CN112964691B - 一种多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像方法和装置 - Google Patents
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Abstract
一种多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像方法和装置，该方法包括将n台不同波长的激光器所发出的激光组合成一个扫描阵列，n台不同波长的激光器发出的n束波长不同的激光分别聚焦于n个待测量位置，同一扫描阵列中不同激光聚焦位置之间的距离小于物镜的光学分辨率；将m个扫描阵列组成测量系统，每个扫描阵列分别接入不同的光栅及CCD模块；扫描成像时，由m个扫描阵列在同一测量时间内同时获得m×n个测量位置的拉曼光谱信息；以及记录每个测量位置的拉曼光谱信息，并绘制成拉曼扫描图像。上述方案在保留高空间分辨率优势的基础上，显著提高拉曼扫描成像速度，解决了现有技术不能同时具备高空间分辨率表征和快速表征的技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及拉曼成像技术领域，尤其涉及一种多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像方法和装置。
背景技术
拉曼光谱检测是一种研究材料结构与性质的重要手段，不同的待测样品具有不同的拉曼特征峰，当其组分分布变化、所处环境变化或发生化学反应时，待测样品的拉曼特征峰也会产生相应的变化，通过拉曼空间扫描成像，即可揭示待测样品中组分、温度、应力、化学反应等因素在空间的分布信息及变化规律，因此，拉曼扫描成像技术被广泛应用于生物、医药、化学、材料等领域的研究。
然而，高空间分辨率快速成像是拉曼成像技术始终面临的挑战。以活细胞成像为例：细胞内部结构复杂，需要以较高的空间分辨率进行测量，现有的单点式扫描成像技术，可通过移动位移平台或物镜，实现优于光学分辨率的空间分辨率，但单点扫描成像需要使单个测量激光遍历待测样品上每个待测位置，测量时间较长，由于细胞存活时间有限，单个细胞的测量时间可能超出其存活时间，因此难以实现活细胞成像；线扫描技术可以使光斑以直线形式聚焦在待测样品表面，则其可同时获得直线上多点的拉曼光谱信息，采用多组CCD像元同时收集多条光谱，即可极大缩短测量时间，然而，受限于光学空间分辨率极限，线扫描方法无法区分直线形光斑内光学极限空间分辨率以下的信号变化，同时，此方法仅适用于平整表面，对表面不平整的待测样品，一条直线很难同时满足聚焦要求，因此，此方法也无法实现高空间分辨率快速成像。此外，由于聚焦方法限制(柱面镜或狭缝)，单条直线上激光功率不均匀，则不同点的信号强度基准存在差异，影响成像可靠性和质量。与线扫描技术相似，现有的拉曼“面测量”技术可通过组合复眼式物镜等方法，快速获得待测样品在某个平面区域内的拉曼信号均值，然而，面扫描方法同样无法区分光学极限空间分辨率以下的信号变化，不满足高空间分辨率成像的需求。
综上所述，现有拉曼成像方法尚不能同时具备高空间分辨率表征和快速表征两项优势，亟需开发可实现快速高空间分辨率拉曼成像的方法及装置。此外，在快速表征方法中，缺乏由于激发激光引起的信号强度差异的修正方法。
发明内容
为了实现高空间分辨率的快速拉曼成像，以满足生物、化学、材料等领域的测量需求，本发明提出了一种多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像方法，并设计了相应测量装置。
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
为此，本发明的第一个目的在于提出一种多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像方法，该方法通过扫描阵列将n束不同波长的激光分别聚焦于n个点，由于激光波长不同，在聚焦位置间距小于光学分辨率极限的条件下，仍可根据激发波长区分每个聚焦位置产生的拉曼信号，从而实现了高空间分辨率多点拉曼信号捕捉，组合m个扫描阵列，同时对待测样品进行拉曼扫描，即可将拉曼扫描成像时间缩短至单点扫描成像的1/mn，在保留高空间分辨率的基础上，显著提高拉曼扫描成像速度。
