JP2000506634A - 顕微鏡撮像装置および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 物体が光源（１０）により照明され、透明および非透明のストライプの周期的パターンが物体（０）に重畳される。少なくとも３つの像が、浅い焦点深度の顕微鏡により、パターンの異なる空間的位相で記録される。次に、合焦細部のみを有する３次元像が、周期的パターンを除去する画像処理により、記録像から導出される。照明マスク（１４）あるいは２つのコヒーレントなビームの干渉縞が、周期的パターンを生成する。マスクのシフト、あるいはコヒーレントなビームの時間的位相差を調整することにより、異なる空間位相が生成される。

Description

【発明の詳細な説明】 顕微鏡撮像装置および方法 本発明は、一般に合焦細部(in-focus detail)のみを含む像を生成するための 顕微鏡撮像（イメージング）装置(microscope imaging apparatus)および撮像方 法と、そのための方法に関する。本発明は、ボリューム（体積）構造(volume st ructure)の合焦３次元像(in-focus three dimensionalimage)を作るために用い ることができる像を生成するのに適している。 従来の光学顕微鏡では、３次元構造を正常に撮像(image)することはできない 。得られる画像は、３次元構造の合焦領域(in-focus region)の鮮明な像と、そ の合焦領域の上および下の構造の焦点のぼけた像とからなる。従来の光学顕微鏡 では、焦点から外れた部分の細部(detail)を除外することは不可能である。 完全なボリューム構造の合焦３次元像を形成するために組み合わせ可能な、構 造の個々の層あるいは薄層の合焦像(in-focus image)を提洪するための、３次元 構造を光学的に切断する共焦点顕微鏡が開発されている。残念ながら、非コヒー レント光源が使用されるとき、共焦点顕微鏡の光収支(light budget)は、通常、 不満足なものである。レーザー走査共焦点顕微鏡は、非常に浅い焦点深度を実現 するが、高価な装置とレーザー光がそこを通過して焦点を結ぶ照明／結像ピンホ ールを必要とする。 米国特許第５，３８１，２３６号においては、３次元構造の涸々の特徴部のレ ンジ（距離）を決定するために使用される光学センサが説明されている。このセ ンサは、構造を照明し可逆的である周期的なパターンを形成ずる光源を有する（ すなわち、パターンは１８０°位相シフトされている）。パターンの像とその構 造を照明するパターンの反転(reversal)とを検出するために、光源のパターンに 対して配列された検出器要素のアレイが使用されている。パターンは、構造のそ れ自身の焦点の合っている部分に対してのみ良く撮像されるであろうから、その 構造の合焦部分のレンジ（距離）の決定を可能にする。米国特許第５，３８１， ２３６号で説明されている装置および方法は、動作するためには、検出器の個々 の素子が光源のパターンに対して正確に配列され、また適合されていなけれ ばならないという短所を有する。実際には、これは実現がほとんど不可能である ことが分かっている。 本発明は、共焦点像(confocal image)と同様な方法で実質的に合焦細部のみを 有し、かつ構造の光学的セクショニング（切断）によりその構造の３次元像を作 るために使用することができる像を作るための、顕微鏡撮像装置および撮像方法 を提供しようとするものである。本発明は、検出器およびパターン要素の正確な 配列あるいは整合の必要なしに、光学的セクショニングを実現し、同時に有利な 光収支をもたらす。 １つの局面において、本発明は、試料の像を生成する方法であって、前記試料 を光源により照明するステップと、前記試料の上にほぼ周期的な空間的パターン を生成するステップと、前記試料の第１の像を記録するステップと、前記試料の 上の前記パターンの空間位相を変えて前記試料の第２の像を記録するステップと 、前記試料の上の前記パターンの前記空間位相を変えて前記試料の第３の像を記 録するステップを少なくとも１回繰り返すステップであって、前記試料の少なく とも３つの記録像における前記パターンの前記空間位相が異なっているステップ と、前記空間的パターンを前記像から除去し、それにより前記試料の光学的切片 像を生成するために、前記試料の前記３つ以上の記録像を解析するステップと、 を有ずる試料の像を生成する方法を提供する。 上述した従来技術は、厳しい条件でマスクパターンに対して配列された整合検 出器格子(matched detector grid)に依存しているが、本発明には、このような 整合検出器格子の必要がないという利点がある。像データの処理は簡単であり、 本発明は、従来の顕微鏡から光学的切片像(optically sectionedimage)をリアル タイムで作ることを可能にする。 