：試料への点状作用を伴う構造化照
明第五装置では、試料に対し線状励起の代わりに点状励起
が行なわれる。レーザ走査型顕微鏡の場合、現状技術で
は図２に従って操作されるが、図１９に基づく場合では
構造（ＳＴ）を、スキャナｘおよびｙよりも試料側にあ
る中間画像平面の位置で使用する。ｘまたはｙ方向での
スキャニングによりその構造が試料に連続的に結像す
る。位相画像の記録は構造をＰＥによりシフトすること
によって行なう。装置３および４に基づく準同時照明も
追加実施できる。上記装置による位相コーディングおよ
び周波数コーディングが何ら制限なく転用できる。

【０１１８】従来型点スキャナと比較して本装置の優位
点は、試料の信号がデスキャンなしにＣＣＤカメラで直
接測定できるというところにある。この場合では共焦点
絞りも省略できる。ＣＣＤカメラとしては、例えばゲー
ト式カメラ（ピコスター、ラビジョン）も使用できる。
それにより、例えば共焦点光学切断面の経時分解された
蛍光記録を得ることができる。これは現状技術では、試
料に対し非線形作用を適用することでしか可能でない。
しかし現状技術でも、点状デスキャン検出および部分デ
スキャン検出（文献：Ｓｔｉｍｓｏｎおよび協働者「器
械科学評論」第７０巻、３３５１ページ、１９９９年
刊）を行うこともできる。

【０１１９】さらに、既述の検出バリエーションの適用
下で位相コーディングまたは周波数コーディングを行な
うことにより、様々な波長で励起された試料信号を同時
に記録することができる。その場合では１検出器しか必
要としない。このように、本装置によりレーザ走査型顕
微鏡の構造は、フレキシビリティの面で制限を受けるこ
となく一段と簡易化できる。構造体の組み入れにより、
従来のレーザ走査型顕微鏡と構造化照明を持つレーザ走
査型顕微鏡間で相互接続が可能になる。

【０１２０】方法１〜５の組み合わせも同様に本発明に
属するものである。さらに、上記方法と現状技術に基づ
くいわゆる平行走査法との組み合わせも制限なく可能で
ある。これらの方法の場合、同強度を持つ複数の点また
は線をマトリクスとして試料に同時に結像させる（文
献：Ｂｕｉｓｔおよび協働者「顕微鏡ジャーナル」第１
９２巻、２１７ページ、１９９８年刊、Ｎｉｅｌｓｅｎ
および協働者「顕微鏡ジャーナル」第２０１巻、８５２
ページ、２０００年刊）。それによって画像記録率をさ
らに高めることができる。そのほか、試料をテーブルス
キャナまたは現状技術に基づくスキャナ（例えばニポー
ディスク）で結像させることもできる。

【０１２１】既述の有利な装置は、加えて巨視的試料の
検査にも有効に使用できる。巨視的試料は、例えば作用
物質をスクリーニングする際にチップ上で使用される。
この場合走査フィールドの縁の長さは数１０ｍｍであ
る。例えば試料を図２に基づく顕微鏡装置の中間画像に
配置してガルボスキャナの走査角を拡大することによ
り、あるいは中間画像を拡大する特殊な対物レンズ装置
（巨視的対物レンズ）によりこの走査フィールドの試料
上への結像が達成される。

【０１２２】Ｈｅｌｌおよびその協働者の寄稿（「顕微
鏡ジャーナル」第２０２巻、第３章、４５７〜４６３ペ
ージ、２００１年６月刊）に、２光子または３光子励起
で蛍光信号を１.５〜２.５ポイント高めるための装置の
ことが書かれている。その目的には、試料の平行励起
を、多重法で空間照明される複数フォーカスの形態で行
う。その場合干渉によって生成される照明パターンは、
ある周期のもとに空間移動するが、この周期についての
信号を時系列平均し記録する。

【０１２３】本装置の目的は多光子励起における蛍光信
号を高めることである。この方法は空間分解能には影響
を及ぼさない。即ち、光学的分解能は上記説明の技術水
準に基づく、個々の試料点における非線形相互作用によ
り達成される。この場合、本発明によれば被検査走査フ
ィールドへの平均エネルギーの再分配のため、少なくと
も２つの部分光線の干渉性重畳が利用される。平均エネ
ルギーの再分配によって多光子励起における蛍光信号が
高まる結果となる。

【０１２４】加えて、部分光線の干渉性重畳が既述の走
査線構造化を惹き起こし、光学分解能の上昇に寄与して
いる。それにより、蛍光信号が同一レベルであるとすれ
ば、試料点当りの平均出力を下げることができるので、
検査試料にかかる負荷が小さくなる。

【０１２５】さらに、現状技術との比較においてレーザ
の初期出力が同じとすれば、より多くの試料点が同時検
査できることになる。あるいは試料点が同数であるとす
れば、より低い初期出力のレーザが使用できることにな
る。従って本発明に基づく方法は、試料への非線形相互
作用を必要とする応用領域には特に適している。これに
よれば、励起強度を引き下げて、つまり少ない試料損傷
で検査できるからである。

【０１２６】ここに記述した方法の原理は、レーザ光線
をビームスプリッタにより、あるいは同出力の少なくと
も２つの部分光線へひとみ分割することによって分離す
るところにある。その場合部分光線の波面は典型例とし
ては５°以下の角度を成している。続いてｎ本の分割光
線が１つになって干渉性の重畳を起こす。それにより、
設定角に依存して周期性縞パターンが生じる。

【０１２７】ｘ座標（励起）に沿った縞パターンの強度
Ｉ_Ｍは一般には次のように表わされる：

【式２１】Ｉ_０は試料上のレーザ総強度であり、ｎ本の部分光線に
等分に分割されている。θｉ、Φｉは任意に選択した部
分光線についての部分光線間の角度および位相関係であ
る。

