JPH06331894A

JPH06331894A - 落射蛍光顕微鏡

Info

Publication number: JPH06331894A
Application number: JP12108393A
Authority: JP
Inventors: Noriyuki Shimizu; 敬之清水; Takashi Nagano; 隆長野
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1993-05-24
Filing date: 1993-05-24
Publication date: 1994-12-02

Abstract

(57)【要約】【目的】落射蛍光顕微鏡において、標本から発する２
種以上の蛍光像の各光量を個別に調整可能にして、最良
の観察画像及び最良の撮影画像を得る。【構成】落射照明用光源１からダイクロイックミラー
８までの光路に、各狭帯域励起光波長の光の光量をそれ
ぞれ個別に調整する光量調整装置16を介挿する。また、
光量調整装置16を、入射光を各帯域励起光波長の光に分
離する複数の分離用ダイクロイックミラ― 33a〜33c
と、各分離用ダイクロイックミラ―にて分離された各光
の光量を調整する複数の光量調整用フィルタ― 34a〜34
c と、各光量調整用フィルタ―で光量が調整された各光
を１本の光束に集光するための複数の集光素子33a'〜 3
3c' とで構成する。さらに、光量調整装置16を、１個の
分離用ダイクロイックミラ―と１個の光量調整用フィル
タ―及び１個の集光素子が組込まれた複数の単位光量調
整ユニット 42a〜42c で構成している。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、医学，生物学等の分野
において生物組織などの状態を観察するときに利用され
る落射蛍光顕微鏡に係わり、特に標本から発する２種以
上の蛍光像の各光量を個別に調整可能にした落射蛍光顕
微鏡に関する。

【０００２】

【従来の技術】落射蛍光顕微鏡は、主として医学および
生物学の分野において生物組織細胞上で蛍光標識を施し
た蛋白や遺伝子などを検出する目的で広く使用されてい
る。特に、近年では、微弱な蛍光しか発しない物質であ
っても、複数の蛍光標識による多重染色によって、他の
物質との位置相互関係を調べる目的で多用されるように
なってきた。

【０００３】このような落射蛍光顕微鏡を用いて多重染
色蛍光標本を観察する場合、それぞれ単一の蛍光色素を
観察するための蛍光フィルタ―セット（励起フィルタ
―，ダイクロイックミラ―，吸収フィルタ―）を各単一
の蛍光色素毎に切換えることにより１つづつの蛍光色素
を観察していた。そして、それぞれの蛍光色素の位置相
互関係を調べるためにはそれぞれの蛍光像について写真
やビデオメモリに多重記録して表示しなくてはならな
い。

【０００４】しかし、このような落射蛍光顕微鏡におい
ては、蛍光フィルタ―セットの切換操作が繁雑であり、
切換操作に一定以上の作業時間が必要であり、観察作業
能率が低下する。また、例えば褪色の速い蛍光色素や時
間をパラメ―タとした蛍光色素の位置相互関係の検出に
は利用できない問題が生じる。

【０００５】さらに、蛍光フィルタ―セットの切換えに
伴い、ダイクロイックミラ―や吸収フィルタ―等の部品
精度によって観察光学系の芯ずれが発生し、蛍光像より
検出される位置相互関係に誤差が発生する問題がある。

【０００６】このような問題を解消するために、最近、
図９及び図１０に示す複数の狭帯域励起光波長の光を同
時に標本に照射する落射蛍光顕微鏡が提唱されている。
図９において、水銀ランプ等の光源１から投射された光
束はコレクタレンズ２で集光されたのち、開口絞り３及
び視野絞り４で絞られた後、レンズ５を介して蛍光フィ
ルタ―セット６に入射される。

【０００７】この蛍光フィルタ―セット６は、図１０に
示すように、３種の蛍光色素Ａ、Ｂ、Ｃを効率的に励起
する３つの高透過率の狭帯域励起光波長λ_EA、λ_EB、λ
_ECを持つ励起フィルタ―７と、これら３つの波長λ_EA、
λ_EB、λ_ECとの間、および波長λ_ECよりも長い波長領域
の３つの高透過率領域を有するダイクロイックミラ―８
と、不要波長成分を除去する吸収フィルター９とで構成
されている。