好ましい実施態様においては、試料の合焦３次元像を作成するために、上述の 方法が異なる焦点位置(focal position)で繰り返される。その結果、以下に詳細 に説明する本発明の具体的な実施態様において、試料の表面組織(surfacetextur e)の３次元像が得られる。 パターンの空間位相は、連続的に、あるいは離散的なステップで、変えられて もよい。空間位相が連続的に変えられる場合には、試料の記録像は、所定の時間 にわたって積分される。パターンの空間位相が連続的に変えられる場合には、高 品質な像が得られることが計算され、また実際に確認されている。上に述べたよ うに、空間位相を変化させるための広範な手段が、本発明の出願目的である。 さらに別の局面において、本発明は、同一試料の少なくとも３つの像の画像デ ータの処理方法であって、前記像はその上に重畳されたほぼ周期的なパターンを 有し、３つの像の前記パターンの空間位相は異なり、前記パターンを含まない複 合画像を生成するように、前記データの解析を含む画像データの処理方法を提洪 する。 さらに別の局面において本発明は、光源と、ほぼ周期的な空間的パターンを生 成するパターン形成手段と、前記光源からの光を試料の上に集束し、前記試料の 上に前記パターンを生成する集束手段と、前記試料の上に生成された前記パター ンの前記空間位相を調整する位相シフト手段と、前記試料の像を検出するための 検出器と、前記パターンの前記空間位相のシフトが少なくとも３つの像で異なっ ていて、前記試料の像を解析する手段と、前記試料の前記３つの像から前記空間 的パターンを除去し、それにより前記試料の光学的切片像を生成する手段とを有 するアナライザと、を有する顕微鏡撮像装置を提供する。 パターン形成手段は、１次元の局所的な周期性を有するマスクの形態であるこ とが望ましく、またマスクパターンは試料に投影されていることが望ましい。た とえば、マスクは、線形格子(linear grating)でもよい。またマスクは、スパイ ラル格子(spiral grating)を有する円形のマスクでもよい。この後者の場合に、 円形のマスクの端縁に向かってあるいは端縁に位置する格子の一部を介して試料 を照明することにより、この部分においてスパイラル格子は平行な線の格子に近 似しているので、パターンは好都合に試料に投影される。このスパイラル格子の 利点は、マスクの回転により格子の連続した動きが実現されることである。ある いはコヒーレント光源が使用される場合には、パターン形成手段は、第１の光源 からの光に干渉するように配置された第２のコヒーレント光源により提供されて もよい。 さらに別の局面において本発明は、ほぼ周期的な空間的パターンを生成するパ ターン形成手段と、前記パターンの前記空間位相を調整する位相シフト手段と、 前記パターンの前記空間位相のシフトが少なくとも３つの像で異なっていて、前 記空間的パターンがその上に生成される試料の像を解析するための手段と、前記 ３つの像から前記空間的パターンを除去し、それにより前記試料の光学的切片像 を生成する手段を有するアナライザと、を有する従来の顕微鏡を改造するように 適応された装置を提供する。 さらに他の実施態様において本発明は、試料の光学的切片像を発生するために 従来の顕微鏡を適応さぜる方法を提供する。この方法は、前記試料の上にほぼ周 期的な空間的パターンを生成するために、顕微鏡の光学系にパターン形成手段を 導入するステップと、前記試料の上に少なくとも３つの異なる空間的位相シフト パターンを作成ずるために、前記パターンの前記空間位相を調整する空間位相シ フト手段を設けるステップと、それぞれ前記パターンの異なる空間位相シフトを 有する前記試料の少なくとも３つの別々な像を解析するための手段と、前記試料 の前記像から前記空間的パターンを除去し、それにより前記試料の光学的切片像 を生成する手段を有するアナライザを設けるステップと、を有する。 このように、実験室装置の広く普及した部分である従来の顕微鏡が、光学的切 片像を提洪可能なように容易に転換されることができることは、本発明の利点で ある。 本発明は、さらに、同一試料の少なくとも３つの像の像データを処理する方法 を提供する。像はその上に重畳されたほぼ周期的なパターンを有し、３つの像の 上のパターンの空間位相は異なっている。前記像から、パターンを含まない合成 像(composite)を生成するように、像データのこの処理方法は、データ解析を含 んでいる。 添付図面を参照して、実施例により、本発明の実施態様を説明する。 図１は、本発明による顕微鏡撮像装置の略図である。 図２は、本発明の光学系の略図である。 図３は、図２の系の軸方向応答の測定結果を示す。 図４(a)は、本発明により得られたユリの花粉粒（視野寸法は１００μｍ×７ ０μｍである）の自動焦点像(autofocus image)である。 