DE102004053730B4

DE102004053730B4 - Verfahren und Anordnung zur Unterdrückung von Falschlicht

Info

Publication number: DE102004053730B4
Application number: DE102004053730.5A
Authority: DE
Inventors: Dr. Westphal Peter
Original assignee: Carl Zeiss Jena GmbH
Current assignee: Jenoptik AG
Priority date: 2004-11-06
Filing date: 2004-11-06
Publication date: 2014-04-03
Anticipated expiration: 2024-11-07
Also published as: US7567726B2; US20060098895A1; DE102004053730A1

Abstract

Verfahren zur Abbildung eines Objekts (4) mittels einer Weitfeldoptik (5) auf einen ortsauflösenden Detektor (6) mit Unterdrückung von Falschlicht, bei dem – das Objekt (4) in wenigstens einer Objektebene (3) mit wenigstens zwei Beleuchtungsmustern (26, 27; 33, 34; 37, 38) beleuchtet wird und für jedes der Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34; 37, 38) entsprechende Bilder erfaßt werden, wobei die Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34; 37, 38) jeweils Dunkelbereiche (27; 34; 38), die bei Überlagerung der Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34; 37, 38) das Objekt (4) vollständig überdecken, und Hellbereiche (26; 33; 37) aufweisen, – aus den erfaßten Bildern ein Dunkelbild des Objekts (4) ermittelt wird, – ein Hellbild des Objekts (4) erzeugt wird, und bei dem – von dem Hellbild das Dunkelbild subtrahiert wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abbildung eines Objekts mittels einer Weitfeldoptik auf einen ortsauflösenden Detektor für optische Strahlung mit Unterdrückung von Falschlicht sowie eine entsprechende Vorrichtung.
Biologische Proben oder Materialien werden häufig mikroskopisch untersucht. Insbesondere können entsprechende Objekte mit Weitfeldoptiken untersucht werden, die das Objekt bzw. eine Ebene des Objekts auf einen ortsauflösenden Detektor abbilden. Die Untersuchung kann beispielsweise mit normaler Mikroskopie oder Fluoreszenzmikroskopie, insbesondere quantitativer Fluoreszenzmikroskopie, erfolgen. Bei den Objekten kann es sich insbesondere um Biochips, welche auf photolithographischem Wege oder mittels eines Spotters hergestellt wurden, oder um Materialoberflächen handeln.
Bei der Verwendung von Weitfeldoptiken zur Abbildung von heterogen leuchtenden Flächen bzw. flächenhaften Objekten auf einen ortsauflösenden Detektor, beispielsweise in einer CCD-Kamera, ergibt sich stets das Problem des Vorhandenseins von ”Falschlicht”, welches die Abbildung des Objektes negativ beeinträchtigt. Unter Falschlicht wird hier jegliches Licht verstanden, das den Kontrast der detektierten Intensitätsverteilung verringert oder verfälscht. Falschlicht entsteht beispielsweise durch Reflexionen und durch Streulicht an Oberflächen, in Gläsern, z. B. aufgrund von Lufteinschlüssen, durch Eigenfluoreszenz der verwendeten Gläser, an Fassungen oder bei Fluoreszenzmessungen durch nicht unterdrücktes Anregungslicht. Weiterhin kann Falschlicht auch aus außerhalb der Fokusebene liegenden Bereichen des Objektes oder der Probe kommen, beispielsweise von der Rückseite eines Objektträgers. Zum Problem wird das Falschlicht insbesondere dann, wenn die Helligkeitsverteilung der Probe stark heterogen ist und ein hohes Kontrastverhältnis bei der Detektion verlangt wird.
Beispielsweise kann sich in einem Bild eines Objekt, das eine Vielzahl gleichartig fluoreszierender Kügelchen umfaßt, eine helle Fläche aus einer entsprechenden Vielzahl gleichartig fluoreszierender Kügelchen bzw. Kreise mit einem scharf definierten Durchmesser zusammensetzen. Somit sollte – von Beugungseffekten abgesehen – im Idealfall dort, wo sich die Kügelchen bzw. Kreise befinden, maximale Helligkeit vorhanden sein. In den übrigen Bereichen sollte vollkommene Dunkelheit herrschen. Tatsächlich ist jedoch auch dort, wo es dunkel sein sollte, eine gewisse Resthelligkeit vorhanden, d. h. ein inhomogener Untergrund, dessen Ursache in dem oben genannten Falschlicht liegt. Wäre dieser Untergrund homogen über das Bild verteilt, könnte er als ”offset” betrachtet und in einfacher Weise von allen Pixelwerten des Detektors subtrahiert werden. Ein solcher idealer Fall ist jedoch in der Praxis kaum vorzufinden, und demzufolge ist diese Vorgehensweise nicht generell anwendbar.
Bei radiometrischen Messungen, speziell bei Biochip-Anwendungen und quantitativer Fluoreszenzmikroskopie im Allgemeinen, wird die nutzbare Intensitätsdynamik, welche das Verhältnis von größtem zu kleinstem detektierbarem Intensitätswert wiedergibt, durch den inhomogenen Untergrund stark eingeschränkt, da bei einer unbekannten Fluorophor-Verteilung das Nutzlicht nicht vom Falschlicht unterschieden werden kann. Dieses ist insbesondere dann problematisch, wenn keine oder kaum Referenzflächen zur Verfügung stehen, an denen lokal der Untergrund bestimmt werden kann, also z. B. bei hochdichten Biochips, welche photolithographisch hergestellt wurden.
Eine Möglichkeit zur Vermeidung von Falschlicht liegt in der Verwendung von konfokalen Laserscannern. Bei einem konfokalen Laserscanner wird stets nur eine kleine Fläche der Probe von wenigen μm² beleuchtet und zudem bei der Detektion nur diese kleine Fläche betrachtet. Wird dies mit Hilfe einer gut angepaßten Lochblende konsequent durchgeführt, so wird Falschlicht von vornherein unterdrückt. Laserscanner weisen jedoch gegenüber Mikroskopen mit Weitfeldoptik eine Reihe von Nachteilen auf. Beispielsweise kann bei Fluoreszenzmikroskopie Anregungssättigung und ein starkes Ausbleichen von Fluorophoren auf Grund der hohen Strahlungsintensität im Fokus auftreten. Ferner gibt es deutliche Einschränkungen bei der Wahl der Wellenlänge. Viele bewegliche Komponenten, ein hoher Justieraufwand sowie eine geringe Quanteneffizienz des Detektors, in der Regel ein Photomultiplier, sind weitere Nachteile.
In der DE 199 30 816 A1 sind ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Tiefenselektion von Mikroskopbildern beschrieben, bei denen ein eindimensional periodisches Gitter, z. B. ein Streifengitter, zur Beleuchtung verwendet wird. Dabei werden mindestens n (n > 2) CCD-Kameraaufnahmen gemacht, wobei die Struktur der Beleuchtung um jeweils 1/n der Gitterkonstanten verschoben wird. Aus den mindestens drei Aufnahmen wird anschließend ein konfokaler Schnitt der Probe berechnet. Dieses Verfahren ist anfällig für Artefakte, wenn das Gitter keine sinusförmige Beleuchtungsintensität auf der Probe erzeugt.
Die WO 98/45745 A1 ( DE 698 02 514 T2 ) beschreibt ein Abbildungssystem und -verfahren für Mikroskope, bei denen eine strukturierte Beleuchtung mittels Überlagerung zweier kohärenter Lichtstrahlen vorgesehen ist. Das Verfahren verfolgt ebenso wie das oben beschriebene Verfahren gemäß der DE 199 30 816 A1 hauptsächlich das Ziel, optische Schnitte in verschiedenen Objektebenen analog einem Laser-Scanning-Mikroskop zu generieren.
Beide Verfahren verfolgen das Ziel, eine Tiefenauflösung von dicken Proben zu erhalten. Sie dienen dazu, mit einer Weitfeldoptik konfokale Schnitte einer im Vergleich zur Tiefenschärfe dicken Probe oder eines Objektes zu erhalten. In beiden Fällen ist der Rechenaufwand relativ groß, weil trigonometrische Gleichungen gelöst werden müssen.
In der unveröffentlichten deutschen Patentanmeldung P 103 30 716.8 ist eine Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens zur Eliminierung von Falschlicht bei der Abbildung von heterogenen, leuchtenden oder beleuchteten flächenhaften Objekten beschrieben. Diese umfaßt eine Strahlungsquelle mit nachgeordneter, die Strahlung homogenisierender Beleuchtungsoptik zur homogenen Ausleuchtung einer nachgeordneten Feldblendenebene, in welcher eine strukturierte Feldblende zur Erzeugung einer dem Objekt oder der Probe überlagerten Beleuchtungsstruktur angeordnet ist. Diese Beleuchtungsstruktur wird durch erste optische Mittel auf die Probe abgebildet, wobei diese ersten optischen Mittel einen Beleuchtungstubus, gegebenenfalls einen Farbteiler, und ein Objektiv umfassen können. Es sind ferner zweite optische Mittel zur Abbildung der Probe zusammen mit der überlagerten Beleuchtungsstruktur auf einen ortsauflösenden Detektor, insbesondere für optische Strahlung, vorgesehen. Die Anordnung enthält ferner Einstellmittel, mit denen die Beleuchtungsstruktur in der Objektebene auf dem Objekt oder der Probe definiert positionierbar ist. Der Detektor ist mit einer Auswerteeinrichtung zur Ermittlung und Eliminierung des Falschlichtes verbunden. Es wird eine strukturierte Hellfeldbeleuchtung mit wenigstens zwei verschiedenen Beleuchtungsmustern verwendet, bei der sich dunkle Bereiche nicht überschneiden. Aus entsprechenden Bildern kann dann ein Dunkelbild und ein Hellbild ermittelt werden. Durch Subtraktion des Dunkelbildes von dem Hellbild kann ein resultierendes Bild erhalten werden.
