WO2018092248A1

WO2018092248A1 - 標本形状測定装置

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Publication number: WO2018092248A1
Application number: PCT/JP2016/084155
Authority: WO
Inventors: 大平まゆみ; 鈴木良政
Original assignee: オリンパス株式会社
Priority date: 2016-11-17
Filing date: 2016-11-17
Publication date: 2018-05-24
Also published as: US10539411B2; JPWO2018092248A1; US20190265022A1

Abstract

表面の反射率が低い標本であっても、高い精度で標本の表面形状を測定できる標本形状測定装置を提供する。　標本形状測定装置は、光源ユニット２と、照明光学系３と、検出光学系４と、光検出素子５と、処理装置６と、を備え、照明光学系３によって、照明光学系３と検出光学系４との間に光スポットが形成され、光走査ユニット９は、光スポットと標本７とを相対移動させ、照明光学系３により標本７に照射された照明光は、標本７を透過し、標本７から出射した光は検出光学系４に入射し、光検出素子５は、検出光学系４から出射した光を受光し、照明光学系３と検出光学系４の少なくとも一方は、光学部材１５を有し、処理装置は、受光した光に基づく光量を求め、光量と基準の光量との差及び比の少なくとも一方を算出し、差及び比の少なくとも一方から、標本の表面における傾き量を算出し、傾き量から標本の形状を計算する。

Description

標本形状測定装置

　本発明は、標本の表面における傾きや形状を測定する装置に関する。

　試料の外観を観察することができると共に、深度に関する情報が得られる装置として、特許文献１に開示された装置がある。

　特許文献１の装置は、レーザ光源と、走査手段と、対物レンズと、光絞り部と、受光素子と、を有する。受光素子は、標本面からの反射光を検出する。

特開平９－２５１１２８号公報

　特許文献１の装置では、標本から反射した光を検出している。そのため、透明で表面の反射率の低い標本、例えば細胞については、高い精度で深度に関する情報を取得すること、すなわち、標本の表面における傾きや形状を測定することが困難である。

　本発明は、このような課題に鑑みてなされたもので、表面の反射率が低い標本であっても、高い精度で標本の表面形状を測定できる標本形状測定装置を提供することを目的とする。

　上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明の標本形状測定装置は、
　光源ユニットと、照明光学系と、検出光学系と、光検出素子と、処理装置と、を備え、
　照明光学系と検出光学系とは、標本を挟んで対向して配置され、
　光源ユニットから出射した光は、照明光学系に入射し、
　照明光学系によって、照明光学系と検出光学系との間に光スポットが形成され、
　光源ユニットから光検出素子までの光路中に、走査手段が配置され、
　走査手段は、光スポットと標本とを相対移動させ、
　照明光学系により標本に照射された照明光は、標本を透過し、
　標本から出射した光は検出光学系に入射し、
　光検出素子は、検出光学系から出射した光を受光し、
　照明光学系と検出光学系の少なくとも一方は、光学部材を有し、
　処理装置は、
　受光した光に基づく光量を求め、
　光量と基準の光量との差及び比の少なくとも一方を算出し、
　差及び比の少なくとも一方から、標本の表面における傾き量を算出し、
　傾き量から標本の形状を計算することを特徴とする。

　本発明によれば、表面の反射率が低い標本であっても、高い精度で標本の表面形状を測定できる標本形状測定装置を提供することができる。

本実施形態の標本形状測定装置を示す図である。第１例の走査手段を示す図である。第２例の走査手段を示す図である。第３例の走査手段を備えた標本形状測定装置を示す図である。共焦点基板の構造を示す図である。開口部材を示す図である。不透明な部材で構成された開口部材を示す図である。透明な部材で構成された開口部材を示す図である。標本位置における光の屈折の様子を示す図である。照明光学系の瞳の像と開口部材との関係を示す図である。標本位置における光の屈折の様子を示す図である。照明光学系の瞳の像と開口部材との関係を示す図である。標本位置における光の屈折の様子を示す図である。検出光学系の瞳と開口部材の像との関係を示す図である。検出光学系の瞳を通過する光束の様子を示す図である。標本位置における光の屈折の様子を示す図である。検出光学系の瞳と開口部材の像との関係を示す図である。検出光学系の瞳を通過する光束の様子を示す図である。ずれ量Δと面積Ｓとの関係を示すグラフである。対物レンズの瞳に対する開口部材の像のずれを示す図である。透過部の外側に遮光部が形成されている開口部材図である。透過部の外側に遮光部が形成されていない開口部材を示す図である。標本位置における光の屈折の様子を示す図である。対物レンズの瞳と開口部材の像との関係を示す図である。対物レンズの瞳を通過する光束の様子を示す図である。標本位置における光の屈折の様子を示す図である。対物レンズの瞳と開口部材の像との関係を示す図である。対物レンズの瞳を通過する光束の様子を示す図である。標本位置における光の屈折の様子を示す図である。対物レンズの瞳と開口部材の像との関係を示す図である。対物レンズの瞳を通過する光束の様子を示す図である。ずれ量Δ_H1と光束の量Ｉの関係を示すグラフである。対物レンズの瞳に対する開口部材の像のずれを示す図である。変形例１の開口部材を用いたときの照明光の様子を示す図である。変形例１の開口部材を用いたときの結像光の様子を示す図である。変形例２の開口部材を示す図である。変形例３の開口部材を示す図である。変形例４の開口部材を用いたときの照明光の様子を示す図である。変形例４の開口部材を用いたときの結像光の様子を示す図である。変形例５の開口部材を示す図である。変形例６の開口部材を示す図である。本実施形態の別の標本形状測定装置を示す図である。第１の開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。第２の開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。光量がゼロのときの状態を示す図である。対物レンズの瞳に対する開口部材の像のずれを示す図である。対物レンズの瞳を通過する光束の様子を示す図である。本実施形態の別の標本形状測定装置を示す図である。ルックアップテーブルの例である。本実施形態の別の標本形状測定装置を示す図である。照明光の光強度分布を示す図である。照明光の光強度分布を示すグラフである。照明側開口部材を示す図である。検出側開口部材を示す図である。傾斜角θ_sと面積Ｓの関係を表すグラフである。標本形状測定方法のフローチャートである。仮想標本における高さの分布を示す図である。第１の位置における傾斜角の分布を示す図である。第２の位置における傾斜角の分布を示す図である。所定の画素における傾き方向と傾き量を示す図である。仮想標本の高さ分布を示す図である。蛍光画像を生成する方法を示すフローチャートである。第１の装置で連続断層像を取得する様子を示す図である。第２の装置で連続断層像を取得する様子を示す図である。第１の装置による観察の様子を示す図である。第２の装置による観察の様子を示す図である。表示例１を示す図である。表示例２を示す図である。表示例３を示す図である。表示例４を示す図である。表示例５を示す図である。表示例６を示す図である。表示例７を示す図である。標本の蛍光画像である。Ｘ方向における傾斜角の分布を示す画像である。Ｙ方向における傾斜角の分布を示す画像である。標本の高さを示す図である。

　以下に、本発明に係る標本形状測定装置の実施形態及び実施例を、図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施形態及び実施例によりこの発明が限定されるものではない。

　本実施形態の標本形状測定装置は、光源ユニットと、照明光学系と、検出光学系と、光検出素子と、処理装置と、を備え、照明光学系と検出光学系とは、標本を挟んで対向して配置され、光源ユニットから出射した光は、照明光学系に入射し、照明光学系によって、照明光学系と検出光学系との間に光スポットが形成され、光源ユニットから光検出素子までの光路中に、走査手段が配置され、走査手段は、光スポットと標本とを相対移動させ、照明光学系により標本に照射された照明光は、標本を透過し、標本から出射した光は検出光学系に入射し、光検出素子は、検出光学系から出射した光を受光し、照明光学系と検出光学系の少なくとも一方は、光学部材を有し、処理装置は、受光した光に基づく光量を求め、光量と基準の光量との差及び比の少なくとも一方を算出し、差及び比の少なくとも一方から、標本の表面における傾き量を算出し、傾き量から標本の形状を計算することを特徴とする。

　図１は、本実施形態の標本形状測定装置を示す図である。標本形状測定装置１は、光源ユニット２と、照明光学系３と、検出光学系４と、光検出素子５と、処理装置６と、を備える。標本形状測定装置１では、照明光学系３と検出光学系４とは、標本７を挟んで対向して配置されている。

　光源ユニット２は、点光源、又は、面光源を有する。点光源としては、例えば、レーザがある。面光源としては、例えば、ＬＥＤ、水銀ランプ、キセノンランプがある。

　面光源は、微小開口と共に用いられる。微小開口としては、例えば、ピンホールがある。面光源と微小開口の組み合わせによって、点光源から出射した光と実質的に同じ光が、光源ユニット２から出射する。

　光源ユニット２から出射した光（以下、「照明光」という）は、光線分離手段１０に入射する。光線分離手段１０では、入射した照明光が、透過光と反射光とに分かれて出射する。２つの光に分ける方法としては、光強度による分割、偏光方向の違いによる分割、波長の違いによる分割がある。

　光線分離手段１０で反射された照明光は、照明光学系３に入射する。照明光学系３によって、照明光学系３と検出光学系４との間に光スポットが形成される。照明光学系３と検出光学系４との間には、標本７が配置されている。光スポットの位置に標本７の位置を一致させることで、標本７を光スポットで照明することができる。

　光スポットが形成されるためには、照明光が、点光源から出射した光であれば良い。上述のように、光源ユニットで２から出射する光は、点光源から出射した光である。よって、標本形状測定装置１では、光スポットが形成される。

　標本形状測定装置１では、顕微鏡光学系が用いられている。よって、標本形状測定装置１では、照明光学系３として、顕微鏡対物レンズ８（以下、「対物レンズ８」という）が用いられている。

　上述のように、標本７は光スポットで照明される。この場合、標本７上の１点しか照明されない。標本７の全体を照明するためには、光スポットと標本７を相対移動させなくてはならない。光源ユニット２から光検出素子５までの光路中に、走査手段を配置することで、光スポットと標本７を相対移動させることができる。

　標本形状測定装置１では、走査手段として、光源ユニット２と照明光学系３との間の光路に、光走査ユニット９が配置されている。光走査ユニット９は、２つの光偏向素子で構成されている。光偏向素子としては、ガルバノメータスキャナ、ポリゴンスキャナ、音響光偏向素子がある。

　光走査ユニット９では、光走査ユニット９に入射した光が、直交する２方向、例えば、Ｘ方向とＹ方向に偏向される。このように、光走査ユニット９で、走査パターンが生成される。

　光走査ユニット９と対物レンズ８との間には、瞳投影光学系１１が配置されている。瞳投影光学系１１は、レンズ１２とレンズ１３とで構成されている。瞳投影光学系１１によって、光走査ユニット９と対物レンズ８の瞳とが共役になっている。

　２つの光偏向素子が近接している場合、一方の偏向素子の偏向面から他方の偏向素子の偏向面までの間の任意の位置が、対物レンズ８の瞳位置と共役になっている。２つの偏向素子の間にレンズが配置されている場合、一方の偏向素子の偏向面と他方の偏向素子の偏向面の両方が、対物レンズ８の瞳と共役になっている。

　光走査ユニット９で生成された走査パターンは、対物レンズ８の瞳に投影される。この走査パターンに基づいて、光スポットが標本７上を移動していく。このとき、光スポットだけが移動し、標本７は移動しない。

　このように、標本形状測定装置１では、光軸と直交する面内で、光スポットと標本７とが相対移動する。その結果、離散的又は連続的に、標本を光スポットで走査することができる。

　標本７を透過した光（以下、「結像光」という）は、検出光学系４に入射する。上述のように、本実施形態の標本形状測定装置では、照明光学系と検出光学系の少なくとも一方に光学部材が配置されていれば良い。標本形状測定装置１では、光学部材１５が検出光学系４に配置されている。

　検出光学系４は、瞳投影レンズ１４、光学部材１５、レンズ１６、及びレンズ１７を有する。瞳投影レンズ１４として、例えば、顕微鏡のコンデンサレンズを用いることができる。

　検出光学系４に入射した結像光は、瞳投影レンズ１４と光学部材１５を通過して、レンズ１６に入射する。レンズ１６に入射した結像光は、レンズ１７を通過して、光検出素子５の受光面に到達する。

　レンズ１６とレンズ１７によって、瞳投影レンズ１４の瞳位置と光検出素子５の位置とが共役になっている。また、上述のように、光走査ユニット９と対物レンズ８の瞳位置とが共役になっている。更に、対物レンズ８の瞳位置と瞳投影レンズ１４の瞳位置とが共役になっている。よって、標本形状測定装置１では、光走査ユニット９と光検出素子５の位置とが共役になっている。

　光走査ユニット９では、照明光の偏向が行われる。この偏向では、照明光と光軸とのなす角が変化する。ただし、光軸と直交する面内では、照明光の位置は変化しない。上述のように、光走査ユニット９と光検出素子５の位置とが共役になっている。よって、光検出素子５では、受光面に入射する結像光の入射角度は変化するが、受光面における入射位置は変化しない。

　光検出素子５では、光電変換が行われる。結像光は電気信号に変換され、これにより、標本７の画像信号が生成される。標本７の画像信号は、処理装置６に入力される。処理装置６では、様々な処理が行われる。

　本実施形態の標本形状測定装置は、標本からの放射光を検出するための第２の光検出素子を更に備え、第２の光検出素子で蛍光の検出を行うことが好ましい。

　標本７に照明光が照射されると、標本７で反射光が生じる。また、標本が蛍光染色されている場合、標本７から蛍光が発生する。よって、これらの光を用いて光学像を形成することができる。

　反射光や蛍光の一部は、照明光学系３に入射する。照明光学系３に入射した光は、瞳投影光学系１１と光走査ユニット９を通過して、光線分離手段１０に入射する。

　光線分離手段１０に入射した光は、光線分離手段１０を通過して、共焦点レンズ１８で集光される。集光位置には、共焦点ピンホール１９が配置されている。共焦点ピンホール１９を通過した光は、光検出器２０で検出される。

　光検出器２０は、第２の光検出素子である。光検出器２０では、標本７から反射した光や蛍光が検出される。よって、標本７の反射像や標本７の蛍光像を得ることができる。

　光検出器２０では、光電変換が行われる。共焦点ピンホール１９を通過した光は電気信号に変換され、これにより、標本７の画像信号が生成される。この時の画像信号は、共焦点画像の信号である。

　本実施形態の標本形状測定装置では、光検出器２０を備えているので、一度の照明で、標本の表面形状を測定した画像と蛍光画像とを、取得することが可能である。また、標本の表面形状を測定した画像と蛍光画像とを重ね合わせることで、２つの画像を同時に観察することができる。この場合、２つの画像を正確に重ね合わせることが可能である。

　標本形状測定装置１では、走査手段として、２つの光偏向素子が用いられている。しかしながら、走査手段はこれに限られない。別の走査手段について説明する。

　第１例の走査手段について説明する。図２Ａは、第１例の走査手段を示す図である。第１例の走査手段では、一方の方向の走査を光スポットの移動で行い、他方の方向の走査をステージの移動で行う。よって、第１例の走査手段では、光スポットと標本が共に移動する。

　第１例の走査手段では、光源ユニットと照明光学系との間の光路に、光走査ユニットが配置されている。光走査ユニットは、１つの光偏向素子で構成されている。また、保持部材３１上に、移動ステージ３２が載置されている。標本は、移動ステージ３２上に載置されている。

　第１例の走査手段では、光偏向素子によって、照明光３０をＸ方向に移動させる。また、移動ステージ３２によって、標本をＹ方向に移動させる。このようにすることで、離散的又は連続的に、標本を光スポットで走査することができる。

　第２例の走査手段について説明する。図２Ｂは、第２例の走査手段を示す図である。第２例の走査手段では、一方の方向の走査と他方の方向の走査を、共にステージの移動で行う。よって、第２例の走査手段では、光スポットは移動せず、標本のみが移動する。

　第２例の走査手段では、保持部材３１上に、移動ステージ３２と移動ステージ３３とが載置されている。標本は、移動ステージ３３上に載置されている。光源ユニットと照明光学系との間の光路に、光走査ユニットは配置されていない。

　第２例の走査手段では、照明光３０は移動しない。その代わりに、移動ステージ３２によって標本をＹ方向に移動させると共に、移動ステージ３３によって標本をＸ方向に移動させる。このようにすることで、離散的又は連続的に、標本を光スポットで走査することができる。

　第３例の走査手段について説明する。図３は、第３例の走査手段を備えた標本形状測定装置を示す図である。図１と同じ構成には、図１と同じ番号を付し、説明は省略する。

　標本形状測定装置４０は、光源ユニット４１と、照明光学系３と、検出光学系４と、光検出素子５と、処理装置６と、を備える。標本形状測定装置４０は、第３例の走査手段として、共焦点基板４２を有する。共焦点基板４２は、光源ユニット４１と照明光学系３との間の光路に、配置されている。

　光源ユニット４１は、点光源、又は、面光源を有する。光源ユニット４１から出射した光は、点光源から出射した光と面光源から出射した光のどちらでも良い。ここでは、光源ユニット４１から出射した光は、点光源から出射した光とする。

　光源ユニット４１から出射した光は、コリメータレンズ４４により、略平行な光となる。略平行になった光は、ビームスプリッタ４５で反射されて、共焦点基板４２に照射される。共焦点基板４２は、モータ（不図示）によって、軸４３の周りに回転可能になっている。