図４(b)は、顕微鏡の焦点を中央の深度面(mid-depth plane)に合わせたと きの、ユリ花粉粒の従来の像（本発明によらない）を示す。 図１に示す撮像装置は、従来の顕微鏡の特徴の多くを有し、特に、非コヒーレ ント光源１０と、撮像されるべき物体Ｏに光源１０からの光を集束させる一つ以 上のレンズ１１の形態であることが望ましい、集束手段とを有している。ビーム スプリッター１２は、ＣＣＤカメラの形態であることが望ましい光検出器１３に 向かって物体からの反射光が反射されるように、光源と物体の間に位置している 。さらに、この装置は、たとえば、格子(grating)の形態でパターンが形成され 、非ゼロの空間的にほぼ周期的なパターンで物体が照明されるように光源１０に 備えられたマスク１４を具備している。かくして、マスクパターンは試料に投影 される。マスクパターンは、１次元内のみで局所的な周期性を有することが望ま しい。検出器面は、物体の光学的切片像が形成されることを可能にするために、 投影されたパターンが集束される平面に結合している。 さらにこの装置は、マスクパターンの少なくとも３つの異なる位相が生成され るように、物体に集束されるマスクパターンの空間位相を調整するための、空間 位相シフト手段１５を有する。位相シフト手段１５は、物体に集束されパターン が形成された光の空間位相が変化させられるように、物体に対して段階的にある いは連続的にマスクを移動させるためのキャリッジの形態であってもよい。線形 格子の形態のマスクの場合には、キャリッジは、撮像装置の軸線に垂直に格子を 動かすために、配置される。空間位相を調整する他の選択肢には、投影されたパ ターンの位相をシフトするような、ビームスプリッターの移動が含まれる。 パターンは、試料上で異なる方法で生成できる。たとえば平行なストライプの パターンを搭載したリボンベルトを使用することにより、パターンは随意に生成 される。ここで、光源は、試料上に、リボンのパターンを投影する。光が光源と 物体の間に置かれたリボンのループの部分を通ってのみ照らすように、リボンは 光源の周りにそのループを形成する。あるいは、リボンは試料の周りにループを 形成する。 他の選択肢は、リボンが鏡の周りにループを形成することであり、リボンの一 部分が光源と鏡の間に置かれる。リボンを通過した光は、次に鏡により試料上に 反射される。かくして、このようなリボンは、常に同じ方向に、連続的にあるい は段階的に動かすことができる。このようなリボンは、鋸歯状に動かしたりある いは動作方向に反転させたりする必要なしに、（長方形のパネルを有するマスク のように、）たとえば正確に平行なストライプのパターンを生成する利点をもた らす。 図１において、位相シフト手段１５は、撮像装置の軸線に垂直な平面内に配置 された（紙面の中へまた外へ）３つの所定の位置にマスク１４を移動させるよう に配置された、キャリッジの形態である。キャリッジに対する３つの位置は、マ スクの３つの異なる空間位相が物体に集束されるように選択される。たとえば、 ３つの位相はφ，φ＋１２０°およびφ＋２４０°であってもよい。たとえば、 φ，φ＋９０°，φ＋１８０°およびφ＋２７０°の、別の空間位相シフトが生 成されてもよい。上記の２つの例のそれぞれにおいて、個々の空間位相の間の角 度差は同じであるが、角度差が同一であることは不可欠ではない、すなわち、φ ,φ＋９０°およびφ＋２７０°の空間位相シフトが使用されてもよい。 さらに、撮像装置は、検出器に接続され、検出器の出力を解析するアナライザ １６を有する。アナライザ１６は、たとえば、それぞれマスクの異なる位相で照 明された物体の３つ以上の像を別々に蓄積する複数のバッファの形態であるメモ リ手段１７を有してもよい。さらに、マスクパターンを像から除去して物体の光 学的切片像を明らかにするように、アナライザ１６は、３つ以上の蓄積された像 を解析するためのパターン除去手段１８を有する。パターン除去手段１８によっ て生成された異なる焦点位置における複数の異なる光学的切片像を合成すること により、物本の３次元像を生成するために、標準的なレンダリング技術を使用す る３次元イメージング手段１９が適宜に設けられる。 パターン除去手段１８は、合焦像(in-focus image)から縞(fringing)を差し引 いたものを直接決定するために作動してもよい。たとえば、３つの像が３つの等 間隔の空間位相において生成されたＩ₁，Ｉ₂，Ｉ₃である時、合焦像Ｉは、次式 を用いることにより決定できる。 しかし、画像の各ピクセルに対してこの手順を実行するには、非常に多くの計 算をしなければならない。あるいは、専用の画像処理装置を必要とせずにリアル タイムイメージングを可能にするためには、アナライザ１６は、パターン除去手 段１８に接続されたルック・アップ・テーブルを具備してもよい。