Die bei dieser Vorrichtung vorgesehene strukturierte Hellfeldbeleuchtung, bei welcher die Objektbeleuchtung und die Abbildung des Objektes zusammen mit der aufbelichteten Feldblendenstruktur durch ein einziges Objektiv erfolgen, kann das Anregungslicht im Objektiv das Auftreten von Falschlicht, insbesondere durch Eigenfluoreszenz der verwendeten Gläser, hervorrufen. Weiterhin wird die Rückseite eines Objekts, z. B. eines Biochips, mit nahezu der gleichen Anregungsintensität bestrahlt wie die Fokusebene. Daher kann auch die durch die Kontamination der Rückseite bedingte Fluoreszenzintensität entsprechend hoch sein und zu Meßfehlern Anlaß geben. Es wurde daher vorgeschlagen, bei einem zweiten Verfahren zur Vermeidung dieser Nachteile statt der Hellfeldbeleuchtung eine strukturierte Dunkelfeldbeleuchtung zu verwenden.
Bei beiden Verfahren ist es jedoch notwendig, eine Interpolation zwischen nicht beleuchteten Bereichen durchzuführen, um ein vollständiges Dunkel- bzw. Falschlichtbild zu erhalten.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, bei einem Verfahren zur Abbildung eines Objekts mittels einer Weitfeldoptik, bei dem die gesuchte Information innerhalb der Schärfentiefe des zur Abbildung verwendeten Objektivs liegt, den Einfluß von Falschlicht auf Messungen und Beobachtungen zu unterdrücken und eine entsprechende Abbildungsvorrichtung zu schaffen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Abbildung eines Objekts mittels einer Weitfeldoptik auf einen ortsauflösenden Detektor für optische Strahlung mit Unterdrückung von Falschlicht, bei dem das Objekt in wenigstens einer Objektebene mit wenigstens zwei Beleuchtungsmustern beleuchtet wird und für jedes der Beleuchtungsmuster entsprechende Bilder erfaßt werden, wobei die Beleuchtungsmuster in der Objektebene jeweils Dunkelbereiche, die bei Überlagerung der Beleuchtungsmuster in der Objektebene das Objekt vollständig überdecken, und Hellbereiche aufweisen, bei dem aus den erfaßten Bildern ein Dunkelbild und ein Hellbild des Objekts erzeugt wird und von dem Hellbild das Dunkelbild subtrahiert wird.
Die Aufgabe wird weiterhin gelöst durch eine Vorrichtung zur Erfassung eines Bildes eines Objekts, in dem Falschlichteinflüsse unterdrückt sind, mit einer Beleuchtungseinrichtung zur Beleuchtung des Objekts wenigstens in einer Objektebene, einer Einrichtung zur Erzeugung wenigstens zweier vorgegebener Beleuchtungsmuster mit einem im Strahlengang nach der Beleuchtungseinrichtung angeordneten, als strukturierte Blende wirkenden Element, wobei die Beleuchtungsmuster in der Objektebene jeweils Dunkelbereiche, die bei Überlagerung das Objekt vollständig überdecken, und Hellbereiche aufweisen, einer Abbildungsoptik zur Abbildung der Objektebene auf eine Bildebene, einem in der Bildebene angeordneten ortsauflösenden Detektor zur Detektion der von dem Objekt ausgehenden optischen Strahlung, und einer Auswerteeinrichtung zur Auswertung von Detektionssignalen des Detektors, mittels derer aus bei der Bestrahlung mit den Beleuchtungsmustern jeweils erfaßten Bildern ein Dunkelbild ermittelbar ist, und mittels derer das Dunkelbild von einem Hellbild des Objekts subtrahierbar ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren, das mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchführbar ist, dient zur Abbildung von Objekten, vorzugsweise flächenhaften Objekten, insbesondere heterogenen, leuchtenden oder beleuchteten Objekten. Insbesondere kann es sich bei diesem Verfahren um ein Mikroskopieverfahren handeln.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Objekt, unter dem im Rahmen der Erfindung je nach Größe des abbildbaren Bereichs in der Objektebene eine ganze Probe oder ein ganzer Gegenstand oder nur ein zu untersuchender bzw. abbildbarer Teilbereich einer ganzen Probe oder eines ganzen Gegenstands verstanden wird, mit wenigstens zwei strukturierten Beleuchtungsmustern beleuchtet. Hierzu sind bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung die Beleuchtungseinrichtung zur Abgabe von Beleuchtungslicht, unter dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung neben sichtbarem auch infrarotes oder ultraviolettes Licht verstanden wird, und die Einrichtung zur Erzeugung wenigstens zweier vorgegebener Beleuchtungsmuster zur insbesondere auch strukturierten Beleuchtung des Objekts wenigstens in der abzubildenden Objektebene vorgesehen. Die Einrichtung zur Erzeugung der Beleuchtungsmuster weist hierzu insbesondere ein als Blende wirkendes Element auf, das vorzugsweise als Feldblende wirkt.
Das Element verfügt über lichtdurchlässige bzw. transparente und lichtundurchlässige bzw. opake Bereiche, denen in den Beleuchtungsmustern jeweils Hell- und Dunkelbereiche entsprechen, die benachbart sind. Dementsprechend treten in bzw. auf dem Objekt bzw. dem untersuchten Bereich mit Beleuchtungslicht beleuchtete und unbeleuchtete Bereiche auf.
Bei dem Verfahren wird das Objekt nacheinander mit jeweils nur einem der Beleuchtungsmuster beleuchtet. Die bei dem Verfahren verwendeten Beleuchtungsmuster sind so gewählt, daß deren Dunkelbereiche bei einer vorgestellten bzw. fiktiven Überlagerung der Beleuchtungsmuster das Objekt vollständig überdecken.
Das Objekt mit dem jeweiligen Beleuchtungsmuster wird dann mittels der Abbildungsoptik, die insbesondere ein Objektiv umfassen kann, auf den ortsauflösenden Detektor abgebildet, der zur Erfassung der Bilder des Objekts dient. Als ortsauflösender Detektor kann vorzugsweise eine CCD- oder CMOS-Matrix eingesetzt werden.
Die Signale des ortsauflösenden Detektors werden von der Auswerteeinrichtung, beispielsweise einer Datenverarbeitungseinrichtung mit einer Videoschnittstelle und einem Prozessor, zu Bildern verarbeitet.
In jedem erfaßten Bild werden von den beleuchteten Bereichen des Objekts, die mit Hellbereichen des jeweiligen Beleuchtungsmusters beleuchtet sind, soweit vorhanden, dem Falschlicht entsprechende Lichtanteile in die Bereiche des Bildes des Objekts gelenkt, die den Dunkelbereichen des jeweiligen Beleuchtungsmusters auf bzw. in dem Objekt, d. h. unbeleuchteten Bereichen des Objekts, entsprechen. In diesen Bereichen des Bildes werden die Anteile dann als Falschlicht detektiert. Da die Dunkelbereiche der Beleuchtungsmuster das Objekt bei Überlagerung der Beleuchtungsmuster vollständig überdecken, kann aus den Dunkelbereichen der Bilder ohne Interpolation ein Dunkelbild bzw. Falschlichtbild des gesamten Objekts erhalten werden, das alle zu eliminierenden Falschlichtanteile enthält. Dieses Dunkel- bzw. Falschlichtbild wird von dem Hellbild des Objekts, das basierend auf Detektionssignalen des Detektors erzeugt ist, subtrahiert, wodurch ein resultierendes Bild entsteht, in dem das Falschlicht unterdrückt ist.
Hierzu ist keine Interpolation zwischen den Bildern der unbeleuchteten Bereiche bzw. der Dunkelbereiche in der Objektebene notwendig.
Darüber hinaus zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren durch seine Einfachheit aus, da neben der Bildung der Dunkel- und gegebenenfalls der Hellbilder nur eine Subtraktion von Intensitätswerten notwendig ist. Diese Schritte sind mit Computern, aber auch einfacheren Prozessoren oder sogar nicht programmierten Schaltungen wesentlich schneller durchführbar als trigonometrische Operationen.
Zur Erzeugung des Dunkelbildes werden vorzugsweise Bereiche der erfaßten Bilder zusammengefügt, die Abbilder der Dunkelbereiche des Objekts bei Beleuchtung mit den Beleuchtungsmustern sind. Die Dunkelbereiche des Objekts sind dabei diejenigen Bereiche des Objekts, die bei Beleuchtung mit einem jeweiligen Beleuchtungsmuster in den Dunkelbereichen des Beleuchtungsmusters liegen. Unter einem Zusammenfügen wird dabei auch verstanden, daß sich die Bilder der Dunkelbereiche des Objekts teilweise überlappen können. Das Zusammenfügen der Bereiche der erfaßten Bilder kann auch als Bildmontage aufgefaßt werden. Die Bereiche werden beim Zusammenfügen entsprechend der Anordnung der entsprechenden Dunkelbereiche auf dem Objekt relativ zueinander angeordnet. Das Zusammenfügen kann beispielsweise durch Addition der Bilder erfolgen. Auf diese Weise kann das Dunkelbild sehr einfach erhalten werden. Überlappen sich die Dunkelbereiche der Beleuchtungsmuster, kann vorzugsweise über die redundanten Teilbereiche der Bilder der Dunkelbereiche aus verschiedenen Bildern gemittelt werden. Beispielsweise kann die Summe der Abbilder der jeweiligen Dunkelbereiche durch entsprechende Renormierung in den Überlappungsbereichen korrigiert werden.