　図４は、共焦点基板の構造を示す図である。共焦点基板４２は円形の平板であって、遮光部４２ａと透過部４２ｂとを備えている。遮光部４２ａは不透明な部材、例えば、金属板で構成されている。透過部４２ｂは金属板に形成された空隙（孔）である。

　共焦点基板４２は、例えば、ガラス板や樹脂板で構成されていても良い。遮光部４２ａは、例えば、遮光塗料をガラス板上に塗布することで形成されている。一方、透過部４２ｂには何も塗布されていない。よって、透過部４２ｂはガラス板そのものである。

　透過部４２ｂの大きさは、非常に小さい。よって、透過部４２ｂからは、点光源から出射した光と実質的に同じ光が出射する。また、透過部４２ｂは、複数形成されている。共焦点基板４２に照射される光の径は、複数の透過部４２ｂを含むように設定されている。そのため、共焦点基板４２の複数の箇所から、点光源から出射した光と実質的に同じ光が出射する。

　共焦点基板４２から出射した光は、結像レンズ４６を通過して、対物レンズ８に入射する。対物レンズ８に入射した光は、標本７に照射される。標本形状測定装置４０では、共焦点基板４２の位置と標本７の位置とが共役になっている。そのため、標本７上に、複数の光スポットが生成される。

　上述のように、共焦点基板４２は、軸４３の周りに回転可能になっている。共焦点基板４２を回転させると、標本７上に形成された複数の光スポットが移動する。その結果、連続的に、標本を光スポットで走査することができる。

　標本７を透過した光は、検出光学系４を介して、光検出素子５の受光面に入射する。標本形状測定装置４０では、標本７上に、複数の光スポットが生成される。よって、光検出素子５の位置は、標本７の位置と共役になっている。

　標本７で反射された光や、標本７で発生した蛍光は、対物レンズ８、結像レンズ４６を通過して、共焦点基板４２に入射する。これらの光は、透過部４２ｂとビームスプリッタ４５を通過して、レンズ４７で集光される。

　集光位置には、光検出器４８が配置されている。レンズ４７で集光された光は、光検出器４８で検出される。透過部４２ｂは、ピンホールと見なすことができる。よって、光検出器４８から、共焦点画像の信号が得られる。

　光学部材１５について説明する。光学部材１５は、遮光部又は減光部と、透過部と、を有する開口部材である。開口部材の構造について説明する。

　図５は、開口部材を示す図である。開口部材４９は、遮光部４９ａと透過部４９ｂとを有する。開口部材４９の形状は、円形の部材の一部を切り取った形状になっている。切り取られた部分が、透過部４９ｂである。遮光部４９ａの形状は弓形である。

　別の開口部材の構成を図６Ａ、図６Ｂに示す。図６Ａは不透明な部材で構成された開口部材を示し、図６Ｂは透明な部材で構成された開口部材を示している。

　図６Ａに示すように、開口部材５０は、遮光部５０ａ１と透過部５０ｂとを有する。更に、開口部材５０は遮光部５０ａ２を有する。遮光部５０ａ１と５０ａ２は不透明な部材、例えば、金属板で構成されている。透過部５０ｂは金属板に形成された空隙（孔）である。

　開口部材５０では、遮光部５０ａ１を保持するために、遮光部５０ａ１と遮光部５０ａ２との間に接続部５０ａ３が３つ形成されている。そのため、透過部５０ｂは３つに分かれている。透過部５０ｂの各々の形状は略扇状（離散的な輪帯形状）になっている。なお、接続部５０ａ３の数は３つに限定されない。

　開口部材５０は、遮光部５０ａ１が照明光学系の光軸を含むように配置されている。また、遮光部５０ａ１の外縁５０ｃは、照明光学系の光軸から所定の距離だけ離れた位置にある。よって、開口部材５０に入射した照明光は、光束の中心が遮光部５０ａ１によって遮光される。ここで、遮光部５０ａ１と透過部５０ｂとの境が、遮光部５０ａ１の外縁５０ｃになる。

　遮光部５０ａ２は、遮光部５０ａ１や透過部５０ｂよりも外側（光軸から離れる方向）に位置している。ここで、透過部５０ｂと遮光部５０ａ２との境が、遮光部５０ａ２の内縁５０ｄになる。

　透過部５０ｂは、遮光部５０ａ１の外縁５０ｃよりも外側に位置している。ここで、遮光部５０ａ１と透過部５０ｂとの境が、透過部５０ｂの内縁になる。また、透過部５０ｂと遮光部５０ａ２との境が、透過部５０ｂの外縁になる。よって、５０ｃは、遮光部５０ａ１の外縁と透過部５０ｂの内縁とを示し、５０ｄは、遮光部５０ａ２の内縁と透過部５０ｂの外縁とを示している。

　また、図６Ｂに示すように、開口部材５０’は、遮光部５０’ａ１と透過部５０’ｂとを有する。更に、開口部材５０’は遮光部５０’ａ２を有する。遮光部５０’ａ１、５０’ａ２及び透過部５０’ｂは透明な部材、例えば、ガラス板や樹脂板で構成されている。遮光部５０’ａ１と５０’ａ２は、例えば、遮光塗料をガラス板上に塗布することで形成されている。一方、透過部５０’ｂには何も塗布されていない。よって、透過部５０’ｂはガラス板そのものである。

　開口部材５０’では、透過部５０’ｂの形状は円環になっている。これは、遮光部５０’ａ２を保持する必要が無いからである。そのため、開口部材５０’では、遮光部５０’ａ１と遮光部５０’ａ２との間に接続部は形成されていない。

　なお、開口部材５０’と開口部材５０との主な違いは、材料と接続部の有無である。よって、遮光部５０’ａ１、５０’ａ２及び透過部５０’ｂについての詳細な説明は省略する。

　なお、開口部材５０の遮光部５０ａ２と接続部５０ａ３や開口部材５０’の遮光部５０’ａ２は、必ずしも必要ではない。例えば、照明光の光束径（直径）を、透過部５０ｂの外縁や透過部５０’ｂの外縁と一致させるようにすれば良い。

　以上のように、開口部材５０、５０’は遮光部５０ａ１、５０’ａ１と透過部５０ｂ、５０’ｂとを備えている。よって、開口部材５０、５０’からは、略円環状又は円環状（以下、適宜、「円環状」という）の照明光が出射する。

　光学部材１５によって生じる作用について説明する。本実施形態の標本形状測定装置では、照明光学系と検出光学系の少なくとも一方に光学部材が配置されている。ここでは、検出光学系に光学部材が配置されている場合について説明する。光学部材には、図６Ｂに示した開口部材５０’が用いられている。

　開口部材５０’は、遮光部５０’ａ１と、遮光部５０’ａ２と、透過部５０’ｂと、を有する。開口部材５０’は、遮光部５０’ａ１が検出光学系４の光軸を含むように配置されている。透過部５０’ｂは、遮光部５０’ａ１の外縁よりも外側に位置している。

　図７Ａは標本位置における光の屈折の様子を示す図、図７Ｂは照明光学系の瞳の像と開口部材との関係を示す図である。図７Ａと図７Ｂは、標本が存在しない場合を示している。標本が存在しない場合には、標本は存在するものの、その表面が平坦になっている場合が含まれる。

　図８Ａは標本位置における光の屈折の様子を示す図、図８Ｂは照明光学系の瞳の像と開口部材との関係を示す図である。図８Ａと図８Ｂは、標本が存在する場合を示している。標本が存在する場合とは、標本の表面が傾斜している（非平坦になっている）場合である。よって、標本は存在するものの、その表面が平坦になっている場合は、標本が存在する場合に含まれない。

　標本が存在しない場合、図７Ａに示すように、保持部材５５へ入射する光と保持部材５５から出射する光とは、光の進行方向が同じになる。その結果、瞳投影レンズ１４の瞳位置、すなわち、光学部材１５の位置に形成される対物レンズの瞳の像は、図７Ｂに示すようになる。なお、符号５８で示す円（円周）は対物レンズの外縁像で、円（円周）の内側が対物レンズの瞳の像になる。

　図７Ｂに示すように、透過部５６の形状は円環で、遮光部５７の形状は円で、外縁像５８の形状は円である。そして、透過部５６と、遮光部５７と、外縁像５８とが同心状になっている。また、透過部５６の中心と、遮光部５７の中心と、外縁像５８の中心とは一致している。

　ここで、透過部５６の中心とは、透過部の外縁５６ａを形作る円の中心のことである（透過部５６は円環なので、透過部５６の中心は、透過部の内縁５６ｂを形作る円の中心でもある）。

　外縁像５８は、透過部の内縁５６ｂよりも外側（光軸から離れる方向）に位置すると共に、透過部の外縁５６ａよりも内側（光軸に近づく方向）に位置している。このように、本実施形態の標本形状測定装置では、透過部の内縁５６ｂと透過部の外縁５６ａとの間に、対物レンズの瞳の外縁像５８が形成される。

　ここで、外縁像５８よりも外側の光は、対物レンズ８から出射しないので、透過部５６を通過しない。よって、透過部５６を通過する光束の領域は、透過部の内縁５６ｂから外縁像５８までの間の領域になる。そして、この領域全体の面積が、標本像の明るさに対応する。

　一方、標本が存在する場合、図８Ａに示すように、保持部材５５へ入射する光と保持部材５５から出射する光とは、光の進行方向が異なる。その結果、光学部材１５の位置に形成される対物レンズの瞳の像は、図８Ｂに示すようになる。図８Ｂにおいても、符号５８で示す円（円周）は外縁像で、円（円周）の内側が対物レンズの瞳の像になる。

　図８Ｂに示すように、透過部５６の形状は円環で、遮光部５７の形状は円で、外縁像５８の形状は円である。ただし、透過部５６及び遮光部５７と、外縁像５８とは同心状になっていない。また、透過部５６の中心及び遮光部５７の中心と、外縁像５８の中心とは一致していない。すなわち、透過部５６の中心及び遮光部５７の中心に対して、外縁像５８の中心は紙面内の左方向にずれている。

　図８Ｂにおいても、外縁像５８よりも外側の光は、対物レンズ８から出射しないので、透過部５６を通過しない。よって、透過部５６を通過する光束の領域は、透過部の内縁５６ｂから外縁像５８までの間の領域になる。そして、この領域全体の面積が、標本像の明るさに対応する。

　ここで、外縁像５８は、透過部の内縁５６ｂよりも外側に位置している。言い換えると、図８Ｂでは、遮光部５７は、外縁像５８の内側に位置している。これは、標本の表面の傾斜が小さいからである。一方、標本が存在しない場合でも、遮光部５７は、外縁像５８の内側に位置している。そのため、標本が存在する場合であっても、標本の表面の傾斜が小さいと、標本像の明るさは、標本が存在しない場合と同じになる。

　しかしながら、標本の表面の傾斜が更に大きくなると、透過部５６の中心に対する外縁像５８の中心のずれが更に大きくなる。この場合、外縁像５８の一部が、透過部の内縁５６ｂよりも内側に位置するようになる。また、外縁像５８の一部が、透過部の外縁５６ａよりも外側に位置するようになる。言い換えると、外縁像５８の一部が、遮光部５７の内側に位置する。その結果、透過部５６を通過する光束の領域は大きく変化する。すなわち、標本が存在する場合と標本が存在しない場合とで、標本像の明るさが異なる。

　以上、検出光学系に光学部材が配置されている場合について説明した。ただし、光学部材は、照明光学系に配置されていても良い。照明光学系に光学部材が配置されている場合について説明する。光学部材には、図６Ｂに示した開口部材５０’が用いられている。

　図９Ａは標本位置における光の屈折の様子を示す図、図９Ｂは検出光学系の瞳と開口部材の像との関係を示す図、図９Ｃは検出光学系の瞳を通過する光束の様子を示す図である。図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃは、標本が存在しない場合を示している。標本が存在しない場合には、標本は存在するものの、その表面が平坦になっている場合が含まれる。

　図１０Ａは標本位置における光の屈折の様子を示す図、図１０Ｂは検出光学系の瞳と開口部材の像との関係を示す図、図１０Ｃは検出光学系の瞳を通過する光束の様子を示す図である。図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃは、標本が存在する場合を示している。標本が存在する場合とは、標本の表面が傾斜している（非平坦になっている）場合である。よって、標本は存在するものの、その表面が平坦になっている場合は、標本が存在する場合に含まれない。

　標本が存在しない場合、図９Ａに示すように、保持部材５５へ入射する光と保持部材５５から出射する光とは、光の進行方向が同じになる。その結果、瞳投影レンズ１４の瞳位置に形成される開口部材の像は、図９Ｂに示すようになる。なお、符号６２で示す円（円周）は瞳投影レンズの瞳の外縁で、円（円周）の内側が瞳投影レンズの瞳になる。

　図９Ａに示すように、透過部の像６０の形状は円環で、遮光部の像６１の形状は円で、外縁６２の形状は円である。そして、透過部の像６０と、遮光部の像６１と、外縁６２とが同心状になっている。また、透過部の像６０の中心と、遮光部の像６１の中心と、外縁６２の中心とは一致している。遮光部の像６１は、例えば、開口部材５０や開口部材５０’における遮光部５０ａ１や５０’ａ１の像である。

　ここで、透過部の像６０の中心とは、透過部の外縁の像６０ａを形作る円の中心のことである（透過部の像６０は円環なので、透過部の像６０の中心は、透過部の内縁の像６０ｂを形作る円の中心でもある）。

　そして、透過部の内縁の像６０ｂは、外縁６２よりも内側（光軸に近づく方向）に位置している。また、透過部の外縁の像６０ａは、外縁６２の外縁よりも外側（光軸から離れる方向）に位置している。このように、本実施形態の標本形状測定装置では、外縁６２よりも内側に、透過部の内縁の像６０ｂが形成され、外縁６２よりも外側に、透過部の外縁の像６０ａが形成される。

　ここで、外縁６２よりも外側の光は、瞳投影レンズの瞳を通過しない（瞳投影レンズから出射しない）。よって、瞳投影レンズの瞳を通過する光束の領域は、図９Ｃに示すように、透過部の内縁の像６０ｂから外縁６２までの間の領域になる。そして、この領域全体の面積が、標本像の明るさに対応する。

　一方、標本が存在する場合、図１０Ａに示すように、保持部材５５へ入射する光と保持部材５５から出射する光とは、光の進行方向が異なる。その結果、瞳投影レンズの瞳位置に形成される開口部材の像は、図１０Ｂに示すようになる。なお、図１０Ｂにおいても、符号６２で示す円（円周）は瞳投影レンズの瞳の外縁で、円（円周）の内側が瞳投影レンズの瞳になる。

　図１０Ｂに示すように、透過部の像６０の形状は円環で、遮光部の像６１の形状は円で、外縁６２の形状は円である。ただし、透過部の像６０及び遮光部の像６１と、外縁６２とは同心状になっていない。また、透過部の像６０の中心及び遮光部の像６１の中心と、外縁６２の中心とは一致していない。すなわち外縁６２の中心に対して、透過部の像６０の中心及び遮光部の像６１の中心は紙面内の左方向にずれている。

　また、瞳投影レンズの瞳を通過する光束の領域は、図１０Ｃに示すように、透過部の内縁の像６０ｂから外縁６２までの間の領域になる。そして、この領域全体の面積が、標本像の明るさに対応する。

　ここで、図１０Ｂでは、透過部の内縁の像６０ｂは、外縁６２の内側に位置している。言い換えると、図１０Ｂでは、遮光部の像６１は、外縁６２の内側に位置している。これは、標本の表面の傾斜が小さいからである。一方、標本が存在しない場合でも、遮光部の像６１は、外縁６２の内側に位置している。そのため、標本が存在する場合であっても、標本の表面の傾斜が小さいと、標本像の明るさは、標本が存在しない場合と同じになる。

　しかしながら、標本の表面の傾斜が更に大きくなると、瞳投影レンズの瞳の中心に対する透過部の像６０の中心のずれ（以下、適宜、「透過部の像のずれ」という）が更に大きくなる。この場合、後述（図１０Ｂ）するように、透過部の内縁の像６０ｂの一部が、外縁６２よりも外側に位置するようになる。また、透過部の外縁の像６０ａの一部が、外縁６２よりも内側に位置するようになる。言い換えると、遮光部の像６１の一部が、外縁６２の外側に位置する。その結果、瞳投影レンズの瞳を通過する光束の領域は大きく変化する。すなわち、標本が存在しない場合と、標本像の明るさが異なる。

　照明光学系に光学部材が配置されている場合、瞳投影レンズの瞳に対して、光学部材の像、すなわち、開口部材の像がずれる。ずれ量Δを、瞳投影レンズの瞳に対する開口部材の像のずれ量とし、面積Ｓを、瞳投影レンズの瞳を通過する光束の面積とする。ずれ量Δを変化させると、面積Ｓも変化する。図１１Ａは、ずれ量Δと面積Ｓとの関係を示すグラフである。図１１Ｂは、対物レンズの瞳に対する開口部材の像のずれを示す図である。

　図１１Ａでは、Ｒ’0×β＝０．９７×ＲPL、Ｒ’1×β＝１．１５×ＲPLで、計算を行っている。ここで、
　Ｒ’0は、照明光学系の光軸から透過部の内縁までの長さ、
　Ｒ’1は、照明光学系の光軸から透過部の外縁までの長さ、
　ＲPLは、瞳投影レンズの瞳の半径、
　βは、瞳投影レンズの焦点距離を対物レンズの焦点距離で割った値、
である。