本发明的另一个目的在于提出一种多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像装置。
为达到上述目的，本发明第一方面实施例提出了一种多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像方法，该方法包括以下步骤：
步骤S10，将n台不同波长的激光器所发出的激光组合成一个扫描阵列，所述n台不同波长的激光器发出的n束波长不同的激光分别聚焦于n个待测量位置，同一扫描阵列中不同激光聚焦位置之间的距离小于物镜的光学分辨率；
步骤S20，将m个所述的扫描阵列组成测量系统，每个所述的扫描阵列分别接入不同的光栅及电荷耦合器件CCD模块；
步骤S30，扫描成像时，由m个所述扫描阵列在同一测量时间内同时获得m×n个测量位置的拉曼光谱信息；以及
步骤S40，记录每个所述测量位置的拉曼光谱信息，并绘制成拉曼扫描图像。
另外，根据本发明上述实施例的多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像方法还可以通过下述方式实现：
进一步地，在本发明第一方面实施例中，所述n和m为大于等于1的正整数，且不同时为1，则采用此多波长阵列式方法，拉曼成像时间可缩短为原有单点扫描成像时间的1/mn。
进一步地，在本发明第一方面实施例中，所述扫描阵列的实现方法为采用光纤耦合方法，将所述n束波长不同的激光通过光纤分别引入n个不同的微型物镜。
进一步地，在本发明第一方面实施例中，所述扫描阵列的实现方法为采用开放式光路，将n束波长不同的激光分别经过不同的扫描振镜，再聚焦于同一个物镜，通过调整扫描振镜角度改变不同激光器的聚焦位置。
进一步地，在本发明第一方面实施例中，每个所述扫描阵列所收集的拉曼光谱使用同一光栅分光并测量，或者使用不同光栅分光测量。
进一步地，在本发明第一方面实施例中，在所述步骤S30中，扫描成像的实现方法为待测样品固定，m个扫描阵列分别独立移动或同步移动；或者为m个扫描阵列固定，支撑待测样品的位移平台移动。
进一步地，在本发明第一方面实施例中，在所述步骤S20之后，还包括步骤S21，在同一测量位置采用不同波长的激光预先获得同一测量位置的拉曼光谱信号，再根据不同波长的激光所激发拉曼光谱信号的强度比例关系，处理修正图像。
为达上述目的，本发明第二方面实施例提出了一种多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像装置，包括：多波长耦合聚焦模块、测量模块和样品模块；所述多波长耦合聚焦模块包括m个扫描阵列，每个扫描阵列由n台不同波长的激光器所发出的激光组成，所述n台不同波长的激光器发出的n束波长不同的激光分别聚焦于n个待测量位置，同一扫描阵列中不同激光器聚焦位置之间的距离小于物镜的光学分辨率，其中，每个所述扫描阵列分别接入不同的光栅及CCD模块；所述测量模块包括滤波片、光栅及CCD图像传感器、拉曼光谱信号处理模块及组成光路的光学元件；以及所述样品模块包括可支撑并移动待测样品的位移平台。
另外，根据本发明上述实施例的多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像装置还可以通过下述方式实现：
进一步地，在本发明第二方面实施例中，所述滤波片为截止滤波片，或者为陷波滤波片；单个所述扫描阵列连接单个或多个所述光栅，不同所述扫描阵列连接不同所述光栅，在所述光栅之前安装截止滤波片，所述截止滤波片为通过所述光栅的最长波长λn的截止滤波片；或者在所述光栅之前安装通过所述光栅的对应每个波长的陷波滤波片的组合。
进一步地，在本发明第二方面实施例中，还包括预处理模块，所述预处理模块用于修正由激发波长不同引起的拉曼信号强度差异。