【０１２８】光学軸に対して垂直な構造位相シフト（位
相関係Φｉの変化）により、構造の様々な投影画面を得
ることができる。構造化された照明の変調周波数は角度
θｉによって決められる。図２０ＡはＸ／Ｙ平面にある
平らな２つの波面、即ち装置の光学軸に対しθの角度を
成し、互に干渉し合う波長λの部分光線Ｔ１、Ｔ２を示
している。

【０１２９】Ｙ方向でのフォーカシング、例えば円筒レ
ンズＺＬを通して行なう試料平面へのフォーカシングに
よって、試料上Ｘに沿った、回折制限のある、周期性で
線状の強度分布が現われる。試料上でのＸに沿った線状
強度分布は、そのほか、現状技術（文献：「回折光学系
による製品設計の改良」フォトニクス・スペクトラ、Ｌ
ａｕｒｉｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社１９９５年９月刊）
に基づく回折素子またはホログラフィック素子によって
行なうことができる。

【０１３０】さらには、ＵＳ４，８２６，２９９に記載
されているような、いわゆるパウエルレンズも使用でき
る。当素子は円筒レンズに比較してレンズに沿った方向
に、より均等な強度分布をもたらす。パウエルレンズお
よび回折素子、ホログラフック素子は、この目的には例
えば顕微鏡装置のひとみ平面に、特に光源とスキャナの
間に配置するのが好ましい。

【０１３１】それぞれ平坦な波面を持つ同強度（総強度
Ｉ_０）の２つの部分光線が干渉下で全般的に重なり合っ
た場合、光学軸に垂直な方向に下記の強度変調が発生す
る：

【式２２】但し、k=2π/λ （１） θは両部分光線の両波面間の角度である。λおよびφは
それぞれ部分光線の波長、変調周波数ｐの位相位置であ
る。

【０１３２】角度θの変更によって、変調周期を照準通
り調整でき、光学切断面の厚さを変更することもできる
（ずっと上の前出箇所参照）。さらに、使用波長に依存
して変調周波数が変化し、既述の周波数コーディングを
行なうことができる。変調周波数の位相は両部分光線間
の位相関係φによって決められる。上記に基づきφを変
更することによって、画像位相の調整および位相コーデ
ィングを行なうことができる。

【０１３３】試料との線形相互作用（1光子相互作用）
の結果としての強度変調を描いたのが図２０Ｂ（１）で
ある。グラフではそれぞれ走査線（ｘ座標）に沿った強
度が記されている。但し、その場合他条件は考慮されず
Ｉ_０＝１と仮定されている。変調は周期ｐの余弦曲線状
であり、対称軸１を中心に０〜２の往復運動を行なう。

【０１３４】以下では、試料との非線形相互作用（多光
子励起、高調波の生成）における信号得量の増加につい
て２つの部分光線の干渉性重畳を手掛かりにより詳しく
説明する。試料との非線形相互作用が起これば、検出器
により相互作用から生じる次の信号Ｓ_Ｎが測定される：

【式２３】但し、Ｎは非線性の序列数である。この等式から得られ
る走査線に沿った信号Ｓ_Ｎは、図２０Ｂ（２）では試料
との平方相互作用Ｎ＝２（例えば２光子励起）について
描かれている。但し、そこでは他条件は考慮されずＩ_０
＝１と仮定されている。

【０１３５】そのほか、変調について言えば、周期ｐを
持ち周期性であるが、この場合、非対称で０〜４を往復
運動している。それはＣＯＳ^２（ｘ）が１に対して非対
称だからである。この非対称の程度はＮが大きくなると
強まる。

【０１３６】強度変調の周期毎に発生する信号Ｓ_Ｎはｘ
方向における信号Ｓ_Ｎ（ｘ）の積分によって得られる：

【式２４】

【０１３７】それに対して、ｘ方向で走査線に沿って均
一分布する光強度の場合では試料との相互作用は次式で
表わされる：

【式２５】

【０１３８】図２１は構造化走査線使用時における試料
との相互作用を、均質走査線との比較で再度一般的に表
わしたものである。但し、両ラインの強度は同じとす
る。図では比Ｓ_Ｎ／Ｆ_Ｎが非線性序列数Ｎの関数で描か
れている。それより分かるように、Ｎ＞１の場合、即ち
試料との非線形相互作用の場合この比は１より大きくな
る。

【０１３９】これが意味するところは、平均励起強度Ｉ
_０を一定とすると、変調ラインの使用によって対試料相
互作用の効果は均質走査線の時より高まるということで
ある。その効果は、例えば２光子相互作用の場合では
１．５ポイント大きくなる。

【０１４０】図２２は２つの部分光線を生成するための
各種構成を図示したものである。それぞれ対象物光路が
示されている。ここでは部分光線の生成法が、顕微鏡ひ
とみの分割による場合（部分画像ＡおよびＢ）とビーム
スプリッタ使用の場合（部分画像Ｃ）とに区別される。
２つの部分光線への分割は顕微鏡の１ひとみ平面である
顕微鏡装置のｘｚ平面、即ち走査線の生成される平面で
行なわれる。

【０１４１】ひとみの分割は、特に広いスペクトル領域
に亘って複数波長を使用する場合には得策である。両部
分光線へのエネルギー分布は波長に依存しているからで
ある。但し、光源の光線特性が均質でない場合には不都
合が起こる。そのような場合走査線に沿った変調深度が
装置ＡおよびＢでは不均一になることがある。装置Ｃで
はそれは避けられる。しかし当装置の場合ビームスプリ
ッタのスペクトル特性への要求が高まる。一般には、例
えば回折素子の使用により、および部分画像Ａ、Ｂまた
はＣ用別装置の組み合わせによって光線特性の適合化が
可能である。