　また、透過部の透過率は１００％にしている。また、図１１Ａにおいて、横軸の数値は、ずれ量Δを瞳投影レンズの瞳の半径ＲPLで規格化している。また、縦軸の数値は、ずれ量Δが０のときの面積（π（ＲPL^２－（Ｒ0×β）^２））で規格化している。

　なお、面積Ｓは瞳投影レンズの瞳を通過する光束の範囲を示している。よって、面積Ｓは光束の量Ｉに置き換えることができる。そこで、図１１Ａでは、縦軸の変数としてＩを用いている。

　標本が存在しない場合（あるいは、標本の表面が平坦な場合）、ずれ量Δは０である。この場合、対物レンズの瞳と開口部材の像との関係は、図１１Ｂの（Ａ）のようになる。よって、矢印Ａで示すように、光束の量Ｉは１になる。

　次に、標本が存在する場合、ずれ量Δは０でない。ここで、標本の表面の傾斜が小さいと、瞳投影レンズの瞳と開口部材の像との関係は、図１１Ｂの（Ｂ）のようになる。しかしながら、図１１Ｂの（Ａ）と図１１Ｂの（Ｂ）とでは、遮光部の像の位置は瞳投影レンズの瞳内において異なっているものの、どちらも、瞳投影レンズの瞳の外縁の内側に遮光部の像が位置している。そのため、矢印Ｂで示すように、光束の量Ｉは１になる。

　一方、標本の表面の傾斜が大きいと、瞳投影レンズの瞳と開口部材の像との関係は、図１１Ｂの（Ｃ）のようになる。この場合、遮光部の像の一部が瞳投影レンズの瞳の外側に位置する状態になる。そのため、矢印Ｃで示すように、光束の量Ｉは１よりも大きくなる。

　このように、本実施形態の標本形状測定装置では、矢印Ｂから矢印Ｃまでの間で、ずれ量Δの変化に応じて光束の量Ｉが変化する。そのため、本実施形態の標本形状測定装置によれば、標本における形状の変化を明暗の変化として検出できる。

　なお、「瞳投影レンズの瞳の外縁よりも内側に、透過部の内縁の像が形成される」には、図１１Ｂの（Ｂ）で示すように、瞳投影レンズの瞳の外縁よりも内側に、透過部の内縁の像が全部含まれる場合のみならず、図１１Ｂの（Ｃ）で示すように、透過部の内縁の像が一部含まれる場合も含まれる。

　更に、別の開口部材の構成を、図１２Ａ、図１２Ｂに示す。図１２Ａは透過部の外側に遮光部が形成されている開口部材示す図、図１２Ｂは透過部の外側に遮光部が形成されていない開口部材を示す図である。なお、遮光部の代わりに減光部を用いても良い。

　まず、開口部材９０について説明する。図１２Ａに示すように、開口部材９０は、遮光部９０ａ１と、遮光部９０ａ２と、透過部９０ｂと、を有する。なお、図１２Ａでは、説明上、遮光部９０ａ１と遮光部９０ａ２とを区別して描いている。しかしながら、両者を区別しなくても良い。よって、遮光部９０ａ１と遮光部９０ａ２は単一の部材で構成されていても良い。

　開口部材９０では、遮光部９０ａ１と遮光部９０ａ２は不透明な部材、例えば、金属板で構成されている。この場合、透過部９０ｂは金属板に形成された空隙（孔）である。あるいは、遮光部９０ａ１、９０ａ２及び透過部９０ｂは透明な部材、例えば、ガラス板や樹脂板で構成されている。この場合、遮光部９０ａ１と遮光部９０ａ２は、例えば、遮光塗料をガラス板上に塗布することで形成されている。一方、透過部９０ｂには何も塗布されていない。よって、透過部９０ｂはガラス板そのものである。

　遮光部９０ａ１は、照明光学系の光軸ＡＸ_iを含むように形成されている。遮光部９０ａ１の形状は、第１の外縁９０ｃと第２の外縁９０ｄとで規定される。第１の外縁９０ｃの両端は、第２の外縁９０ｄを介して繋がっている。図１２Ａでは、第１の外縁９０ｃは円周の一部で、第２の外縁９０ｄは直線である。第１の外縁９０ｃと第２の外縁９０ｄとで示されるように、遮光部９０ａ１の形状は円の一部を切り取った形状で、いわゆるＤカット状になっている。

　透過部９０ｂの形状は、外縁９０ｅと内縁９０ｆとによって規定される。外縁９０ｅの両端は、内縁９０ｆを介して繋がっている。図１２Ａでは、外縁９０ｅは円周の一部で、内縁９０ｆは直線である。外縁９０ｅと内縁９０ｆとで示されるように、透過部９０ｂの形状は円の一部を切り取った形状で、弓状になっている。

　遮光部９０ａ２の形状は円環である。遮光部９０ａ２は必ずしも設ける必要はないが、遮光部９０ａ１よりも外側に遮光部９０ａ２を設けることで、外縁９０ｅがより明確になる。これにより、開口部材９０に入射させる光束の径を外縁９０ｅより大きくしても、開口部材９０に入射した光束は、透過部９０ｂを通過する際に外縁９０ｅによって制限を受ける。

　そのため、開口部材９０から出射する光束の最大径は、外縁９０ｅによって決まる径になる。その結果、次に述べる開口部材９０’に比べると、開口部材９０に入射させる光束の径を、外縁９０ｅに対して高い精度で一致させる必要がない。

　次に、開口部材９０’について説明する。図１２Ｂに示すように、開口部材９０’は遮光部９０’ａ１を有する。開口部材９０’では、開口部材９０と同様に、遮光部９０’ａ１は不透明な部材、例えば、金属板で構成することができる。あるいは、遮光部９０’ａ１は透明な部材、例えば、ガラス板や樹脂板で構成しても良い。遮光部９０’ａ１は、例えば、遮光塗料をガラス板上に塗布することで形成されている。

　遮光部９０’ａ１は、検出光学系の光軸ＡＸ_iを含むように形成されている。遮光部９０’ａ１の形状は、第１の外縁９０’ｃと第２の外縁９０’ｄとで規定される。第１の外縁９０’ｃの両端は、第２の外縁９０’ｄを介して繋がっている。図１２Ｂでは、第１の外縁９０’ｃは円周の一部で、第２の外縁９０’ｄは直線である。第１の外縁９０’ｃと第２の外縁９０’ｄとで示されるように、遮光部９０’ａ１の形状は円の一部を切り取った形状で、いわゆるＤカット状になっている。

　透過部９０’ｂの形状は、外縁９０’ｅと内縁９０’ｆとによって規定される。外縁９０’ｅの両端は、内縁９０’ｆを介して繋がっている。図１２Ｂでは、外縁９０’ｅは円周の一部で、内縁９０’ｆは直線である。外縁９０’ｅと内縁９０’ｆとで示されるように、透過部９０’ｂの形状は円の一部を切り取った形状で、弓状になっている。

　以上のように、透過部９０ｂと透過部９０’ｂの形状は、いずれも、円の一部を切り取った形状になっている。そのため、透過部９０ｂと透過部９０’ｂは、いずれも、照明光学系の光軸ＡＸ_iに対して非対称に配置されているということができる。

　なお、開口部材９０’を金属板で構成する場合、透過部９０’ｂは物理的に存在しない。そのため、透過部９０’ｂの外縁が物理的に存在しなくなる。また、開口部材９０’を透明な部材で構成する場合、透明部材の形状を遮光部９０’ａ１の形状と同じにすると、透過部９０’ｂは物理的に存在しない。そのため、透過部９０’ｂの外縁が物理的に存在しなくなる。

　一方、透明な部材の形状を円にすると、透過部９０’ｂが物理的に存在する。この場合、透明部材の縁が透過部９０’ｂの外縁になるので、透過部９０’ｂの外縁が物理的に存在する。しかしながら、透過部９０’ｂは透明であるので、光学的には、開口部材９０’を金属板で構成した場合と実質的に同じである。よって、透明な部材の形状を円にした場合も、透過部９０’ｂの外縁が物理的に存在しているとは言い難い。

　そこで、開口部材９０’を用いる場合は、開口部材９０に入射させる光束の径を、第１の外縁９０’ｃと一致させるようにすれば良い。この場合、光束の最も外側が透過部９０’ｂの外縁になる。また、透過部９０’ｂの内縁は第２の外縁９０’ｄと同じである。以上のことから、光束の最も外側と第２の外縁９０’ｄとを用いて、透過部９０’ｂの形状を規定することができる。

　上述のように、本実施形態の標本形状測定装置では、照明光学系と検出光学系の少なくとも一方に光学部材が配置されている。よって、開口部材９０や開口部材９０’は、検出光学系に配置されていても良い。この場合、透過部は、検出光学系の光軸に対して非対称に配置されていることになる。

　開口部材９０や開口部材９０’によって生じる作用について説明する。ここでは、検出光学系に光学部材が配置されている場合について説明する。前述の開口部材５０’を用いた例では、瞳投影レンズの瞳の位置での様子を説明した。以下の説明では、対物レンズの瞳の位置での様子について説明する。

　対物レンズの瞳と開口部材の像との関係について説明する。なお、以下の説明では、図１２Ａに示す開口部材９０と同じ構造を持つ開口部材が用いられているものとする。

　開口部材９０において、第２の外縁９０ｄあるいは内縁９０ｆは、遮光部９０ａ１と透過部９０ｂとを区切る境界である。ここで、この境界に対して垂直な軸を第１の軸とし、境界と平行な軸を第２の軸とする。図１２Ａでは、第１の軸は紙面内の左右方向の軸で、第２の軸は紙面内の上下方向の軸になる。以下の説明では、第１の軸と第２の軸を用いて説明する。

　図１３Ａは標本位置における光の屈折の様子を示す図、図１３Ｂは対物レンズの瞳と開口部材の像との関係を示す図、図１３Ｃは対物レンズの瞳を通過する光束の様子を示す図である。図１３Ａでは、標本は存在していない。標本が存在しない場合には、標本は存在するものの、その表面が平坦になっている場合が含まれる。

　図１４Ａは標本位置における光の屈折の様子を示す図、図１４Ｂは対物レンズの瞳と開口部材の像との関係を示す図、図１４Ｃは対物レンズの瞳を通過する光束の様子を示す図である。図１４Ａでは、標本の表面の傾斜は右肩上がり、すなわち、標本の表面は第１の軸の左側から右側に向かって高くなっている。

　図１５Ａは標本位置における光の屈折の様子を示す図、図１５Ｂは対物レンズの瞳と開口部材の像との関係を示す図、図１５Ｃは対物レンズの瞳を通過する光束の様子を示す図である。図１５Ａでは、標本の表面の傾斜は右肩下がり、すなわち、標本の表面は第１の軸の左側から右側に向かって低くなっている。

　標本が存在する場合とは、標本の表面が傾斜している（非平坦になっている）場合である。よって、標本は存在するものの、その表面が平坦になっている場合は、標本が存在する場合に含まれない。

　標本が存在しない場合、図１３Ａに示すように、保持部材５５へ入射する光と保持部材５５から出射する光とは、光の進行方向が同じになる。その結果、対物レンズの瞳位置に形成される開口部材の像９５は、図１３Ｂに示すようになる。なお、符号９８で示す円（円周）は対物レンズの瞳の外縁で、円（円周）の内側が対物レンズの瞳になる。

　図１３Ｂに示すように、透過部の像９６の形状は弓状で、対物レンズの瞳９８の形状は円である。ここで、透過部の像９６は、対物レンズの瞳９８の外縁の一部を含むように位置している。一方、遮光部の像９７は、透過部の像９６の領域を除いて対物レンズの瞳９８全体を覆うように位置している。

　そして、透過部の内縁の像９６ａは、対物レンズの瞳９８の外縁よりも内側（光軸に近づく方向）に位置している。また、透過部の外縁の像９６ｂは、対物レンズの瞳９８の外縁よりも外側（光軸から離れる方向）に位置している。このように、本実施形態の標本形状測定装置では、対物レンズの瞳９８の外縁よりも内側に、透過部の内縁の像９６ａが形成され、対物レンズの瞳９８の外縁よりも外側に、透過部の外縁の像９６ｂが形成される。

　ここで、対物レンズの瞳９８の外縁よりも外側の光は、対物レンズの瞳９８を通過しない（対物レンズの瞳９８から出射しない）。よって、対物レンズの瞳９８を通過する光束の領域９９は、図１３Ｃに示すように、透過部の内縁の像９６ａから対物レンズの瞳９８の外縁までの間の領域になる。そして、この領域９９全体の面積が、標本像の明るさに対応する。

　なお、透過部の内縁の像９６ａの両端は、対物レンズの瞳９８の外縁よりも外側に位置している。そのため、透過部の内縁の像９６ａは、全部が対物レンズの瞳９８の外縁よりも内側に位置しているわけではない。しかしながら、透過部の内縁の像９６ａのほとんどは、対物レンズの瞳９８の外縁よりも内側に位置している。よって、このような状態であっても、対物レンズの瞳９８の外縁よりも内側に、透過部の内縁の像９６ａが形成されているものとする。

　一方、標本が存在する場合、図１４Ａや図１５Ａに示すように、保持部材５５へ入射する光と標本から出射する光とは、光の進行方向が異なる。

　図１４Ａでは、標本の表面は、第１の軸の左側から右側に向かって高くなっている。そして、標本から出射する光は光軸に近づく方向に屈折されている。その結果、対物レンズの瞳位置に形成される開口部材の像は、図１４Ｂに示すようになる。なお、図１４Ｂにおいても、符号９８で示す円（円周）は対物レンズの瞳の外縁で、円（円周）の内側が対物レンズの瞳になる。

　図１４Ｂに示すように、透過部の像９６の形状は弓状で、対物レンズの瞳９８の形状は円である。ここで、透過部の像９６は、対物レンズの瞳９８の外縁の一部を含むように位置している。一方、遮光部の像９７は、透過部の像９６の領域を除いて対物レンズの瞳全体を覆うように位置している。

　そして、透過部の内縁の像９６ａは、対物レンズの瞳９８の外縁よりも内側（光軸に近づく方向）に位置している。また、透過部の外縁の像９６ｂは、対物レンズの瞳９８の外縁よりも外側（光軸から離れる方向）に位置している。

　しかしながら、標本が存在しない場合に比べると、開口部材の像９５は、対物レンズの瞳９８に対して第１の軸に沿って左方向にずれている。そのため、図１４Ｃに示すように、透過部の内縁の像９６ａから対物レンズの瞳９８の外縁までの間隔が、図１３Ｃに比べて狭くなっている。この場合、領域９９の面積は、図１３Ｃにおける領域９９の面積に比べて小さくなる。そのため、図１４Ｃにおける標本像の明るさは、図１３Ｃにおける標本像の明るさに比べて暗くなる。

　なお、標本の表面の傾斜が急になると、標本から出射する光は光軸に対して近づく。この場合、標本像の明るさは暗くなる。逆に、標本の表面の傾斜が緩やかになると、標本から出射する光は光軸に対して離れる。この場合、標本像の明るさは明るくなる。

　図１５Ａでは、標本の表面は、第１の軸の左側から右側に向かって低くなっている。そして、標本から出射する光は光軸から離れる方向に屈折されている。その結果、対物レンズの瞳位置に形成される開口部材の像は、図１５Ｂに示すようになる。なお、図１５Ｂにおいても、符号９８で示す円（円周）は対物レンズの瞳の外縁で、円（円周）の内側が対物レンズの瞳になる。

　図１５Ｂに示すように、透過部の像９６の形状は弓状で、対物レンズの瞳９８の形状は円である。ここで、透過部の像９６は、対物レンズの瞳９８の外縁の一部を含むように位置している。一方、遮光部の像９７は、透過部の像９６の領域を除いて対物レンズの瞳全体を覆うように位置している。

　しかしながら、標本が存在しない場合に比べると、開口部材の像９５は対物レンズの瞳９８に対して第１の軸に沿って右方向にずれている。そのため、図１５Ｃに示すように、透過部の内縁の像９６ａから対物レンズの瞳９８の外縁までの間隔が、図１３Ｃに比べて広くなっている。この場合、領域９９の面積は、図１３Ｃにおける領域９９の面積に比べて大きくなる。そのため、図１５Ｃにおける標本像の明るさは、図１３Ｃにおける標本像の明るさに比べて明るくなる。

　なお、標本の表面の傾斜が急になると、標本から出射する光は光軸から離れる。この場合、標本像の明るさは明るくなる。逆に、標本の表面の傾斜が緩やかになると、標本から出射する光は光軸に対して近づく。この場合、標本像の明るさは暗くなる。

　図１６Ａは、ずれ量Δ_H1と光束の量Ｉの関係を示すグラフである。図１６Ｂは、対物レンズの瞳に対する開口部材の像のずれを示す図である。ここで、ずれ量Δ_H1は、対物レンズの瞳に対する開口部材の像のずれ量であって、第１の軸に沿う方向におけるずれ量、光束の量Ｉは、瞳投影レンズの瞳を通過する光束の量である。

　図１６Ｂでは、対物レンズの瞳に対して、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の順で、矢印の方向に開口部材の像が移動している。また、開口部材の像がずれる方向は第１の軸に沿う方向である。