Besonders bevorzugt wird das Dunkelbild aus Teilbereichen der erfaßten Bilder zusammengefügt, die Abbilder der Dunkelbereiche des Objekts bei Beleuchtung mit den Beleuchtungsmustern sind und im wesentlichen ohne Überlappung aneinander angrenzen. Dazu sind die Beleuchtungsmuster auf dem Objekt vorzugsweise so ausgebildet und bei Überlagerung zueinander ausgerichtet, daß die Dunkelbereiche bei Überlagerung der Beleuchtungsmuster im wesentlichen überlappungsfrei aneinandergrenzen. Auf diese Weise kann der Aufwand für ein wegen einer Überlappung der Teilbereiche wünschenswerte Korrektur vermieden oder wenigstens stark reduziert werden.
Weiter wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Reduktion von Rauscheffekten das Dunkelbild vorzugsweise rechnerisch geglättet. Diese Möglichkeit stellt einen wesentlichen Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber anderen Verfahren unter Verwendung einer strukturierten Beleuchtung dar, bei denen kein vollständiges Dunkelbild während der Datenauswertung generiert wird bzw. werden kann.
Das Hellbild kann auf unterschiedliche Art und Weise erzeugt werden. Bei einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird bevorzugt das Hellbild durch Erfassung eines Bildes bei einer unstrukturierten Beleuchtung erzeugt. Dieses Vorgehen erlaubt eine besonders schnelle Verarbeitung der erfaßten Bilder, da das Hellbild nicht erst aus mehreren Teilen generiert zu werden braucht. Darüber hinaus bestehen bei der Wahl der Beleuchtungsmuster größere Freiheiten, da die Hellbereiche der Beleuchtungsmuster bei Überlagerung der Beleuchtungsmuster in der Objektebene das Objekt nicht zu überdecken brauchen.
Um nur eine möglichst geringe Anzahl von Bildern erfassen zu müssen, wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt das Hellbild aus den bei Beleuchtung mit den Beleuchtungsmustern erfaßten Bildern erzeugt, wobei die Beleuchtungsmuster Hellbereiche aufweisen, die bei Überlagerung der Beleuchtungsmuster in der Objektebene das Objekt vollständig überdecken. Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist dazu bevorzugt die Einrichtung zur Erzeugung wenigstens zweier vorgegebener Beleuchtungsmuster zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern mit Hellbereichen ausgebildet, die bei Überlagerung der Beleuchtungsmuster in der Objektebene das Objekt vollständig überdecken, und bei der das Hellbild mittels der Auswerteeinrichtung aus den bei Beleuchtung mit den Beleuchtungsmustern erfaßten Bildern erzeugbar ist. Wie bereits im Zusammenhang mit den Dunkelbereichen erwähnt, überdecken die Hellbereiche das Objekt bei einer vorgestellten Überlagerung der Beleuchtungsmuster, tatsächlich wird das Objekt nacheinander mit den verschiedenen Beleuchtungsmustern bestrahlt. Besonders bevorzugt werden zur Erzeugung des Hellbildes Bereiche der erfaßten Bilder zusammengefügt, die Abbilder der Hellbereiche des Objekts bei Beleuchtung mit den Beleuchtungsmustern sind. Wie schon bei der Bildung des Dunkelbildes ausgeführt, kann in dem Fall, in dem sich die Hellbereiche der Beleuchtungsmuster auf dem Objekt bzw. in der Objektebene überlappen, über die redundanten Teilbereiche der Bilder der Hellbereiche aus verschiedenen Bildern gemittelt werden. Beispielsweise kann bei einer Summierung der Abbilder der Hellbereiche eine Renormierung in den Überlappungsbereichen durchgeführt werden, um Effekte einer doppelten Erfassung in diesen Bereichen zu korrigieren.
Besonders bevorzugt wird das Hellbild aus Teilbereichen der erfaßten Bilder zusammengefügt, die Abbilder der Hellbereiche des Objekts bei Beleuchtung mit den Beleuchtungsmustern sind und im wesentlichen ohne Überlappung aneinander angrenzen. Dazu sind die Beleuchtungsmuster auf dem Objekt vorzugsweise so ausgebildet und bei Überlagerung zueinander ausgerichtet, daß die Dunkelbereiche bei Überlagerung der Beleuchtungsmuster im wesentlichen überlappungsfrei aneinandergrenzen. Auf diese Weise kann der Aufwand für eine wegen einer Überlappung der Teilbereiche wünschenswerte Korrektur vermieden oder wenigstens stark reduziert werden.
Besonders bevorzugt kann das Hellbild durch additive Überlagerung aller Bilder erzeugt werden, die bei Beleuchtung des Objekts mit den Beleuchtungsmustern erfaßt wurden. Vorzugsweise wird dann noch eine Normierung mit der additiven Beleuchtungsintensität vorgenommen.
Die Beleuchtungsmuster können prinzipiell beliebig gewählt werden, sofern die Dunkel- und Hellbereiche die zuvor genannten Eigenschaften aufweisen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren jedoch sind bevorzugt die Beleuchtungsmuster durch ein Grundmuster gegeben, das relativ zu dem Objekt jeweils unterschiedlich versetzt ist. Die Beleuchtungsmuster besitzen also die gleiche Struktur, sind aber in der Objektebene gegeneinander versetzt. Solche Beleuchtungsmuster sind einfach zu erzeugen. Darüber hinaus gestaltet sich die Auswertung der mit den Beleuchtungsmustern jeweils erzeugten Bilder besonders einfach.
Der Versatz der Beleuchtungsmuster relativ zu dem Objekt kann auf verschiedene Art und Weise erzielt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Objekt gegenüber dem Beleuchtungsmuster verschoben. Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist dazu ein Antrieb, mit dem das Objekt oder ein Objektträger bewegbar ist, von der Auswerteeinrichtung so steuerbar, daß auf dem durch Bewegung versetzten Objekt ein von dem als strukturierte Blende wirkenden Element erzeugtes Grundmuster eines der Beleuchtungsmuster bildet, und daß mittels der Auswerteeinrichtung Bilder nach jeder Lageänderung des Objekts automatisch erfaßbar sind. Als Antriebe können vorzugsweise Piezoaktoren oder Exzenterantriebe zum Einsatz kommen, die eine sehr genaue Positionierung erlauben. Der Antrieb kann gegebenenfalls auch zur ohnehin notwendigen Positionierung des Objekts relativ zu der Optik genutzt werden. Vorzugsweise kann ein ohnehin vorhandener motorisch bewegbarer Mikroskoptisch verwendet werden. Die Bewegung durch den Antrieb kann dabei, je nach verwendeten Beleuchtungsmustern, in ein oder zwei Richtungen entlang der Objektebene möglich sein. Die Auswerteeinrichtung kann insbesondere dazu ausgebildet sein, eine Folge von Beleuchtungsmustern auf bzw. in dem Objekt durch Ansteuerung des Antriebs zu erzeugen, wobei nach Einstellen jeweils eines Beleuchtungsmusters ein Bild erfaßt wird. Damit wird für den Benutzer der Vorrichtung die Bedienung wesentlich vereinfacht. Darüber hinaus kann durch entsprechende Programmierung der Auswerteeinrichtung die durch das Verfahren notwendige Abhängigkeit zwischen der Art der Beleuchtungsmuster und notwenigen Verschiebungen automatisch berücksichtigt werden.
Um eine Bewegung des Objekts relativ zu dem Detektor zu vermeiden, kann zur vorbeschriebenen Variante alternativ bevorzugt das Grundmuster mittels einer mechanischen Vorrichtung verschoben werden. Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist bevorzugt das als strukturierte Blende wirkende Element eine Feldblende. Ein Antrieb, mit dem die Feldblende oder ein Teil der Feldblende bewegbar ist, ist von der Auswerteeinrichtung so steuerbar, daß die Beleuchtungsmuster auf das Objekt gestrahlt werden. Nach jeder Änderung des Beleuchtungsmusters werden mittels der Auswerteeinrichtung Bilder automatisch erfaßt. Unter Feldblende wird hierbei insbesondere eine Blende verstanden, die zur Bildung der strukturierten Beleuchtung starre, nichttransparente bzw. opake Elemente aufweist.
Alternativ zur Bewegung der Beleuchtungsmuster kann vorgesehen sein, daß das als strukturierte Blende wirkende Element eine Feldblende ist und zur Erzeugung der mindestens zwei Beleuchtungsstrukturen hinter der Feldblende ein bewegliches, lichtablenkendes Element angeordnet ist. Die Feldblende kann dabei fest positioniert sein. Als lichtablenkendes Element kann insbesondere eine spiegelnde Fläche oder eine transparente planparallele Platte verwendet werden, die je nach verwendeten Beleuchtungsmustern um eine Achse oder zwei orthogonale Achsen kippbar ist. Als Antriebe können vorzugsweise piezoelektrische Antriebe oder Exzenterantriebe verwendet werden. Um die Einstellung der Beleuchtungsmuster und die Erfassung der entsprechenden Bilder zu vereinfachen, ist ein Antrieb, mit dem das lichtablenkende Element bewegbar ist, von der Auswerteeinrichtung so steuerbar, daß die Beleuchtungsmuster auf das Objekt gestrahlt werden. Nach jeder Änderung des Beleuchtungsmusters mittels der Auswerteeinrichtung werden Bilder automatisch erfaßt. Diese Weiterbildung hat die zuvor im Zusammenhang mit der automatischen Ansteuerung genannten Vorteile.