【０００８】蛍光フィルタ―セット６へ入射された光束
は励起フィルタ―７によって、３つの狭帯域励起光波長
λ_EA、λ_EB、λ_ECの光のみが抽出されて次のダイクロイ
ックミラ―８へ入射される。ダイクロイックミラ―８は
図１０に示す波長透過特性を有しているので、狭帯域励
起光波長λ_EA、λ_EB、λ_ECの各光はこのダイクロイック
ミラ―８で反射されてステ―ジ１０上の標本１１に照射
される。

【０００９】標本１１は予め３種類の蛍光色素によって
染色されているので、この標本１１からは前記各波長λ
_EA、λ_EB、λ_ECに対して、各波長λ_EA、λ_EB、λ_ECから
長波長側にシフトした波長を有する３種類の蛍光を発す
る。標本１１から発せられた蛍光は、対物レンズ１２を
介してダイクロイックミラ―８へ入射する。ダイクロイ
ックミラ―８は前記各波長λ_EA、λ_EB、λ_ECから長波長
側にシフトした波長を有する各蛍光を透過させて、次の
吸収フィルター９へ入射させる。各蛍光はこの吸収フィ
ルタ―９によって不要な波長域の光が除去されて、蛍光
像の波長のみがビームスプリッター１３にて撮影系レン
ズ１４、及び結像レンズと接眼レンズとからなる観察光
学系１５へ導かれる。

【００１０】このように、複数の波長透過特性を有した
励起フィルター７とダイクロイックミラ―８と吸収フィ
ルター９とを組合せることにより、３種の蛍光色素Ａ、
Ｂ、Ｃを同時に観察することが可能である。

【００１１】また、２種の蛍光色素のみを同時観察する
落射蛍光顕微鏡や、上記高透過率領域を更に連ねて４種
及びそれ以上の種類の蛍光色素の同時観察を行う落射蛍
光顕微鏡も同様な構成で実現できる。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】上述したような構成の
蛍光フィルタ―セット６を用いることによって、観察光
学系の芯ずれや位置相互関係の誤差をなくすことができ
るが、蛍光色素毎の蛍光強度の違いや蛍光の褪色速度の
違いなどが生じているとき、これら複数種の蛍光強度を
所望の明るさにすることが困難である。

【００１３】その結果、観察或いは写真等に記録される
各蛍光像はどれか１つが暗すぎたり、または明るすぎた
り、また明るさが不揃いになる問題がある。なお、前述
した３種類の蛍光色素の蛍光強度を調節する手段とし
て、例えば観察光路中の吸収フィルタ―９の特性を変更
するか、又は観察光路に補助フィルタ―を挿入して、標
本１１から発する蛍光を部分的にカットする蛍光カット
手段が考えられる。また、照明光路中に分光選択吸収を
示さない中性濃度のＮＤフィルタ―を挿入するか又は開
口絞り３を調節するなどして照明光の強度を調節する光
強度調節手段も考えられる。

【００１４】しかし、前者の蛍光カット手段では、カッ
トされた部分の蛍光を励起した励起光が無駄となり、そ
れだけ蛍光の利用効率が悪くなり、標本１１に余分な疲
労（損傷）を与えることになって好ましくない。一方、
後者の光強度調節手段では、３波長の励起光強度をそれ
ぞれ独立的に調節できないので、３種類の蛍光の強度比
を変えることができない。

【００１５】本発明はこのような事情に鑑みてなされた
もので、蛍光フィルタ―セットを構成する各フィルター
を交換することなく多重染色蛍光標本の観察を可能と
し、しかも、各励起毎の蛍光強度を簡単な操作で適宜可
変して観察又は撮影しやすい蛍光像を得ることができ、
操作性及び観察，撮影精度を向上できる落射蛍光顕微鏡
を提供することを目的とする。

【００１６】

【課題を解決するための手段】上記課題を解消するため
に本発明は、落射照明用光源から出射された光束から複
数の狭帯域励起光波長の光を抽出する励起フィルタ―
と、この励起フィルタ―にて抽出された複数の狭帯域励
起光波長の光を反射させて標本に照射し、標本から発せ
られる複数種類の蛍光を透過するダイクロイックミラ―
と、このダイクロイックミラ―からの透過光に含まれる
不要波長成分を吸収する吸収フィルタ―と、吸収フィル
タ―を透過した蛍光像を観察する観察光学系とを有する
落射蛍光顕微鏡において、落射照明用光源からダイクロ
イックミラーまでの光路に、各狭帯域励起光波長の光の
光量をそれぞれ個別に調整する光量調整装置を介挿して
いる。