【０１４２】部分画像Ａには、視準化光線束を生成する
光源ＬＱがフレネル・バイプリズムＦＢＰを通じて送り
込まれる。円筒レンズＺＬはＦＢＰの後にあって、図平
面および光学軸に垂直な平面で作用する。ＺＬは図２２
Ｄに描かれているように、ＦＢＰの前であっても制限な
く設置できる。バイプリズムによって、視準化された光
源光線が典型的には５°以下の角度θを持つ同エネルギ
ーの２つの部分光線に分割される。

【０１４３】両部分光線は顕微鏡装置の中間画像ＺＢで
交差する。ｘｙ平面には、円筒光学系ＺＬによって形成
されたｘ方向沿いのラインが中間画像に存在する。図で
は例えば、光源ＬＱの光を中間画像ＺＢにフォーカシン
グする円筒光学系ＺＬが描かれている。例えばＺＬは、
中間画像から丁度焦点距離分離れた位置に設置される。

【０１４４】部分光線は顕微鏡装置の後続光学系（図
９、１０、１１、１２および２３参照）に誘導され、ス
キャナＸおよびＹ、走査光学系ＳＯ、鏡胴レンズＴＬお
よび対物レンズＯを経由して試料に到達する。試料では
両部分光線が干渉重畳し、ｘ軸に沿った周期的構造化特
性を持つ走査線を形成する。走査線の周期はＦＢＰ（図
２２Ａ参照）の傾斜角度θおよびＬＱの波長に依存す
る。図２２Ａでは旋回点ＤＰを中心とするＦＢＰの回転
によって画像位相、即ちφを照準通り調整することがで
きる。

【０１４５】顕微鏡装置、位相画像生成法および断面画
像算定の詳細については既に説明した通りである。Ａ法
の利点は、ＦＢＰおよびＺＬを顕微鏡光路へ組み込むこ
とによって、点走査型レーザスキャニング顕微鏡をリア
ルタイム同時平行走査顕微鏡へと非常に有利な形に構成
し直せることである。また、変調周波数はＦＢＰのプリ
ズム作用を通して入射した光の波長に強く依存してい
る。このことは特に周波数コーディング（ずっと上の前
出箇所参照）にとっては有利である。

【０１４６】しかしＦＢＰのプリズム作用は、１００ｆ
ｓ以下のパルス長を持つ短パルスレーザの使用にとって
は問題である。それは、レーザパルスの個々のスペクト
ル成分が試料の様々な部分で結像し、その結果パルスの
分散、延いてはパルス出力の低下に繋がりかねないから
である。

【０１４７】そこで、別な有利な装置として示したのが
図２２Ｂ型のものである。この場合分割は、例えは縁カ
バー付きミラーＤＫＳのような反射性素子で行なわれ
る。ＤＫＳは光源モジュール（図９、１０、１１、１２
および２３参照）内で、同エネルギーの部分光線がｘｚ
平面内ＺＢにおいて角度θで交差するように配置され
る。ＺＬはｙｚ平面上にもＬＱをフォーカシングするの
で、ＺＢにラインが形成される。

【０１４８】両ミラーＭ１およびＭ２間の角度を、例え
ば圧電調整器で、あるいはＭ２またはＭ１を押し付ける
スピンドルで変えることにより、両部分光線、延いては
変調周波数間の角度θを照準通り調整することができ
る。加えて、ＤＫＳを図示された旋回軸ＤＰ中心に回転
させることにより画像位相φの調整を行うこともでき
る。光学切断面の記録および算定は既述の方法に準じて
行なう。

【０１４９】部分画像Ｃ用の装置では、ビームスプリッ
タＢＳとしての部分透過平板鏡により同エネルギーの２
つの部分光線が生成される。これについては、例えばＤ
Ｅ１９９０４５９２Ａ１にも記述があるが、しかしここ
での場合、線状強度分布構成のための素子、例えば走査
線生成用円筒レンズＺＬとの共同作用で行なえるのが有
利である。

【０１５０】続いて、部分光線は２つのミラーＭ１およ
びＭ２によりＺＢ方向に向けられ、ｘｚ平面上丁度ＺＢ
で交差する。また、ＺＬは光線をｙｚ平面にフォーカシ
ングするので、ＺＢにはｘに沿ったラインが発生する。
角度θはＢＳの回転によって調整することができる。画
像位相φの調整はＭ１またはＭ２の単独シフトにより、
あるいは距離一定のままでＭ１およびＭ２の共同シフト
により行なうことができる。光学切断面の記録および算
定は上記と同様に行なう。

【０１５１】顕微鏡装置全体については、特に、既述の
部分光線干渉用装置を含めたレーザ走査型顕微鏡装置の
全体については、対応の光源モジュールを含む既述の装
置（例えば図９、１９、２３）が参考になる。

【図面の簡単な説明】

【図１】色素分子の励起、Ａ）１光子吸収、Ｂ）２光子
吸収

【図２】現状技術のレーザ走査型顕微鏡

【図３】現状技術の構造化照明

【図４】測定経過の図式

【図５】走査フィールドの様様な色素

【図６】従来の光学切断面の形成

【図７】Ａ）位相コーディングの実行装置、Ｂ）その位
相コーディング、Ｃ)変調周波数の波長別調整装置、
Ｄ）周波数に直線的に依存する構造形態例

【図８】走査フィールド内のラインフォーカスの図式化

【図９】顕微鏡装置のひとみ光路(破線)と対象物光路
(実線)