In beiden Ausführungsformen weist die Feldblende transparente und opake Bereiche auf, die so ausgebildet sind, daß in der Objektebene die gewünschten Beleuchtungsmuster erhalten werden.
Soll die Verwendung von mechanischen Mitteln zur Verschiebung des Grundmusters vermieden werden, kann eine elektrisch steuerbare Modulationseinheit für Licht vorgesehen sein, die so angesteuert wird, daß die Beleuchtungsmuster erzeugt werden. Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann zum Beispiel das als Blende wirkende Element als eine solche elektronisch ansteuerbare Modulationseinheit ausgebildet sein. Als elektrische steuerbare Modulationseinheiten für Licht können beispielsweise sogenannte DMDs (”digital mirror devices”) oder auch elektronisch ansteuerbare Durchlicht- oder Reflexions-Flüssigkristallfelder bzw. -LCDs zum Einsatz kommen. Wie zuvor ist vorzugsweise die Auswerteeinrichtung so steuerbar, daß die Beleuchtungsmuster auf den zu untersuchenden Bereich gestrahlt werden und nach jeder Änderung des Beleuchtungsmusters mittels der Auswerteeinrichtung Bilder automatisch erfaßbar sind. Diese Ausführungsform der Erfindung erlaubt es nicht nur, auf mechanische Antriebe zu verzichten, sondern gestattet auch einen einfachen Wechsel zwischen verschiedenen Beleuchtungsmustertypen. Darüber hinaus ist es auch einfach möglich, das Objekt unstrukturiert zu beleuchten, sodaß ein Hellbild einfach direkt erfaßbar ist.
Die Beleuchtungsmuster selbst können unterschiedliche Strukturen aufweisen.
Beispielsweise können Beleuchtungsmuster mit radial verlaufenden Hell- und Dunkelbereichen verwendet werden, die jeweils durch Drehung eines entsprechenden Grundmusters um einen Mittelpunkt um einen vorgegebenen Winkel erzeugt werden.
Bei Verwendung mechanisch verstellbarer, als Blende wirkender Elemente sollten bevorzugt Beleuchtungsmuster mit sich periodisch abwechselnden streifenförmigen Hell- und Dunkelbereichen verwendet werden, die quer zur Richtung der Streifen versetzt sind. Die Streifen erstrecken sich dabei vorzugsweise über den ganzen Untersuchungsbereich bzw. das ganze Objekt. Um eine Überdeckung des Objekts mit den Dunkelfeldern erreichen zu können, sind vorzugsweise die hellen Streifen schmaler als die dunklen Streifen der Beleuchtungsmuster. Je nach Anzahl n der verwendeten Beleuchtungsmuster und der entsprechenden Anzahl zu erfassender Bilder wird das Streifenmuster vorzugsweise folgendermaßen gewählt. Bezeichnet p die Periode des Streifenmusters, wird die Breite h der hellen Streifen kleiner als p/(n – 1) und größer als p/n, aber möglichst nahe bei p/n, gewählt. h soll dabei vorzugsweise so groß sein, daß Beugungseffekte bei der Zusammensetzung des Hellbildes nicht stören. Der Versatz v der Beleuchtungsmuster bzw. eines diesen zugrunde liegenden Grundmusters ist so gewählt, daß die Dunkelbereiche der Beleuchtungsmuster bei Überlagerung das gesamte Objekt abdecken, vorzugsweise zu etwa p/n. Zur Vermeidung von Beugungseffekten im Dunkelbild werden die dunklen Streifen so breit wie möglich gewählt, wobei deren Breite d aber größer als p·(n – 2)/(n – 1) und kleiner als p·(n – 1)/n ist. Je mehr Beleuchtungsmuster genutzt werden, desto weniger Anregungslicht wird bei der Erfassung eines entsprechenden Bildes verwendet. Hierdurch kann das Intensitätsrauschen im Untergrund des resultierenden Bildes nahezu beliebig gesenkt werden. Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einer Feldblende weist die Feldblende bevorzugt eine streifenförmige Struktur aus einander abwechselnden transparenten und opaken Bereichen auf. Die Dimensionen der transparenten und opaken Bereiche sind dabei so gewählt, daß Beleuchtungsmuster mit den zuvor genannten Parametern erzeugt werden können. Bei Verwendung einer elektrisch ansteuerbaren Modulationseinheit genügt zur Erzeugung dieser Beleuchtungsmuster eine entsprechende Ausbildung bzw. Programmierung der Auswerteeinrichtung.
Alternativ können, daß Beleuchtungsmuster mit jeweils einer in zwei Richtungen periodischen Anordnung von Hell- und Dunkelbereichen verwendet werden, wobei die Anordnungen in wenigstens einer der Richtungen gegeneinander versetzt sind. Bei Verwendung einer mechanisch verschiebbaren Feldblende weist die Feldblende bevorzugt eine in zwei Richtungen periodische Anordnung von transparenten und opaken Bereichen auf, wobei die opaken Bereiche aneinander angrenzen. Bei Verwendung einer elektrisch ansteuerbaren Modulationseinheit genügt zur Erzeugung dieser Beleuchtungsmuster eine entsprechende Ausbildung bzw. Programmierung der Auswerteeinrichtung. Die Richtungen können zueinander orthogonal sein, jedoch braucht dies nicht unbedingt der Fall zu sein. Bei dieser Ausführungsform wird die Auszeichnung einer Richtung durch Verwendung von Streifen vermieden, sodaß die Unterdrückung von Falschlicht weniger richtungsabhängig wird. Darüber hinaus verschwindet die Modulation durch die strukturierte Beleuchtung schneller außerhalb der Fokusebene bzw. Objektebene, sodaß Licht außerhalb der Schärfentiefe der Abbildungsoptik besser unterdrückt wird.
Werden periodische Beleuchtungsmuster verwendet, ist es möglich, daß in dem von Falschlicht befreiten Bild noch durch die Periodizität der Beleuchtungsmuster bedingte Beleuchtungsinhomogenitäten vorhanden sind. Es ist daher bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, daß das durch Subtraktion des Dunkelbildes von dem Hellbild entstandene Bild niederfrequent gefiltert wird. Unter niederfrequent wird hierbei verstanden, daß die Filterung bei Frequenzen kleiner als die durch die Periodizität der Beleuchtungsmuster gegebene Frequenz bzw. gegebenen Frequenzen erfolgt.
Soll ein Objekt mit einer Dunkelfeldbeleuchtung untersucht werden, was insbesondere bei Fluoreszenzmikroskopie wünschenswert sein kann, ist die Beleuchtungsoptik zur Abbildung des als Blende wirkenden Elements auf das Objekt für eine Dunkelfeldbeleuchtung ausgebildet.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung sollte dann die Beleuchtungsoptik als ein Beleuchtungsobjektiv mit kleiner Apertur ausgebildet sein, wobei die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs und die durch die Abbildungsoptik definierte optische Achse einen Winkel α einschließen. Diese Ausbildung ergibt einen großen Schärfentiefebereich. Der Winkel α soll vorzugsweise größer als 50° sein, um die Strahlungsintensität auf der Unterseite von transparenten Objekten bzw. Proben zu minimieren.
Vorzugsweise ist in diesem Fall die Beleuchtungsoptik eine Scheimpflugoptik. Dabei kann eine größere numerische Apertur für die Dunkelfeldbeleuchtung vorgesehen werden, da die Fokusebene der Beleuchtung an die Oberseite der Probe angepaßt werden kann.
Ferner kann die Abbildungsoptik zur Abbildung des Objekts auf den Detektor eine Scheimpflugoptik umfassen. In diesem Fall steht die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs senkrecht zur Oberfläche der Probe, während die optische Achse des Abbildungsobjektivs unter einem Winkel α zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs steht.
Sowohl das Verfahren als auch die Vorrichtung, mit der dieses Verfahren durchführbar ist, können vorteilhaft zum Auslesen von Biochips, in der Fluoreszenzmikroskopie und bei photometrischen Messungen angewendet werden.
Die Erfindung wird nachfolgend beispielhaft anhand der Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
1 eine schematische Darstellung eines optischen Aufbaus einer Vorrichtung zur Erfassung eines Bildes eines Objekts nach einer ersten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung,
2 eine schematische teilweise Darstellung einer Einrichtung zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern mit einer Feldblende mit Exzenterantrieb in der Vorrichtung aus 1,
3a, b drei mit der Feldblende der Vorrichtung aus 1 erhältliche Beleuchtungsmuster und entsprechende Verläufe von Signalen eines Detektors der Vorrichtung aus 1 bei Beleuchtung eines homogen fluoreszierenden Objekts mit diesen Beleuchtungsmustern,
4 eine schematische teilweise Darstellung einer Einrichtung zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern bei einer Vorrichtung zur Erfassung eines Bildes eines Objekts nach einer vierten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung,
5 ein in zwei Richtungen periodisches Beleuchtungsmuster bei der Vorrichtung bzw. einem Verfahren nach der vierten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung,
6 eine schematische teilweise Darstellung einer Einrichtung zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern bei einer Vorrichtung zur Erfassung eines Bildes eines Objekts nach einer fünften bevorzugten Ausführungsform der Erfindung,
7 eine schematische Darstellung eines optischen Aufbaus einer Vorrichtung zur Erfassung eines Bildes eines Objekts nach einer sechsten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung,
8 ein in zwei Richtungen periodisches Beleuchtungsmuster bei der Vorrichtung bzw. einem Verfahren nach der sechsten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, und
9 eine schematische Darstellung eines optischen Aufbaus einer Vorrichtung zur Erfassung eines Bildes eines Objekts nach einer siebten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung.