【００１７】また別の発明においては、上記構成の落射
蛍光顕微鏡の光量調整装置を、入射光を各帯域励起光波
長の光に分離する複数の分離用ダイクロイックミラ―
と、各分離用ダイクロイックミラ―にて分離された各光
の光量を調整する複数の光量調整用フィルタ―と、各光
量調整用フィルタ―で光量が調整された各光を１本の光
束に集光するための複数の集光素子とで構成している。

【００１８】さらに別の発明においては、上述した光量
調整装置を、１個の分離用ダイクロイックミラ―と１個
の光量調整用フィルタ―及び１個の集光素子が組込まれ
た複数の単位光量調整ユニットで構成し、かつこの各単
位光量調整ユニットを任意に着脱及び増設可能にしてい
る。

【００１９】

【作用】このように構成された落射蛍光顕微鏡において
は、落射照明用光源からダイクロイックミラーまでの光
路に、各狭帯域励起光波長の光の光量をそれぞれ個別に
調整する光量調整装置が介挿されている。

【００２０】すなわち、落射照明用光源から出射された
光束から励起フィルタ―によって複数の狭帯域励起光波
長の光が抽出されて、この抽出された各狭帯域励起光波
長の光がダイクロイックミラーにて反射されて標本に入
射される。そして、このダイクロイックミラーにて反射
されて標本に入射される各狭帯域励起光波長の光が、光
量調整装置によって個別に調整可能である。

【００２１】したがって、たとえ、蛍光色素毎の蛍光強
度の違いや蛍光の褪色速度の違い等が生じていたとして
も、標本に入射される各光の光量を調整することによっ
て、各蛍光像の明るさを均一にでき、各蛍光像を観察又
は撮影しやすくできる。

【００２２】また、標本に対する入射光の光量が調整対
象となるので、標本に過大な光量が照射されて、この標
本から発する蛍光を後からフィルター等を用いて減光す
る事態が生じることはないので、過大照射に起因する標
本の劣化を防止できる。

【００２３】また別の発明においては、光量調整装置が
各狭帯域励起光波長の光をそれぞれ分離するための複数
の分離用ダイクロイックミラーと分離された各光の光量
を調整する複数の光量調整用フィルタ―と光量が調整さ
れた各光を１本の光束に集光するための複数の集光素子
とで構成されている。したがって、調整対象とする蛍光
像に対応する光の光量調整用フィルタ―を操作すればよ
い。

【００２４】さらに別の発明においては、光量調整装置
が１個の分離用ダイクロイックミラ―と１個の光量調整
用フィルタ―及び１個の集光素子が組込まれた複数の単
位光量調整ユニットで構成されている。さらに、各単位
光量調整ユニットを任意に着脱及び増設可能にしてい
る。このように構成することによって、標本から発する
蛍光像の数が増加したり減少した場合においても、光量
調整装置全体を交換することなく、不必要な単位光量調
整ユニットを取外したり、不足する単位光量調整ユニッ
トを増設すればよい。

【００２５】

【実施例】以下本発明の一実施例を図面を用いて説明す
る。図１は実施例の落射蛍光顕微鏡の光学系を示す構成
図である。図９に示す従来の落射蛍光顕微鏡と同一部分
には同一符号が付してある。したがって、重複する部分
の詳細説明を省略する。

【００２６】落射照明用光源としての水銀ランプ等の光
源１から投射された光束はコレクタレンズ２で集光され
たのち、光量調整装置１６へ入射される。光量調整装置
１６にて光量が調整された光束は開口絞り３及び視野絞
り４で絞られた後、レンズ５を介して蛍光フィルタ―セ
ット６へ入射される。

【００２７】この蛍光フィルタ―セット６は、図１０で
説明したように、３種の蛍光色素Ａ、Ｂ、Ｃを効率的に
励起する３つの高透過率の狭帯域励起光波長λ_EA、
λ_EB、λ_ECを持つ励起フィルタ―７と、これら３つの波
長λ_EA、λ_EB、λ_ECとの間、および波長λ_ECよりも長い
波長領域の３つの高透過率領域を有するダイクロイック
ミラ―８と、不要波長成分を除去する吸収フィルター９
とで構成されている。