【図１０】Ａ）ＸＺ平面において可能な図式構造、Ｂ)
ＸＺ平面に一スキャナ（Ｙ）だけを持つ簡略型装置

【図１１】透過格子が顕微鏡装置のひとみ平面に配置さ
れる光学図式

【図１２】別の分散素子（ＰＲ）をスペクトル分割のた
めに照明光線に垂直に設置したマルチスペクトル・ライ
ンスキャナおよび検出パターン

【図１３】ライン検出器を持つ信号検出用電子機器の構
造

【図１４】３ラインを使用した縞柄画像の検出装置

【図１５】図１４のＹＺ平面の光学構造

【図１６】ビームスプリッタ装置（Ｔ）の２構造形態

【図１７】平行な複数励起線の生成

【図１８】マルチスペクトル・ラインスキャナと構造化
照明との組合せ

【図１９】構造（ＳＴ）を、スキャナｘおよびｙよりも
試料側にある中間画像平面の位置で使用する例

【図２０】試料との線形相互作用（1光子相互作用）の
結果としての強度変調

【図２１】構造化走査線使用時における試料との相互作
用を、均質走査線との比較で表わしたグラフ

【図２２】２つの部分光線を生成するための各種構成

【符号の説明】

ＬＳＭレーザ走査型顕微鏡Ｌ光源Ｓ走査モジュールＤＥ検出ユニットＭ顕微鏡ＺＢ中間画像平面ＰＯ結像光学系ＴＬ鏡胴レンズＰＭＴ点像検出器Ｏ対物レンズＰＲ試料ＭＤＢダイクロイック・ビームスプリッタＺＬ円筒レンズＰＨピンホール光学系ＰＭＴ点像検出器

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ラルフヴォレシェンスキードイツ国 99510 シェッテンプロムナーデ３ (72)発明者ミケールケンぺドイツ国 07751 クーニッツメンヒェンベルゲ８Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA16 CA03 EA01 FA02 FA06 HA01 HA02 HA05 HA09 KA09 LA02 NA01 2H052 AA07 AA08 AA09 AC04 AC10 AC15 AC16 AC27 AC34 AF02 AF25