上述实施例的方法和装置，通过扫描阵列，可将n束激光可分别聚焦于n个待测量位置，实现一个模块下多点信号的同步采集，由于激光波长不同，在聚焦位置间距小于光学分辨率极限的条件下，仍可根据激发波长区分每个聚焦位置产生的拉曼信号，从而实现了高空间分辨率多点拉曼信号捕捉；组合m个扫描阵列，同时对待测样品进行拉曼扫描，即可将拉曼扫描成像时间缩短至单点扫描成像的1/mn，即可在保留高空间分辨率的基础上，实现快速成像。同时，考虑到不同波长激光通过不同的光路测量，可能对信号强度基准有所影响，本发明开发了预处理模块及方法，通过测量前采用不同激光标定统一位置的信号强度再进行修正，即可实现更准确有效的拉曼成像。
本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是本发明实施例一所提供的一种多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像方法的流程示意图；
图2是本申请实施例基于多波长方法实现高空间分辨率多点信号区分的原理示意图；
图3是本申请实施例采用光纤耦合多个微型物镜组成的几种形式的扫描阵列示意图；
图4是本申请实施例采用开放光路构造的扫描阵列示意图；
图5是本申请实施例几种扫描阵列排布模式示意图；
图6是本申请实施例中多波长阵列式扫描方法提升测量速度的原理示意图：(a)为单点扫描成像示意图，(b)为多波长阵列式扫描成像示意图；
图7是本申请实施例中信号预处理方法的原理图；
图8是本申请实施例中待测样品和待测量位置的示意图；
图9是本申请实施例所提供的一种多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像装置的结构示意图。
附图标记：
λ1 第1台激光器产生的激光波长
λ2 第2台激光器产生的激光波长
λn 第n台激光器产生的激光波长，λ1<λ2<λn
A 波长为λ1的激光在待测样品上的聚焦位置
B 波长为λ2的激光在待测样品上的聚焦位置
C 聚焦波长为λ1的激光的微型物镜
D 聚焦波长为λ2的激光的微型物镜
000 待测样品
010 位移平台
100–1 波长为λ1的激光器
100–n 波长为λn的激光器
200–1 第1个扫描阵列
200–m 第m个扫描阵列
300–1 第1组截止滤光片/陷波滤光片
300–m 第m组截止滤光片/陷波滤光片
400–1 第1组光栅
400–m 第m组光栅
410–1 第1组CCD图像传感器
410–m 第m组CCD图像传感器
420 拉曼光谱信号分析及预处理模块
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下面参考附图描述本发明实施例的多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像方法和装置。首先将参照附图描述根据本发明实施例提出的多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像方法。
图1为本发明实施例一所提供的一种多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像方法的流程示意图。
如图1所示，该多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像方法包括以下步骤：
在步骤S10中，将n台不同波长的激光器所发出的激光组合成一个扫描阵列，n台不同波长的激光器发出的n束波长不同的激光分别聚焦于n个待测量位置，同一扫描阵列中不同激光聚焦位置之间的距离小于物镜的光学分辨率。由于不同测量位置的激发波长不同，每个测量位置的拉曼散射信号可根据其激发波长区分，由此即可实现优于光学分辨率的高空间分辨率多点拉曼信号捕捉。