【００２８】蛍光フィルタ―ユニット６へ入射された光
束は励起フィルタ―７によって、３つの狭帯域励起光波
長λ_EA、λ_EB、λ_ECの光のみが抽出されて次のダイクロ
イックミラ―８へ入射される。ダイクロイックミラ―８
は図１０に示す波長透過特性を有しているので、狭帯域
励起光波長λ_EA、λ_EB、λ_ECの各光はこのダイクロイッ
クミラ―８で反射されて上下動可能なステ―ジ１０上の
標本１１に照射される。

【００２９】標本１１は予め３種類の蛍光色素によって
染色されているので、この標本１１からは前記各波長λ
_EA、λ_EB、λ_ECに対すして、各波長λ_EA、λ_EB、λ_ECか
ら長波長側にシフトした波長を有する３種類の蛍光を発
する。標本１１から発せられた蛍光は、対物レンズ１２
を介してダイクロイックミラ―８へ入射する。ダイクロ
イックミラ―８は前記各波長λ_EA、λ_EB、λ_ECから長波
長側にシフトした波長を有する各蛍光を透過させて、次
の吸収フィルター９へ入射させる。各蛍光はこの吸収フ
ィルタ―９によって不要な波長域の光が除去されて、蛍
光像の波長のみがビームスプリッター１３にて撮影系レ
ンズ１４、及び結像レンズと接眼レンズとからなる観察
光学系１５へ導かれる。

【００３０】図２は前記光量調整装置１６の光学系を示
す構成図である。コンデンサンズ２，開口絞り３，視野
絞り４，レンズ５，蛍光フィルタ―セット６の光軸３６
上に、コリメ―タレンズ３１，２個の全反射ミラー３
２，３２´．集光レンズ３５が配設されている。なお、
コリメータレンズ３１と集光レンズ３５の間は光源１に
対して平行光となっている。

【００３１】全反射ミラー３２の反射光軸上に３個の分
離用ダイクロイックミラ―３３ａ，３３ｂ，３３ｃが配
設されている。同様に、全反射ミラー３２´の入射光軸
上に３個の集光素子としての集光用ダイクロイックミラ
―３３ａ´，３３ｂ´，３３ｃ´が配設されている。各
ダイクロイックミラ―３３ａ〜３３ａ´相互間，３３ｂ
〜３３ｂ´相互間，３３ｃ〜３３ｃ´相互間にそれぞれ
光量調整フィルターとしての干渉フィルター３４ａ．３
４ｂ．３４ｃが介挿されている。

【００３２】前記各ダイクロイックミラ―３３ａ，３３
ａ´は、図５に示すように、色素Ａに対応する狭帯域励
起光波長λ_EAの光より長波長側の光を透過する透過特性
を有する。したがって、狭帯域励起光波長λ_EAの光は反
射される。また、前記各ダイクロイックミラ―３３ｂ，
３３ｂ´は、色素Ｂに対応する狭帯域励起光波長λ_EBの
光より長波長側の光を透過する透過特性を有する。さら
に、前記各ダイクロイックミラ―３３ｃ，３３ｃ´は、
色素Ｃに対応する狭帯域励起光波長λ_ECの光より長波長
側の光を透過する透過波長特性を有する。

【００３３】図３は図２に示した光量調整装置１６の外
観図である。顕微鏡本体フレ―ム４１内には、図２に示
す光軸上のコリメ―タレンズ３１、２個の全反射ミラー
３２，３２´．集光レンズ３５が収納されている。そし
て、顕微鏡本体フレ―ム４１におけるこの各光学部材が
収納された外面に３個の直方体形状を有する単位光量調
整ユニット４２ａ，４２ｂ，４２ｃが積層状に取付けら
れている。