Eine in 1 stark vereinfacht und schematisch gezeigte Vorrichtung zur Erfassung eines Bildes eines heterogen leuchtenden oder beleuchteten flächenhaften Objekts, in dem Falschlichteinflüsse unterdrückt sind, umfaßt nach einer ersten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung eine Beleuchtungseinrichtung 1, eine dieser nachgeordnete Einrichtung 2 zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern in einer Objektebene 3 eines auf einem Träger bzw. Tisch angeordneten Objekts 4, eine Abbildungsoptik 5 zur Abbildung des Objekts 4 auf eine Bildebene B und einen in der Bildebene angeordneten ortsauflösenden Detektor 6. Eine Auswerteeinrichtung 7 ist über eine Detektorverbindung mit dem Detektor 6 und über eine Steuerleitung mit der Einrichtung 2 verbunden.
Die Beleuchtungseinrichtung 1 verfügt über eine Licht- oder Strahlungsquelle 8, der ein Filter 9, ein Verschluß 10 und, nur optional, den Strahlengang homogenisierende optische Elemente 11, wie z. B. ein Lichtleitstab oder ein innen verspiegelter Glashohlstab, und erste Beleuchtungsoptiken 12 und 13 zur homogenen Ausleuchtung eines Bereichs einer Feldblendenebene 14 nachgeordnet sind.
Die Einrichtung 2 besitzt ein im Strahlengang der Beleuchtungseinrichtung 1 angeordnetes, durch diese homogen ausleuchtbares, als strukturierte Blende wirkendes, im Strahlengang in zwei zueinander orthogonalen Richtungen in der Feldblendenebene 14 definiert verschiebbar angeordnetes Element, im Beispiel eine strukturierte Feldblende 15, und einen in 1 nur schematisch gezeigten Antrieb 16, mit dem die Feldblende 15 verschiebbar ist.
Der mechanische Aufbau der Einrichtung 2 zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern ist in 2 genauer gezeigt. Exzenterantriebe 17 und 18 sind mit der Feldblende 15 so gekoppelt, daß dieses in der Feldblendenebene 14 in zwei zueinander orthogonalen Richtungen lateral verschoben und auf diese Weise definiert positioniert werden kann.
Die Feldblende 15 besitzt periodisch angeordnete, streifenförmige, opake Bereiche, die durch transparente Bereiche voneinander getrennt sind, so daß in der Objektebene 3 entsprechende streifenförmige Beleuchtungsmuster erzeugbar sind, wie weiter unten noch näher erläutert wird.
Wie weiter in 1 gezeigt, wird durch eine dem Element 15 nachgeordnete zweite Beleuchtungsoptik 19, die einen Beleuchtungstubus 20, einen Strahlenteiler 21 und ein Objektiv 22 umfaßt, die Feldblende 15 auf das zu untersuchende oder abzubildende Objekt 4 bzw. die Objektebene 3 abgebildet, so daß auf das Objekt 4 ein der Stellung der Feldblende 15 in der Feldblendenebene 14 und dessen Struktur entsprechendes Beleuchtungsmuster gestrahlt wird.
Die Abbildungsoptik 5, die eine Weitfeldoptik darstellt, umfaßt im Beispiel das Objektiv 22, den Strahlenteiler 21 sowie einen Abbildungstubus 23, und bildet das mit der jeweiligen Beleuchtungsstruktur beleuchtete Objekt 4 kontrastreich auf die Bildebene B bzw. den ortsauflösenden Detektor 6 für optische Strahlung ab.
Der Strahlenteiler 21 ist im Beispiel als Farbteiler ausgebildet und besitzt Filter 24 und 25, mit denen unerwünschte oder störende spektrale Strahlungsanteile ausgefiltert werden können. Der Strahlenteiler 21 und die Filter 24 und 25 sind Bestandteile einer Vorrichtung für Auflichtfluoreszenz, wobei es vorteilhaft ist, wenn die Filter 25 und 26 um einige Winkelgrade schräg gestellt sind, um so störende Reflexe aus dem Strahlengang zu entfernen.
Der Detektor 6 umfaßt eine Matrix aus CCD- oder CMOS-Elementen und ist im Beispiel Bestandteil einer CCD- Kamera.
Der Detektor 6 ist mit der Auswerteeinrichtung 7 verbunden, welche Signale des Detektors 6 erfaßt, die Ermittlung bzw. Eliminierung des Falschlichtes bei der Abbildung des Objekts 4 durchführt und ein resultierendes Bild erzeugt. Die Auswerteeinrichtung 7 verfügt hierzu über einen Prozessor, einen Speicher und entsprechende Schnittstellen. Die resultierenden Bilder können gespeichert und/oder über eine in 1 nicht gezeigte Anzeigevorrichtung oder einen Drucker ausgegeben werden.
Die Auswerteeinrichtung 7 dient weiterhin als Steuerung für den Antrieb 16, mit dem die von der strukturierten Feldblende 15 erzeugte Beleuchtungsstruktur verschiebbar ist. Die Auswerteeinrichtung 7 ist so ausgebildet, daß sie durch Ansteuerung des Antriebs 16 und des Verschlusses 10 eine Folge von Beleuchtungsmustern erzeugt und durch Erfassung der Signale des Detektors 6 eine Folge von jeweils den Beleuchtungsmustern entsprechenden Bildern des Untersuchungsbereichs bzw. des Objekts 4 erfaßt. Diese Bilder werden nach Erfassung des letzten Bildes der Folge in der Auswerteeinrichtung 7 verarbeitet.
Bei der Durchführung eines Verfahrens nach einer ersten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden drei der Struktur der Feldblende 15 entsprechende Beleuchtungsmuster verwendet, die in 3a genauer dargestellt sind.
Das erste Beleuchtungsmuster ist ein Grundmuster. Die anderen Beleuchtungsmuster gehen aus dem Grundmuster durch Verschiebung des Grundmusters um die Strecke v hervor. Das Grundmuster besitzt eine periodische Struktur der Periode p mit streifenförmigen Dunkelbereichen 27 der Breite d und jeweils zwischen den Dunkelbereichen angeordneten streifenförmigen Hellbereichen 26 der Breite h. Die Parameter p, d und h sind so gewählt, daß die Breite h der Hellbereiche 26 zwischen einem Drittel und der Hälfte der Periode p, d. h. 1/3 p und 1/2 p, liegt. Dementsprechend liegt die Breite d der Dunkelbereiche 27 zwischen 1/2 p und 2/3 p.
Das Grundmuster wird in einer Richtung, die orthogonal zu der Längsrichtung der streifenförmigen Dunkelbereiche 27 bzw. Hellbereiche 26 ausgerichtet ist, zweimal um die Strecke v verschoben. Die Strecke v, um die die durch Verschiebung des Grundmusters entstandenen, aufeinanderfolgenden Beleuchtungsmuster gegeneinander versetzt sind, hat ungefähr die Länge von einem Drittel der Periode p.
Die Periode p liegt probenseitig vorzugsweise zwischen 1 μm und 100 μm.
Bei Überlagerung der drei Beleuchtungsmuster in der Objektebene 3 wird der Untersuchungsbereich bzw. das Objekt 4 vollständig durch die Dunkelbereiche 26 überdeckt. Bei Zusammenfügung der Dunkelbereiche 27 wird das Objekt 4 daher vollständig durch diese abgedeckt, so daß keine Interpolation zwischen den Dunkelbereichen 27 notwendig ist.
Entsprechendes gilt für die Hellbereiche 26.
Bei einem Verfahren zur Abbildung eines Objekts mittels einer Weitfeldoptik auf einen ortsauflösenden Detektor für optische Strahlung mit Unterdrückung von Falschlicht nach einer ersten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Objekt 4 in der Objektebene 3 nacheinander mit den drei Beleuchtungsmustern beleuchtet, wozu die Auswerteeinrichtung 7 den Antrieb 16 und den Verschluß 10 entsprechend ansteuert. Für jedes der Beleuchtungsmuster wird mittels des Detektors 6 und der Auswerteeinrichtung 7 ein entsprechendes Bild automatisch erfaßt. Die erfaßten Bilder weisen gegebenenfalls in den Bereichen, in die die Dunkelbereiche 27 abgebildet werden, Aufhellungen durch Falschlicht auf, das aus mit Hellbereichen 26 beleuchteten Abschnitten des Objekts 4 abgegeben wird.
Aus den erfaßten Bildern wird dann in der Auswerteeinrichtung 7 ein Hellbild des Objekts erzeugt. Dazu werden die Bereiche der erfaßten Bilder, die durch Abbildung der Hellbereiche 26 in der Objektebene 3 bzw. auf dem Objekt 4 erhalten wurden, durch Summation zu einem Hellbild des Objekts 4 zusammengefügt. Die Anordnung der Bereiche der erfaßten Bilder zueinander entspricht dabei der Anordnung der den Bereichen der erfaßten Bilder entsprechenden Dunkelbereiche der Beleuchtungsmuster auf dem Objekt 4. Da sich die Hellbereiche 26 überlappen, entstehen bei der Summation in den Überlappungsbereichen Intensitätsüberhöhungen, die durch Referenzierung bzw. Renormierung beseitigt werden. Dies ist beispielhaft für den Fall eines homogen fluoreszierenden Objekts in dem Diagramm in 3b dargestellt. In dem Diagramm sind die Hellsignale für jedes der darüber dargestellten, mit den Ziffern 1, 2 bzw. 3 gekennzeichneten Beleuchtungsmuster als Funktion des Ortes für einen Schnitt durch die Objektebene 3 sowie das durch Summation resultierende Hellsignal (1 + 2 + 3) dargestellt.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden nur Teilbilder der Abbilder der Hellbereiche 26 verwendet, die bei Überlagerung der erfaßten Bilder aneinandergrenzen bzw. sich nur minimal überlappen. Gegebenenfalls kann zusätzlich nochmals eine Renormierung stattfinden.