　図１６Ａでは、Ｌ’0×β＝０．８×ＲPL、Ｌ’1×β＝１．１×ＲPLで、計算を行っている。ここで、
　Ｌ’0は、照明光学系の光軸から所定の位置までの長さ、
　Ｌ’1は、照明光学系の光軸から透過部の外縁までの長さであって、照明光学系の光軸と所定の位置とを結ぶ線上における長さ、
　所定の位置は、透過部の内縁上の位置のうち、照明光学系の光軸からの長さが最小となる位置、
　ＲPLは、瞳投影レンズの瞳の半径、
　βは、瞳投影レンズの焦点距離を対物レンズの焦点距離で割った値、
である。

　また、透過部の透過率は１００％にしている。また、図１６Ａにおいて、横軸の数値は、ずれ量Δ_H1を瞳投影レンズの瞳の半径ＲPLで規格化している。また、縦軸の数値は、ずれ量Δ_H1が０のときの面積、
　Ｓ₀＝ＲPL²×θ－ＲPL×Ｌ’0×β×sinθ、ただしθ＝cos^-1（Ｌ’0×β／ＲPL）
で規格化している。

　なお、面積Ｓは瞳投影レンズの瞳を通過する光束の範囲を示している。よって、面積Ｓは光束の量Ｉに置き換えることができる。そこで、図１６Ａでは、縦軸の変数としてＩを用いている。

　標本が存在しない場合（あるいは、標本の表面が平坦な場合）、ずれ量Δ_H1は０である。この場合、対物レンズの瞳と開口部材の像との関係は、図１６Ｂの（Ｂ）のようになる。よって、光束の量Ｉは矢印Ｂで示す量になる。

　次に、標本が存在する場合、ずれ量Δ_H1は０でない。ここで、標本の表面が第１の軸の左側から右側に向かって高いと、対物レンズの瞳と開口部材の像との関係は、図１６Ｂの（Ａ）のようになる。この場合、透過部の像の領域のうち、対物レンズの瞳内に位置する領域は、ずれ量Δ_H1が０である場合に比べて少なくなる。そのため、光束の量Ｉは矢印Ａで示す量になる。

　一方、標本の表面が第１の軸の左側から右側に向かって低いと、対物レンズの瞳と開口部材の像との関係は、図１６Ｂの（Ｃ）のようになる。この場合、透過部の像の領域のうち、対物レンズの瞳内に位置する領域は、ずれ量Δ_H1が０である場合に比べて多くなる。そのため、光束の量Ｉは矢印Ｃで示す量になる。

　このように、本実施形態の標本形状測定装置では、ずれ量Δ_H1の変化に応じて光束の量Ｉが変化する。

　透過部が照明光学系の光軸に対して非対称に配置されている場合について説明した。透過部が検出光学系の光軸に対して非対称に配置されている場合でも、上述した作用効果が得られる。

　以上のように、本標本形状測定装置では、標本が存在する場合と標本が存在しない場合とで、標本像の明るさが異なる。更に、標本の表面の傾斜の方向や傾斜の緩急に応じて、標本像の明るさが変化する。

　開口部材９０’の変形例を示す。以下の変形例では、透過部を開口部という。図１７Ａは、変形例１の開口部材を用いたときの照明光の様子を示す図である。図１７Ｂは、変形例１の開口部材を用いたときの結像光の様子を示す図である。図１７Ａには、開口部材１００に照射された照明光の様子が示されている。照明光の照射範囲は、照明光学系の瞳と見なすことができる。よって、図１７Ａでは、開口部材１００に照明光学系の瞳を重ねた状態が示されていることになる。

　変形例１の開口部材１００は、遮光部１００ａと開口部１００ｂとを有する。開口部材１００が照明光学系の光路に挿入された場合、開口部材１００は、遮光部１００ａが光軸ＡＸ_iを含むように配置される。開口部１００ｂは、光軸ＡＸ_iに対して偏心した場所に位置している。

　遮光部１００ａと開口部１００ｂとの間には、境界線１０１が形成されている。境界線１０１によって、遮光部１００ａと開口部１００ｂとが区分されている。

　開口部材１００に照明光学系の瞳を重ねたとき、境界線１０１と照明光学系の瞳の外縁とが、点１０２と点１０３とで交わっている。点１０２と点１０３は所定の２点である。直線１０４は、点１０２と点１０３とを通過する直線である。

　境界線１０１は、円弧で構成されている。円弧は、遮光部１００ａから開口部１００ｂに向かって凸となるように形成されている。よって、開口部材１００では、直線１０４が、境界線１０１と光軸ＡＸ_iとの間に位置する。

　開口部材１００では、境界線１０１は、１本の曲線で構成された線である。しかしながら、境界線１０１は、複数の直線で構成された線、複数の曲線で構成された線、あるいは曲線と直線とで構成された線のいずれでも良い。

　図１７Ｂには、検出光学系の位置における結像光の様子が示されている。境界線１０５は、第２の境界線である。境界線１０５は、境界線１０１の像である。境界線１０６は、外側境界線である。境界線１０６は、検出光学系の瞳７の外縁の一部で構成されている。光束透過領域１０７は、境界線１０５と境界線１０６とで囲まれている。

　境界線１０５と境界線１０６は、共に凸状になっている。そして、凸の向きは、境界線１０５と境界線１０６とで同一になっている。この場合、光束透過領域１０７の形状は、光軸ＡＸ_i側に凹部を向けたメニスカス形状になっている。よって、境界線１０５は、光軸ＡＸ_i側に向かって凹の線で構成されているということができる。

　変形例２の開口部材を図１８Ａに示し、変形例３の開口部材を図１８Ｂに示す。図１８Ａは、２本の直線で構成された開口部材を示す図である。図１８Ｂは、３本の直線で構成された開口部材を示す図である。

　図１８Ａに示すように、変形例２の開口部材１１０は、遮光部１１０ａと開口部１１０ｂとを有する。開口部材１１０が照明光学系の光路に挿入された場合、開口部材１１０は、遮光部１１０ａが光軸ＡＸ_iを含むように配置される。開口部１１０ｂは、光軸ＡＸ_iに対して偏心した場所に位置している。

　遮光部１１０ａと開口部１１０ｂとの間には、境界線１１１が形成されている。境界線１１１によって、遮光部１１０ａと開口部１１０ｂとが区分されている。

　開口部材１１０に照明光学系の瞳を重ねたとき、境界線１１１と照明光学系の瞳の外縁とが、点１１２と点１１３とで交わっている。点１１２と点１１３は所定の２点である。直線１１４は、点１１２と点１１３とを通過する直線である。

　境界線１１１は、２本の直線で構成されている。２本の直線は、遮光部１１０ａから開口部１１０ｂに向かって凸となるように形成されている。よって、開口部材１１０では、直線１１４が、境界線１１１と光軸ＡＸ_iとの間に位置する。

　開口部材１１０を用いることで、より大きな表面の傾き量を持つ標本を測定することができる。

　図１８Ｂに示すように、変形例３の開口部材１２０は、遮光部１２０ａと開口部１２０ｂとを有する。開口部材１２０が照明光学系の光路に挿入された場合、開口部材１２０は、遮光部１２０ａが光軸ＡＸ_iを含むように配置される。開口部１２０ｂは、光軸ＡＸ_iに対して偏心した場所に位置している。

　遮光部１２０ａと開口部１２０ｂとの間には、境界線１２１が形成されている。境界線１２１によって、遮光部１２０ａと開口部１２０ｂとが区分されている。

　開口部材１２０に照明光学系の瞳を重ねたとき、境界線１２１と照明光学系の瞳の外縁とが、点１２２と点１２３とで交わっている。点１２２と点１２３は所定の２点である。直線１２４は、点１２２と点１２３とを通過する直線である。

　境界線１２１は、３本の直線で構成されている。３本の直線は、遮光部１２０ａから開口部１２０ｂに向かって凸となるように形成されている。よって、開口部材１２０では、直線１２４が、境界線１２１と光軸ＡＸ_iとの間に位置する。

　開口部材１２０を用いることで、より大きな表面の傾き量を持つ標本を測定することができる。

　図１９Ａは、変形例４の開口部材を用いたときの照明光の様子を示す図である。図１９Ｂは、変形例４の開口部材を用いたときの結像光の様子を示す図である。図１９Ａには、開口部材１３０に照射される照明光の様子が示されている。照明光の照射範囲は、照明光学系の瞳と見なすことができる。よって、図１９Ａでは、開口部材１３０に照明光学系の瞳を重ねた状態が示されていることになる。

　変形例４の開口部材１３０は、遮光部１３０ａと開口部１３０ｂとを有する。開口部材１３０が照明光学系の光路に挿入された場合、開口部材１３０は、遮光部１３０ａが光軸ＡＸ_iを含むように配置される。開口部１３０ｂは、光軸ＡＸ_iに対して偏心した場所に位置している。

　遮光部１３０ａと開口部１３０ｂとの間には、境界線１３１が形成されている。境界線１３１によって、遮光部１３０ａと開口部１３０ｂとが区分されている。

　開口部材１３０に照明光学系の瞳を重ねたとき、境界線１３１と照明光学系の瞳の外縁とが、点１３２と点１３３とで交わっている。点１３２と点１３３は所定の２点である。直線１３４は、点１３２と点１３３とを通過する直線である。

　境界線１３１は、円弧で構成されている。円弧は、開口部１３０ｂから遮光部１３０ａに向かって凸となるように形成されている。よって、開口部材１３０では、境界線１３１が、直線１３４と光軸ＡＸ_iとの間に位置する。

　開口部材１３０では、境界線１３１は、１本の曲線で構成された線である。しかしながら、境界線１３１は、複数の直線で構成された線、複数の曲線で構成された線、あるいは曲線と直線とで構成された線のいずれでも良い。

　図１９Ｂには、検出光学系の瞳の位置における結像光の様子が示されている。境界線１３５は、境界線１３１の像である。境界線１３６は、外側境界線である。境界線１３６は、検出光学系の瞳の外縁の一部で構成されている。光束透過領域１３７は、境界線１３５と境界線１３６とで囲まれている。

　境界線１３５と境界線１３６は、共に凸状になっている。そして、凸の向きは、境界線１３５と境界線１３６とで正反対になっている。この場合、光束透過領域１３７の形状は、両凸形状になっている。よって、境界線１３５は、光軸ＡＸ_i側に向かって凸の線で構成されているということができる。

　変形例５の開口部材を図２０Ａに示し、変形例６の開口部材を図２０Ｂに示す。図２０Ａは、２本の直線で構成された開口部材を示す図である。図２０Ｂは、３本の直線で構成された開口部材を示す図である。

　図２０Ａに示すように、変形例５の開口部材１４０は、遮光部１４０ａと開口部１４０ｂとを有する。開口部材１４０が照明光学系の光路に挿入された場合、開口部材１４０は、遮光部１４０ａが光軸ＡＸ_iを含むように配置される。開口部１４０ｂは、光軸ＡＸ_iに対して偏心した場所に位置している。

　遮光部１４０ａと開口部１４０ｂとの間には、境界線１４１が形成されている。境界線１４１によって、遮光部１４０ａと開口部１４０ｂとが区分されている。

　開口部材１４０に照明光学系の瞳を重ねたとき、境界線１４１と照明光学系の瞳の外縁とが、点１４２と点１４３とで交わっている。点１４２と点１４３は所定の２点である。直線１４４は、点１４２と点１４３とを通過する直線である。

　境界線１４１は、２本の直線で構成されている。２本の直線は、遮光部１４０ａから開口部１４０ｂに向かって凹となるように形成されている。よって、開口部材１４０では、境界線１４１が、直線１４４と光軸ＡＸ_iとの間に位置する。

　開口部材１４０を用いることで、より小さな傾き量を持つ標本の表面を測定することができる。

　図２０Ｂに示すように、変形例６の開口部材１５０は、遮光部１５０ａと開口部１５０ｂとを有する。開口部材１５０が照明光学系の光路に挿入された場合、開口部材１５０は、遮光部１５０ａが光軸ＡＸ_iを含むように配置される。開口部１５０ｂは、光軸ＡＸ_iに対して偏心した場所に位置している。

　遮光部１５０ａと開口部１５０ｂとの間には、境界線１５１が形成されている。境界線１５１によって、遮光部１５０ａと開口部１５０ｂとが区分されている。

　開口部材１５０に照明光学系の瞳を重ねたとき、境界線１５１と照明光学系の瞳の外縁とが、点１５２と点１５３とで交わっている。点１５２と点１５３は所定の２点である。直線１５４は、点１５２と点１５３とを通過する直線である。

　境界線１５１は、３本の直線で構成されている。３本の直線は、遮光部１５０ａから開口部１５０ｂに向かって凹となるように形成されている。よって、開口部材１５０では、境界線１５１が、直線１５４と光軸ＡＸ_iとの間に位置する。

　開口部材１５０を用いることで、より小さな傾き量を持つ標本の表面を測定することができる。

　変形例１～６の開口部材でも、透過部が照明光学系の光軸に対して非対称に配置されている。よって、上述した作用効果が得られる。

　本実施形態の標本測定装置では、照明光学系と検出光学系の少なくとも一方は、光学部材を有している。照明光学系に光学部材が配置された場合、特定の方向に偏斜された照明光が生じる。また、検出光学系に光学部材が配置された場合、明視野照明とほぼ同じ照明が行われる。

　本実施形態の標本測定装置では、特定の方向に偏斜された照明光を標本に照射しているだけである。そのため、標本の表面における傾き量の分布の導出では、標本から出射した光、すなわち、標本を透過した光を利用しているだけで、像のコントラストや非回折光と回折光との干渉を利用していない。よって、本実施形態の標本測定装置によれば、表面の反射率が低く、表面形状が滑らかな標本であっても、高い精度で標本の表面における傾き量を測定できる。また、後述のように、測定した傾き量を用いることで、高い精度で標本の表面形状を測定できる。

　本実施形態の標本測定装置では、明視野照明とほぼ同じ照明を行うと共に、観察光学系の瞳に到達した光の一部、又は、観察光学系の瞳の共役像に到達した光の一部を透過するようにしているだけである。そのため、標本の表面における傾き量の分布の導出では、標本から出射した光、すなわち、標本を透過した光を利用しているだけで、像のコントラストや非回折光と回折光との干渉を利用していない。

　本実施形態の標本形状測定装置によれば、標本の表面形状が滑らかになっていても、高い精度で標本の表面形状を測定できる。また、所定の領域を設定しているので、所定の領域を設定しない場合に比べてＳＮ比が向上する。よって、標本の表面における傾き量を高い精度で算出することができる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、検出光学系は、光学部材を有し、光学部材は、遮光部又は減光部と、透過部と、を有する開口部材であって、透過部は、照明光学系の瞳の像の内側の一部分と外側を含むように位置していることが好ましい。

　開口部材４９は、遮光部４９ａと透過部４９ｂとを有する。透過部４９ｂは、照明光学系の瞳の像の内側の一部分と外側の一部分を含むように位置している。

　開口部材５０は、遮光部５０ａ１と透過部５０ｂとを有する。透過部５０ｂは、照明光学系の瞳の像の内側の一部分と外側全てを含むように位置している。開口部材５０’も同様である。

　開口部材９０は、遮光部９０ａ１と透過部９０ｂとを有する。透過部９０ｂは、照明光学系の瞳の像の内側の一部分と外側の一部分を含むように位置している開口部材９０’も同様である。

　このように、本実施形態の標本測定装置では、透過部は、照明光学系の瞳の像の内側の一部分と外側の一部分とを、少なくとも含むように位置している。

　開口部材４９、開口部材５０、又は開口部材９０を用いることで、表面の反射率が低く、表面形状が滑らかな標本であっても、高い精度で標本の表面における傾き量を測定できる。また、測定した傾き量を用いることで、高い精度で標本の表面形状を測定できる。

　照明光学系の瞳については、以下のような関係であれば良い。
　照明光の光束が対物レンズの瞳を満たしている場合
　　照明光学系の瞳径（ｍｍ）＝対物レンズの開口数×焦点距離／２
　照明光の光束が対物レンズの瞳を満たしていない場合
　　照明光学系の瞳径（ｍｍ）＝対物レンズ瞳位置での照明光の光束径／２

　本実施形態の標本形状測定装置では、検出光学系は、光学部材を有し、光学部材は、遮光部又は減光部と、透過部と、を有する開口部材であって、遮光部又は減光部は、検出光学系の光軸を含むように位置し、透過部は、照明光学系の瞳の像の内側の一部分と外側を含むように位置していることが好ましい。

　開口部材５０は、遮光部５０ａ１と透過部５０ｂとを有する。遮光部５０ａ１は、検出光学系の光軸を含むように位置している。透過部５０ｂは、照明光学系の瞳の像の内側の一部分と外側全てを含むように位置している。開口部材５０’も同様である。

　開口部材９０は、遮光部９０ａ１と透過部９０ｂとを有する。遮光部９０ａ１は、検出光学系の光軸を含むように位置している。透過部９０ｂは、照明光学系の瞳の像の内側の一部分と外側の一部分を含むように位置している。開口部材９０’も同様である。

　このように、本実施形態の標本測定装置では、遮光部又は減光部は、検出光学系の光軸を含むように位置し、透過部は、照明光学系の瞳の像の内側の一部分と外側の一部分とを、少なくとも含むように位置している。