【００３４】顕微鏡本体フレ―ム４１に取付けられた単
位光量調整ユニット４２ａ内には、図２に示す分離用ダ
イクロイックミラー３３ａ、干渉フィルター３４ａ．集
光用ダイクロイックミラー３３ａ´が収納されている。
また、単位光量調整ユニット４２ｂ内には分離用ダイク
ロイックミラー３３ｂ、干渉フィルター３４ｂ．集光用
ダイクロイックミラー３３ｂ´が収納されている。さら
に、単位光量調整ユニット４２ｃ内には分離用ダイクロ
イックミラー３３ｃ、干渉フィルター３４ｃ．集光用ダ
イクロイックミラー３３ｃ´が収納されている。

【００３５】単位光量調整ユニット４２ａ，４２ｂ，４
２ｃ内に収納された各干渉フィルター３４ａ〜３４ｃは
図示するように、光路中に光軸と垂直な軸を中心に回転
可能に保持するための筒状フィルタ―枠４３ａ〜４３ｃ
に支持されている。そして、この筒状フィルタ―枠４３
ａ〜４３ｃは操作ツマミ４５ａ〜４５ｃによって回動さ
れる。この各操作ツマミ４５ａ〜４５ｃは貫通孔４４ａ
〜４４ｃを介して各単位光量調整ユニット４２ａ，４２
ｂ，４２ｃの上面に露出している。

【００３６】また、各単位光量調整ユニット４２ａ，４
２ｂ，４２ｃの各前面及び後面には各分離用ダイクロイ
ックミラー３３ａ〜３３ｃを透過した光、及び，各集光
用ダイクロイックミラー３３ａ´〜３３ｃ´へ入射する
光りが通過する貫通孔４８ａ．４８ｂが穿設されてい
る。なお、最も外側の単位光量調整ユニット４２ｃの前
面の使用しなし貫通孔４８ａ．４８ｂは図示しないキャ
ップ等で塞がれている。

【００３７】そして、各単位光量調整ユニット４２ａ，
４２ｂ，４２ｃ相互間は固定金具４６を介して固定ビス
４７で固定されている。第４図は各単位光量調整ユニッ
ト４２ｂ〜４２ｃの内部構成を示す断面図である。

【００３８】単位光量調整ユニット４２ｃのフレ―ム５
１ｃには、前記筒状フィルタ―枠４３ｃを光軸と垂直な
軸を持って回転可能に保持するための嵌合部が形成され
ている。この嵌合部内には、前記筒状フィルタ―枠４３
ｃを押すように動作可能な球５２、この球５２を押すた
めのコイルバネ５３、このコイルバネ５３を支持するば
ね受け５４がねじ固定されている。

【００３９】また、前記分離用ダイクロイックミラ―３
３ｃはフィルタ―枠５５にて保持さている。さらに、こ
のフィルタ―枠５５は前記フレ―ム５１ｃの下部に設け
られた取付部５６に着脱可能に保持されている。同様
に、前記集光用ダイクロイックミラ―３３ｃ´はフィル
タ―枠５５´にて保持さている。さらに、このフィルタ
―枠５５´は前記フレ―ム５１ｃの下部に設けられた取
付部５６´に着脱可能に保持されている。

【００４０】また、フレ―ム５１ｃ，５１ｂの側面に
は、単位光量調整ユニット４２ｃ，４２ｂ相互間を固定
する場合に前記金具４６及び固定ビス４７を取付けるた
めのビス穴５７．５８が刻設されている。さらに、フレ
―ム５１ｃの後面にには、隣の単位光量調整ユニット４
２ｂに自己の単位光量調整ユニット４２ｃを積層するた
めに、隣の貫通孔４８ａ，４８ｂに挿入されるフランジ
部５９ａ，５９ｂが形成されている。

【００４１】よって、各単位光量調整ユニット４２ｃ〜
４３ｃの上面に露出している各操作ツマミ４５ａ〜４５
ｃを観察者が手動で回動させたり、他の電気的又は機械
的手段により回動することによって、干渉フィルタ―３
４ａ〜３４ｃが回転され、かつ、コイルばね５３の押圧
力を受けて前記球５２が押圧力を与えて筒状フィルタ―
枠４３、つまり干渉フィルタ―３４ａ〜３４ｃは任意の
回転位置で固定される。