图2是本申请实施例基于多波长方法实现高空间分辨率多点信号区分的原理示意图，图2给出了在同一扫描阵列中，不同激光聚焦位置小于物镜光学分辨率极限时的多点信号区分原理，由图1可以看出，物镜C将波长为λ1的激光聚焦于点A，物镜D将波长为λ2的激光聚焦于点B，由于点A和点B的间距x小于光学分辨率极限，点A所产生的拉曼散射可以进入物镜D的收集角，同理，点B产生的拉曼散射也可进入物镜C的收集角。然而，由于激光波长λ1<λ2，两束激光所激发的拉曼特征峰的峰位，也存在(1/λ1-1/λ2)cm-1的波数差，通过这一偏差，即可区分点A和点B产生的拉曼信号，从而实现优于光学分辨率极限的空间分辨率。
扫描阵列可以将n束不同波长的激光分别聚焦于n个点，本申请实施例采用光纤耦合方法构造构造扫描阵列，如图3所示。
图3是本申请实施例采用光纤耦合多个微型物镜组成的几种形式的扫描阵列示意图，图3给出了采用光纤耦合方法构造扫描阵列的示意方法，将n束波长分别为λ1，λ2，……，λn的激光通过光纤分别引入n个不同的微型物镜，通过调整微型物镜的角度，使微型物镜焦点间距为x，此间距x可通过改变物镜角度进一步调整。在本发明的实际应用中，存在多种光纤耦合微型物镜的排布方法，包括但不限于图3中(a)、(b)、(c)三种示例。
除此之外，本申请实施例还可以采用开放式光路构造扫描阵列。
图4是本申请实施例采用开放光路构造的扫描阵列示意图，图4给出了采用开放式光路构造扫描阵列的方法，2束不同波长的激光，分别经过不同的扫描振镜，再通过半透半反镜聚焦于同一个物镜，通过调整扫描振镜角度，即可改变不同激光的聚焦位置；需要说明的是，在实际使用中，通过调整光路设计，开放式光路同样可构造耦合n束不同波长激光的扫描阵列。通过调整扫描振镜中反射镜角度和位置，可以改变激光进入物镜的位置和角度，进而可以调节同一扫描阵列中不同激光聚焦位置之间的距离x，其空间分辨率可达50nm。当然也可以通过其他方法调节同一扫描阵列中不同激光聚焦位置之间的距离x。
优选的，通过改变微型物镜角度或调整扫描振镜等方法，可以调节同一扫描阵列中不同激光聚焦位置之间的距离。
在步骤S20中，将m个扫描阵列组成测量系统，每个扫描阵列分别接入不同的光栅及电荷耦合器件CCD模块，也就是说，在测量系统中，可包括m个扫描阵列，每个扫描阵列分别接入不同的光栅及CCD模块，即可实现多组扫描阵列信号同步捕捉。
图5是本申请实施例几种扫描阵列排布模式示意图，图5给出了几种扫描阵列排布方法的示意图，在本发明的实际应用中，存在多种扫描阵列的排布方法，包括但不限于图4中(a)、(b)、(c)三种示例。扫描阵列可独立扫描，也可同步移动。
在步骤S30中，扫描成像时，由m个扫描阵列在同一测量时间内同时获得m×n个测量位置的拉曼光谱信息，也就是说，扫描阵列遍历待测样品表面，即可快速高空间分辨率拉曼扫描成像，其中，当n和m为大于等于1的正整数，且不同时为1时，本申请实施例中拉曼成像时间可缩短为原有单点扫描成像时间的1/mn。
进一步地，本申请实施例中扫描成像的方法包括但不限于：待测样品固定，m个扫描阵列分别独立移动或同步移动；扫描阵列固定，支撑待测样品的位移平台移动。
图6是本申请实施例中多波长阵列式扫描方法提升测量速度的原理示意图：(a)为单点扫描成像示意图，(b)为多波长阵列式扫描成像示意图，图6给出了多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像方法扫描成像与单点扫描成像的对比示意图，在需要测量同样数目点数时，单点扫描成像测量一个点拉曼信号的时间内，此发明提出的方法可以测量m×n个点的拉曼信号，以相同的空间分辨率测量相同尺寸的待测样品时，多波长阵列式拉曼成像时间可缩短为原有单点扫描成像时间的1/mn，即本实施例可在保留高空间分辨率的基础上，实现快速成像。
在步骤S40中，记录每个所述测量位置的拉曼光谱信息，并绘制成拉曼扫描图像。
进一步地，本申请实施例中每个所述扫描阵列所收集的拉曼光谱使用同一光栅分光并测量，或者使用不同光栅分光测量。
在实际测量中，单个扫描阵列所收集的拉曼光谱信息，可以使用同一光栅分光并测量，也可使用不同光栅分光测量，当使用同一光栅分光时，需采用模块中使用的最长的波长所对应的截止滤波片，或将模块中使用的所有波长对应的陷波滤波片组合使用；当使用不同光栅分光时，需采用此光栅所分光的最长波长所对应的截止滤波片，或将此光栅所分光的所有波长对应的陷波滤波片组合使用。
