JP2012047502A - 分光画像取得装置及び方法 - Google Patents

Abstract

【課題】
ＥＥＭイメージングを短時間で実施可能な分光画像取得装置及び方法を提供すること。また、装置全体を小型化することが可能な分光画像取得装置を提供すること。
【解決手段】
複数の異なる波長の励起光を試料に照射する励起光照射手段と、該励起光の波長毎に該試料からの蛍光のスペクトル分布を計測する蛍光計測手段とを有する分光画像取得装置において、該励起光照射手段は、空間的に異なる位置に異なる波長の励起光を同時に照射するように構成され、該蛍光計測手段は、前記異なる位置毎に蛍光の光路を分離し、分離された蛍光をスペクトル分光し、スペクトル分光された蛍光の少なくとも一部を、前記異なる位置毎に同時に計測するように構成されていることを特徴とする。
【選択図】図５

Description

本発明は、分光画像取得装置及び方法に関し、特に、試料に複数の異なる波長の励起光を照射し、該励起光の波長毎に該試料からの蛍光のスペクトル分布を計測する分光画像取得装置及び方法に関する。

食料品の安全と品質（成熟度測定、汚れ検知、鮮度検査、生育モニタリング、不純物検査、腐敗度確認）、犯罪科学・法医学（通貨確認、鑑識アシスト）、材料検知、バイオテクノロジー（遺伝子変異確認、培養試験）、メディカルエンジニアリング（癌化細胞識別ｉｐｓ細胞等の識別）、半導体デバイス、リモートセンシングなど、多くの技術分野で利用が期待されている技術に、励起・蛍光マトリックス・イメージング（以下、ＥＥＭイメージングと言う）がある。

これは、特許文献１に示すように、複数の異なる波長の励起光を試料に照射し、該試料から放射される蛍光をスペクトル分析することで、励起光波長と蛍光波長とのマトリックス分布（ＥＥＭ）を、試料の観察部分（画像ピクセル）毎に取得するものである。そして、この励起・蛍光マトリックスを分析することで、試料自体の成分や試料の表面に付着している物質を判別することが可能となる。

従来のＥＥＭイメージングでは、試料への励起光の照射方法として、図１又は図２に示すような干渉フィルタや回折格子を用いる方法が提案されている。図１は、光源から放射される放射光をコリメータレンズで平行光とし、特定波長の光波のみ透過させる干渉フィルタで特定波長を通過させ、照射レンズで試料に照射する。なお、図１の照射方法の場合には、複数の干渉フィルタを配置したターレットを利用することが必要であり、装置自体が大型化する欠点がある。また、波長選択に可動式レンズユニットを利用する場合には、駆動機構など装置自体が複雑化・大型化する。

図２は、図１の波長選択部分を回折格子で置き換えたものである。回折格子の場合は、図１のターレットが不要となる半面、回折格子が分光する光波が空間的に分布するため、可動式レンズユニットが不可欠であり、装置自体の複雑化や大型化を解消することは難しい。

他方、試料からの蛍光を分光計測する方法としては、図３に示すように、試料から放射される蛍光をカメラレンズで結像し、ＣＣＤなどの受光センサが二次元配列された受光素子（エリアセンサ）に投影される。この際、蛍光のスペクトル分光を計測する必要があるため、カメラレンズの試料側又はエリアセンサ側に、干渉フィルタを多数配置したターレットが設けられている。

また、図４に示すように、回折格子を用いた分光計測も可能である。図４では、試料からの蛍光をカメラレンズで集光し、集光した蛍光画像をスリットでライン状に一部を切り出し、スリット部分の蛍光画像のみを、コリメータレンズ、回折格子及び対物レンズを用いて、スリットに垂直な方向にスペクトル分光を展開している。このように２次元的に展開された分光を、エリアセンサを用いて検出している。

図３で示す干渉フィルタを用いる分光計測方法は、図１の照射方法と同様に、装置全体が大型化する欠点がある。また、図４で示す回折格子を用いる分光計測方法は、試料の一部（スリットに対応する領域）しか蛍光観察されておらず、試料をスキャン方向に何度も移動させることが不可欠である。しかも、図３及び４のいずれにおいても、複数の異なる波長の励起光について、蛍光分析を行う必要があり、励起光の種類だけ、分光計測を繰り返す必要がある。このため、干渉フィルタの切替や試料の走査作業に加え、励起光の波長切替など、ＥＥＭイメージングには、極めて多くの計測条件を変更するため、分光計測に長時間を要していた。