Zur Ermittlung eines Dunkel- bzw. Falschlichtbildes werden analog die Bereiche der erfaßten Bilder, die durch Abbildung der Dunkelbereiche 27 in der Objektebene 3 bzw. in dem Objekt 4 erhalten wurden, zu einem Dunkel- beziehungsweise Falschlichtbild zusammengefügt bzw. summiert, ohne daß eine Interpolation notwendig wäre. Das Dunkelbild wird dann zur Rauschunterdrückung unter Verwendung eines entsprechenden Tiefpaßfilters rechnerisch geglättet.
Schließlich wird in der Auswerteeinrichtung 7 das Dunkelbild von dem Hellbild subtrahiert, wobei ein resultierendes Bild des Objekts 4 entsteht, in dem Falschlicht unterdrückt ist.
Bei einer zweiten bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. der erfindungsgemäßen Vorrichtung werden vier Beleuchtungsmuster verwendet, die aus einem Grundmuster mit einer periodischen Streifenstruktur durch sukzessive Verschiebung um eine Strecke v in einer Richtung orthogonal zu der Richtung der Streifen hervorgehen. Die Breite h der Hellbereiche, die Breite d der Dunkelbereiche und die Strecke v können bei Periode p der Streifenstruktur folgendermaßen gewählt sein: 1/4 p < h < 1/3 p, v = 1/4 p und 2/3 p < d < 3/4 p.
Es werden entsprechend der Anzahl der Beleuchtungsmuster vier Bilder erfaßt, die analog zu dem ersten Ausführungsbeispiel zur Falschlichtunterdrückung verarbeitet werden.
Bei Verwendung von fünf Beleuchtungsmustern, die durch Verschiebung aus einem periodischen Grundmuster mit Streifen um die Strecke v in einer Richtung orthogonal zu der Richtung der Streifen hervorgehen, können die Breiten d und h der Dunkel- bzw. Hellbereich und die Verschiebung beispielsweise folgendermaßen gewählt sein: 1/5 p < h < 1/4 p, v = 1/5 p und 3/4 p < d < 4/5 p.
Je mehr Beleuchtungsmuster verwendet werden, desto weniger Anregungslicht wird bei der Erfassung eines entsprechenden Bildes genutzt. Hierdurch kann das Intensitätsrauschen im Untergrund des resultierenden Bildes nahezu beliebig gesenkt werden.
Bei einer dritten bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird die Feldblende 15 nicht bewegt, sondern das Objekt 4. Hierzu kann ein Tisch verwendet werden, auf welchem das Objekt angeordnet ist und der mittels eines von der Auswerteeinrichtung 7 gesteuerten Antriebs in Richtungen parallel zu der Objektebene 3 bewegbar ist. Die Auswertung der erfaßten Bilder erfolgt analog zu dem ersten Ausführungsbeispiel. Zur Positionierung des Objekts 4 in der Objektebene 3 sind als Antriebe Piezoaktoren, Exzenterantriebe oder andere geeignete Verstellmechanismen einsetzbar, vorzugsweise aber ein motorisierter Mikroskoptisch.
Eine Vorrichtung nach einer vierten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung unterscheidet sich von der Vorrichtung des ersten Ausführungsbeispiels dadurch, daß eine modifizierte Einrichtung 28, prinzipiell dargestellt in 4, zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern und eine entsprechend modifizierte Auswerteeinrichtung verwendet werden. Da die anderen Komponenten im wesentlichen unverändert sind, werden für diese die gleichen Bezugszeichen verwendet und es gelten die Erläuterungen zu dem ersten Ausführungsbeispiel entsprechend.
Die teilweise in 4 gezeigte Einrichtung 28 besitzt nun als als strukturierte Blende wirkendes Element eine in der Feldblendenebene 14 angeordnete Feldblende 29 mit einer Struktur, die in zwei zueinander orthogonalen Richtungen periodisch ausgebildete transparente und opake Bereiche aufweist (vgl. 5). Zur Erzeugung unterschiedlicher Beleuchtungsstrukturen verfügt die Einrichtung 28, wie in 4 schematisch dargestellt, über eine der strukturierten Feldblende 29 in Lichtrichtung nachgeordnete, planparallele Glasplatte 30, die um zwei zueinander orthogonale Achsen kippbar ist. Zur gesteuerten, definierten Kippung dieser Glasplatte 30 sind als Antrieb 31 in vorteilhafter Weise Piezoaktoren 32 vorgesehen, welche durch eine Steuerung der nicht dargestellten Auswerteeinrichtung entsprechend angesteuert werden. Durch die Kippung der Glasplatte 30 erfolgt bekanntermaßen ein optischer Strahlenversatz des Strahlenganges und damit eine versetzte Abbildung der Feldblende 29 auf das Objekt 4. Die in der 5 eingezeichneten Pfeile kennzeichnen die Kipprichtungen der Glasplatte 30.
Zur Erzeugung des Strahlenversatzes können auch andere geeignete Elemente eingesetzt werden. Als Antriebe für die Glasplatte 30 können bei einer anderen Ausführungsform auch Exzenterantriebe oder andere geeignete Antriebsmechanismen vorgesehen werden.
Bei Abbildung der Feldblende 29 in die Objektebene 3 ergibt sich ein in 5 dargestelltes Grundmuster mit in zwei zueinander orthogonalen Richtungen periodisch angeordneten Hellbereichen 33 und Dunkelbereichen 34. Das Grundmuster weist in der ersten, im Folgenden durch die Ziffer 1 gekennzeichneten Richtung eine Periode p1 und in der zweiten, im Folgenden durch Ziffer 2 gekennzeichneten Richtung die Periode p2 auf. Die Hellbereiche 33 sind rechteckig mit Seitenlängen h1 und h2 und bilden zusammen mit den L-förmigen Dunkelbereichen 34 Rechtecke mit Kantenlängen p1 und p2, die in 5 durch gestrichelte Linien gekennzeichnet sind.
Zur Erzeugung der in diesem Beispiel sechs Beleuchtungsmuster wird das Grundmuster, das selbst ein erstes Beleuchtungsmuster darstellt, zunächst zweimal nacheinander um die Strecke v1 in der Richtung 1, d. h. parallel zu der Seite der Hellbereiche 33 mit der Länge h1, verschoben, wobei ein zweites und drittes Beleuchtungsmuster entstehen. Zur Erzeugung eines vierten Beleuchtungsmusters erfolgt dann eine Verschiebung um die Strecke v2 in einer Richtung 2 orthogonal zu der Richtung der ersten Verschiebung, d. h. parallel zu der Seite der Hellbereiche mit der Länge h2. Danach werden zwei weitere Beleuchtungsmuster durch Verschiebung um jeweils die Strecke v1 in Richtung der ersten Verschiebungen erzeugt.
Die Größe der Verschiebungen v1 und v2 ergibt sich aus den Beziehungen p1 = 3·v1 und p2 = 3·v2, die Größe der Seiten h1 und h2 der Hellbereiche 33 aus den Beziehungen 1/3·p1 < h1 < 1/2·p1 und 1/3·p2 < h2 < 1/2·p2.
Die Perioden p1 und p2 liegen in der Objektebene vorzugsweise im Bereich zwischen 1 μm und 100 μm. Sie können gleich oder verschieden groß gewählt sein.
Bei Überlagerung der sechs Beleuchtungsmuster decken deren Hellbereiche 33 das Objekt 4 in der Objektebene 3 vollständig ab. Entsprechendes gilt für die Dunkelbereiche 34.
Das Verfahren zur Abbildung des Objekts 4 nach der vierten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt analog zu dem ersten Ausführungsbeispiel. Es werden die sechs Beleuchtungsmuster nacheinander erzeugt und entsprechende Bilder des Untersuchungsbereichs erfaßt. Die Erzeugung des resultierenden Bildes erfolgt wie im ersten Ausführungsbeispiel mit der Änderung, daß nun die sechs bei Beleuchtung mit jeweils unterschiedlichen entsprechenden Beleuchtungsmustern erfaßten Bilder bzw. die den Dunkel- bzw. Hellbereichen entsprechenden Teilbilder zur Ermittlung des Dunkelbildes und des Hellbildes herangezogen werden. Das resultierende Bild wird wie zuvor durch Subtraktion des Dunkelbildes von dem Hellbild ermittelt.
Das Verfahren hat gegenüber dem Verfahren des ersten Ausführungsbeispiels, d. h. der Verwendung von Beleuchtungsmustern mit Streifen, den Vorteil, daß die Modulation durch die strukturierte Beleuchtung schneller außerhalb der Fokusebene bzw. Objektebene verschwindet, so daß Licht außerhalb der Schärfentiefe der Abbildungsoptik besser unterdrückt wird.
Eine Vorrichtung zur Erfassung eines Bildes eines Objekts nach einer fünften bevorzugten Ausführungsform der Erfindung unterscheidet sich von der Vorrichtung des ersten Ausführungsbeispiels durch einen anderen Antrieb für die Feldblende 15. Alle anderen Komponenten sind unverändert, sodaß für diese die gleichen Bezugszeichen verwendet werden und die Erläuterungen im Zusammenhang mit dem ersten Ausführungsbeispiel gemäß 1 entsprechend gelten.