ルック・アッ プ・テーブルは、３つの入力画像値に対する上述の式のすべての起こり得る解の 表であり、各ピクセルについての式の解の計算ではなく、テーブルの参照により 、像Ｉの決定を可能にする。 上述の撮像装置は、装置の焦点がぼかされるにつれて、物体の像の任意の非ゼ ロ空間周波数が減衰することを利用している。これは、物体の焦点のあった部分 上にのみマスクパターンが良く映し出されることを意味し、かくして、望ましく ない縞状(frinqe)パターンが重畳されてはいるが、物本の焦点のあった部分をセ クショニングする手段を提供する。同一焦点位置であるけれどもパターンの異な る重畳された空間位相で物体の３つ以上の像を記録することにより、物体の光学 的切片像を明らかにするために、重畳されたパターンを除去するために像を解析 することが可能である。 マスク１４は方形波パターンである線形格子の形態であることが望ましく、こ れは最大の光スループットを与える。交互の透明および非透明の等しい幅のバン ドが適当である。より広いバンドのパターンはより深い光学的断面（optical se ction）をもたらす。幅５〜３０μｍ、特に１２．５μｍのバンドを用いて良い 結果が得られるが、必要とされる光学的セクショニングによっては異なる幅が適 切であろう。しかし、任意に適用されたほぼ周期的な光強度パターンが使用され てもよい。好適な他のマスクには、スパイラル格子が含まれる。さらに、２次元 の周期的パターンを用いてもよいが、結果として生じる像の解析は、必然的に幾 分複雑となる。 パターン間隔が光学的セクショニングの深さを決定するから、理想的にはマス クのパターン間隔（空間的周期性）が選択され、また照明倍率は、パターンの基 本波のみが物体に投影されるように決められる。格子の３つの位相φ，φ＋１２ ０°およびφ＋２４０°が物体に投影される上述の線形方形波格子の場合には、 ３つの像の引き続く処理において３次高調波は自動的に相殺されるので、物体に 投影される３次高調波を防止することは必須ではない。これは撮像システムの総 合的な設計に大きな自由度をもたらし、装置の光収支を改善する。一般に、物体 に投影されるパターンのｎ個の位相シフトの間の差分が各場合について同じであ るときは、ｎ次高調波およびその高調波が自動的に相殺される。 パターンの３つ以上の離散的な所定の位相シフトが物体に投影される撮像装置 を以上に説明した。たとえば回転するスパイラル・マスクあるいはグリッド型マ スクの連続した動きを用いて、パターンの空間位相が連続的に変化される場合に は、光学的切片像を生成するために、物体の像は所定の時間にわたって積分され る。 あるいは、撮像装置はコヒーレント光源を使用してもよい。これは、マスクが 強度あるいは位相パターンを有することを許容する。装置の光収支が周期的強度 パターン形成の場合より大きいので、周期位相パターン形成(period phasepatte rning)の使用が望ましい。さらに別の装置では、物体ボリューム(object volume )内に縞状パターンを生成するために、２つの光源からの光が干渉するように配 置された２つのコヒーレント光ビームが使用されてもよい。２つのコヒーレント 光ビームが使用される場合には、縞状パターンの所要の空間位相シフトを生ずる ために、２つのビームの間の時間的位相差は変えられてもよい。１つ以上のコヒ ーレント光源が使用される場合には、縞状パターンは物体ボリュームを介して深 く延びており、したがって検出平面の正轄な軸方向の配列（アライメント）はも はや重要ではない。この方法は蛍光イメージングに特に適切である。 本発明の具体的な実施態様の光学系は、単に振幅透過率あるいは反射率τ(ｔ₁ ,ｗ₁)の物体に映し出される照明マスク、Ｓ(ｔ₀，ｗ₀)からなる。最終の像は、 像平面（ｔ，ｗ）内のＣＣＤカメラにより記録される。マスクはインコヒーレン トに照明され、像強度は次の式で表される。 ここでｈ_1,2は２つのレンズの振幅点拡がり関数を表す。さらに、み入れることとする。ここでｎ ｓｉｎ αは開口数（ＮＡ）であり、λは波長を 表す。 ここで照明マスクは、単純化のために、次式で書くことができる１次元格子の 形態をとると仮定する。 ここでｍは変調深さを、またφ₀は任意の空間位相を示す。正規化された空間周 はグリッド平面と試料平面の間の倍率を表す。ここで式(2)を式(1)に代入すれば 、式(3)が得られる。 I(t,w)=I₀+I_Ccosφ₀+I_Ssinφ₀ (3) ここでＩ₀はＳ＝１として式(1)により与えられ、当然、従来の広視野像を表す。 去できる。それぞれ相対的空間位相φ₀＝０，φ₀＝２π／３およびφ₀＝４π／ ３に対応している３つの像Ｉ₁，Ｉ₂およびＩ₃を撮影することにより、これは実 現される。このようにして、下式を計算することにより、Ｉ₀を含まない光学的 切片像が得られる。 これは通信システムにおける２乗則検波に類似している。 