特許第３７０６９１４号公報

本発明が解決しようとする課題は、上述したような問題を解決し、ＥＥＭイメージングを短時間で実施可能な分光画像取得装置及び方法を提供することである。また、装置全体を小型化することが可能な分光画像取得装置を提供することである。

上記課題を解決するため、請求項１に係る発明は、複数の異なる波長の励起光を試料に照射する励起光照射手段と、該励起光の波長毎に該試料からの蛍光のスペクトル分布を計測する蛍光計測手段とを有する分光画像取得装置において、該励起光照射手段は、空間的に異なる位置に異なる波長の励起光を同時に照射するように構成され、該蛍光計測手段は、前記異なる位置毎に蛍光の光路を分離し、分離された蛍光をスペクトル分光し、スペクトル分光された蛍光の少なくとも一部を、前記異なる位置毎に同時に計測するように構成されていることを特徴とする。

請求項２に係る発明は、請求項１に記載の分光画像取得装置において、前記異なる位置は、ストライプ状に区分された領域であり、該試料と該励起光の照射位置とは、該ストライプ状の配列方向に相対的に移動するよう構成されていることを特徴とする。

請求項３に係る発明は、請求項１又は２に記載の分光画像取得装置において、該励起光
照射手段は、光源と、該光源からの放射光を分光する、回折格子、プリズム又はフィルタのいずれかと、異なる波長がストライプ状に照射されるように、該放射光又は該分光のいずれかの光路を調整するレンズ又はミラーとを有することを特徴とする。ただし、この場合、光源は広帯域の単一光源、複数の単色光源を集合した光源のいずれでも良い。

請求項４に係る発明は、請求項１乃至３のいずれかに記載の分光画像取得装置において、該蛍光計測手段は、前記異なる位置がストライプ状に区分された領域であり、前記異なる位置毎に蛍光を並列した各スリット状に結像する第１の光学系と、前記スリット状に結像した蛍光を分光する、回折格子、プリズム又はフィルタのいずれかと、該分光を二次元配列の受光素子に結像させる第２の光学系とを有することを特徴とする。

請求項５に係る発明は、請求項４に記載の分光画像取得装置において、該第２の光学系に対して該受光素子を相対的に移動させ、分光された異なる波長を受光素子の同一部分で検知することを特徴とする。

請求項６に係る発明は、請求項４又は５に記載の分光画像取得装置において、該第１の光学系は、走査ミラーを備え、該走査ミラーを動作させることにより、スリット状に結像される該試料の観察位置を変更することを特徴とする。

請求項７に係る発明は、請求項１乃至６のいずれかに記載の分光画像取得装置を用いる分光画像取得方法において、該装置から出力される計測信号を蓄積及び処理し、励起光及び蛍光に係るマトリックス画像を該試料の空間分布として得ることを特徴とする。

請求項１に係る発明により、複数の異なる波長の励起光を試料に照射する励起光照射手段と、該励起光の波長毎に該試料からの蛍光のスペクトル分布を計測する蛍光計測手段とを有する分光画像取得装置において、該励起光照射手段は、空間的に異なる位置に異なる波長の励起光を同時に照射するように構成され、該蛍光計測手段は、前記異なる位置毎に蛍光の光路を分離し、分離された蛍光をスペクトル分光し、スペクトル分光された蛍光の少なくとも一部を、前記異なる位置毎に同時に計測するように構成されているため、同時に複数の励起光に関し、分光計測が可能となり、ＥＥＭを短時間で取得することが可能となる。しかも、試料に対する励起光の照射位置を変更する走査（スキャニング）を一度行うだけで、試料全体のＥＥＭを取得でき、極めて効率的にＥＥＭイメージング作業を行うことができる。

請求項２に係る発明により、前記異なる位置は、ストライプ状に区分された領域であり、該試料と該励起光の照射位置とは、該ストライプ状の配列方向に相対的に移動するよう構成されているため、試料を該配列方向に一度移動させるだけで、試料全体のＥＥＭを容易に取得することが可能となる。