进一步地，本申请实施例中在所述步骤S20之后，还实施了步骤S21，在同一测量位置采用不同波长的激光预先获得同一测量位置的拉曼光谱信号，再根据不同波长所激发的拉曼光谱信号的强度比例关系，处理修正图像。由于不同激光器产生的激光波长不同，经过光路后聚焦时的强度可能也存在差异，为了修正可能存在的不同波长激光激发信号强度的差异，测量前，可在同一测量位置，采用不同波长的激光预先获得拉曼信号，再根据对应信号的强度比例关系，处理修正图像。
具体的，当不同波长激光通过不同的光路聚焦于待测样品表面时，每束激光所激发的拉曼信号强度基准可能有所不同，为此，本申请实施例采用如下图像修正方法，如图7所示，采用扫描阵列中波长为λ1，λ2，……，λn的激光，分别测量同一待测样品同一位置的拉曼信号，并记录相应波长激发的拉曼峰强度h1，h2，……，hn，以最强的信号为基准，对其他特征峰进行修正，例如，λ1与λn波长激光所激发的拉曼峰强度分别为h1和hn，则选取h1为基准，实际测量中基于λn获得的拉曼信号强度需乘以修正系数h1/hn。通过测量前采用不同激光标定统一位置的信号强度再进行修正，即可实现更准确有效的拉曼成像。
拉曼成像通常是根据特征峰的强度进行成像，但同一张图片中，特征峰的强度应有统一标准，即，其差异仅由样品特性变化引起，而非因为测量条件改变引起。然而，不同波长的激光所激发的拉曼特征峰，其强度存在确定比例的差异，即使两种波长的激光以相同功率测量同一位置，其信号强度也会不同。为了使不同波长激光获得的拉曼特征峰能统一标准进而实现成像，必须修正波长引起的比例差异。
本申请实施例使用波长λ1测量某位置，记其拉曼特征峰强度为h1，使用波长λ2测量同一位置，记其拉曼特征峰强度为h2，则对波长λ2测量得到的峰强乘以修正系数h1/h2时，波长λ1和波长λ2测量得到的拉曼特征峰峰强具有统一标准，即可得到修正后的准确图像。
图9是本申请实施例所提供的一种多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像装置的结构示意图，如图9所示，该装置包括波长耦合聚焦模块、测量模块和样品模块；
本申请实施例中多波长耦合聚焦模块包括m个扫描阵列，每个扫描阵列由n台不同波长的激光器所发出的激光组成，n台不同波长的激光器发出的n束波长不同的激光分别聚焦于n个待测量位置，同一扫描阵列中不同激光器聚焦位置之间的距离小于物镜的光学分辨率，其中，每个扫描阵列分别接入不同的光栅及CCD模块。
具体而言，每台激光器均可产生激光以激发待测样品的拉曼信号，n台激光器可编号为激光器1,2，……，n，且其波长各不相同，所述n台激光器对应波长为λ1<λ2<……<λn；
每个扫描阵列的实现方法包括但不限于：组合n个微型物镜，可分别编号为物镜1,2，……，n，使用可分光光纤，将激光器产生的激光连接至对应编号的物镜，则不同的激光分别聚焦于对应编号的物镜的焦点；或采用n个扫描振镜，可分别编号为扫描振镜1,2，……，n，激光器产生的激光分别经过对应编号的扫描振镜，使用半透半反镜耦合光路，使n条激光通过同一物镜聚焦，通过调整扫描振镜改变不同波长激光的聚焦位置；
m个扫描阵列可分别独立移动或整体移动。
本申请实施例中测量模块包括滤波片、光栅及CCD图像传感器、拉曼光谱信号处理模块及组成光路的光学元件。具体而言，光栅用于对过滤后的散射光进行分光；CCD图像传感器用于探测分光后的散射拉曼光谱；拉曼光谱信号处理模块用于对探测的拉曼光谱进行分析处理；组成光路所必须的光学元件，包括但不限于反射镜、半透半反镜、小孔等，用于组成光路。
本申请实施例中样品模块包括可支撑并移动待测样品的位移平台。
进一步地，本申请实施例中的滤波片为截止滤波片，或者为陷波滤波片，截止滤波片或陷波滤波片用于消除激光的雷利散射。
本实施例中单个扫描阵列连接单个或多个所述光栅，不同扫描阵列连接不同所述光栅，在光栅之前安装截止滤波片，截止滤波片为通过所述光栅的最长波长λn的截止滤波片；或者在所述光栅之前安装通过所述光栅的对应每个波长的陷波滤波片的组合。