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】照明光が少なくとも一空間方向に変調を示
し、走査動作および当走査動作に組み込まれた検出が、
変調における少なくとも第１および第２の異なった位相
位置において行われ、および／または変調における第１
または第２の周期性周波数において行なわれ、試料／試
料の１部から少なくとも１つの光学切断像が算定される
という、試料全体または少なくとも試料の１部に対し
て、試料上または試料中に分布した少なくとも１波長の
照明光を走査動作させて行なう、試料の深部分解による
光学的把握方法および特に試料との相互作用により影響
を受けた光、特に蛍光および／または反射光および／ま
たはルミネセンス光および／または散乱光および／また
は透過光の検出方法。
【請求項２】変調が少なくとも１次元空間での周期性構
造の印加によって行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】光分布の結像が試料上になされる、請求項
１または２に記載の方法。
【請求項４】切断像が画像形態で描かれる、先行請求項
の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項５】周期性構造を光学的に結像させる、先行請
求項の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項６】少なくとも１つの試料干渉パターンが印加
される、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項７】構造の複数周波数および複数位相位置を同
時に試料に結像させる、先行請求項の少なくとも１項に
記載の方法。
【請求項８】構造の複数周波数および／または複数位相
位置を試料に逐次結像させる、先行請求項の少なくとも
１項に記載の方法。
【請求項９】照明が、狭い方向では回折制限される程度
の広がりを示し、それに直角な別な方向ではその何倍も
の広がりを示す、少なくとも１つの線状光分布によって
行なわれる、先行請求項の少なくとも１項に記載の方
法。
【請求項１０】走査が、走査動作により点状に行なわれ
る、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項１１】走査フィールド内でラインパターンの、
および／または少なくとも１次元または２次元点パター
ンの走査動作が行なわれる、先行請求項の少なくとも１
項に記載の方法。
【請求項１２】走査ラインパターンおよび／または点パ
ターンから成る合成画像が作製される、請求項１１に記
載の方法。
【請求項１３】ラインパターンおよび／または点パター
ンに等距離ラスタが使用される、請求項１１または１２
に記載の方法。
【請求項１４】照明光が複数の波長を含んでいる、先行
請求項の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項１５】ｎ種波長の場合に少なくともｎ＋１の構
造体位相位置が検出される、先行請求項の少なくとも１
項に記載の方法。
【請求項１６】コーディング値の設定のため、各波長毎
に位相および／または周波数が様々に調整される、先行
請求項の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項１７】照明光について波長別に位相コーディン
グおよび／または周波数コーディングが行なわれ、それ
ぞれ波長毎にコーディングによって光学切断像が算定さ
れる、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項１８】走査過程が複数波長を持つ１ラインによ
って行なわれる、先行請求項の少なくとも１項に記載の
方法。
【請求項１９】走査過程が複数ラインによって同時に行
なわれる、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項２０】単１または複数の波長によって照明され
る、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】画像位相（ψ_ｉ）を有す位相画像（Ｉ_ｊ
（ｘ））の算定では、励起波長（φ_ｊ）の位相コーディ
ングにより、それぞれｊ番目の波長に特有な、準共焦点
切断（Ｃ_ｊ）および背景（Ｂ_ｊ）についての画像情報を
含む画像が次式のように算定される、先行請求項の少な
くとも１項に記載の方法。【式１】【式２】ここで Cu(X)=cos(k・x＋φj＋ψｉ)-cos(k・x＋φj) とする。
【請求項２２】その周期が周期性方向（Ｘ）に垂直な少
なくとも１つの空間方向（Ｙ）で変化するという周期性
構造が使用される、先行請求項の少なくとも１項に記載
の方法。
【請求項２３】照明光をスペクトル成分に分離し、再度
合一化させる分散ユニットおよびスペクトル成分の焦平
面への結像のための結像光学系を有し、焦平面内または
その付近に照明光の波長別影響を与えるための周期性構
造体が設置されている光学装置が使用される、先行請求
項の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項２４】構造化照明の使用下での光学切断像の作
製が、様々な変調周波数および／または画像位相を持つ
個別画像の記録によって行なわれる、先行請求項の少な
くとも１項に記載の方法。
【請求項２５】変調周波数の変更によって光学切断の厚
さが変えられる、先行請求項の少なくとも１項に記載の
方法。
【請求項２６】様々な波長および／またはラインフォー
カスの同時結像における位相コーディングが共通の検出
器で行なわれる、先行請求項の少なくとも１項に記載の
方法。
【請求項２７】様々な波長および／またはラインフォー
カスの同時結像における周波数コーディングが共通の検
出器で行なわれる、先行請求項の少なくとも１項に記載
の方法。
【請求項２８】複数の波長を試料に同時結像させる、先
行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項２９】結像が離れた位置に、または試料上共通
な１つの位置になされる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】１波長を試料に結像させる、先行請求項
の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項３１】結像が離れた複数の位置に、または試料
の１つの位置になされる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】試料上の光の分布が線状または点状であ
る、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項３３】個別画像が逐次記録される、先行請求項
の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項３４】複数の線状および／または点状の光分布
状態が生成される、先行請求項の少なくとも１項に記載
の方法。
【請求項３５】個別画像が平行に記録される、先行請求
項の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項３６】複数波長の場合に、それぞれ変調周波数