【００４２】このような構成の光量調整装置１６におい
て、コレクターレンズ２を介して入射した光束はコリメ
―タレンズ３１で平行光に変換されて、全反射ミラー３
２で全反射されて、各分離用ダイクロイックミラ―３３
ａ，３３ｂ，３３ｃに導かれれる。各分離用ダイクロイ
ックミラ―３３ａ，３３ｂ，３３ｃにおいて、図５から
理解できるように、各色素Ａ，Ｂ，Ｃに対応する各狭帯
域励起光波長λ_EA，λ_EB，λ_ECの各光のみが反射されて
それぞれの干渉フィルター３４ａ，３４ｂ，３４ｃへ入
射される。

【００４３】各干渉フィルター３４ａ．３４ｂ．３４ｃ
は、図６（ａ）（ｂ）に示すように、透過率の波長特性
が、光軸に対する傾斜角度に対応してシフトする特性を
有する。

【００４４】具体的には、この干渉フィルター３４ａ，
３４ｂ，３４ｃを光軸に対して垂直な方向（傾き０°）
に挿入したとき図６（ａ）に示すように各狭帯域励起光
波長λ_EA，λ_EB，λ_ECを中心とする透過波長特性を有す
る。一方、干渉フィルター３４ａ，３４ｂ，３４ｃを光
軸に垂直な方向の軸に対して４５°だけ傾けて挿入した
とき図６（ｂ）のような各透過波長特性を得ることがで
きる。

【００４５】一般に、干渉フィルタ―３４ａ〜３４ｃの
干渉条件は、最大透過率波長をλ、誘電体の光学的な厚
さ（誘電体の境界で生じる位相差も光路長に換算して含
ませる）をｔ、境界による反射角をφとしたとき、次の
ような関係式で表すことができる。２ｔ・ cosφ＝ｍλ ここで、次数ｍを一定とし、かつ、干渉条件を一定とし
たとき、波長λは cosφに比例する。この角度φは反射
角であるが、スネルの法則により入射角と共役なので同
等と見なせる。このことは、入射角を大きくしていけ
ば、 cosφが減少していき、同時に波長λも減少してい
き、よって透過波長特性における最大透過率が得られる
波長は徐々に低波長側へシフトしていく。このため、光
軸に垂直な方向の軸から徐々に４５°まで干渉フィルタ
―３４ａ〜３４ｃを傾けることによって、図６（ａ）に
示す各透過波長特性を図６（ｂ）に示す透過波長特性ま
でその波長領域を連続的にシフトさせることができる。

【００４６】前記干渉フィルタ―３４ａ，３４ｂ，３４
ｃを透過した各光は、前記分離用ダイクロイックミラ―
３３ａ，３３ｂ，３３ｃと同一の透過波長特性を有する
集光用ダイクロイックミラ―３３ａ′，３３ｂ′，３３
ｃ′にて反射さされて全反射ミラー３２で全反射されて
前記光軸３６上で再び集光レンズ３５にて１つの光束に
変換されて、この光量調整装置１６から次の開口絞り３
へ出射される。

【００４７】光量調整装置１６から出射された光束は開
口絞り３，視野絞り４，レンズ５を介して蛍光フィルタ
―セット６内の励起フィルター７へ入射される。励起フ
ィルター７は図１０で示す各狭帯域励起光波長λ_EA、λ
_EB、λ_ECの光を透過する特性を有している。

【００４８】したがって、前記光量調整装置１６とこの
励起フィルタ―７とを併用することによって得られるダ
イクロイックミラー８に入射する励起光の波長成分は図
６（ａ），（ｂ）における斜線部分となる。図６（ａ）
は各干渉フィルタ―３４ａ，３４ｂ，３４ｃを光軸に垂
直にした場合を示し、図６（ｂ）は各干渉フィルタ―３
４ａ，３４ｂ，３４ｃを光軸に対し４５°方向に傾斜さ
せた場合を示す。

【００４９】図６（ａ）においては、各励起波長帯域と
も励起フィルタ―７による励起光と同等の励起光が得ら
れるが、図６（ｂ）では各干渉フィルタ―３４ａ〜３４
ｃの影響により各励起波長帯域ともカットされて、光量
が減少している。さらに図６（ａ）と図６（ｂ）の間の
状態、つまり各干渉フィルタ―３４ａ〜３４ｃの傾きを
０°から４５°へ徐々に増加していくと、各干渉フィル
タ―３４ａ〜３４ｃによる透過波長率帯はその傾斜角増
加に伴って短波長側にシフトしていき、励起フィルタ―
７の透過波長率帯との重なりは各励起波長帯域の長波長
側から消滅していく。