　開口部材５０や開口部材９０を用いることで、表面の反射率が低く、表面形状が滑らかな標本であっても、高い精度で標本の表面における傾き量を測定できる。また、測定した傾き量を用いることで、高い精度で標本の表面形状を測定できる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、検出光学系は、光学部材を有し、光学部材は、遮光部又は減光部と、透過部と、を有する開口部材であって、遮光部又は減光部は、検出光学系の光軸を含むように位置し、透過部は、光軸を含まず、照明光学系の瞳の像の縁の全てを含むように位置していることが好ましい。

　開口部材５０は、遮光部５０ａ１と透過部５０ｂとを有する。遮光部５０ａ１は、検出光学系の光軸を含むように位置している。透過部５０ｂは、照明光学系の瞳の像の内側の一部分と外側全てを含むように位置している。すなわち、透過部は、光軸を含まず、照明光学系の瞳の像の縁の全てを含むように位置している。開口部材５０’も同様である。

　開口部材５０を用いることで、表面の反射率が低く、表面形状が滑らかな標本であっても、高い精度で標本の表面における傾き量を測定できる。また、測定した傾き量を用いることで、高い精度で標本の表面形状を測定できる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、検出光学系は、光学部材を有し、光学部材は、遮光部又は減光部と、透過部と、を有する開口部材であって、遮光部又は減光部は、検出光学系の光軸を含むように位置し、透過部は、光軸に対して偏心しており、照明光学系の瞳の像の縁の一部を含むように位置していることが好ましい。

　開口部材９０は、遮光部９０ａ１と透過部９０ｂとを有する。遮光部９０ａ１は、検出光学系の光軸を含むように位置している。透過部９０ｂは、照明光学系の瞳の像の内側の一部分と外側の一部分を含むように位置している。透過部は、光軸に対して偏心している。開口部材９０’も同様である。

　開口部材９０を用いることで、表面の反射率が低く、表面形状が滑らかな標本であっても、高い精度で標本の表面における傾き量を測定できる。また、測定した傾き量を用いることで、高い精度で標本の表面形状を測定できる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、照明光学系が対物レンズを有し、検出光学系が瞳投影レンズを有し、以下の条件式を満たすことが好ましい。
　Ｒ0＜Ｒill×β＜Ｒ1
　ただし、
　Ｒ0は、瞳投影レンズの光軸から所定の位置までの長さ、
　Ｒ1は、瞳投影レンズの光軸から透過部の外縁までの長さであって、瞳投影レンズの光軸と所定の位置とを結ぶ線上における長さ、
　所定の位置は、遮光部の内縁上の位置のうち、瞳投影レンズの光軸からの長さが最小となる位置、
　Ｒillは、照明光学系の瞳の半径、
　βは、瞳投影レンズの焦点距離を対物レンズの焦点距離で割った値、
とする。

　条件式を満足することで、表面の反射率が低く、表面形状が滑らかな標本であっても、高い精度で標本の表面における傾き量を測定できる。また、測定した傾き量を用いることで、高い精度で標本の表面形状を測定できる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、観察光学系の瞳を通過する光を検出している。そのため、開口部材の透過部は、観察光学系の瞳の内側に位置している。また、照明光学系の瞳の像の縁が、透過部に含まれるようになっている。これは、照明光学系の瞳の像の縁が、観察光学系の瞳の内側に位置していることを意味している。

　本実施形態の標本形状測定装置では、顕微鏡の光学系を利用することができる。顕微鏡の光学系では、観察光学系として顕微鏡対物レンズが用いられ、照明光学系としてコンデンサレンズが用いられる。また、顕微鏡の光学系では、複数の顕微鏡対物レンズと複数のコンデンサレンズが使用可能である。よって、照明光学系の開口数と観察光学系の開口数の組み合わせは、多数存在する。

　照明光学系の瞳の像の大きさは、照明光学系の開口数と観察光学系の開口数とで決まる。そのため、照明光学系と観察光学系の組み合わせによっては、照明光学系の瞳の像が、観察光学系の瞳よりも大きくなる可能性がある。この場合、照明光学系の瞳の像の縁が、観察光学系の瞳の内側に位置しない状態になる。

　このような状態の場合は、例えば、光源から出射する光の光束径を細くする。このようにすると、観察光学系の瞳位置において、照明光の光束径が透過部に含まれるようになる。照明光の光束の位置は、標本の表面における傾き量に応じて変化するので、標本の表面における傾き量の変化を、明るさの変化として検出することができる。

　以上のように、照明光学系の瞳の像は、観察光学系の瞳位置における照明光の光束に置き換えることができる。よって、以下の言い替えが可能になる。

　「透過部は、照明光学系の瞳の像の内側の一部分と外側を含む」は、「透過部は、観察光学系の瞳位置における照明光の光束の内側の一部分と外側を含む」と言い換えることができる。

　「透過部は、照明光学系の瞳の像の縁の一部を含む」は、「透過部は、観察光学系の瞳位置における照明光の光束の縁の一部を含む」と言い換えることができる。

　「透過部は、照明光学系の瞳の像の縁の全てを含むように設けられている」は「透過部は、観察光学系の瞳位置における照明光の光束の縁の全てを含むように設けられている」と言い換えることができる。

　「Ｒillは、照明光学系の瞳の半径」は「Ｒillは、観察光学系の瞳位置における照明光の光束の半径」と言い換えることができる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、照明光学系は、光学部材を有し、光学部材は、遮光部又は減光部と、透過部と、を有する開口部材であることが好ましい。

　本実施形態の標本形状測定装置では、照明光学系が光学部材を有し、光学部材は、遮光部又は減光部と、透過部と、を有する開口部材であって、開口部材は、所定の位置に、遮光部又は減光部が照明光学系の光軸を含むように配置され、所定の位置は、光源ユニットと走査手段との間の位置、又は照明光学系の瞳位置であり、透過部は、遮光部又は減光部の外縁よりも外側に位置し、検出光学系の瞳の外縁よりも内側に、透過部の内縁の像が形成され、検出光学系の瞳の外縁よりも外側に、透過部の外縁の像が形成されることが好ましい。

　本実施形態の別の標本形状測定装置について説明する。図２１は、本実施形態の別の標本形状測定装置を示す図である。図１と同じ構成には、図１と同じ番号を付し、説明は省略する。

　標本形状測定装置１６０は、光学部材１６１を有する。光学部材１６１は、遮光部又は減光部と、透過部と、を有する開口部材である。光学部材１６１として、例えば、上述の、開口部材５０、開口部材５０’を用いることができる。開口部材４９、開口部材９０、又は開口部材９０’を用いても良い。

　光学部材１６１は、所定の位置に配置されている。所定の位置は、光源と走査手段との間の位置、又は照明光学系の瞳位置である。標本形状測定装置１６０では、光学部材１６１は、光源ユニット２と光走査ユニット９との間に配置されている。

　光学部材１６１は、遮光部又は減光部が照明光学系の光軸を含むように配置されている。そのため、光学部材１６１から出射する照明光の形状は、円環状になっている。

　光源ユニット２と光走査ユニット９との間の位置は、照明光学系３の瞳位置と共役な位置である。よって、光学部材１６１は、照明光学系３の瞳位置に配置されていると見なすことができる。また、照明光学系３の瞳位置は、検出光学系４の瞳の位置と共役である。よって、光学部材１６１の像が、検出光学系の瞳１６２に形成される。

　光学部材が照明光学系に配置されている場合については、既に説明した。すなわち、図１１Ａに示すように、本実施形態の標本形状測定装置では、矢印Ｂから矢印Ｃまでの間で、ずれ量Δの変化に応じて光束の量Ｉが変化する。

　このように、本実施形態の標本測定装置では、特定の方向に偏斜された照明光を標本に照射しているだけである。そのため、標本の表面における傾き量の分布の導出では、標本から出射した光、すなわち、標本を透過した光を利用しているだけで、像のコントラストや非回折光と回折光との干渉を利用していない。よって、本実施形態の標本測定装置によれば、表面の反射率が低く、表面形状が滑らかな標本であっても、高い精度で標本の表面における傾き量を測定できる。また、後述のように、測定した傾き量を用いることで、高い精度で標本の表面形状を測定できる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、処理装置は、画像を再構築する機能を有することが好ましい。

　画像の再構築については、後述する。

　本実施形態の標本形状測定装置では、照明光学系が対物レンズを有し、光路に挿入離脱する第１の開口部材と第２の開口部材とを有し、第１の開口部材は、対物レンズの光軸を含む箇所が遮光部であり、光軸に対して偏心した位置に第１の開口部を有し、第２の開口部材は、対物レンズの光軸を含む箇所が遮光部であり、光軸に対して偏心した位置に第２の開口部を有し、第１の開口部材を光路に挿入したときの光軸と第１の開口部重心を結ぶ方向と、第２の開口部材を光路に挿入したときの光軸と第２の開口部重心を結ぶ方向と、は交差することが好ましい。

　本実施形態の標本形状測定装置では、照明光学系が対物レンズと光学部材を有する。よって、開口部材は、照明光学系の光路中に配置されている。

　本実施形態の標本形状測定装置は、開口ユニット１７０を有する。開口ユニット１７０は、第１の開口部材１７１と、第２の開口部材１７２と、移動機構１７３と、を有する。

　第１の開口部材１７１と第２の開口部材１７２は、共に、移動機構１７３に保持されている。移動機構１７３としては、例えば、スライダーやターレットがある。移動機構１７３がスライダーの場合、第１の開口部材１７１と第２の開口部材１７２は、光軸１７４と直交する方向に移動する。移動機構１７３がターレットの場合、第１の開口部材１７１と第２の開口部材１７２は、光軸１７４と平行な軸を中心に回転する。

　図２２Ａは、第１の開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。図２２Ｂは、第２の開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。

　第１の開口部材１７１は、遮光部１７１ａと第１の開口部１７１ｂとを有する。第１の開口部材１７１では、光軸１７４を含む箇所が遮光部１７１ａになっている。第１の開口部材１７１は、光軸１７４に対して偏心した位置に第１の開口部１７１ｂを有している。

　第２の開口部材１７２は、遮光部１７２ａと第２の開口部１７２ｂとを有する。第２の開口部材１７２では、光軸１７４を含む箇所が遮光部１７２ａになっている。第２の開口部材１７２は、光軸１７４に対して偏心した位置に第２の開口部１７２ｂを有している。

　そして、光軸１７４と第１の開口部１７１ｂの重心を結ぶ方向と、光軸１７４と第２の開口部１７２ｂの重心を結ぶ方向とは、第１の開口部材１７１を光路に挿入したときと第２の開口部材１７２を光路に挿入したときとで交差する。図２２Ａや図２２Ｂでは、直交する２つの直線のうちの一方の直線上に第１の開口部１７１ｂが位置し、他方の直線上に第２の開口部１７２ｂが位置している。

　第１の開口部１７１ｂを通過する照明光の面積は、第２の開口部１７２ｂを通過する照明光の面積と等しい。よって、傾斜角が変化したときの、像の明るさの変化の様子は、第１の開口部材１７１を光路に挿入したときと、第２の開口部材１７２を光路に挿入したときとで同じになる。

　第１の開口部１７１ｂにおける分光透過率特性は、第２の開口部１７２ｂにおける分光透過率特性と等しい。この場合、１つの光源を用いて測定を行うことができる。光源から出射する光の波長域は、広くても良く、狭くても良い。

　第１の開口部１７１ｂにおける分光透過率特性を、第２の開口１７２ｂにおける分光透過率特性と異ならせても良い。この場合、測定方法としては、照明光の波長を変えずに測定を行う方法と、照明光の波長を変えて測定を行う方法とがある。

　照明光の波長を変えずに測定を行う方法では、光源には、出射光の波長域が広い光源を用いる。出射光の波長域が広い光源としては、白色光源がある。また、光検出素子には、複数の光電変換素子を使用する。複数の光電変換素子で構成された検出素子としては、例えば、三板式のカメラがある。

　三板式のカメラは、３つのＣＣＤを備えている。第１のＣＣＤには赤色のフィルタが配置され、第２のＣＣＤには緑色のフィルタが配置され、第３のＣＣＤには青色のフィルタが配置されている。

　そこで、例えば、第１の開口部１７１ｂにおける分光透過率特性を、赤色のフィルタの分光透過率特性と一致させ、第２の開口部１７２ｂにおける分光透過率特性を、緑色のフィルタの分光透過率特性と一致させておく。

　そして、測定では、白色光源を光路中に配置し、第１の開口部材１７１を光路に挿入したときは、第１のＣＣＤで測定を行い、第２の開口部材１７２を光路に挿入したときは、第２のＣＣＤで測定を行えば良い。

　照明光の波長を変えて測定を行う方法では、複数の光源を用いる場合と１つの光源を用いる場合とがある。

　複数の光源を用いる場合は、例えば、第１の光源とは別に、第２の光源を用意しておく。そして、第１の光源から出射する光の波長域と、第２の光源から出射する光の波長域とを異ならせておく。更に、第１の開口部１７１ｂにおける分光透過率特性を、光源Ａから出射する光の波長域と一致させ、第２の開口部１７２ｂにおける分光透過率特性を、光源Ｂから出射する光の波長域と一致させておく。

　そして、測定では、第１の開口部材１７１を光路に挿入したときは、第１の光源を用いて測定を行い、第２の開口部材１７２を光路に挿入したときは、第２の光源を用いて測定を行えば良い。

　１つの光源を用いる場合は、光学フィルタを複数用意しておく。例えば、第１の光学フィルタと第２の光学フィルタとを用意しておく。また、第１の開口部１７１ｂにおける分光透過率特性を、第１の光学フィルタの分光透過率特性と一致させ、第２の開口部１７２ｂにおける分光透過率特性を、第２の光学フィルタの分光透過率特性と一致させておく。

　そして、測定では、第１の開口部材１７１を光路に挿入したときは、第１の光学フィルタを用いて測定を行い、第２の開口部１７２を光路に挿入したときは、第２の光学フィルタを用いて測定を行えば良い。

　標本形状測定装置では、結像光の光量の変化を、どの方向においても検出することができる。よって、本実施形態の標本形状測定装置によれば、標本の表面における傾きの方向と傾き量とを求めることができる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、照明光学系が対物レンズを有し、光学部材は開口部材であって、開口部材は、対物レンズの光軸を含む箇所が遮光部であり、光軸に対して偏心した位置に第１の開口部と第２の開口部とを有し、開口部材を光路に挿入したときの光軸と第１の開口部重心を結ぶ方向と、光軸と第２の開口部重心を結ぶ方向と、は交差することが好ましい。

　図２３は、開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。開口部材１８０は、遮光部１８０ａと、第１の開口部１８０ｂと、第２の開口部１８０ｃを有する。開口部材１８０では、光軸１７４を含む箇所が遮光部１８０ａになっている。開口部材１８０は、光軸１７４に対して偏心した位置に第１の開口部１８０ｂと第２の開口部１８０ｃとを有している。

　そして、光軸１７４と第１の開口部１８０ｂの重心を結ぶ方向と、光軸１７４と第２の開口部１８０ｃの重心を結ぶ方向とは、交差する。図２３では、直交する２つの直線のうちの一方の直線上に第１の開口部１８０ｂが位置し、他方の直線上に第２の開口部１８０ｃが位置している。

　第１の開口部１８０ｂを通過する照明光の面積は、第２の開口部１８０ｃを通過する照明光の面積と等しい。よって、傾斜角θ_sを変化させたときの、面積Ｓの変化の様子は、第１の開口部１８０ｂを照明光が通過したときと、第２の開口部１８０ｃを照明光が通過したときとで同じになる。

　第１の開口部１８０ｂにおける分光透過率特性は、第２の開口部１８０ｃにおける分光透過率特性と異ならせておく必要がある。検出素子に複数の光電変換素子を使用するか、又は、照明光の波長を変えることで、開口部材１８０を、常に光路中に配置したままで測定を行うことができる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、開口部材を移動させることなく、結像光の光量の変化を、どの方向においても検出することができる。よって、本実施形態の標本形状測定装置によれば、標本の表面における傾きの方向と傾き量とを求めることができる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、照明光学系が対物レンズを有し、光学部材は開口部材であって、開口部材は、対物レンズの光軸を含む箇所が遮光部であり、光軸に対して偏心した位置に開口部を有し、
　光軸と開口部重心を結ぶ方向を変更可能であることが好ましい。

　図２４は、開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。開口部材１９０は、遮光部１９０ａを有する。開口部材１９０では、対物レンズの光軸１７４を含む箇所が遮光部１９０ａになっている。開口部材１９０は、光軸１７４に対して偏心した位置に開口部を有している。

　本実施形態の標本形状測定装置では、開口部材１９０を実線で示す位置から、一点鎖線で示す位置に移動可能になっている。すなわち、光軸と開口部重心を結ぶ方向を変更可能になっている。

　開口部材１９０を実線で示す位置に移動させることで、図２２Ａと同じ状態を実現できる。また、開口部材１９０を一点鎖線で示す位置に移動させることで、図２２Ｂと同じ状態を実現できる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、結像光の光量の変化を、どの方向においても検出することができる。よって、本実施形態の標本形状測定装置によれば、標本の表面における傾きの方向と傾き量とを求めることができる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、照明光学系が対物レンズを有し、光学部材は遮光部を有する開口部材であって、遮光部の大きさと対物レンズの標本側開口数の少なくとも一方が変更可能であることが好ましい。