具体而言，当选用截止滤波片时，应选取通过此光栅的最长波长λn的截止滤波片，当选用陷波滤波片时，应选取通过此光栅的对应每个波长的陷波滤波片组合使用。
本申请实施例通过扫描阵列，可将n束激光可分别聚焦于n个待测量位置，实现一个模块下多点信号的同步采集，由于激光波长不同，在聚焦位置间距小于光学分辨率极限的条件下，仍可根据激发波长区分每个聚焦位置产生的拉曼信号，从而实现了高空间分辨率多点拉曼信号捕捉；组合m个扫描阵列，同时对样品进行拉曼扫描，即可将拉曼扫描成像时间缩短至单点扫描成像的1/mn，即可在保留高空间分辨率的基础上，实现快速成像。同时，考虑到不同波长激光通过不同的光路测量，可能对信号强度基准有所影响，本发明开发了预处理模块及方法，通过测量前采用不同激光标定统一位置的信号强度再进行修正，即可实现更准确有效的拉曼成像。
综上所述，本申请实施例所提供的一种多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像方法的测量步骤为：
(1)选取需要数目的扫描阵列，根据待测样品测量分辨率需求调整好阵列内测量位置间距，如图8所示；
(2)开启激光器，对选择好的扫描阵列进行标定，确认每一波长对应信号强度，并得到修正参数；
(3)将待测样品放置在位移平台上，开始扫描，扫描的方法包括但不限于：待测样品固定，m个扫描阵列分别独立移动或同步移动；扫描阵列固定，支撑待测样品的位移平台移动。
(4)记录每个测量位置的拉曼光谱信号，并根据需求绘制拉曼扫描图像。
本申请实施例所提供的一种多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像装置，如图9所示，该装置由待测样品000、位移平台010、n台激光器(其中n台激光器在图8中的标号为100–1，...，100–n)、m个扫描阵列(其中，m个扫描阵列在图8中的标号为200–1，...，200–m)、m组截止滤光片/陷波滤光片(其中，m组截止滤光片/陷波滤光片在图8中的标号为300–1，...，300–m)、m组光栅(其中，m组光栅在图8中的标号为400–1，...，400–m)、m组CCD图像传感器(其中，m组CCD图像传感器在图8中的标号为410–1，...，410–m)和拉曼光谱信号分析及预处理处理模块420组成。
n台激光器用于产生波长不同的探测激光，激光器100–1产生激光波长为λ1，激光器100–n产生激光波长为λn，λ1<λn，实际测量中，可根据实际需求选取包括但不限于下述激光波长：633nm，635nm，785nm，808nm，980nm，1550nm等。
任选地，在激光器单色性较差时，使用带通滤光片提高探测激光的单色性。
扫描阵列(其中，m个扫描阵列在图8中的标号为200–1，...，200–m)用于分别将n束激光可分别聚焦于待测样品000上的n个待测量位置，扫描阵列的搭建方法包括但不限于光纤耦合方法及开放式光路构造方法，其结构进一步示意在图3和图4中给出。
图3给出了采用光纤耦合方法构造扫描阵列的方法，将n束波长分别为λ1，λ2，……，λn的激光通过光纤分别引入n个不同的微型物镜，通过调整微型物镜的角度，使微型物镜焦点间距为x，此间距x可通过改变物镜角度进一步调整。
图4给出了采用开放式光路构造扫描阵列的方法，2束不同波长的激光，分别经过不同的扫描振镜，再通过半透半反镜聚焦于同一个物镜，通过调整扫描振镜角度，即可改变不同激光的聚焦位置；需要说明的是，在实际使用中，通过调整光路设计，开放式光路同样可构造耦合n束不同波长激光的扫描阵列。通过调整扫描振镜中反射镜角度和位置，可以改变激光进入物镜的位置和角度，进而可以调节同一扫描阵列中不同激光聚焦位置之间的距离x，其空间分辨率可达50nm。
位移平台010用于改变待测样品位置，在扫描阵列产生的聚焦光斑固定不变时，可通过移动位移平台位置，改变激光照射在待测样品上的位置。
根据需求，选取使用截止滤光片或陷波滤光片(其中，m组截止滤光片/陷波滤光片在图8中的标号为300–1，...，300–m)，可消除探测激光的瑞利散射，进而获得探测激光激发的拉曼光谱。