6 zeigt eine schematische teilweise Darstellung der veränderten Einrichtung zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern. Der von der Steuerung in der Auswerteeinrichtung gesteuerte Antrieb umfaßt Piezoaktoren 35 und 36, welche mit der Feldblende 15 gekoppelt sind, so daß die Feldblende 15 mittels der Piezoaktoren 35 und 36 definiert durch laterale Verschiebung längs zweier zueinander orthogonaler Richtungen in der Feldblendenebene 14 verstellt werden kann. Durch die Abbildung der in unterschiedlichen Positionen eingestellten Feldblende 15 auf das Objekt 4 werden wie zuvor unterschiedliche Beleuchtungsstrukturen in der Objektebene 3 erzeugt, welche dann zusammen mit dem Objekt 3 auf den Detektor 6 abgebildet werden.
Eine sechste Ausführungsform der Erfindung unterscheidet sich von den bisher beschriebenen Ausführungsbeispielen dadurch, daß die Einrichtung zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern nun weder eine Feldblende noch einen Antrieb, sondern statt dessen als als strukturierte Blende wirkendes Element eine in der Feldblendenebene 14 angeordnete elektrisch steuerbare Modulationseinheit 45 in Form eines Durchlicht-LCD besitzt. Wie in 7 schematisch dargestellt ist die Modulationseinheit 45 über eine Steuerleitung mit einer Auswerteeinrichtung 46 verbunden, die gegenüber der Auswerteeinrichtung 7 des ersten Ausführungsbeispiels dahingehend verändert ist, daß in der Auswerteeinrichtung gespeicherte Hell-Dunkel-Muster auf dem Durchlicht-LCD dargestellt werden, sodaß auf die Objektebene 3 entsprechende Beleuchtungsmuster gestrahlt werden.
Bei diesem Ausführungsbeispiel werden zum einen zwei Beleuchtungsmuster verwendet, nämlich ein Grundmuster, das in zwei zueinander orthogonalen Richtungen periodisch angeordnete Hellbereiche 37 und Dunkelbereiche 38 aufweist, und ein aus diesem durch Verschiebung in einer der Periodizitätsrichtungen hervorgehendes Beleuchtungsmuster. Zum anderen wird eine unstrukturierte Beleuchtung verwendet, um ein Hellbild zu erfassen.
Das Grundmuster ist genauer in 8 gezeigt. In mit den Perioden p1 und p2 in den zueinander orthogonalen Richtungen 1 und 2 periodisch angeordneten rechteckigen Zellen 39 mit Kanten in Richtung 1 und 2 mit Kantenlängen p1 und p2 sind jeweils auf der Diagonalen zwei gleiche rechteckige Hellfelder 37 mit Kantenlängen h1 und h2 angeordnet, von denen eines mit zwei seiner Kanten einen Teil des Randes der Zelle 39 bildet und das andere so angeordnet ist, daß die Hellfelder 37 entlang einer Diagonalen des Grundmusters gleiche Abstände voneinander aufweisen.
Die Perioden p1 und p2 können gleich oder voneinander verschieden sein und in der Objektebene 3 eine Länge in einem Bereich von 1 μm und 100 μm aufweisen. Die Kantenlängen h1 und h2 sind so gewählt, daß sie die Beziehungen h1 < 1/2·p1 und h2 < 1/2·p2 erfüllen. Weiter wird die Größe der Verschiebung v1 zu 1/2·p1 gewählt.
Die Dunkelbereiche 38 der beiden Beleuchtungsmuster überdecken bei einer vorgestellten Überlagerung der Beleuchtungsmuster den Untersuchungsbereich bzw. das Objekt 4. Bei Zusammenfügen der den Dunkelbereichen entsprechenden Bereiche der bei Beleuchtung mit den beiden Beleuchtungsmustern erfaßten Bilder ist wie bei dem Verfahren des ersten Ausführungsbeispiels ein Dunkelbild ermittelbar.
Bei einer anderen Ausführungsform wird das Hellbild durch einfache Addition aller erfaßten Bilder und nachfolgende Normierung mit der addierten Beleuchtungsintensität erzeugt. Weiterhin werden vorzugsweise durch die Periodizität der Beleuchtungsmuster gegebenenfalls entstehende Beleuchtungsinhomogenitäten in dem durch Subtraktion des Dunkelbildes von dem Hellbild erhaltenen Bild beseitigt, indem das erhaltene Bild einer Ortsfrequenz-Filterung mit einem niederfrequenten Filter unterzogen wird, der der Periodizität entsprechende Frequenzen herausfiltert bzw. deren Stärke auf ein dem restlichen Spektrum der Frequenzen entsprechenden Wert setzt. Eine solche Filterung kann auch bei den anderen Ausführungsbeispielen zusätzlich durchgeführt werden.
Bei einem Verfahren zur Abbildung eines Objekts mittels einer Weitfeldoptik auf einen ortsauflösenden Detektor für optische Strahlung mit Unterdrückung von Falschlicht nach der sechsten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Objekt 4 in der Objektebene 3 nacheinander mit den beiden strukturierten Beleuchtungsmustern und der unstrukturierten Beleuchtung beleuchtet, wozu die Auswerteeinrichtung 46 die Modulationseinheit 45 entsprechend ansteuert. Für jedes der Beleuchtungsmuster wird mittels des Detektors 6 und der Auswerteeinrichtung 7 ein entsprechendes Bild erfaßt.
Aus den erfaßten Bildern bei Beleuchtung mit einem Beleuchtungsmuster wird analog zu dem ersten Ausführungsbeispiel (vgl. 1) ein Dunkelbild ermittelt, das unter Bildung eines resultierenden Bildes von dem bei unstrukturierter Beleuchtung erfaßten Hellbild subtrahiert wird.
Eine Vorrichtung nach einer siebten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, deren optischer Gesamtaufbau schematisch vereinfacht in 9 gezeigt ist, unterscheidet sich von der Vorrichtung des ersten Ausführungsbeispiels dadurch, daß das als Blende wirkende Element zur Dunkelfeldbeleuchtung scharf auf das Objekt abbildbar ist. Hierzu ist die zweite Beleuchtungsoptik 19 durch eine modifizierte zweite Beleuchtungsoptik 40 ersetzt, der Strahlenteiler 21 ist nicht mehr notwendig. Für Komponenten, die gegenüber dem ersten Ausführungsbeispiel im Wesentlichen unverändert sind, gelten die Ausführungen des ersten Ausführungsbeispiels entsprechend und es werden die gleichen Bezugszeichen verwendet.
Die Vorrichtung umfaßt die Beleuchtungseinrichtung 1 mit der Licht- oder Strahlungsquelle 8, der optional der Verschluß 10 und, vorteilhaft, den Strahlengang homogenisierende optische Elemente 11, wie z. B. ein Lichtleitstab oder ein innen verspiegelter Glashohlstab, und Beleuchtungsoptiken 12 und 13 zur homogenen Ausleuchtung einer in der Feldblendenebene 14 im Strahlengang angeordneten Einrichtung 2 zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern, die im Beispiel die strukturierte Feldblende 15 umfaßt, nachgeordnet sind. Diese Feldblende 15 ist im Strahlengang in zwei zueinander orthogonalen Richtungen der Feldblendenebene 14 definiert positionierbar angeordnet. Sie kann also mittels des mit der Feldblende 15 gekoppelten Antriebs 16 in dieser Ebene 14 verschoben werden.
Durch die der Feldblende 15 nachgeordnete modifizierte zweite Beleuchtungsoptik 40, die im Beispiel einen Beleuchtungstubus 41, einen Ablenkspiegel 42, einen Anregungsfilter 43, und ein Objektiv 44, wird das als strukturierte Blende wirkende Element, d. h. hier die strukturierte Feldblende 15, in Dunkelfeldbeleuchtung auf das zu untersuchende oder zu messende Objekt 4 bzw. die Objektebene 3 abgebildet. Die zweite Beleuchtungsoptik 40 bildet eine sogenannte Scheimpflugoptik, deren optische Achse unter einem Winkel α zur senkrecht zur Oberfläche des Objekts 4 bzw. der Objektebene 3 verlaufenden optischen Achse der Abbildungsoptik 5 angeordnet ist. Vorteilhaft ist der Winkel α > 50°. Durch diese Abbildungsoptik 5, die beispielsweise das Objektiv 22, den Filter 25 sowie den Abbildungstubus 23 umfaßt, wird das Objekt 4 kontrastreich zusammen mit der ihr überlagerten Beleuchtungsstruktur auf den ortsauflösenden Detektor 6 für optische Strahlung abgebildet.
In analoger Weise kann jedoch auch bei einer modifizierten Ausführungsform die Abbildungsoptik als eine Scheimpflugoptik ausgebildet sein. In diesem Fall steht die optische Achse der zweiten Beleuchtungsoptik 40 senkrecht auf der Oberfläche des Objekts 4 bzw. der Objektebene 3. Mit dieser optischen Achse bildet dann die optische Achse der Abbildungsoptik den Winkel α.