の変更によって切断の厚さが好ましくも同一に設定され
る、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項３７】検出が点像検出器および／またはライン
検出器および／またはマトリクス検出器によって行なわ
れる、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項３８】波長別の位相コーディングが、波長別平
行シフトの実行装置により周期性構造に沿って行なわれ
る、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項３９】波長別位相コーディングが中間画像での
傾倒プレートによって行なわれる、先行請求項の少なく
とも１項に記載の方法。
【請求項４０】波長別位相コーディングが分散素子によ
って行なわれる、先行請求項の少なくとも１項に記載の
方法。
【請求項４１】波長別位相コーディングが、照明光をス
ペクトル成分に分離し、再度合一化させる分散ユニット
およびスペクトル成分の焦平面への結像のための結像光
学系を有し、焦平面内またはその付近に照明光の波長別
影響を与えるための周期性構造体が設置されていて、当
構造体が光学軸の周りを回転できるという光学装置によ
って行なわれる、先行請求項の少なくとも１項に記載の
方法。
【請求項４２】スペクトル分割が中間画像で行なわれ
る、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】複数波長の周波数コーディングが、照明
光をスペクトル成分に分離し、再度合一化させる分散ユ
ニットおよびスペクトル成分の焦平面への結像のための
結像光学系を有し、焦平面内またはその付近に照明光の
波長別影響を与えるための−その周期が周期性方向
（Ｘ）に垂直な少なくとも１つの空間方向（Ｙ）で変化
する−周期性構造体が設置されている光学装置によって
行なわれる、先行請求項の少なくとも１項に記載の方
法。
【請求項４４】複数波長の周波数コーディングが、結像
倍率の波長別変更によって行なわれる、先行請求項の少
なくとも１項に記載の方法。
【請求項４５】複数波長の周波数コーディングが、照明
光をスペクトル成分に分離し、再度合一化させる分散ユ
ニットおよびスペクトル成分の焦平面への結像のための
結像光学系を有し、焦平面内またはその付近に照明光の
波長別影響を与えるための−様々な周期性を持つ複数部
分から合成された−周期性構造体が設置されている光学
装置によって行なわれる、先行請求項の少なくとも１項
に記載の方法。
【請求項４６】個別画像の逐次記録が画像位相の変更下
で行なわれる、先行請求項の少なくとも１項に記載の方
法。
【請求項４７】周期性構造が光学軸に垂直にシフトされ
る、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】個別画像の逐次記録が、スキャナの位置
移動による画像位相の変更下で行われる、先行請求項の
少なくとも１項に記載の方法。
【請求項４９】個別画像の逐次記録が、平面平行プレー
トの傾倒による画像位相の変更下で行われる、先行請求
項の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項５０】個別画像の逐次記録が、それぞれ変調周
波数の変更下で行なわれる、先行請求項の少なくとも１
項に記載の方法。
【請求項５１】個別画像の逐次記録が、それぞれ結像倍
率の波長別変更による変調周波数の変更下で行なわれ
る、先行請求項の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項５２】個別画像の逐次記録が、それぞれ異なっ
た周期性を持つ様々な構造体の転向による変調周波数の
変更下で行なわれる、先行請求項の少なくとも１項に記
載の方法。
【請求項５３】個別画像の逐次記録が、それぞれその周
期が周期性方向（Ｘ）にほぼ垂直な少なくとも１つの空
間方向（Ｙ）で変化する周期性構造体をその周期性に対
して直角にシフトすることによる変調周波数の変更下で
行なわれる、先行請求項の少なくとも１項に記載の方
法。
【請求項５４】複数の光分布が試料上に形成され、個別
画像が同時平行的に記録される、先行請求項の少なくと
も１項に記載の方法。
【請求項５５】特に、少なくとも１つの完全ミラーと１
つの部分透過ミラーとから成るビームスプリッタによる
照明光の複数部分光線への分離によって、または少なくとも１つのミラーとビームスプリッタとし
て機能する１つの反射性周期性構造体とによる照明光の
複数部分光線への分離によって、１波長において試料上
に複数の光分布が形成される、請求項５４に記載の方
法。
【請求項５６】特に、１つの分散素子による照明光の複
数部分光線への分離によって、または少なくとも１つの完全ミラーと１つの部分透過ミ
ラーとから成るビームスプリッタによる照明光の複数部
分光線への分離によって、または少なくとも１つのミラーとビームスプリッタとし
て機能する１つの反射性周期性構造体とによる照明光の
複数部分光線への分離によって、複数波長において試料上に複数の光分布が形成される、
請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】個別画像の平行記録が照明の様々な位相
位置において行なわれる、先行請求項の少なくとも１項
に記載の方法。
【請求項５８】複数波長において、特に、好ましくは中間画像に配置された分散素子および
光学軸の周りを回転できる周期性構造体を持つ装置によ
って、および／または、好ましくは中間画像に配置された分散
素子および異なった周期性を持つ複数部分から成る周期
性構造体を持つ装置によって、および／または分散素子および反射性のあるビームスプ
リッタとして機能する周期性構造体を持つ装置によって
行なわれる、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】１波長において、特に、少なくとも１つの完全ミラーと１つの部分透過ミ
ラーとから成るビームスプリッタによる照明光の複数部
分光線への分離によって、または少なくとも１つのミラーとビームスプリッタとし
て機能して光学軸の周りを回転できる１つの反射性周期
性構造体とによる照明光の複数部分光線への分離によっ
て、または少なくとも１つのミラーと多数の部分から成りビ
ームスプリッタとして機能する１つの反射性周期性構造
体とによる照明光の複数部分光線への分離によって行な
われる、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】異なった変調周波数により同時平行記録
が行なわれる、先行請求項の少なくとも１項に記載の方
法。
【請求項６１】複数波長において、分散素子およびその
周期が、周期性方向（Ｘ）にほぼ垂直な少なくとも１つ
の空間方向（Ｙ）で変化する周期性構造体を持つ装置に
より、または好ましくは中間画像に配置された分散素子
および異なった周期性を持つ複数部分から成る周期性構
造体を持つ装置により行なわれる、請求項６０に記載の
方法。
【請求項６２】１波長において、特に、少なくとも１つ
の完全ミラーと１つの部分透過ミラーとから成るビーム
スプリッタＡＯによる照明光の複数部分光線への分離に
よって、または少なくとも１つのミラーとその周期が周期性方向
（Ｘ）にほぼ垂直な少なくとも１つの空間方向（Ｙ）で