光学的切片像をリアルタイムで生成ずるこのシステムの能力を証明するために 、従来の顕微鏡の照明経路に１ｍｍ当たり４０本の１次元格子を導入した。無限 大の光学的筒長を用いたので、試料上に格子の像を投影し、またＣＣＤカメラに 試料を映し出すために、別々なレンズの導入が必要であった。これは、照明平面 と試料との間に（５０／１８０）Ｍの実効的な倍率をもたらした、ここでＭは、 対物レンズの公称倍率である。１５Ｗのタングステン・ハロゲン電球が、緑色フ ィルタ（帯域幅１００ｎｍ）とともに光源に使用された。像はＣＣＤカメラで記 録され、Matrox Meteor社製のフレーム・グラッバー(frame grabber)に転送され た。格子は、任意の３つの連続したカメラ像が格子の投影された像の位置におけ る１周期の３分の１の空間的シフトに対応するように、カメラのフレーム・レー トに同期して単純な鋸歯状に動かされた（図２）。各フレームの積分時間の 間に格子が動いているという事実は、式(3)におけるＩ_CおよびI_Sの値をｓｉｎｃ （πｔ／３Ｔ）のファクタだけ減少させる。ここでｔはカメラの積分時間(integ ration)であり、Ｔは連続したフレームの記録の間の時間である。この場合Ｔ＝ ２ｔ＝４０ミリ秒であり、したがってこの係数はわずか０．９５５である。最悪 の場合には、Ｔ＝ｔであり、この係数はわずか０．８２７に低下する。光学的切 片像は、８ビットカメラからのＩ₁，Ｉ₂およびＩ₃のすべての起こり得る組み合 わせをＩ_pにマッピングするルック・アップ・テーブルとともに式(4)を用いて得 られる。 顕微鏡の光学的切断（セクショニング）強度を測定するために、較正された軸 移動ステージとともに平面鏡を使用した。その結果の２つのオリンパス社製のＭ Ｄ Ｐｌａｎ対物レンズに対する軸方向応答を図３に示す。５０×，０．７５Ｎ Ａの使用は、このシステムのν＝０．４に対応し、このシステムに対しては、０ ．９１μｍの測定値に良く匹敵する０．８７μｍの半値全幅（ＦＷＨＭ）を予測 できる。理論的には、１５０×，０．９５ＮＡの乾燥対物レンズは、ν＝０．８ 、したがって０．２７μｍの半値全幅を生ずると予測される。実際には、０．９ ５よりむしろ０．８５であるこのレンズの開口数に対応する０．４３μｍと測定 される。この相違は、大口径レンズで行われた他の測定と矛盾せず、種々の原因 によるものかもしれない。その原因の１つは、瞳関数の実効的なアポダイゼイシ ョンを招く周縁光線の強い減衰である可能性が高い。 ユリの花粉粒の厚いボリューム構造を映し出ず像を図４に示す。図４(a)は、 ５０×，０．７５ＮＡ対物レンズを用いた本発明による３０μｍの軸方向走査を 通じて各ピクセルにおける最高の像強度を表示することにより得られた自動焦点 像を表す。粒の全表面組織は、像ボリュームの全体上で良く解像されている。他 方、図４(b)は、粒を通る中間の平面において撮られた従来の像を示す。これに は、かなり多量の焦点の外れたぼけがあり、意味のある３次元画像処理を実行す ることが妨げられることが明確である。 光学的切片像を生成するように、従来の顕微鏡を容易に改造できることは明白 であろう。上述したように、この改造は、顕微鏡の照明系の中へのパターン形成 されたマスクおよびキャリッジの導入と、アナライザの追加からなる。マスクお よびキャリッジの導入は、代わりに付加的な光学系の導入を必要とするかもしれ ないが、従来の顕微鏡が、物体に集束された絞りを有する場合には、単に絞りを マスクおよびキャリッジにより置換するだけでよい。 上述の撮像装置は、たとえば暗視野および差分干渉コントラスト(differentia l interference contrast)を含む広範囲の撮像様式で使用することができる。さ らに、この撮像装置は、従来の顕微鏡のすべての応用に使用することができる。 特に、この装置は、生物医学的な応用に使用することができ、また光源としてレ ーザーを必要とせずに光学的に切片化された螢光イメージングを効率的に行うこ とができるという利点を有する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９９年６月４日（１９９９．６．４） 【補正内容】 請求の範囲 １． 試料の像を生成する方法であって、 前記試料を光源により照明するステップと、 前記試料の上にほぼ周期的な空間的パターンを生成するステップと、 前記試料の第１の像を記録するステップと、 前記試料の上の前記パターンの空間位相を変えて前記試料の第２の像を記録す るステップと、 前記試料の上の前記パターンの前記空間位相を変えて前記試料の第３の像を記 録するステップを少なくとも１回繰り返すステップであって、前記試料の少なく とも３つの記録像における前記パターンの前記空間位相が異なっているステップ と、 前記空間的パターンを前記像から除去し、それにより前記試料の光学的切片像 を生成するために、前記試料の前記３つ以上の記録像を解析するステップと、を 有し、 前記記録された像を像のペアにグルービングし、像の各ペア中の前記記録され た像の間の差の平方の和の平方根を計算することによって、合焦像が得られ、 ３つの像が記録されている場合には、式 （ここで前記３つの記録された像がＩ₁，Ｉ₂およびＩ₃であり、前記合焦像がＩ である） に従って、前記空間パターンが除去される、試料の像を生成する方法。 ２． 前記試料を照明し前記試料の上にほぼ周期的な空間的パターンを生成 するために、２つのコヒーレント光源が使用される請求項１に記載の方法。 ３． 前記試料の上に前記パターンを投影するマスクを使用するステップを 含む請求項１に記載の方法。 ４． 前記マスクが１方向にのみ局部的な周期性を有する請求項３に記載の 方法。 ５． 前記マスクがさまざまな不透明度のほぼ平行なストライプを有する請 求項３または４に記載の方法。 ６． 前記マスクが半径方向に延びるストライプを有する請求項４に記載の 方法。 ７． 前記マスクにおいて、ほぼ透明なストライプがほぼ非透明のストライ プと交互に配置する請求項５または６に記載の方法。 ８． 前記ストライプの不透明度が、周期性が見出される方向になめらかに 変化する請求項５または６に記載の方法。 ９． 前記マスクがスパイラル・パターンを有する請求項３または４に記載 の方法。 １０． 前記パターンの前記空間位相を変える前記ステップが、前記マスクを 移動させることを含む請求項３乃至９のいずれか１項に記載の方法。 １１． 前記パターンの前記空間位相を変える前記ステップが、周期性が見出 される方向に前記マスクを移動させることを含む請求項３乃至８のいずれか１項 に記載の方法。 １２． ３つの記録像の前記空間位相が、それぞれφ₀，φ₀＋１２０°，φ₀ ＋２４０°であり、φ₀は任意の位相である請求項１乃至１１のいずれか１項に 記載の方法。 １３． 前記パターンの前記空間位相をほぼ連続的に変化させることを含む請 求項１乃至１２のいずれかl項に記載の方法。 １４． 前記パターンの前記空間位相をほぼ段階的に変化させることを含む請 求項１乃至１２のいずれか１項に記載の方法。 １５． 同一試料の少なくとも３つの像の画像データの処理方法であって、前 記像はその上に重畳されたほぼ周期的なパターンを有し、３つの像の前記パター ンの空間位相は異なり、前記パターンを含まない複合画像を生成するように、前 記データを解析することを含み、 前記記録された像を像のペアにグルーピングし、像の各ペア中の前記記録され た像の間の差の平方の和の平方根を計算することによって、合焦像が得られ、 ３つの像が記録されている場合には、式 （ここで前記３つの記録された像がＩ₁，Ｉ₂およびＩ₃であり、前記合焦像がＩ である） に従って、前記空間パターンが除去される、画像データの処理方法。 １６． 前記パターンが１方向にのみ局部的な周期性を有する請求項１５に記 載の方法。 １７． 光源と、 ほぼ周期的な空間的パターンを生成するパターン形成手段と、 前記光源からの光を試料の上に集束し、前記試料の上に前記パターンを生成す る集束手段と、 前記試料の上に生成された前記パターンの空間位相を調整する位相シフト手段 と、 前記試料の像を検出するための検出器と、 前記パターンの前記空間位相のシフトが少なくとも３つの像で異なっていて、 前記試料の前記少なくとも３つの像を解析する手段と、前記試料の前記３つの像 から前記空間的パターンを除去し、それにより前記試料の光学的切片像を生成す る手段とを有するアナライザと、を有し、 前記記録された像を像のペアにグルーピングし、像の各ペア中の前記記録され た像の間の差の平方の和の平方根を計算することによって、合焦像が得られ、 ３つの像が記録されている場合には、式 （ここで前記３つの記録された像がＩ₁，Ｉ₂およびＩ₃であり、前記合焦像がＩ である） に従って、前記空間パターンが除去される、顕微鏡撮像装置。 １８． 前記パターン形成手段が、前記試料を照明し前記試料の上にほぼ周期 的なパターンを生成する２つのコヒーレント光源を有する請求項１７に記載の装 置。 １９． 前記パターン形成手段が、マスクと、前記試料の上に前記パターンを 投影する手段とを有する請求項１７に記載の装置。 ２０． 前記マスクが１方向にのみ局部的な周期性を有する請求項１９に記載 の装置。 ２１． 前記マスクがさまざまな不透明度のほぼ平行なストライプを有する請 求項１９または２０に記載の装置。 ２２． 前記マスクが半径方向に延びるストライプを有する請求項２０に記戦 の装置。 ２３． 前記マスクにおいて、ほぼ透明なストライプがほぼ非透明のストライ プと交互に配置している請求項２１または２２に記載の装置。 ２４． 前記ストライプの不透明度が、周期性が見出される方向になめらかに 変化する請求項２１または２２に記載の装置。 ２５． 前記ストライプが５μｍ幅と３０μｍ幅の間である請求項２１乃至２ ４のいずれか１項に記載の装置。 ２６． 前記マスクがスパイラル・パターンを有する請求項１９または２０に 記載の装置。 ２７． 前記位相シフト手段が前記マスクを動かすように適合された請求項１ ９乃至２６のいずれか１項に記載の装置。 ２８． 前記位相シフト手段が、周期性が見出される方向に前記マスクを動か すように適合された請求項１９乃至２５のいずれか１項に記載の装置。 ２９． 前記位相シフト手段が、前記パターンの前記位相をほぼ連続的にシフ トするように適合された請求項１７乃至２８のいずれか１項に記載の装置。 ３０． 前記位相シフト手段が、前記パターンの前記位相をほぼ段階的にシフ トするように適合された請求項１７乃至２８のいずれか１項に記載の装置。 ３１． 前記試料の蛍光像を検出するための検出器を有する請求項１７乃至３ ０のいずれか１項に記載の装置。 ３２． ほぼ周期的な空間的パターンを生成するパターン形成手段と、 前記パターンの前記空間位相を調整する位相シフト手段と、 前記パターンの前記空間位相のシフトが少なくとも３つの像で異なっていて、 前記空間的パターンがその上に生成される試料の像を解析するための手段と、前 記３つの像から前記空間的パターンを除去し、それにより前記試料の光学的切片 像を生成する手段を有するアナライザと、を有する、 従来の顕微鏡を請求項１７乃至３０のいずれか１項に記載の装置に改造するよ うに適合された装置。 ３３． 試料の光学的切片像を発生するために従来の顕微鏡を適合させる方法 であって、 前記試料の上にほぼ周期的な空間的パターンを生成するために、顕微鏡の光学 系にパターン形成手段を導入するステップと、 前記試料の上に少なくとも３つの異なる空間的位相シフトパターンを作成する ために、前記パターンの空間位相を調整する空間位相シフト手段を設けるステッ プと、 それぞれ前記パターンの異なる空間位相シフトを有する前記試料の少なくとも ３つの別々な像を解析するための手段と、前記試料の前記像から前記空間的パタ ーンを除去し、それにより前記試料の光学的切片像を生成する手段を有するアナ ライザを設けるステップと、を有し、 前記記録された像を像のペアにグルーピングし、像の各ペア中の前記記録され た像の間の差の平方の和の平方根を計算することによって、合焦像が得られ、 ３つの像が記録されている場合には、式 （ここで前記３つの記録された像がＩ₁，Ｉ₂およびＩ₃であり、前記合焦像がＩ である） に従って、前記空間パターンが除去される、試料の光学的切片像を発生するため に従来の顕微鏡を適合させる方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ネイル、マーク、アンドリュー、アクウィ ラ イギリス国 オーエックス２ ９エルビー オックスフォード ボトレイ ポプラー ロード 22 (72)発明者 ジャッカティス、リンヴィダス イギリス国 オーエックス２ ８エヌティ ー オックスフォード マリオット クロ ーズ ３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 試料の像を生成する方法であって、 前記試料を光源により照明するステップと、 前記試料の上にほぼ周期的な空間的パターンを生成するステップと、 前記試料の第１の像を記録するステップと、 前記試料の上の前記パターンの空間位相を変えて前記試料の第２の像を記録す るステップと、 前記試料の上の前記パターンの前記空間位相を変えて前記試料の第３の像を記 録するステップを少なくとも１回繰り返すステップであって、前記試料の少なく とも３つの記録像における前記パターンの前記空間位相が異なっているステップ と、 前記空間的パターンを前記像から除去し、それにより前記試料の光学的切片像 を生成するために、前記試料の前記３つ以上の記録像を解析するステップと、 を有する試料の像を生成する方法。 ２． 前記試料を照明し前記試料の上にほぼ周期的な空間的パターンを生成 するために、２つのコヒーレント光源が使用される請求項１に記載の方法。 ３． 前記試料の上に前記パターンを投影するマスクを使用するステップを 含む請求項１に記載の方法。 ４． 前記マスクが１方向にのみ局部的な周期性を有する請求項３に記載の 方法。 ５． 前記マスクがさまざまな不透明度のほぼ平行なストライプを有する請 求項３または４に記載の方法。 ６． 前記マスクが半径方向に延びるストライプを有する請求項４に記載の 方法。 ７． 前記マスクにおいて、ほぼ透明なストライプがほぼ非透明のストライ プと交互に配置する請求項５または６に記載の方法。 ８． 前記ストライプの不透明度が、周期性が見出される方向になめらかに 変化する請求項５または６に記載の方法。 ９． 前記マスクがスパイラル・パターンを有する請求項３または４に記載 の方法。 １０． 前記パターンの前記空間位相を変える前記ステップが、前記マスクを 移動させることを含む請求項３乃至９のいずれか１項に記載の方法。 １１． 前記パターンの前記空間位相を変える前記ステップが、周期性が見出 される方向に前記マスクを移動させることを含む請求項３乃至８のいずれか１項 に記載の方法。 １２． ３つの記録像の前記空間位相が、それぞれφ₀，φ₀＋１２０°，φ₀ ＋２４０°であり、φ₀は任意の位相である請求項１乃至１１のいずれか１項に 記載の方法。 １３． 前記パターンの前記空間位相をほぼ連続的に変化させることを含む請 求項１乃至１２のいずれか１項に記載の方法。 １４． 前記パターンの前記空間位相をほぼ段階的に変化させることを含む請 求項１乃至１２のいずれか１項に記載の方法。 １５． 同一試料の少なくとも３つの像の画像データの処理方法であって、前 記像はその上に重畳されたほぼ周期的なパターンを有し、３つの像の前記パター ンの空間位相は異なり、前記パターンを含まない複合画像を生成するように、前 記データを解析することを含む画像データの処理方法。 １６． 前記パターンが１方向にのみ局部的な周期性を有する請求項１５に記 載の方法。 １７． 光源と、 ほぼ周期的な空間的パターンを生成するパターン形成手段と、 前記光源からの光を試料の上に集束し、前記試料の上に前記パターンを生成す る集束手段と、 前記試料の上に生成された前記パターンの空間位相を調整する位相シフト手段 と、 前記試料の像を検出するための検出器と、 前記パターンの前記空間位相のシフトが少なくとも３つの像で異なっていて、 前記試料の前記少なくとも３つの像を解析する手段と、前記試料の前記３つの像 から前記空間的パターンを除去し、それにより前記試料の光学的切片像を生成す る手段とを有するアナライザと、 を有する顕微鏡撮像装置。 １８． 前記パターン形成手段が、前記試料を照明し前記試料の上にほぼ周期 的なパターンを生成する２つのコヒーレント光源を有する請求項１７に記載の装 置。 １９． 前記パターン形成手段が、マスクと、前記試料の上に前記パターンを 投影する手段とを有する請求項１７に記載の装置。 ２０． 前記マスクが１方向にのみ局部的な周期性を有する請求項１９に記載 の装置。 ２１． 前記マスクがさまざまな不透明度のほぼ平行なストライプを有する請 求項１９または２０に記載の装置。 ２２． 前記マスクが半径方向に延びるストライプを有する請求項２０に記載 の装置。 ２３． 前記マスクにおいて、ほぼ透明なストライプがほぼ非透明のストライ プと交互に配置している請求項２１または２２に記載の装置。 ２４． 前記ストライプの不透明度が、周期性が見出される方向になめらかに 変化する請求項２１または２２に記載の装置。 ２５． 前記ストライプが５μｍ幅と３０μｍ幅の間である請求項２１乃至２ ４のいずれか１項に記載の装置。 ２６． 前記マスクがスパイラル・パターンを有する請求項１９または２０に 記載の装置。 ２７． 前記位相シフト手段が前記マスクを動かすように適合された請求項１ ９乃至２６のいずれか１項に記載の装置。 ２８． 前記位相シフト手段が、周期性が見出される方向に前記マスクを動か すように適合された請求項１９乃至２５のいずれか１項に記載の装置。 ２９． 前記位相シフト手段が、前記パターンの前記位相をほぼ連続的にシフ トするように適合された請求項１７乃至２８のいずれか１項に記載の装置。 ３０． 前記位相シフト手段が、前記パターンの前記位相をほぼ段階的にシフ トするように適合された請求項１７乃至２８のいずれか１項に記載の装置。 ３１． 前記試料の蛍光像を検出するための検出器を有する請求項１７乃至３ ０のいずれか１項に記載の装置。 ３２． ほぼ周期的な空間的パターンを生成するパターン形成手段と、 前記パターンの前記空間位相を調整する位相シフト手段と、 前記パターンの前記空間位相のシフトが少なくとも３つの像で異なっていて、 前記空間的パターンがその上に生成される試料の像を解析するための手段と、前 記３つの像から前記空間的パターンを除去し、それにより前記試料の光学的切片 像を生成する手段を有するアナライザと、を有する、 従来の顕微鏡を請求項１７乃至３０のいずれか１項に記載の装置に改造するよ うに適合された装置。 ３３． 試料の光学的切片像を発生するために従来の顕微鏡を適合させる方法 であって、 前記試料の上にほぼ周期的な空間的パターンを生成するために、顕微鏡の光学 系にパターン形成手段を導入するステップと、 前記試料の上に少なくとも３つの異なる空間的位相シフトパターンを作成する ために、前記パターンの空間位相を調整する空間位相シフト手段を設けるステッ プと、 それぞれ前記パターンの異なる空間位相シフトを有する前記試料の少なくとも ３つの別々な像を解析するための手段と、前記試料の前記像から前記空間的パタ ーンを除去し、それにより前記試料の光学的切片像を生成する手段を有するアナ ライザを設けるステップと、 を有する試料の光学的切片像を発生するために従来の顕微鏡を適合させる方法 。