　上述のように、本実施形態の標本形状測定装置では、標本の表面における傾きの量に応じて、光検素子で検出する光量が変化する。図２５Ａは、光量がゼロのときの状態を示す図である。図２５Ａでは、結像光全体が破線の円で示されている。遮光部２００ａは、光軸２０２を含むように位置している。

　この状態では、図２５Ａに示すように、全ての結像光は、遮光部２００ａで遮光されてしまう。そのため、この場合、対物レンズの瞳２０１を通過する光束は存在しないので、傾き量の測定はできない。

　更に傾き量の測定をできるようにするためには、結像光が開口部材２００から出射する状態になっている必要がある。

　結像光が開口部材２００から出射する状態を実現する方法としては、遮光部２００ａ又は透過部２００ｂの大きさを変更する方法がある。遮光部２００ａ又は透過部２００ｂの大きさを変更するには、開口部材２００を別の開口部材に交換すれば良い。図２５Ｂは、開口部材を交換した様子を示す図である。

　開口部材２１０は、遮光部２１０ａと透過部２１０ｂとを有する。遮光部２１０ａの大きさは、遮光部２００ａの大きさよりも小さい。すなわち、透過部２１０ｂの大きさは、透過部２００ｂの大きさよりも大きい。

　そこで、対物レンズはそのままで、開口部材２００を開口部材２１０に交換する。このようにすることで、結像光２０３が透過部２１０ｂに到達するようになる。すなわち、結像光２０３が開口部材２１０から出射する状態になる。その結果、傾き量の測定可能な範囲を広げることができる。

　開口部材２００は、対物レンズの瞳位置に配置されている。対物レンズの瞳が対物レンズの内部に位置している場合、開口部材２００も対物レンズの内部に配置されている。このような状態であっても、開口部材２００を開口部材２１０に交換することが可能であれば、交換を行えば良い。開口部材２００を開口部材２１０に交換することが困難な場合、対物レンズの瞳の共役像な位置で、開口部材２００と開口部材２１０との交換を行えば良い。

　結像光２０３が開口部材２００から出射する状態を実現する別の方法としては、対物レンズの標本側開口数を変更する方法がある。対物レンズの標本側開口数を変更するには、対物レンズを交換すれば良い。図２５Ｃは、対物レンズを交換した様子を示す図である。

　開口部材２００を有する対物レンズを対物レンズＡとし、開口部材２２０を有する対物レンズを対物レンズＢとする。対物レンズＡと対物レンズＢとでは、標本側開口数が異なる。

　開口部材２２０は、遮光部２２０ａと透過部２２０ｂとを有する。遮光部２２０ａの大きさは、遮光部２００ａの大きさと異なる。すなわち、透過部２２０ｂの大きさは、透過部２００ｂの大きさと異なる。

　上述のように、対物レンズＡと対物レンズＢとでは、標本側開口数が異なる。そのため、対物レンズＡの瞳２０１の径は、対物レンズＢの瞳２４０の径と異なる。また、対物レンズの瞳位置における結像光の大きさも、対物レンズＡと対物レンズＢとで異なる。

　よって、対物レンズＡを対物レンズＢに交換することで、結像光２０３が透過部２２０ｂに到達する。すなわち、結像光２０３が開口部材２２０から出射する状態になる。その結果、傾き量の測定可能な範囲を広げることができる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、対物レンズの標本側開口数の変更は、複数の対物レンズを切り替えて行うことが好ましい。

　このようにすることで、様々な傾き量を持つ標本を測定することができる。複数の対物レンズとしては、例えば、倍率が同じで標本側開口数が異なる対物レンズがある。このような複数の対物レンズを使用すれば、対物レンズを切り替えることで、倍率を変更せずに、測定範囲と測定感度を変えることができる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、光源と走査手段の間に、光束径を変化させる光学素子を配置されていることが好ましい。

　本実施形態の別の標本形状測定装置について説明する。図２６は、本実施形態の別の標本形状測定装置を示す図である。図１と同じ構成には、図１と同じ番号を付し、説明は省略する。

　標本形状測定装置２５０は、光源ユニット２５１と、光束径変更部材２５２と、を有する。標本形状測定装置２５０では、検出光学系４が光学部材１５を有している。光学部材１５は、遮光部又は減光部と、透過部と、を有する開口部材である。

　標本形状測定装置２５０では、透過部の内縁と透過部の外縁との間に、照明光学系の瞳の外縁の像が形成される。よって、標本における形状の変化を、照明光学系の瞳の像のずれの変化に変換することができる。

　照明光は、照明光学系の瞳を通過する。以下の説明では、照明光学系の瞳の外縁を、照明光束の外縁に置き換えて説明する。標本における形状の変化が、照明光学系の瞳の像のずれの変化に変換されるためには、透過部の内縁と透過部の外縁との間に、照明光束の外縁の像が形成されれば良いことになる。

　標本形状測定装置２５０では、顕微鏡光学系が用いられている。よって、対物レンズ８として、乾燥系の顕微鏡対物レンズや、液浸系の顕微鏡対物レンズが用いられる。乾燥系の顕微鏡対物レンズが用いられた状態を第１の状態とし、液浸系の顕微鏡対物レンズが用いられた状態を第２の状態とする。

　第１の状態で、透過部の内縁と透過部の外縁との間に、照明光束の外縁の像が形成されているとする。第１の状態から第２の状態に変更すると、対物レンズ８が、乾燥系の顕微鏡対物レンズから液浸系の顕微鏡対物レンズに変わる。

　通常、液浸系の顕微鏡対物レンズの開口数は、乾燥系の顕微鏡対物レンズの開口数よりも大きい。そのため、光源ユニット２５１から出射する照明光束の径が、第１の状態における光束径のままだと、第２の状態では、照明光学系の瞳の外縁の像は、透過部の内縁と透過部の外縁との間に形成されなくなる。その結果、第２の状態では、標本における形状の変化を、照明光学系の瞳の像のずれの変化に変換することが困難になる。

　標本形状測定装置２５０では、光源ユニット２５１から光線分離手段１０までの間の光路において、光束径変更部材２５２の光路への挿入が可能になっている。光束径変更部材２５２は、開口部を有する。開口部の大きさは、第１の状態において光源ユニット２５１から出射する照明光束の径よりも小さく設定されている。

　第１の状態から第２の状態への変更に伴い、光束径変更部材２５２を光路中に挿入する。これにより、光源ユニット２５１から出射する照明光束の径を、第１の状態における照明光束の径よりも小さくすることができる。これにより、第２の状態でも、照明光学系の瞳の外縁の像は、透過部の内縁と透過部の外縁との間に形成される。その結果、第２の状態でも、標本における形状の変化を、照明光学系の瞳の像のずれの変化に変換することが可能になる。

　以上、対物レンズ８が、乾燥系の顕微鏡対物レンズから液浸系の顕微鏡対物レンズに変わった場合について説明したが、これに限られない。照明光学系の開口数の変更に合わせて、光源ユニット２５１から出射する照明光束の径が変化できれば良い。また、検出光学系の開口数の変更に合わせて、光源ユニット２５１から出射する照明光束の径が変化できれば良い。

　本実施形態の標本形状測定装置では、傾き量を算出するステップでは、予め求めておいた対応関係に基づいて傾き量を算出することが好ましい。

　上述のように、本実施形態の標本形状測定装置では、結像光の光量に基づいて、傾き量を算出する。そこで、結像光の光量と傾き量との対応関係を、予め求めておく。このようにしておくと、対応関係に基づいて、求めた結像光の光量から、傾き量を迅速に算出することができる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、対応関係は、光量と傾き量とをパラメータとするルックアップテーブルで表わされていることが好ましい。

　図２７は、ルックアップテーブルの例である。図２７に示すように、ルックアップテーブルは、輝度と傾斜角とをパラメータとして有する。輝度は結像光の光量を表し、傾斜角は標本の表面における傾き量を表している。

　ルックアップテーブルを作成するためには、標本の屈折率が必要になる。標本が細胞の場合、細胞内には様々な物質が存在する。そのため、細胞全体の屈折率は、これらの物質の屈折率を平均したときの屈折率（以下、「細胞の平均屈折率ｎ_AVE」という）になる。細胞の平均屈折率ｎ_AVEは、細胞内に存在する物質の種類によって変化する。よって、細胞の平均屈折率ｎ_AVEの値は１つに限られない。

　また、例えば、標本が細胞の場合、細胞の周囲には培養液や保存液が存在することもある。そのため、ルックアップテーブルを作成するためには、培養液の屈折率や保存液の屈折率が必要になる。

　図２７に示すルックアップテーブルは、標本が細胞の場合のルックアップテーブルである。このルックアップテーブルでは、培養液の屈折率又は保存液の屈折率を１．３３としてテーブルを作成している。また、細胞の平均屈折率ｎ_AVEについては、３通り（１．３４、１．３５、１．３６）の屈折率を想定し、各屈折率から求めた結果を１つのテーブルにまとめている。

　ステップＳ３３では、結像光の光量と基準の光量との差又は比が算出される。算出された値は、結像光の光量を表している。そこで、算出された値と一致する値を、ルックアップテーブルの輝度の中から探す。算出された値と一致した値があれば、その値に対応する傾斜角を、ルックアップテーブルから求める。これにより、標本の表面における傾き量を迅速に求めることができる。

　一方、算出された値と一致する値が、ルックアップテーブルの中に存在しない場合もある。この場合、算出された値に対して最も近い２つの値を、ルックアップテーブルの輝度の中から抽出する。そして、抽出した２つの値を用いて、傾斜角を求めればよい。これにより、標本の表面における傾き量を求めることができる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、対応関係は、光量と傾き量とをパラメータとする式で表わされていることが好ましい。

　対物レンズから出射する結像光の面積Ｓと傾斜角θ_sは式で表される。面積Ｓは結像光の光量を表し、傾斜角θ_sは標本の表面における傾き量を表している。

　ステップＳ３３では、結像光の光量と基準の光量との差又は比が算出される。算出された値は、結像光の光量を表している。そこで、算出された値を面積Ｓに代入して、傾斜角θ_sを求める。このようにすることで、標本の表面における傾き量を求めることができる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、照明光の標本への照射は、第１の波長域の光と第２の波長域の光とで行われ、第１の波長域は、第２の波長域と異なる波長域を、少なくとも有することが好ましい。

　本実施形態の別の標本形状測定装置を図２８に示す。標本形状測定装置２６０は、第２の光源２６１と、光線分離手段２６２と、光学フィルタ２６３と、を有する。光源２から第１の波長域の光が出射し、光源２６１から第２の波長域の光が出射する。

　第１の波長域は、第２の波長域と異なる波長域を、少なくとも有する。光源２６１から出射した光は、光線分離手段２６２によって反射される。これにより、光源２６１から出射した光は、光源２から出射した光と同一の光路を進行する。

　その結果、照明光の標本への照射を、第１の波長域の光と第２の波長域の光とで行うことができる。第１の波長域の光による検出と第２の波長域の光による検出は、光学フィルタ２６３によって行えば良い。例えば、第１の波長域の光による検出を行うときに、光学フィルタ２６３を光路挿入する。

　図２９Ａは、照明光の光強度分布を示す図である。図２９Ｂは、照明光の光強度分布を示すグラフである。照明光２７０は、光強度が不均一に分布している照明光である。開口部材に入射する直前では、照明光２７０の形状は円である。

　照明光２７０では、光束の中央２７１と光束の周辺２７２とで光強度が異なる。中央２７１における光強度は、周辺２７２における光強度よりも小さい。また、光強度は、中央２７１から周辺２７２に向かって大きくなっている。

　本実施形態の別の標本形状測定装置では、照明光学系と検出光学系の両方に、開口部材を配置している。ここで、照明光学系には照明側開口部材が配置され、検出光学系には検出側開口部材が配置されている。そして、照明側開口部材と検出側開口部材は、共に複数の透過部を有している。

　図３０Ａは照明側開口部材を示す図、図３０Ｂは検出側開口部材を示す図である。
　照明側開口部材２８０は、図３０Ａに示すように、遮光部２８０ａ１と透過部２８０ｂとを有する。更に、開口部材２８０は遮光部２８０ａ２を有する。

　遮光部２８０ａ１、２８０ａ２及び透過部２８０ｂは透明な部材、例えば、ガラス板や樹脂板で構成されている。遮光部２８０ａ１と２８０ａ２は、例えば、遮光塗料をガラス板上に塗布することで形成されている。一方、透過部２８０ｂには何も塗布されていない。よって、透過部２８０ｂはガラス板そのものである。

　遮光部２８０ａ１の形状は円である。一方、透過部２８０ｂの形状は帯状で、具体的には円環になっている。

　照明側開口部材２８０では、遮光部２８０ａ１が複数形成されている。そのため、透過部２８０ｂも複数生成されている。具体的には、４つの透過部２８０ｂが形成されている。そして、４つの透過部２８０ｂは、２次元状に配置されている。照明側開口部材２８０は、光学部材の位置に配置されている。

　一方、検出側開口部材２９０は、図３０Ｂに示すように、遮光部２９０ａと透過部２９０ｂとを有する。遮光部２９０ａと透過部２９０ｂは透明な部材、例えば、ガラス板や樹脂板で構成されている。

　遮光部２９０ａは、例えば、遮光塗料をガラス板上に塗布することで形成されている。一方、透過部２９０ｂには何も塗布されていない。よって、透過部２９０ｂはガラス板そのものである。

　透過部２９０ｂの外形は、透過部２８０ｂの外形と相似形になっている。具体的には、透過部２８０ｂの外形は円なので、透過部２９０ｂの外形も円になっている。

　検出側開口部材２９０では、透過部２９０ｂが複数形成されている。具体的には、４つの透過部２９０ｂが形成されている。そして、４つの透過部２９０ｂは、２次元状に配置されている。検出側開口部材２９０は、瞳投影レンズの瞳位置に配置されている。

　また、１つの透過部２８０ｂと１つの透過部２９０ｂは、対をなしている。そして、１対の透過部２８０ｂと透過部２９０ｂとは、互いの中心が共役になるように配置されている。

　例えば、照明側開口部材２８０の右上の透過部２８０ｂと、観察側開口部材２９０の左下の透過部２９０ｂとが対をなしている。また、左下の透過部２９０ｂの位置に、右上の透過部２８０ｂの像が形成されたとき、左下の透過部２９０ｂの中心と右上の透過部２８０ｂの像とは一致する。

　また、透過部２９０ｂの外縁よりも内側に、透過部２８０ｂの内縁の像が形成され、透過部２９０ｂの外縁よりも外側に、透過部２８０ｂの外縁の像が形成される。そのため、上述の作用効果が、１対の透過部２８０ｂと透過部２９０ｂを用いた場合にも同様に生じる。

　本実施形態の標本測定装置によれば、表面の反射率が低く、表面形状が滑らかな標本であっても、高い精度で標本の表面における傾き量を測定できる。また、後述のように、測定した傾き量を用いることで、高い精度で標本の表面形状を測定できる。

　更に、本実施形態の標本形状測定装置では、対物レンズの瞳の周辺を通過する光だけでなく、対物レンズの瞳の中心を通過する光も結像に寄与することになる。そのため、より明るい陰影像を得ることができる。

　上述のように、対物レンズから出射する結像光の面積Ｓと傾斜角θ_sは式で表される。傾斜角θ_sと面積Ｓの関係を表すグラフを図３１に示す。対物レンズから出射した結像光は、例えば、結像レンズで集光される。集光位置には標本の像が形成される。対物レンズから出射する結像光の面積Ｓが変化すると、標本の像の輝度が変化する。また、傾斜角θ_sが変化すると、標本の表面の光軸に対する傾き角が変化する。そこで、図３１に示すグラフでは、傾き角を傾斜角θ_sに置き換え、像の輝度を面積Ｓに置き換えて、傾き角と像の輝度との関係を示している。

　また、各パラメータの値は、以下の通りである。
　ｎ’＝１．３３、
　ｎ＝１．３５、
　ｆ＝１８［ｍｍ］、
　θ_NA＝９．２［ｄｅｇ.］(ＮＡ＝０．１６)、
　θ_min＝６．５[ｄｅｇ.]