Bezugszeichenliste

1: Beleuchtungseinrichtung
2: Einrichtung zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern
3: Objektebene
4: Objekt
5: Abbildungsoptik
6: Detektor
7: Auswerteeinrichtung
8: Strahlungsquelle
9: Filter
10: Verschluß
11: homogenisierendes optisches Element
12, 13: erste Beleuchtungsoptiken
14: Feldblendenebene
15: Feldblende
16: Antrieb
17, 18: Exzenterantrieb
19: zweite Beleuchtungsoptik
20: Beleuchtungstubus
21: Strahlenteiler
22: Objektiv
23: Abbildungstubus
24, 25: Filter
26: Dunkelbereiche
27: Hellbereiche
28: Einrichtung zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern
29: Feldblende
30: Glasplatte
31: Antrieb
32: Piezoaktoren
33: Hellbereiche
34: Dunkelbereiche
35: Piezoaktor
36: Piezoaktor
37: Hellbereiche
38: Dunkelbereiche
39: Zellen
40: zweite Beleuchtungsoptik
41: Beleuchtungstubus
42: Ablenkspiegel
43: Anregungsfilter
44: Objektiv
45: Modulationseinheit
46: Auswerteeinrichtung

Claims

Verfahren zur Abbildung eines Objekts (4) mittels einer Weitfeldoptik (5) auf einen ortsauflösenden Detektor (6) mit Unterdrückung von Falschlicht, bei dem – das Objekt (4) in wenigstens einer Objektebene (3) mit wenigstens zwei Beleuchtungsmustern (26, 27; 33, 34; 37, 38) beleuchtet wird und für jedes der Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34; 37, 38) entsprechende Bilder erfaßt werden, wobei die Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34; 37, 38) jeweils Dunkelbereiche (27; 34; 38), die bei Überlagerung der Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34; 37, 38) das Objekt (4) vollständig überdecken, und Hellbereiche (26; 33; 37) aufweisen, – aus den erfaßten Bildern ein Dunkelbild des Objekts (4) ermittelt wird, – ein Hellbild des Objekts (4) erzeugt wird, und bei dem – von dem Hellbild das Dunkelbild subtrahiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem zur Ermittlung des Dunkelbildes Bereiche der erfaßten Bilder zusammengefügt werden, die Abbilder der Dunkelbereiche (27; 34; 38) des Objekts (3) bei Beleuchtung mit den Beleuchtungsmustern (26, 27; 33, 34; 37, 38) sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das Dunkelbild rechnerisch geglättet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das Hellbild durch Erfassung eines Bildes bei einer unstrukturierten Beleuchtung erzeugt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das Hellbild aus den bei Beleuchtung mit den Beleuchtungsmustern (26, 27; 33, 34; 37, 38) erfaßten Bildern erzeugt wird, wobei die Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34; 37, 38) Hellbereiche (26; 33; 37) aufweisen, die bei Überlagerung der Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34; 37, 38) in der Objektebene (3) das Objekt (4) vollständig überdecken.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem zur Erzeugung des Hellbildes Bereiche der erfaßten Bilder zusammengefügt werden, die Abbilder der Hellbereiche (26; 33; 37) des Objekts (4) bei Beleuchtung mit den Beleuchtungsmustern (26, 27; 33, 34; 37, 38) sind.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das Hellbild aus Teilbereichen der erfaßten Bilder zusammengefügt wird, die Abbilder der Hellbereiche (26; 33; 37) des Objekts (4) bei Beleuchtung mit den Beleuchtungsmustern (26, 27; 33, 34; 37, 38) sind und ohne Überlappung aneinander angrenzen.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem das Hellbild durch additive Überlagerung aller Bilder erzeugt wird, die bei Beleuchtung des Objekts (4) mit den Beleuchtungsmustern (33, 34) erfasst wurden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34; 37, 38) durch ein Grundmuster (26, 27; 33, 34; 37, 38) gegeben sind, das relativ zu dem Objekt (4) jeweils unterschiedlich versetzt ist.
Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das Objekt (4) gegenüber dem Beleuchtungsmuster (26, 27) verschoben wird.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, bei dem das Grundmuster (26, 27; 33, 34; 37, 38) mittels einer mechanischen Vorrichtung (15, 9; 15, 16; 15, 31) verschoben wird.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, bei dem eine elektrisch steuerbare Modulationseinheit (45) für Licht so angesteuert wird, daß die Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34; 37, 38) erzeugt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, bei dem Beleuchtungsmuster (26, 27) mit sich periodisch abwechselnden streifenförmigen Hell- und Dunkelbereichen (26, 27) verwendet werden, die quer zur Richtung der Streifen versetzt sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, bei dem Beleuchtungsmuster (33, 34; 37, 38) mit jeweils einer in zwei Richtungen periodischen Anordnung von Hell- und Dunkelbereichen (33, 34; 37, 38) verwendet werden, wobei die Anordnungen in wenigstens einer der Richtungen gegeneinander versetzt sind.
Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, bei dem das durch Subtraktion des Dunkelbildes von dem Hellbild entstandene Bild niederfrequent gefiltert wird.
Vorrichtung zur Erfassung eines Bildes eines Objekts (4), in dem Falschlichteinflüsse unterdrückt sind, mit – einer Beleuchtungseinrichtung (1) zur Beleuchtung des Objekts (4) in einer Objektebene (3), – einer Einrichtung (2; 28; 45) zur Erzeugung wenigstens zweier vorgegebener Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34; 37, 38) zur Beleuchtung des Objekts (4) in der Objektebene (3) mit einem im Strahlengang nach der Beleuchtungseinrichtung (1) angeordneten als strukturierte Blende wirkenden Element, wobei die Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34; 37, 38) in der Objektebene (3) jeweils Dunkelbereiche (27; 34; 38), die bei Überlagerung der Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34; 37, 38) in der Objektebene (3) das Objekt (4) vollständig überdecken, und Hellbereiche (26; 33; 37) aufweisen, – einer Abbildungsoptik (5) zur Abbildung der Objektebene (3) auf eine Bildebene (B), – einem in der Bildebene (B) angeordneten ortsauflösenden Detektor (6) zur Detektion der von dem Objekt (4) ausgehenden optischen Strahlung, und – einer Auswerteeinrichtung (7, 46) zur Auswertung von Detektionssignalen des Detektors (6), mittels derer aus bei Bestrahlung mit den Beleuchtungsmustern (26, 27; 33, 34; 37, 38) jeweils erfaßten Bildern ein Dunkelbild ermittelbar ist, und mittels derer das Dunkelbild von einem Hellbild des Objekts (4) subtrahierbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 16, bei der die Einrichtung (2; 28; 45) zur Erzeugung wenigstens zweier vorgegebener Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34; 37, 38) zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern (26, 27; 33, 34; 37, 38) mit Hellbereichen (26; 33; 37) ausgebildet ist, die bei Überlagerung der Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34; 37, 38) in der Objektebene (3) das Objekt (4) vollständig überdecken, und bei der das Hellbild mittels der Auswerteeinrichtung (7, 46) aus den bei Beleuchtung mit den Beleuchtungsmustern (26, 27; 33, 34; 37, 38) erfaßten Bildern erzeugbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 17, bei der – ein Antrieb (16; 31), mit dem das Objekt (4) oder ein Träger für das Objekt (4) bewegbar ist, von der Auswerteeinrichtung (7) so steuerbar ist, daß auf dem mit dem Träger bewegten Objekt (4) ein von dem als strukturierte Blende wirkenden Element erzeugtes Grundmuster (26, 27; 33, 34; 37, 38) ein Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34; 37, 38) abbildet, und – mittels der Auswerteeinrichtung (7, 46) Bilder des Detektors (6) nach jeder Änderung der Lage des Objekts (4) automatisch erfaßbar sind.
Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 18, bei der das als strukturierte Blende wirkende Element eine Feldblende (15) ist, – bei der ein Antrieb (16; 31), mittels dessen die Feldblende (15) oder ein Teil der Feldblende (15) bewegbar ist, von der Auswerteeinrichtung (7, 46) so steuerbar ist, daß die Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34; 37, 38) auf das Objekt (4) gestrahlt werden, und – bei der nach jeder Änderung des Beleuchtungsmusters (26, 27; 33, 34; 37, 38) mittels der Auswerteeinrichtung (7, 46) Bilder des Detektors (6) automatisch erfaßbar sind.
Vorrichtung nach Anspruch 18 oder 19, bei der das als strukturierte Blende wirkende Element eine Feldblende (15) ist und zur Erzeugung der mindestens zwei Beleuchtungsstrukturen hinter der Feldblende (15) ein bewegliches, lichtablenkendes Element (30) angeordnet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 20, bei der die Feldblende (15) eine streifenförmige Struktur aus einander abwechselnden transparenten und opaken Bereichen aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 20, bei der die Feldblende (15) eine in zwei Richtungen periodische Anordnung von transparenten und opaken Bereichen aufweist, wobei die opaken Bereiche aneinander angrenzen.
Vorrichtung nach Anspruch 17, bei der das als Blende wirkende Element eine elektronisch ansteuerbare Modulationseinheit (45), insbesondere ein LCD oder ein DMD, ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 23, bei der eine Beleuchtungsoptik (40) zur Abbildung des als Blende wirkenden Elements auf das Objekt (4) als eine Beleuchtungsoptik für eine Dunkelfeldbeleuchtung ausgebildet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 24, bei der die Beleuchtungsoptik (40) als ein Beleuchtungsobjektiv (44) mit kleiner Apertur ausgebildet ist, wobei die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs (44) und die durch die Abbildungsoptik (5) definierte optische Achse einen Winkel α einschließen.
Vorrichtung nach Anspruch 24 oder 25, bei der die Beleuchtungsoptik (40) eine Scheimpflugoptik ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 26, bei der die Abbildungsoptik (5) zur Abbildung des Objekts (4) auf den Detektor (6) eine Scheimpflugoptik umfaßt.