変化する周期性構造を持つ１つの反射性周期性構造体と
による照明光の複数部分光線への分離によって、または少なくとも１つのミラーと異なった周期性を持つ
複数部分から成る１つの反射性周期性構造体とによる照
明光の複数部分光線への分離によって行なわれる、請求
項６０に記載の方法。
【請求項６３】少なくとも１つの波長による試料照明手
段と、試料と照明光間の相対運動生成手段と、試料の影響を受けた光を少なくとも１つの検出器へ結像
させるための手段と、少なくとも１次元空間において様々な位相および／また
は周波数で周期的に変化する周期性構造を試料に結像さ
せるための手段と試料の影響を受けた光に関する位置情
報から少なくとも１つの光学切断像を算定するための手
段とを有する、深部分解による試料の、特に試料との相
互作用により影響を受けた照明分布光、なかでも特に蛍
光および／または反射光および／またはルミネセンス光
および／または散乱光および／または透過光の光学的把
握のための装置。
【請求項６４】切断像を画像形態で表示する手段が備わ
っている、先行請求項の少なくとも１項に記載の装置。
【請求項６５】少なくとも１つの干渉パターンを結像さ
せるための手段が備わっている、先行請求項の少なくと
も１項に記載の装置。
【請求項６６】照明が、狭い方向では回折制限される程
度の広がりを、それに直角な別な方向ではその何倍もの
広がりを示す、少なくとも１つの線状光分布によって行
なわれる、先行請求項の少なくとも１項に記載の装置。
【請求項６７】走査が走査動作により点状に行なわれ
る、先行請求項の少なくとも１項に記載の装置。
【請求項６８】走査フィールド内でラインパターンの、
および／または少なくとも１次元または２次元点パター
ンの走査動作が行なわれる、先行請求項の少なくとも１
項に記載の装置。
【請求項６９】走査ラインパターンおよび／または点パ
ターンから成る合成画像を作製する、先行請求項の少な
くとも１項に記載の装置。
【請求項７０】ラインパターンおよび／または点パター
ンに等距離ラスタが使用される、先行請求項の少なくと
も１項に記載の装置。
【請求項７１】照明光が複数の波長を含んでいる、先行
請求項の少なくとも１項に記載の装置。
【請求項７２】走査過程が複数波長を持つ１ラインによ
って行なわれる、先行請求項の少なくとも１項に記載の
装置。
【請求項７３】走査過程を複数ラインによって同時に行
なう、先行請求項の少なくとも１項に記載の装置。
【請求項７４】単一または複数の波長によって走査を行
なう、先行請求項の少なくとも１項に記載の装置。
【請求項７５】その周期が周期性方向（Ｘ）に垂直な少
なくとも１つの空間方向（Ｙ）で変化する周期性構造体
が設置されている、先行請求項の１項に記載の装置。
【請求項７６】照明光をスペクトル成分に分離し、再度
合一化させる分散ユニットおよびスペクトル成分の焦平
面への結像のための結像光学系を持ち、焦平面内または
その付近に照明光の波長別影響を与えるための周期性構
造体が設置されている光学装置の配備された先行請求項
の１項に記載の装置。
【請求項７７】分散分離を中間画像平面で行なう、請求
項７６に記載の装置。
【請求項７８】様々な波長および／またはラインパター
ンの同時結像における位相コーディングを共通の検出器
で行なう、先行請求項の１項に記載の装置。
【請求項７９】様々な波長および／またはラインフォー
カスの同時結像における周波数コーディングを共通の検
出器で行なう、先行請求項の１項に記載の装置。
【請求項８０】複数の波長を試料に同時結像させる、先
行請求項の１項に記載の装置。
【請求項８１】結像を離れた位置で、または試料上共通
な１つの位置で行なう、先行請求項の１項に記載の装
置。
【請求項８２】１波長を試料に結像させる、先行請求項
の１項に記載の装置。
【請求項８３】結像を離れた複数の位置で、または試料
の１つの位置で行なう、先行請求項の１項に記載の装
置。
【請求項８４】試料上の光の分布が線状または点状にな
る、先行請求項の１項に記載の装置。
【請求項８５】個別画像の逐次記録を行なう、先行請求
項の１項に記載の装置。
【請求項８６】複数の線状および／または点状の光分布
状態を作成する、先行請求項の１項に記載の装置。
【請求項８７】個別画像の同時平行記録を行なう、先行
請求項の１項に記載の装置。
【請求項８８】検出を点像検出器および／またはライン
検出器および／またはマトリクス検出器によって行な
う、先行請求項の１項に記載の装置。
【請求項８９】波長別の位相コーディングのための、先
行請求項の１項に記載の装置。
【請求項９０】周期性構造に沿って行なう波長別平行シ
フトのための、請求項８９に記載の装置。
【請求項９１】中間画像に傾倒平板プレートの設置され
た、請求項９０に記載の装置。
【請求項９２】周期性方向にある分散素子が結像ひとみ
に置かれている、請求項９０に記載の装置。
【請求項９３】照明光をスペクトル成分に分離し、再度
合一化させる分散ユニットおよびスペクトル成分の焦平
面への結像のための結像光学系を有し、焦平面内または
その付近に照明光の波長別影響を与えるために、光学軸
の周りを回転できる周期性構造体が設置されている光学
装置を持つ位相コーディング用装置。
【請求項９４】スペクトル分割を中間画像で行なう、請
求項９３に記載の装置。
【請求項９５】照明光をスペクトル成分に分離し、再度
合一化させる分散ユニットおよびスペクトル成分の焦平
面への結像のための結像光学系を有し、焦平面内または
その付近に照明光の波長別影響を与えるための−その周
期が周期性方向（Ｘ）に垂直な少なくとも１つの空間方
向（Ｙ）で変化する−周期性構造体が設置されている光
学装置の配備された、複数波長の周波数コーディングの
ための、先行請求項の１項に記載の装置。
【請求項９６】結像倍率の波長別変更を伴う複数波長の
周波数コーディングのための、先行請求項の１項に記載
の装置。
【請求項９７】照明光をスペクトル成分に分離し、再度
合一化させる分散ユニットおよびスペクトル成分の焦平
面への結像のための結像光学系を有し、焦平面内または
その付近に照明光の波長別影響を与えるための−様々な
周期性を持つ複数部分から合成された−周期性構造体が
設置されている光学装置の配備された、複数波長の周波
数コーディングのための、先行請求項の１項に記載の装
置。
【請求項９８】光学軸に垂直な構造体（ＰＥ）シフトの
もと、画像位相の変更下で使用される、個別画像の逐次
記録のための、先行請求項の１項に記載の装置。
【請求項９９】スキャナの位置移動による画像位相の変
更下で行われる個別画像の逐次記録のための、先行請求
項の１項に記載の装置。
【請求項１００】平面平行プレートの傾倒による画像位
相の変更下で行われる個別画像の逐次記録のための、先
行請求項の１項に記載の装置。
【請求項１０１】結像倍率の波長別変更手段による変調
周波数の変更下で行なわれる個別画像逐次記録のため
の、先行請求項の１項に記載の装置。
【請求項１０２】異なった周期性を持つ様々な格子の転
向による変調周波数の変更下で行なわれる個別画像逐次
記録のための、先行請求項の１項に記載の装置。
【請求項１０３】その周期が周期性方向（Ｘ）にほぼ垂
直な少なくとも１つの空間方向（Ｙ）で変化する周期性
構造体を、その周期性に対して直角にシフトすることに
よる変調周波数の変更下で行なう個別画像の逐次記録の
ための、先行請求項の１項に記載の装置。