【００５０】すなわち、カットされる波長領域が徐々に
多くなっていくので、励起光の光量が減少していく。よ
って各干渉フィルタ―３４ａ〜３４ｃの傾きを任意の角
度にすることでダイクロイックミラー８を介して標本１
１へ照射される各励起光の光量を無段階で調整すること
が可能となる。

【００５１】ここで各励起光波長帯域の光量（強度）は
夫々独立した光路に配置された干渉フィルタ―３４ａ，
３４ｂ，３４ｃの傾きによって制御されるために、３つ
の狭帯域励起光波長λ_EA，λ_EB，λ_ECの光の光量はそれ
ぞれ独立して調整することができる。

【００５２】つまり干渉フィルタ―３４ａ，３４ｂ，３
４ｃの傾きをそれぞれ独立して任意の角度にすれば各波
長λ_EA，λ_EB，λ_ECを有する３つの各励起光の強度の比
を連続的に変化させることができ、これに伴って各励起
光により励起される３種類の蛍光相互間の強度比、及び
各蛍光の強度の絶対値を所望とする値に調整することが
できる。

【００５３】したがって、３種類の蛍光色素によって蛍
光強度に差が生じた場合や３種類の蛍光間で褪色の速度
に差が生じた場合、３種類の蛍光像の明るさのバランス
が異なるが、このような場合には干渉フィルタ―３４ａ
〜３４ｃの傾きを変更する簡単な操作により３種類の蛍
光強度の比を容易に調節でき、観察或いは写真撮影等に
おいて一つの蛍光像が明るすぎたり、或いは暗すぎたり
する問題を解決することができる。

【００５４】さらに、標本１１に対する照明側の光路に
おける調光であるので、前述したような励起効率の低下
や標本１１の劣化速度を上昇させる懸念もなくなる。以
上、標本１１に対する３重染色について説明したが、次
に、２重染色又は４重染色以上の対応について説明す
る。

【００５５】図４に示すように、各干渉フィルタ―３４
ａ〜３４ｃと、その前後の分離用及び集光用の各ダイク
ロイックミラ―３３ａ〜３３ｃ，３３ａ´〜３３ｃ′と
をそれぞれ１個づつ含んだ構成をそれぞれ独立した単位
光量調整ユニット４２ａ〜４２ｃとしている。

【００５６】したがって、単位光量調整ユニット４２ａ
〜４２ｃの組込個数を増加することによって、簡単に高
機能化を図ることができる。例えば２重励起のみに対応
する場合、図３において最も外側の単位光量調整ユニッ
ト４２ｃを取外し、光量調整装置１６を２個の単位光量
調整ユニット４２ａ，４２ｂのみで構成すればよい。

【００５７】一方、４重励起に対応する場合、図２に破
線で示したダイクロイックミラ―３３ｄ，３３ｄ′およ
び干渉フィルタ―３４ｄを含む、図示しないユニット４
２ｄを取り付ければ良い。図２において最も外側の分離
用ダイクロイックミラー３３ｃを透過した長波長部分の
光は新たに継足した単位光量調整ユニット４２ｄの分離
用ダイクロイックミラー３３ｄに導かれるため、干渉フ
ィルタ―３４ｄの対応する励起波長帯域を、光軸３６か
ら離れるに従って長波長側とし、それに対応する各ダイ
クロイックミラ―３３ｄ，３３ｄ′を使用することで、
何重励起であろうとも対応可能となる。

【００５８】単位光量調整ユニット４２の取付は、図４
において任意のユニット４２のフランジ部５９ａ，５９
ｂを、光軸３６に近い側の単位光量調整ユニット４２の
貫通孔４８ａ．４８ｂへ挿入して嵌合させる。その後、
前記金具４６を使いユニットのビス穴５７，５８にビス
固定し、連結固定させる。

【００５９】したがって、このような構成によれば、前
述の効果に加え、将来多重染色が何重に増えようとも対
応する観察システムが容易かつ簡便に実現できる。図７
は本発明の他の実施例に係わる落射蛍光顕微鏡に組込ま
れる光量調整装置の外観図である。