　傾斜角θ_sと面積Ｓの関係を表す曲線（以下、「特性曲線」という）から分かるように、傾斜角θ_sの値が大きくなるに従って、像の輝度は単調に減少する。このように、像の輝度と傾斜角θ_sは一対一で対応する。

　そこで、特定の方向に偏斜された照明光を標本に照射し、標本の２次元画像を取得する。そして、取得した２次元画像の各画素について、光量（輝度）の情報を取得する。ここで、標本の屈折率（平均的屈折率）ｎ、浸液の屈折率ｎ’、対物レンズの焦点距離ｆ、対物レンズの標本側開口数θ_NA、及び角度θ_minは既知である。よって、これらを用いて、画素ごとに傾斜角θ_sを導出することが可能となる。すなわち、標本の表面における傾き量の分布を導出することが可能となる。

　本実施形態の標本形状測定装置は、標本形状測定方法を備えている。標本形状測定方法について、説明する。ここでは、照明光学系が対物レンズと光学部材を有しているものとする。開口部材は、照明光学系の光路中に配置されている。開口部材が、検出光学系の光路中に配置されている場合も、標本形状測定方法を用いることができる。

　図３２は、標本形状測定方法のフローチャートである。標本形状測定方法は、照明光を準備するステップＳ１０と、照明光を照射するステップＳ２０と、所定の処理ステップＳ３０と、を有し、所定の処理ステップＳ３０は、結像光を受光するステップＳ３１と、結像光の光量を求めるステップＳ３２と、差又は比を算出するステップＳ３３と、傾き量を算出するステップＳ３４と、標本の形状を画像化するステップＳ５０と、を有する。

　標本形状測定方法では、まず、ステップＳ１０が実行される。ステップＳ１０は、照明光を準備するステップである。ステップＳ１０では、照明光学系内に、所定の照明領域が設定される。所定の照明領域は、照明光が通過する領域である。照明光学系の光路に光学部材を配置することで、所定の照明領域の設定が行われる。このとき、光軸を含み、且つ照明光の光束の一部を遮光するように、光学部材が配置される。

　また、光学部材は、照明光学系の瞳位置、具体的には、コンデンサレンズの瞳位置に配置されている。コンデンサレンズの瞳の位置は、検出光学系の瞳位置、具体的には、対物レンズの瞳の位置と共役になっている。よって、対物レンズの瞳の位置に、所定の照明領域の像が形成される。このとき、所定の照明領域の像は、対物レンズの瞳の内側と外側の両方に分布するように形成される。

　このように、所定の照明領域は、照明光学系の瞳位置にて光軸を含まないように設定されると共に、所定の照明領域を通過した照明光が、観察光学系の瞳位置にて該瞳の内側の一部分と該瞳の外側に照射されるように設定される。

　ステップＳ１０が終わると、ステップＳ２０が実行される。ステップＳ２０は、照明光を照射するステップである。ステップＳ２０では、照明光が標本に照射される。このとき、標本には、偏射照明光が照射される。すなわち、光束が標本位置において光軸と交差するように、照明光は標本に照射され、標本を透過する。標本が照明されることで、標本から結像光が出射する。標本から出射した光は、観察光学系に入射する。

　ステップＳ２０が終わると、ステップＳ３０が実行される。ステップＳ３０は、所定の処理を行うステップである。ステップＳ３０では、ステップＳ３１、ステップＳ３２、ステップＳ３３及びステップＳ３４が実行される。

　ステップＳ３０では、まず、ステップＳ３１が実行される。ステップＳ３１は、結像光を受光するステップである。結像光は、観察光学系から出射した光である。

　ステップＳ３１が終わると、ステップＳ３２が実行される。ステップＳ３２は、結像光の光量を求めるステップである。結像光の光量は、ステップＳ３１で受光した光の光量である。

　ステップＳ３２が終わると、ステップＳ３３が実行される。ステップＳ３３は、差又は比を算出するステップである。ステップＳ３３では、ステップＳ３１で受光した光の光量、すなわち、結像光の光量と基準の光量との差又は比が算出される。

　ステップＳ３３が終わると、ステップＳ３４が実行される。ステップＳ３４は、傾き量を算出するステップである。ステップＳ３４では、ステップＳ３３で算出された結果から、標本の表面における傾き量が算出される。

　ステップＳ３４が終わると、ステップＳ５０が実行される。ステップＳ５０では、傾き量から標本７の形状を計算し、計算した形状から標本７の形状を画像化する。このようにすることで、標本の形状を視覚的に把握することができる。ステップＳ３０がステップＳ５０を含んでいても良い。

　また、基準の光量は、標本が存在していない状態での光量であることが好ましい。

　同じ標本を、異なる光量の照明光で照明すると、結像光の光量も異なる。そのため、結像光の光量だけを用いて傾き量を算出すると、標本が同じであっても、面形状は照明光の光量によって変化してしまう。そこで、本実施形態の標本形状測定方法では、結像光の光量と基準の光量との差又は比を算出している。このようにすることで、照明光の光量が変化しても、標本の表面形状を正しく求めることができる。

　基準の受光量は、標本が存在していない状態の光量なので、照明光の光量になる。よって、基準の光量を用いて結像光の光量との差又は比を算出することで、照明光の光量が変化しても、標本の表面形状を正しく求めることができる。

　シミュレーションの例を次に示す。図３３は、仮想標本における高さの分布を示す図である。仮想標本では、中央部が最も高く、周辺に向かって高さが低くなっている。

　図３４Ａは、第１の位置における傾斜角の分布を示す図である。図３４Ｂは、第２の位置における傾斜角の分布を示す図である。図３４Ａと図３４Ｂに示す傾斜角の分布は、仮想標本における傾斜角の分布である。

　図３４Ａに示す傾斜角の分布は、所定の照明領域を第１の位置に移動させたときの傾斜角の分布である。第１の位置は、Ｘ軸上に位置している。よって、図３４Ａに示す傾斜角の分布は、Ｘ方向の傾斜角の分布を表している。

　図３４Ｂに示す傾斜角の分布は、所定の照明領域を第２の位置に移動させたときの傾斜角の分布である。第２の位置は、Ｙ軸上に位置している。よって、図３４Ｂに示す傾斜角の分布は、Ｙ方向の傾斜角の分布を表している。

　シミュレーションでは、高さの分布や傾斜角の分布を算出する際に、仮想標本における傾き量がゼロの場合の光量を、予め算出している。図３３に示す高さの分布や、図３４Ａと図３４Ｂに示す傾斜角の分布は、傾き量がゼロの場合の光量との差分を示している。

　図３５は、所定の画素における傾き方向と傾き量を示す図である。所定の画素における傾き方向と傾き量は、図３４Ａと図３４Ｂに示された傾斜角の分布、すなわち、各画素のＸ方向とＹ方向の傾き量から算出している。図３５の「×」は解析点を示し、矢印の向きは解析点における傾きの方向、矢印の長さは傾き量（絶対値）を示している。解析点は、所定の画素の位置を示している。所定の画素は、全画素から離散的に抽出されている。よって、解析点も離散的に分布している。

　図３６は、仮想標本の高さ分布を示す図である。この高さ分布は、図３５の結果を用いて導出したものである。高さ分布については、上記の結果を用いて、隣接する画素の傾きの方向と傾き量が滑らかに繋がるように解析しても良い。このようにすることで、標本面の高さ分布を滑らかに導出することが可能となる。解析手法としては、フィッティング処理やスプライン処理がある。

　本実施形態の標本形状測定装置を用いた測定例について説明する。

　上述のように、本実施形態の標本形状測定装置は、第２の光検出素子を更に備えても良い。これにより、第２の光検出素子で蛍光の検出を行うことができる。

　図１に示す標本形状測定装置１は、第２の光検出素子として、光検出器２０を備えている。標本７で発生した蛍光は、共焦点ピンホール１９を介して光検出器２０で検出される。

　標本形状測定装置１では、標本７から光検出器２０までの間の光学系で、共焦点光学系が形成されている。共焦点光学系では、標本の光学断層像（以下、「断層像」という）が得られる。また、光軸方向に沿って焦点位置を変化させることで、様々な高さでの光学断層像（以下、「連続断層像」という）が得られる。焦点位置は変えずに、標本を光軸方向に移動させても、連続断層像が得られる。

　光検出器２０で蛍光を受光した場合、蛍光の断層像が得られる。また、光軸方向に沿って焦点位置を変化させることで、蛍光の連続断層像が得られる。

　光軸方向の所望の位置で、断層像を効率よく取得すためには、所望の位置と焦点位置とができるだけ一致した状態にすることが好ましい。

　また、連続断層像を効率よく取得するためには、標本の高さが最も高い位置（以下、「最高位置」という）から、標本の高さが最も低い位置（以下、「最低位置」という）までの間で、焦点位置を変化させることが好ましい。

　蛍光の強度は励起光の１０^－６と極めて微弱である。蛍光観察では、標本は、蛍光を発する物質で染色される。蛍光を発生する物質に励起光を当て続けると、褪色が発生する。褪色が発生すると、標本から蛍光が発生しなくなる。

　このようなことから、素早く所望の位置と焦点位置とが一致した状態にできることが好ましい。また、最高位置付近と最低位置付近で、断層像の取得の開始、又は断層像の取得の終了が行われることが好ましい。

　本実施形態の標本形状測定装置は、標本の表面形状を測定することができる。よって、その測定結果に基づいて、１つの断層像を得る場合も、任意の高さでの断層像を取得することができる。また、断層像の取得を開始する位置と断層像の取得を終了する位置とを、最高位置付近又は最低位置付近に設定することができる。

　図３７は、蛍光画像を生成する方法を示すフローチャートである。図３２のフローチャートと同じステップについては同じ番号を付し、説明は省略する。

　ステップＳ５０が終わると、ステップＳ６０が実行される。ステップＳ６０は、走査範囲を設定するステップである。走査には、光軸と直交する面内の走査と、光軸に沿う方向の走査と、がある。光軸と直交する面内の走査を、ＸＹ走査とする。光軸に沿う方向の走査をＺ走査とする。ステップＳ６０では、ＸＹ走査の走査範囲と、Ｚ走査の範囲が設定される。光軸方向の走査範囲が設定される。

　ステップＳ６０が終わると、ステップＳ７０が実行される。ステップＳ７０は、走査を実行するステップである。ステップＳ７０では、設定された範囲をＸＹＺ走査する。これにより、設定された範囲を光スポットが移動する。すなわち、標本に光スポットが照射される。

　ステップＳ７０が終わると、ステップＳ８０が実行される。ステップＳ８０は、蛍光を受光するステップである。ステップＳ８０では、光検出器２０で蛍光が受光される。光検出器２０で受光した蛍光は、電気信号に変換される。

　ステップＳ８０が終わると、ステップＳ９０が実行される。ステップＳ９０は、蛍光画像を生成するステップである。ステップＳ９０では、光検出器２０から出力された電気信号に基づいて、画像が生成される。この画像は、共焦点光学系によって得られた画像、いわゆる、共焦点画像である。

　共焦点画像は、焦点深度が非常に狭い画像なので、断層像と見なすことができる。ステップＳ９０を実行することで、蛍光の断層像が得られる。

　図３７に示すフローチャートは、ステップＳ６０において、Ｚ走査の範囲が１つの断層像を取得する範囲に設定されている場合を示している。よって、ステップＳ９０が終ると、全体の処理が終了する。

　Ｚ走査の範囲が複数の断層像を取得する範囲に設定されている場合、ステップＳ７０からステップＳ９０までが、繰り返し行われる。

　上述のように、本実施形態の標本形状測定装置は、標本の表面形状を測定する機能を備えている。更に、本実施形態の標本形状測定装置は、共焦点光学系を備えることができる。共焦点光学系を備えることで、本実施形態の標本形状測定装置に断層像を取得する機能を持たせることができる。

　断層像の数が多いほど、標本に関する情報量が増える。よって、断層像を連続的に取得できることが好ましい。連続断層像を取得する場合は、できるだけ焦点位置の移動量を小さくすることが好ましい。

　断層像を取得する機能だけを持つ装置（以下、「第１の装置」という）と、本実施形態の標本形状測定方法と断層像を取得する機能とを持つ装置（以下、「第２の装置」という）と、で比較する。

　上述のように、蛍光標本では、励起光が照射されると褪色が生じる。褪色が進むと、標本から発生する蛍光が弱くなる。連続断層像の取得では、励起光が繰り返し標本に照射される。照射時間が長くなり過ぎると、ＳＮ比の高い断層像を取得することが困難になる。照射回数が多くなり過ぎる場合も同様である。

　第１の装置による連続断層像の取得について説明する。図３８Ａは、第１の装置で連続断層像を取得する様子を示す図である。図３８Ａの（Ａ）は、取得前の作業の様子を示している。図３８Ａの（Ｂ）は、連続断層像の取得の様子を示している。

　図３８Ａにおいて、位置Ｐmaxは、標本３００における最高位置、又はその近傍である。位置Ｐsは、第１の装置における走査開始位置である。位置Ｐsは、位置Ｐmaxにおける高さよりも高い位置に設定されている。位置Ｐeは、走査終了位置である。位置Ｐmax、位置Ｐs及び位置Ｐeは、いずれも、光軸方向の位置であって、スライドガラス３１０の底面を原点としている。

　連続断層像を効率よく取得するためには、位置Ｐsを、できるだけ位置Ｐmaxの近くに設定することが好ましい。そのために、連続断層像を取得する前に、位置Ｐmaxを把握するための作業を行う。

　第１の装置では、連続断層像の取得前の作業として、励起光を用いた第１回目の走査が行われる。第１の装置では、共焦点光学系による画像しか得られない。共焦点光学系では、１回のＸＹ走査で１枚の断層像が得られる。ただし、１枚の断層像だけでは、位置Ｐmaxを求めることはできない。最低位置についても同様である。

　そのため、第１の装置では、図３８Ａの（Ａ）に示すように、連続断層像を取得する前に、走査範囲を大まかに設定して、第１回目のＺ走査が行われる。このとき、位置Ｐsは、位置Ｐmaxから十分離れた位置に設定されることになる。

　できるだけ正確に位置Ｐmaxを求めるためには、焦点位置の移動量を小さくすれば良い。しかしながら、焦点位置の移動量が小さいと、標本３００に励起光が照射されている時間が長くなる。

　上述のように、蛍光標本では、励起光が照射されると褪色が生じる。蛍光の褪色を防止するために、標本３００に励起光が照射されている時間を短くしなくてはならない。このようなことから、図３８Ａの（Ａ）に示すように、第１回目の走査では、焦点位置の移動量を大きくせざるを得ない。

　第１回目の走査を行うことで、標本３００の高さを把握することができる。すなわち、位置Ｐmaxが判明する。よって、位置Ｐmaxに基づいて位置Ｐsを設定することができる。説明は省略するが、標本３００における最低位置も判明するので、位置Ｐeも設定することができる。

　位置Ｐsと位置Ｐeが設定されることで、Ｚ走査の捜査範囲が決まる。焦点位置の移動量又は移動回数を設定すれば、第２回目の走査、すなわち、連続断層像の取得が可能になる。

　図３８Ａの（Ｂ）は、第２回目の走査を行う様子を示す図である。位置Ｐmaxが判明しているので、第２回目の走査では、第１回目の走査と異なり、位置Ｐsの位置が位置Ｐmaxと一致している。また、第２回目の走査では、第１回目の走査に比べて、焦点位置を移動させる幅が狭くなっている。その結果、多数の連続断層像を取得することができる。

　第２の装置による連続断層像の取得について説明する。図３８Ｂは、第２の装置で連続断層像を取得する様子を示す図である。図３８Ｂの（Ａ）は、取得前の作業の様子を示している。図３８Ｂの（Ｂ）は、連続断層像の取得の様子を示している。

　第２の装置でも、連続断層像の取得前の作業として、励起光を用いた第１回目の走査が行われる。第２の装置では、共焦点光学系は用いられない。すなわち、第１回目の走査では、共焦点レンズ１８、共焦点ピンホール１９及び光検出器２０は用いられない。その代わりに、図１に示す検出光学系４が用いられる。検出光学系４を用いることで、標本の表面形状を測定することができる。

　第２の装置では、第１回目の走査において、共焦点レンズ１８、共焦点ピンホール１９及び光検出器２０は用いられない。そのため、１回のＸＹ走査で得られる情報は、標本のある一つの高さの情報ではなく、標本全体の情報になる。すなわち、第２の装置では、１回のＸＹ走査で、標本の形状が測定できる。そのため、第２の装置では、第１の装置のように、第１回目の走査で、焦点位置を移動させる必要がない。

　第２の装置では、１回のＸＹ走査における焦点位置は、標本表面近傍、標本３００の内部、標本の底面近傍であれば良い。図３８Ｂの（Ａ）では、焦点位置はカバーガラス３１０の近傍に設定されている。

　第１回目の走査を行うことで、標本の高さを把握することができる。第１回目の走査における焦点位置を位置Ｐeとすると、位置Ｐeを基準にして位置Ｐmaxが判明する。よって、位置Ｐmaxに基づいて位置Ｐsを設定することができる。

　図３８Ｂの（Ｂ）は、第２回目の走査を行う様子を示す図である。位置Ｐmaxが判明しているので、第２回目の走査は、位置Ｐsの位置と位置Ｐmaxとが一致した状態で行われる。その結果、第１の装置と同じように、多数の連続断層像を取得することができる。

　図３８Ａの（Ａ）と図３８Ｂの（Ａ）を比較して分かるように、第１の装置では、Ｚ走査が行われているのに対して、第２の装置では、Ｚ走査が行われていない。そのため、第２の装置では、第１の装置に比べて、励起光の照射時間が短い。その結果、第２の装置では、第１の装置に比べて、褪色を少なくすることができる。

　また、標本の表面形状の測定では、標本３００を透過した光が用いられる。透過光の光強度は、蛍光の光強度に比べて、非常に大きい。そのため、第２の装置では、励起光の光強度が非常に小さくても、標本の表面形状を測定することができる。その結果、第２の装置では、第１の装置に比べて、褪色を少なくすることができる。