【請求項１０４】複数の光分布を試料上に形成して個別
画像を同時平行的に記録するための、先行請求項の１項
に記載の装置。
【請求項１０５】特に、少なくとも１つの完全ミラーと
１つの部分透過ミラーとから成るビームスプリッタによ
る照明光の複数部分光線への分離のもとで、およびまたは少なくとも１つのミラーとビームスプリッ
タとして機能する１つの反射性周期性構造体とによる照
明光の複数部分光線への分離のもとで、１波長において試料上に複数の光分布を形成して、個別
画像を同時平行に記録するための、先行請求項の１項に
記載の装置。
【請求項１０６】特に、１つの分散素子による照明光の
複数部分光線への分離のもとで、および／または少なくとも１つの完全ミラーと１つの部
分透過ミラーとから成るビームスプリッタによる照明光
の複数部分光線への分離のもとで、または少なくとも１つのミラーとビームスプリッタとし
て機能する１つの反射性周期性構造体とによる照明光の
複数部分光線への分離のもとで、複数波長において試料上に複数の光分布を形成して、個
別画像を同時平行に記録するための、先行請求項の１項
に記載の装置。
【請求項１０７】個別画像の平行記録を照明の様々な位
相位置において行なう、先行請求項の１項に記載の装
置。
【請求項１０８】複数波長において、特に、好ましくは中間画像に配置された分散素子および
光学軸の周りを回転できる周期性構造体を持つ装置の配
備された、および／または分散素子および異なった周期性を持つ複
数部分から成る周期性構造体を持つ装置の配備された、および／または分散素子および反射性のあるビームスプ
リッタとして機能する周期性構造体を持つ装置の配備さ
れた照明の様々な位相位置において個別画像を同時平行
的に記録するための、先行請求項の１項に記載の装置。
【請求項１０９】１波長において、特に、少なくとも１つの完全ミラーと１つの部分透過ミ
ラーとから成るビームスプリッタ装置による照明光の複
数部分光線への分離のもとで、および／または少なくとも１つのミラーと光学軸の周り
を回転できる１つの反射性周期性構造体とによる照明光
の複数部分光線への分離のもとで、および／または少なくとも１つの完全ミラーと１つの部
分透過ミラーとから成るビームスプリッタＡＯによる照
明光の複数部分光線への分離のもとで、または少なくとも１つのミラーと複数部分から合成され
ている１つの反射性周期性構造体とによる照明光の複数
部分光線への分離のもとで行なわれる、照明の様々な位相位置における個別画像の同時平行記録
のための、先行請求項の１項に記載の装置。
【請求項１１０】異なった変調周波数によって同時平行
記録を行なうための、先行請求項の１項に記載の装置。
【請求項１１１】特に、分散素子およびその周期が周期
性方向（Ｘ）にほぼ垂直な少なくとも１つの空間方向
（Ｙ）で変化する周期性構造体を持つ、および／または好ましくは中間画像に配置された分散素
子および異なった周期性を持つ複数部分から成る周期性
構造体を持つ、複数波長において様々な変調周波数により行なう同時平
行記録のための、先行請求項の１項に記載の装置。
【請求項１１２】特に、少なくとも１つの完全ミラーと
１つの部分透過ミラーとから成るビームスプリッタＡＯ
による照明光の複数部分光線への分離のもとで、および／または少なくとも１つのミラーとビームスプリ
ッタとして機能する１つの反射性周期性構造体とによる
照明光の複数部分光線への分離のもとで、および／またはその周期が周期性方向（Ｘ）にほぼ垂直
な少なくとも１つの空間方向（Ｙ）で変化する周期性構
造体による照明光の複数部分光線への分離のもとで、および／または少なくとも１つの完全ミラーと１つの部
分透過ミラーとから成るビームスプリッタＡＯによる照
明光の複数部分光線への分離のもとで、または少なくとも１つのミラーとビームスプリッタとし
て機能する、異なった周期性を持つ複数部分から成る１
つの反射性周期性構造体とによる照明光の複数部分光線
への分離のもとで、１波長において様々な変調周波数により行なう同時平行
記録のための、先行請求項の１項に記載の装置。
【請求項１１３】検出装置の前に少なくとも１つの分散
素子が設置されている、先行請求項の少なくとも１項に
記載の装置。
【請求項１１４】顕微鏡、なかでもレーザ走査型顕微鏡
に設置される、先行請求項の少なくとも１項に記載の装
置。
【請求項１１５】− 光線が少なくとも２つの部分光線
に分割される − 部分光線が干渉重合して、１ラインとして検査試料
へ結像する − 生成後、周期性構造体により変調された走査線で試
料上を走査する − 様々な構造体位相位置を持つ画像がライン描出さ
れ、共焦点切断像が算定されるという条件のもと、複数試料点における試料との光学的相互作用を励起する
ための、先行請求項の少なくとも１項に記載の装置。
【請求項１１６】部分光線がひとみ分割によって生成さ
れる、先行請求項の１項に記載の装置。
【請求項１１７】部分光線がフレネル・バイプリズムに
よって生成される、先行請求項の１項に記載の装置。
【請求項１１８】画像位相の調整がバイプリズムの回転
によって行われる、先行請求項の１項に記載の装置。
【請求項１１９】周波数コーディングのために部分光線
の様々な波長に設定される、先行請求項の１項に記載の
装置。
【請求項１２０】部分光線が縁カバー付きミラーによっ
て生成される、先行請求項の１項に記載の装置。
【請求項１２１】画像位相の調整がミラーの回転によっ
て行なわれる、先行請求項の１項に記載の装置。
【請求項１２２】変調周波数の調整がミラーの角度変更
によって行なわれる、先行請求項の１項に記載の装置。
【請求項１２３】変調周波数の調整がビームスプリッタ
と２つのミラーとの共同作用で行なわれる、先行請求項
の１項に記載の装置。
【請求項１２４】画像位相の調整が少なくとも１つのミ
ラーのスライドによって行なわれる、先行請求項の１項
に記載の装置。
【請求項１２５】変調周波数の調整がビームスプリッタ
の回転によって行なわれる、先行請求項の１項に記載の
装置。
【請求項１２６】変調周波数の調整が少なくとも１つの
ミラーの回転によって行なわれる、先行請求項の１項に
記載の装置。
【請求項１２７】光源として短パルスレーザが使用され
る、先行請求項の１項に記載の装置。
【請求項１２８】強度線状分布形成用の光学素子が、少
なくとも１つの円筒レンズ、またはホログラフィック素
子、または回折素子、またはパウエルレンズから成って
いる、先行請求項の１項に記載の装置。
【請求項１２９】光線が複数の部分光線に分割される − 部分光線が干渉重合して、１ラインとして検査試料
へ結像する − 生成後、周期性構造化された走査線で試料上を走査
する − 様々な構造体位相位置を持つ画像が描出され、共焦
点切断像が算定されることを特徴とする、試料との相互作用を同時平行励起するための方法。
【請求項１３０】試料との相互作用が色素内の多光子吸
収および／または試料内高調波の発生として現われる、
先行請求項の１項に記載の方法。
【請求項１３１】吸収光線の蛍光または高調波が記録さ
れる、先行請求項の１項に記載の方法。
【請求項１３２】照射領域の色素を漂白し、周辺領域か
らの新たな色素流入を検査する（ＦＲＡＰ）、先行請求
項の１項に記載の方法。
【請求項１３３】試料との相互作用が高調波の励起とし
て現われる、先行請求項の１項に記載の方法。
【請求項１３４】検査試料が生物学上の試料である、先
行請求項の１項に記載の方法。