光栅(其中，m组光栅在图8中的标号为400–1，...，400–m)用于将进入仪器的光线分光，其分别处理由对应序号扫描阵列(其中，m个扫描阵列在图8中的标号为200–1，...，200–m)获得的散射信号，进而分析拉曼光谱；CCD图像传感器(其中，m组CCD图像传感器在图8中的标号为410–1，...，410–m)用于测量通过相应序号光栅的拉曼光谱信号；拉曼光谱信号分析及预处理模块420用于分析获得的拉曼光谱信号得到待测样品拉曼峰峰位及峰强，并通过预处理消除由于不同测量位置测试激光波长不同、功率不同及测量角度不同所产生的影响。
任选地，使用平面反射镜、半透半反镜等其他光学元件构成光路。
通过移动扫描阵列或调整其角度，或移动位移平台的位置，即可实现将m×n个激光光斑从一组测量位置移动到另一组测量位置的操作，通过重复移动使测量位置遍历待测样品，即可获得待测样品拉曼信号的扫描成像结果。
本申请的发明人经过研究发现，现有拉曼成像方法尚不能同时具备高空间分辨率表征和快速表征两项优势，亟需开发可实现快速高空间分辨率拉曼成像的方法及装置。此外，在快速表征方法中，缺乏由于激发激光引起的信号强度差异的修正方法。
本发明提出的方法和装置，采用本申请实施例的方法和装置，通过扫描阵列，可将n束激光可分别聚焦于n个待测量位置，实现一个模块下多点信号的同步采集，由于激光波长不同，在聚焦位置间距小于光学分辨率极限的条件下，仍可根据激发波长区分每个聚焦位置产生的拉曼信号，从而实现了高空间分辨率多点拉曼信号捕捉；组合m个扫描阵列，同时对待测样品进行拉曼扫描，即可将拉曼扫描成像时间缩短至单点扫描成像的1/mn，即可在保留高空间分辨率的基础上，实现快速成像。同时，考虑到不同波长激光通过不同的光路测量，可能对信号强度基准有所影响，本发明开发了预处理模块及方法，通过测量前采用不同激光标定统一位置的信号强度再进行修正，即可实现更准确有效的拉曼成像。
本发明不仅局限于上述具体实施方式，本发明中提出的基于多波长耦合实现高空间分辨率成像拉曼方法的原理可广泛应用于本领域及与之相关的其它领域，可以采用其它多种具体实施方式实施本发明。例如，基于以上方法，通过结合表面增强拉曼测量进一步提高拉曼成像速度等。因此，凡是采用本发明的设计思想，做一些简单的变化或更改的设计进行拉曼成像测量，都落入本发明保护的范围。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
流程图中或在此以其他方式描述的任何过程或方法描述可以被理解为，表示包括一个或更多个用于实现定制逻辑功能或过程的步骤的可执行指令的代码的模块、片段或部分，并且本发明的优选实施方式的范围包括另外的实现，其中可以不按所示出或讨论的顺序，包括根据所涉及的功能按基本同时的方式或按相反的顺序，来执行功能，这应被本发明的实施例所属技术领域的技术人员所理解。
在流程图中表示或在此以其他方式描述的逻辑和/或步骤，例如，可以被认为是用于实现逻辑功能的可执行指令的定序列表，可以具体实现在任何计算机可读介质中，以供指令执行系统、装置或设备(如基于计算机的系统、包括处理器的系统或其他可以从指令执行系统、装置或设备取指令并执行指令的系统)使用，或结合这些指令执行系统、装置或设备而使用。就本说明书而言，"计算机可读介质"可以是任何可以包含、存储、通信、传播或传输程序以供指令执行系统、装置或设备或结合这些指令执行系统、装置或设备而使用的装置。计算机可读介质的更具体的示例(非穷尽性列表)包括以下：具有一个或多个布线的电连接部(电子装置)，便携式计算机盘盒(磁装置)，随机存取存储器(RAM)，只读存储器(ROM)，可擦除可编辑只读存储器(EPROM或闪速存储器)，光纤装置，以及便携式光盘只读存储器(CDROM)。另外，计算机可读介质甚至可以是可在其上打印所述程序的纸或其他合适的介质，因为可以例如通过对纸或其他介质进行光学扫描，接着进行编辑、解译或必要时以其他合适方式进行处理来以电子方式获得所述程序，然后将其存储在计算机存储器中。
Claims (10)