請求項３に係る発明により、励起光照射手段は、光源と、該光源からの放射光を分光する、回折格子、プリズム又はフィルタのいずれかと、異なる波長がストライプ状に照射されるように、該放射光又は該分光のいずれかの光路を調整するレンズ又はミラーとを有するため、試料の異なる位置に異なる波長の励起光を同時に照射することが可能となり、ＥＥＭの取得時間を短縮することが可能となる。

請求項４に係る発明により、蛍光計測手段は、前記異なる位置がストライプ状に区分された領域であり、前記異なる位置毎に蛍光を並列した各スリット状に結像する第１の光学系と、前記スリット状に結像した蛍光を分光する、回折格子、プリズム又はフィルタのいずれかと、該分光を二次元配列の受光素子に結像させる第２の光学系とを有するため、異なる波長の励起光が照射された各々領域について、同時に蛍光分光することが可能であり、短時間でＥＥＭを得ることができる。
しかも、ストライプ状に配列された方向（スリットの幅方向（長手方向に対して垂直な方向））に試料を相対的に一度移動させることにより、試料全体のＥＥＭを得ることも可能である。

請求項５に係る発明により、第２の光学系に対して受光素子を相対的に移動させ、分光された異なる波長を受光素子の同一部分で検知するため、受光素子内の受光センサ（ピクセル）の配置密度が低い場合、特に、スリットの幅方向に密度が低い場合でも、異なる分光スペクトルを精度良く検出することが可能となる。

請求項６に係る発明により、第１の光学系は、走査ミラーを備え、該走査ミラーを動作させることにより、スリット状に結像される該試料の観察位置を変更するため、試料を走査する機構が不要となり、装置全体を簡素化することが可能となる。

請求項７に係る発明により、本発明の分光画像取得装置から出力される計測信号を蓄積及び処理し、励起光及び蛍光に係るマトリックス画像を該試料の空間分布として得ることを特徴とする分光画像取得方法であるため、ＥＥＭを短時間に取得することが可能となると共に、可動部分が限定的であるため装置全体の複雑化や大型化を抑制することも可能となる。

干渉フィルタを用いた従来の励起光照射方法を説明する図である。 回折格子を用いた従来の励起光照射方法を説明する図である。 干渉フィルタを用いた従来の分光計測方法を説明する図である。 回折格子を用いた従来の分光計測方法を説明する図である。 本発明の分光画像取得装置及び方法の概要を説明する図である。 蛍光計測手段における分光機構を説明する図である。 蛍光計測手段の第２の実施例を説明する図である。 図７の蛍光計測手段を用いて異なる蛍光スペクトルを計測する手順を説明する図である。 蛍光計測手段の第３の実施例を説明する図である。

以下、本発明の分光画像取得装置及び方法について、好適例を用いて詳細に説明する。
本発明の分光画像取得装置は、複数の異なる波長の励起光を試料に照射する励起光照射手段と、該励起光の波長毎に該試料からの蛍光のスペクトル分布を計測する蛍光計測手段とを有する分光画像取得装置において、図５に示すように、該励起光照射手段は、空間的に異なる位置に異なる波長の励起光を同時に照射するように構成され、該蛍光計測手段は、前記異なる位置毎に蛍光の光路を分離し、分離された蛍光をスペクトル分光し、スペクトル分光された蛍光の少なくとも一部を、前記異なる位置毎に同時に計測するように構成されていることを特徴とする。

図５に示すように、同時に複数の励起光を異なる位置に照射し、これらの各位置から放射される蛍光を同時に分光計測することが可能となるため、ＥＥＭを短時間で取得することが可能となる。例えば、試料に対する励起光の照射位置を変更する走査（スキャニング）を一度行うだけで、試料全体のＥＥＭを取得でき、極めて効率的にＥＥＭイメージング作業を行うことができる。

また、ＥＥＭイメージングをおこなう場合、特許文献１では、空間的に同じ位置に異なる波長の励起光を経時的に照射するが、本発明は同波長域で空間的に異なる位置をマルチポイントでスキャニングすることを特徴とする。よって、測定時間が飛躍的に短縮される。このように、本発明と特許文献１の方式とでは、測定方式が異なる。