　取得前の作業は、複数の焦点位置で行っても良い。このようにすることで、標本３００の高さが高い場合であっても、標本３００の全体の形状を測定することができる。

　この場合、第１の装置と同様にＺ走査を行うことになる。しかしながら、第２の装置では、１回の作業で測定できる幅（標本の厚み）は、第１の装置における断層像に比べると遥かに広い。よって、Ｚ走査の回数は、第１の装置に比べると、非常に少なくすることができる。また、上述のように、第２回目の走査では、第１の装置に比べて、励起光の光強度も小さい。よって、Ｚ走査を行っても、第２の装置では、第１の装置に比べて、褪色を少なくすることができる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、第１の波長域の光は、蛍光が励起されない波長域の光であり、第２の波長域の光は、蛍光が励起される波長域の光であり、標本への照明光の照射は、第１の波長域の光による照射を、第２の波長域の光による照射の前に行うことが好ましい。

　上述の説明では、第２の装置における取得前の作業を、励起光で行った。しかしながら、標本の表面形状を測定では透過光を利用するため、取得前の作業では励起光を使用しなくても良い。

　そこで、第２の装置では、取得前の作業を、第１の波長域の光で行う。第１の波長域の光は、蛍光が励起されない波長域の光である。この場合、照明光の照射時間が長くても、褪色は発生しない。その結果、第２の装置では、第１の装置に比べて、褪色を少なくすることができる。

　本実施形態の標本形状測定装置は、標本のタイムラプス観察にも用いることができる。図３９は、第１の装置による観察の様子を示している。図４０は、第２の装置による観察の様子を示している。

　図３９と図４０には、細胞が分裂している様子が示されている。細胞は状態（Ｉ）から状態（Ｖ）まで変化している。各状態で連続断層像を取得することで、様々な情報を得ることができる。

　詳細な説明は省略するが、第１の装置によるタイムラプス観察と第２の装置によるタイムラプス観察の両方で、（Ｉ－２）、（ＩＩ－２）、（ＩＩＩ－２）、（ＩＶ－２）、（Ｖ－２）の観察時に、励起光が細胞に照射される。

　ただし、第１の装置によるタイムラプス観察では、（Ｉ－１）、（ＩＩ－１）、（ＩＩＩ－１）、（ＩＶ－１）、（Ｖ－１）においても、励起光が細胞に照射される。しかも、そのときの励起光の光強度は、（Ｉ－２）、（ＩＩ－２）、（ＩＩＩ－２）、（ＩＶ－２）、（Ｖ－２）における励起光光強度とほぼ同じである。

　一方、第２の装置によるタイムラプス観察では、では、（Ｉ－１）、（ＩＩ－１）、（ＩＩＩ－１）、（ＩＶ－１）、（Ｖ－１）においても、励起光が細胞に照射される。但し、第２の装置では、Ｚ走査が行われない。そのため、第２の装置では第１の装置に比べて、励起光の照射時間が短い。更に、第２の装置では、第１の装置に比べて、励起光の光強度が小さい。よって、第１の装置によるタイムラプス観察に比べて、褪色を少なくすることができる。

　第２の装置では、（Ｉ－１）、（ＩＩ－１）、（ＩＩＩ－１）、（ＩＶ－１）、（Ｖ－１）において、第１の波長域の光、すなわち、蛍光が励起されない波長域の光を標本に照射しても良い。このようにすることで、褪色を、より少なくすることができる。

　本実施形態の標本形状測定装置では、ＸＹＺ走査を行うことで、３次元の情報を取得することができる。よって、取得した情報は様々な形で表示できる。

　図４１Ａ、図４１Ｂ、図４１Ｃには、取得した情報がＸＹ面内で表示され様子が示されている。図４１Ａは、表示例１を示す図、図４１Ｂは、表示例２を示す図、図４１Ｃは、表示例３を示す図である。

　表示例１では、標本の高さ情報が明暗で表示されている。色を変えて、標本の高さ情報表示しても良い。表示例２では、標本の高さ情報が等高線で表示されている。図に示すように、表示例１と表示例２の両方に、例えば、測定点Ｐｍを表示することができる。

　表示例３では、標本の高さ情報が等高線で表され、更に、円形状の蛍光画像が示されている。本実施形態の標本形状測定装置では、取得前の作業と第２回目の走査が行われる。第２回目の走査に先立って、第２回目における走査範囲を、等高線で表示された画像に重ねて表示することができる。

　図４２Ａ、図４２Ｂには、取得した情報がＸＺ面内で表示され様子が示されている。図４２Ａは、表示例４を示す図、図４２Ｂは、表示例５を示す図である。

　表示例４では、標本の断面に、測定している面が重ねて表示されている。表示例５では、標本の断面に、円形状の蛍光画像が重ねて示されている。

　図４３Ａ、図４３Ｂには、取得した情報が立体的に表示され様子が示されている。図４３Ａは、表示例６を示す図、図４３Ｂは、表示例７を示す図である。

　表示例６では、標本の高さ情報が鳥瞰図で示されると共に、鳥瞰図に測定している面が重ねて表示されている。表示例７では、標本の高さ情報が鳥瞰図で示されると共に、鳥瞰図に円形状の蛍光画像が重ねて表示されている。

　本実施形態の標本形状測定装置による測定例を示す。図４４Ａは、標本の蛍光画像である。図４４Ｂは、Ｘ方向における傾斜角の分布を示す画像である。図４４Ｃは、Ｙ方向における傾斜角の分布を示す画像である。図４５は、標本の高さを示す図である。

　標本の蛍光画像では、蛍光を検出することで得られる。よって、蛍光が発生していない領域は黒で表示される。傾斜角の分布を示す画像は、透過光を検出することで得られる。そのため、明暗の場所は、蛍光画像と傾斜角の分布を示す画像とで異なる。

　図４４Ｂに示す画像と図４４Ｃに示す画像は、共に、標本の高さ情報を含んでいる。よって、２つの画像から、図４５に示すように、標本の高さ情報を取得することができる。

　以上のように、本発明は、表面の反射率が低い標本であっても、高い精度で標本の表面形状を測定できる標本形状測定装置に適している。

　１　標本形状測定装置
　２　光源ユニット
　３　照明光学系
　４　検出光学系
　５　光検出素子
　６　処理装置
　７　標本
　８　対物レンズ
　９　光走査ユニット
　１０　光線分離手段
　１１　瞳投影光学系
　１２、１３　レンズ
　１４　瞳投影レンズ
　１５　光学部材
　１６、１７　レンズ
　１８　共焦点レンズ
　１９　共焦点ピンホール
　２０　光検出器
　３０　照明光
　３１　保持部材
　３２、３３　移動ステージ
　４０　標本形状測定装置
　４１　光源ユニット
　４２　共焦点基板
　４２ａ　遮光部
　４２ｂ　透過部
　４３　軸
　４４　コリメータレンズ
　４５　ビームスプリッタ
　４６　結像レンズ
　４７　レンズ
　４８　光検出器
　４９　開口部材
　５０、５０’　開口部材
　５０ａ１、５０ａ２、５０’ａ１、５０’ａ２　遮光部
　５０ｂ、５０’ｂ　透過部
　５０ａ３　接続部
　５０ｃ　遮光部の外縁（透過部の内縁）
　５０ｄ　遮光部の内縁（透過部の外縁）
　５５　保持部材
　５６　透過部
　５６ａ　透過部の外縁
　５６ｂ　透過部の内縁
　５７　遮光部
　５８　外縁像
　６０　透過部の像
　６０ａ　透過部の外縁の像
　６０ｂ　透過部の内縁の像
　６１　遮光部の像
　６２　外縁
　９０、９０’　開口部材
　９０ａ１、９０ａ２、９０’ａ１　遮光部
　９０ｂ、９０’ｂ　透過部
　９０ｃ、９０’ｃ　第１の外縁
　９０ｄ、９０’ｄ　第２の外縁
　９０ｅ、９０’ｅ　外縁
　９０ｆ、９０’ｆ　内縁
　９５　開口部材の像
　９６　透過部の像
　９６ａ　透過部の内縁の像
　９６ｂ　透過部の外縁の像
　９７　遮光部の像
　９８　対物レンズの瞳
　９９　光束の領域
　１００、１１０、１２０　変形例１の開口部材
　１００ａ、１１０ａ、１２０ａ　遮光部
　１００ｂ、１１０ｂ、１２０ｂ　開口部
　１０１、１１１、１２１　境界線
　１０２、１０３、１１２、１１３、１２２、１２３　所定の点
　１０４、１１４、１２４　直線（所定の２点を結ぶ直線）
　１０５　境界線（第２の境界線）
　１０６　境界線の像（外側境界線）
　１０７　光束透過領域
　１１０　変形例２の開口部材
　１２０　変形例３の開口部材
　１３０　変形例４の開口部材
　１３０ａ、１４０ａ、１５０ａ　遮光部
　１３０ｂ、１４０ｂ、１５０ｂ　開口部
　１３１、１４１、１５１　境界線
　１３２、１３３、１４２、１４３、１５２、１５３　所定の点
　１３４、１４４、１５４　直線（所定の２点を結ぶ直線）
　１３５　境界線（第３の境界線）
　１３６　境界線（外側境界線）
　１３７　光束透過領域
　１４０　変形例５の開口部材
　１５０　変形例６の開口部材
　１６０　標本形状測定装置
　１６１　光学部材
　１６２　検出光学系の瞳
　１７０　開口ユニット
　１７１、１７５、１７７　第１の開口部材
　１７１ａ、１７５ａ、１７７ａ　遮光部
　１７１ｂ、１７５ｂ、１７７ｂ　第１の開口部
　１７２、１７６、１７８　第２の開口部材
　１７２ａ、１７６ａ、１７８ａ　遮光部
　１７２ｂ、１７６ｂ、１７８ｂ　第２の開口部
　１７３　移動機構
　１７４　光軸（照明光学系の光軸）
　１８０　開口部材
　１８０ａ　遮光部
　１８０ｂ　第１の開口部
　１８０ｃ　第２の開口部
　１９０　開口部材
　１９０ａ　遮光部
　２００、２１０、２２０　開口部材
　２００ａ、２１０ａ、２２０ａ　遮光部
　２００ｂ、２１０ｂ、２２０ｂ　透過部
　２０１　対物レンズの瞳
　２０２　光軸
　２０３　結像光
　２４０　対物レンズＢの瞳
　２５０　標本形状測定装置
　２５１　光源ユニット
　２５２　光束径変更部材
　２６０　標本形状測定装置
　２６１　第２の光源
　２６２　光線分離手段
　２６３　光学フィルタ
　２７０　照明光
　２７１　光束の中央
　２７２　光束の周辺
　２８０　照明側開口部材
　２８０ａ１、２８０ａ２　遮光部
　２８０ｂ　透過部
　２９０　検出側開口部材
　２９０ａ　遮光部
　２９０ｂ　透過部
　ＡＸ_i　光軸

Claims

　光源ユニットと、照明光学系と、検出光学系と、光検出素子と、処理装置と、を備え、
　前記照明光学系と前記検出光学系とは、標本を挟んで対向して配置され、
　前記光源ユニットから出射した光は、前記照明光学系に入射し、
　前記照明光学系によって、前記照明光学系と前記検出光学系との間に光スポットが形成され、
　前記光源ユニットから前記光検出素子までの光路中に、走査手段が配置され、
　前記走査手段は、前記光スポットと前記標本とを相対移動させ、
　前記照明光学系により前記標本に照射された照明光は、前記標本を透過し、
　前記標本から出射した光は前記検出光学系に入射し、
　前記光検出素子は、前記検出光学系から出射した光を受光し、
　前記照明光学系と前記検出光学系の少なくとも一方は、光学部材を有し、
　前記処理装置は、
　前記受光した光に基づく光量を求め、
　前記光量と基準の光量との差及び比の少なくとも一方を算出し、
　前記差及び比の少なくとも一方から、前記標本の表面における傾き量を算出し、
　前記傾き量から前記標本の形状を計算することを特徴とする標本形状測定装置。
　前記検出光学系は、前記光学部材を有し、
　前記光学部材は、遮光部又は減光部と、透過部と、を有する開口部材であって、
　前記透過部は、前記照明光学系の瞳の像の内側の一部分と外側を含むように位置していることを特徴とする請求項１に記載の標本形状測定装置。
　前記検出光学系は、前記光学部材を有し、
　前記光学部材は、遮光部又は減光部と、透過部と、を有する開口部材であって、
　前記遮光部又は前記減光部は、前記検出光学系の光軸を含むように位置し、
　前記透過部は、前記照明光学系の瞳の像の内側の一部分と外側を含むように位置していることを特徴とする請求項１に記載の標本形状測定装置。
　前記検出光学系は、前記光学部材を有し、
　前記光学部材は、遮光部又は減光部と、透過部と、を有する開口部材であって、
　前記遮光部又は前記減光部は、前記検出光学系の光軸を含むように位置し、
　前記透過部は、前記光軸を含まず、前記照明光学系の瞳の像の縁の全てを含むように位置していることを特徴とする請求項１に記載の標本形状測定装置。
　前記検出光学系は、前記光学部材を有し、
　前記光学部材は、遮光部又は減光部と、透過部と、を有する開口部材であって、
　前記遮光部又は前記減光部は、前記検出光学系の光軸を含むように位置し、
　前記透過部は、前記光軸に対して偏心しており、前記照明光学系の瞳の像の縁の一部を含むように位置していることを特徴とする請求項１に記載の標本形状測定装置。
　前記照明光学系が対物レンズを有し、
　前記検出光学系が瞳投影レンズを有し、
　以下の条件式を満たすことを特徴とする請求項４に記載の標本形状測定装置。
　Ｒ0＜Ｒill×β＜Ｒ1
　ただし、
　Ｒ0は、前記瞳投影レンズの光軸から所定の位置までの長さ、
　Ｒ1は、前記瞳投影レンズの光軸から前記透過部の外縁までの長さであって、前記瞳投影レンズの光軸と前記所定の位置とを結ぶ線上における長さ、
　前記所定の位置は、前記遮光部の内縁上の位置のうち、前記瞳投影レンズの光軸からの長さが最小となる位置、
　Ｒillは、前記照明光学系の瞳の半径、
　βは、前記瞳投影レンズの焦点距離を前記対物レンズの焦点距離で割った値、
とする。
　前記照明光学系は、前記光学部材を有し、
　前記光学部材は、遮光部又は減光部と、透過部と、を有する開口部材であることを特徴とする請求項１に記載の標本形状測定装置。
　前記処理装置は、画像を再構築する機能を有することを特徴とする請求項１に記載の標本形状測定装置。
　前記照明光学系が対物レンズを有し、
　光路に挿入離脱する第１の開口部材と第２の開口部材とを有し、
　前記第１の開口部材は、前記対物レンズの光軸を含む箇所が遮光部であり、前記光軸に対して偏心した位置に第１の開口部を有し、
　前記第２の開口部材は、前記対物レンズの光軸を含む箇所が遮光部であり、前記光軸に対して偏心した位置に第２の開口部を有し、
　前記第１の開口部材を光路に挿入したときの前記光軸と第１の開口部重心を結ぶ方向と、前記第２の開口部材を光路に挿入したときの前記光軸と第２の開口部重心を結ぶ方向と、は交差することを特徴とする請求項１に記載の標本形状測定装置。
　前記照明光学系が対物レンズを有し、
　前記光学部材は開口部材であって、
　前記開口部材は、前記対物レンズの光軸を含む箇所が遮光部であり、
　前記光軸に対して偏心した位置に第１の開口部と第２の開口部とを有し、
　前記開口部材を光路に挿入したときの前記光軸と第１の開口部重心を結ぶ方向と、
　前記光軸と第２の開口部重心を結ぶ方向と、は交差することを特徴とする請求項１に記載の標本形状測定装置。
　前記照明光学系が対物レンズを有し、
　前記光学部材は開口部材であって、
　前記開口部材は、前記対物レンズの光軸を含む箇所が遮光部であり、前記光軸に対して偏心した位置に開口部を有し、
　前記光軸と開口部重心を結ぶ方向を変更可能であることを特徴とする請求項１に記載の標本形状測定装置。
　前記照明光学系が対物レンズを有し、
　前記光学部材は遮光部を有する開口部材であって、
　前記遮光部の大きさと前記対物レンズの標本側開口数の少なくとも一方が変更可能であることを特徴とする請求項１に記載の標本形状測定装置。
　前記対物レンズの標本側開口数の変更は、複数の対物レンズを切り替えて行うことを特徴とする請求項１２に記載の標本形状測定装置。
　前記傾き量を算出するステップでは、予め求めておいた対応関係に基づいて前記傾き量を算出することを特徴とする請求項１に記載の標本形状測定装置。
　前記対応関係は、光量と傾き量とをパラメータとするルックアップテーブルで表わされていることを特徴とする請求項１４に記載の標本
形状測定装置。
　前記対応関係は、光量と傾き量とをパラメータとする式で表わされていることを特徴とする請求項１４に記載の標本形状測定装置。
　前記標本からの放射光を検出するための、第２の光検出素子を更に備え、
　前記第２の光検出素子で蛍光の検出を行うことを特徴とする請求項１に記載の標本形状測定装置。
　前記照明光の前記標本への照射は、第１の波長域の光と第２の波長域の光とで行われ、
　前記第１の波長域は、前記第２の波長域と異なる波長域を、少なくとも有することを特徴とする請求項１に記載の標本形状測定装置。
　前記第１の波長域の光は、蛍光が励起されない波長域の光であり、
　前記第２の波長域の光は、蛍光が励起される波長域の光であり、
　前記標本への前記照明光の照射は、前記第１の波長域の光による照射を、前記第２の波長域の光による照射の前に行うことを特徴とする請求項１８に記載の標本形状測定装置。