1.一种多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤S10，将n台不同波长的激光器所发出的激光组合成一个扫描阵列，所述n台不同波长的激光器发出的n束波长不同的激光分别聚焦于n个待测量位置，同一扫描阵列中不同激光聚焦位置之间的距离小于物镜的光学分辨率；
步骤S20，将m个所述的扫描阵列组成测量系统，每个所述的扫描阵列分别接入不同的光栅及电荷耦合器件CCD模块；
步骤S30，扫描成像时，由m个所述扫描阵列在同一测量时间内同时获得m×n个测量位置的拉曼光谱信息；以及
步骤S40，记录每个所述测量位置的拉曼光谱信息，并绘制成拉曼扫描图像。
2.根据权利要求1所述的多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像方法，其特征在于，所述n为大于1的正整数，所述m为大于等于1的正整数。
3.根据权利要求1所述的多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像方法，其特征在于，所述扫描阵列的实现方法为采用光纤耦合方法，将所述n束波长不同的激光通过光纤分别引入n个不同的微型物镜。
4.根据权利要求1所述的多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像方法，其特征在于，所述扫描阵列的实现方法为采用开放式光路，将n束波长不同的激光分别经过不同的扫描振镜，再聚焦于同一个物镜，通过调整扫描振镜角度改变不同激光器的聚焦位置。
5.根据权利要求1所述的多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像方法，其特征在于，每个所述扫描阵列所收集的拉曼光谱使用同一光栅分光并测量，或者使用不同光栅分光测量。
6.根据权利要求1所述的多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像方法，其特征在于，在所述步骤S30中，扫描成像的实现方法为待测样品固定，m个扫描阵列分别独立移动或同步移动；或者为m个扫描阵列固定，支撑待测样品的位移平台移动。
7.根据权利要求1所述的多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像方法，其特征在于，在所述步骤S20之后，还包括步骤S21，在同一测量位置采用不同波长的激光预先获得同一测量位置的拉曼光谱信号，再根据不同波长所激发的拉曼光谱信号的强度比例关系，处理修正图像。
8.一种用于实现由权利要求1-6任一方法的多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像装置，其特征在于，包括：多波长耦合聚焦模块、测量模块和样品模块；
所述多波长耦合聚焦模块包括m个扫描阵列，每个扫描阵列由n台不同波长的激光器所发出的激光组成，所述n台不同波长的激光器发出的n束波长不同的激光分别聚焦于n个待测量位置，同一扫描阵列中不同激光器聚焦位置之间的距离小于物镜的光学分辨率，其中，每个所述扫描阵列分别接入不同的光栅及CCD模块；
所述测量模块包括滤波片、光栅及CCD图像传感器、拉曼光谱信号处理模块及组成光路的光学元件；以及，
所述样品模块包括可支撑并移动待测样品的位移平台。
9.根据权利要求8所述的多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像装置，其特征在于，所述滤波片为截止滤波片，或者为陷波滤波片；
单个所述扫描阵列连接单个或多个所述光栅，不同所述扫描阵列连接不同所述光栅，在所述光栅之前安装截止滤波片，所述截止滤波片为通过所述光栅的最长波长λn的截止滤波片；或者在所述光栅之前安装通过所述光栅的对应每个波长的陷波滤波片的组合。
10.根据权利要求8所述的多波长阵列式快速高空间分辨率拉曼成像装置，其特征在于，还包括预处理模块，所述预处理模块用于修正由激发波长不同引起的拉曼信号强度差异。
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