図５での励起光の照射状態は、上述の「異なる位置」が、ストライプ状に区分された領域を表示している。つまり、異なる波長の励起光がストライプ状に領域を分けて照射されている。本発明において、励起光の照射状態はこのようなストライプ状のものに限定されない。例えば、同心円状又はその一部（虹のように円弧が重なった状態、あるいはストライプ部分が円弧を描くもの）、多角形の領域がモザイク状に集まっている状態、あるいはストライプ部分が波状となっているものなど、種々の領域形状を採用することが可能であり、結果として、当該領域形状に集まった励起光を試料全体に走査することで、試料全体から各波長の励起光に関する蛍光スペクトルを得ることができれば、特に、励起光の照射状態は、任意に選択できる。

ただし、ストライプ状に区分された領域を使用する場合には、試料と励起光の照射位置とは、該ストライプ状の配列方向に相対的に移動するよう構成することで、試料を該配列方向に一度移動させるだけで、試料全体のＥＥＭを容易に取得することが可能となる。

励起光照射手段は、励起光の照射状態に依存して、種々の形態が採用可能であるが、基本的に、単一光源を利用する場合には、励起光照射手段の構成を簡素化することが可能となり、好ましい。励起光照射手段の構成する主な部品は、単一の光源と、該光源からの放射光を分光する、回折格子、プリズム又はフィルタのいずれかと、異なる波長の励起光が所定のパターン、例えば、図５のように直線のストライプ状のパターンに照射されるように、該放射光又は該分光のいずれかの光路を調整するレンズ又はミラーとを有している。図５では、光源の放射光をコリメータレンズで平行光とし、回折格子を通じて分離した光を、照射レンズで、異なる波長の励起光が異なる位置に集束しながら照射している。

分光手段としては、回折格子に限らず、プリズムやストライプ状に配置された干渉フィルタ（異なる波長選択性を有する干渉フィルタをストライプ状に配置したもの。ストライプ状に限らず、上述した任意の照射パターンに応じたレイアウトも可能である。）を用いる
ことができる。また、異なる波長毎に励起光の照射領域を明確に区分するため、試料に照射する前に、光路上に各波長に対応する複数のスリットを配置することも可能である。

蛍光計測手段は、異なる位置、例えば、図５のように直線のストライプ状に区分された領域から放射される蛍光を、スペクトル分光し、エリアセンサなどの受光素子で分光計測する。図５に示すように、蛍光計測手段は、主に、励起光を照射した異なる位置に対応して、各領域から放射される蛍光を並列した各スリット状に結像する第１の光学系と、前記スリット状に結像した蛍光を分光する、回折格子、プリズム又はフィルタのいずれかと、該分光を二次元配列の受光素子に結像させる第２の光学系とを有している。

第１の光学系は、図５において、反射鏡及びトロイダルミラーで構成されているが、本発明がこれに限られないことは、言うまでもない。例えば、図７又は図９に示すような、撮像レンズ（カメラレンズ）を使用することも可能である。

第２の光学系については、図６に示すように、レンチキュラーレンズなどのレンズアレーが好適に利用可能である。図６及び図７のように、蛍光像が結像される位置に配置されるスリット、分光する回折格子、レンズアレー、イメージセンサ（エリアセンサ）を、カメラ部として一体的に構成することも可能である。

分光手段として、回折格子の替わりにプリズムを用いる場合には、各光学部品の順序は、図６と同様でもよいが、回折格子の替わりにフィルタを用いる場合には、スリットの後段にレンズアレーを配置し、コリメートされた蛍光をストライプ状に配置された干渉フィルタを通過させて、スペクトル分光毎にイメージセンサに入射するよう構成する必要がある。

図７に示すように、レンズアレーとイメージセンサとの距離が近接している場合には、蛍光をスペクトル分光する際に、イメージセンサに入射する各スペクトル分光の間隔が狭くなる。このため、イメージセンサには、スリットの幅方向（図６の図の上下方向）に高密度に受光センサ（ピクセル）を配置することが必要となる。しかしながら、このようなイメージセンサは高価であり、製造コストを増加させる要因ともなる。

このため、図７に示すように、スリットからレンズアレーまでの光学部品、特に上述した第２の光学系と、受光素子であるイメージセンサとを相対的に移動させ、分光された異なる波長を受光素子の同一部分で検知するよう構成することが可能である。この場合は、図８に示すように、最初の１回目（図８（ａ））で、試料上の異なる観察位置に対応した、特定スペクトルの蛍光を計測し、２回目（図８（ｂ））には、イメージセンサを少し移動させて、他の異なる特定スペクトルの蛍光を計測する。図８（ｃ）及び（ｄ）のように、これを順次繰り返して、必要な種類のスペクトル分光を計測する。これにより、イメージセンサにおける各ピクセルのスリットの幅方向の配列は、観察位置に対応したストライプ状の領域に対応する間隔で良く、画素密度が低いイメージセンサであっても、本発明の分光画像取得装置に使用することができる。なお、イメージセンサ等の移動にはピエゾ素子などが利用可能である。

また、試料を移動させる機構も、分光画像取得装置を複雑化又は大型化させる要因でもあることから、図９に示すように、第１の光学系に、ポリゴンミラーなどの走査ミラーを配置することも可能である。走査ミラーはカメラレンズの前段であっても後段であって良い。この走査ミラーを動作させることにより、スリット状に結像される試料の観察位置を移動させることが可能であるため、試料を走査する機構が不要となる。

本発明の分光画像取得方法では、上述した分光画像取得装置を利用し、当該装置から出力される計測信号を蓄積及び処理することで、特許文献１に示したような、励起光及び蛍光に係るマトリックス画像（ＥＥＭ）を試料の空間分布として得ている。当然、観察する用途などに応じて、着目するスペクトル分光の波長を限定することも可能である。

また、本発明の分光画像取得装置、特に、蛍光計測手段については、ＥＥＭイメージング方法の用途に限らず、多数の観察位置から同時に放出される放射光を、同時にスペクトル分光する技術にも利用可能である。

以上説明したように、本発明によれば、ＥＥＭイメージングを短時間で実施可能な分光画像取得装置及び方法を提供することが可能であり、また、装置全体を小型化することが可能な分光画像取得装置を提供することができる。

Claims (7)

1. 複数の異なる波長の励起光を試料に照射する励起光照射手段と、該励起光の波長毎に該試料からの蛍光のスペクトル分布を計測する蛍光計測手段とを有する分光画像取得装置において、
   該励起光照射手段は、空間的に異なる位置に異なる波長の励起光を同時に照射するように構成され、
   該蛍光計測手段は、前記異なる位置毎に蛍光の光路を分離し、分離された蛍光をスペクトル分光し、スペクトル分光された蛍光の少なくとも一部を、前記異なる位置毎に同時に計測するように構成されていることを特徴とする分光画像取得装置。
2. 請求項１に記載の分光画像取得装置において、前記異なる位置は、ストライプ状に区分された領域であり、該試料と該励起光の照射位置とは、該ストライプ状の配列方向に相対的に移動するよう構成されていることを特徴とする分光画像取得装置。
3. 請求項１又は２に記載の分光画像取得装置において、該励起光照射手段は、光源と、該光源からの放射光を分光する、回折格子、プリズム又はフィルタのいずれかと、異なる波長がストライプ状に照射されるように、該放射光又は該分光のいずれかの光路を調整するレンズ又はミラーとを有することを特徴とする分光画像取得装置。
4. 請求項１乃至３のいずれかに記載の分光画像取得装置において、該蛍光計測手段は、前記異なる位置がストライプ状に区分された領域であり、前記異なる位置毎に蛍光を並列した各スリット状に結像する第１の光学系と、前記スリット状に結像した蛍光を分光する、回折格子、プリズム又はフィルタのいずれかと、該分光を二次元配列の受光素子に結像させる第２の光学系とを有することを特徴とする分光画像取得装置。
5. 請求項４に記載の分光画像取得装置において、該第２の光学系に対して該受光素子を相対的に移動させ、分光された異なる波長を受光素子の同一部分で検知することを特徴とする分光画像取得装置。
6. 請求項４又は５に記載の分光画像取得装置において、該第１の光学系は、走査ミラーを備え、該走査ミラーを動作させることにより、スリット状に結像される該試料の観察位置を変更することを特徴とする分光画像取得装置。
7. 請求項１乃至６のいずれかに記載の分光画像取得装置を用いる分光画像取得方法において、該装置から出力される計測信号を蓄積及び処理し、励起光及び蛍光に係るマトリックス画像を該試料の空間分布として得ることを特徴とする分光画像取得方法。

Images