【００６０】この光量調整装置においては、図２の各干
渉フィルター３４ａ，３４ｂ，３４ｃの代りに、各光量
調整フィルターとして、それぞれニュートラル・デンシ
ティー・フィルター（以下ＮＤフィルータと略記する）
７１ａ〜７１ｃが交換可能に設けられている。その他の
光学構成は図２に示す実施例と同じである。

【００６１】このＮＤフィルター７１ａ〜７１ｃは、各
波長領域に亘って一定の透過率を有している。すなわ
ち、顕微鏡本体フレ―ム４１内には、図２に示す光軸上
のコリメ―タレンズ３１、２個の全反射ミラー３２，３
２´．集光レンズ３５が収納されている。そして、顕微
鏡本体フレ―ム４１におけるこの各光学部材が収納され
た外面に３個の直方体形状を有する単位光量調整ユニッ
ト６２ａ，６２ｂ，６２ｃが積層状に取付けられてい
る。

【００６２】単位光量調整ユニット６２ａ内には、分離
用ダイクロイックミラー３３ａ，ＮＤフィルター７１
ａ，集光用ダイクロイックミラー３３ａ´が収納されて
いる。また、単位光量調整ユニット６２ｂ内には分離用
ダイクロイックミラー３３ｂ，ＮＤフィルター７１ｂ，
集光用ダイクロイックミラー３３ｂ´が収納されてい
る。さらに、単位光量調整ユニット６２ｃ内には分離用
ダイクロイックミラー３３ｃ，ＮＤフィルター７１ｃ，
集光用ダイクロイックミラー３３ｃ´が収納されてい
る。

【００６３】単位光量調整ユニット６２ａ，６２ｂ，６
２ｃ内に収納された各ＮＤフィルター７１ａ〜７１ｃ
は、図示するように、フィルタ―枠６３ａ〜６３ｃにて
光路中に光軸と垂直な方向に支持されている。そして、
このフィルタ―枠６３ａ〜６３ｃには、貫通孔６４ａ〜
６４ｃを介してこの各単位光量調整ユニット４２ａ，４
２ｂ，４２ｃの外部に引出すための突起部６５ａ〜６５
ｃが取付けられている。

【００６４】また、各単位光量調整ユニット６２ａ，６
２ｂ，６２ｃの各前面及び後面には各分離用ダイクロイ
ックミラー３３ａ〜３３ｃを透過した光、及び，各集光
用ダイクロイックミラー３３ａ´〜３３ｃ´へ入射する
光が通過する貫通孔６８ａ，６８ｂが穿設されている。
なお、最も外側の単位光量調整ユニット６２ｃの前面の
使用しない貫通孔６８ａ，６８ｂは図示しないキャップ
等で塞がれている。

【００６５】そして、各単位光量調整ユニット６２ａ，
６２ｂ，６２ｃ相互間は固定金具５６を介して固定ビス
６７で固定されている。このよに構成された光量調整装
置が組込まれた落射蛍光顕微鏡の動作を説明する。

【００６６】各フィルター枠６３ａ〜６３ｃを各単位光
量調整ユニット６２ａ〜６２ｃに装着することによっ
て、各ＮＤフィルター７１ａ〜７１ｃが各分離用ダイク
ロィックミラー３３ａ〜３３ｄの反射光の光路に挿入さ
れる。各ＮＤフィルター７１ａ〜７１ｃに入射する光は
図５に示す各ダイクロイックミラー３３ａ〜３３ｃにて
選別された各狭帯域励起光波長λ_EA，λ_EB，λ_ECの光を
含む。各ＮＤフィルター７１ａ〜７１ｃはこの各狭帯域
励起光波長λ_EA，λ_EB，λ_ECの光を含む光の光量をそれ
ぞれ自己が有する透過率に対応して減少させる。

【００６７】したがって、この光量調整装置の各ＮＤフ
ィルター７１ａ〜７１ｃと図８（ａ）に示す各色素Ａ〜
Ｃに対応する狭帯域励起光波長λ_EA，λ_EB，λ_ECの各光
を抽出する透過波長特性を有した励起フィルター７とを
組合わせた場合には、励起フィルター７からダイクロイ
ックミラー８へ入射する前記各狭帯域励起光波長λ_EA，
λ_EB，λ_ECの光は、図８（ｂ）の斜線部分に示すよう
に、各ＮＤフィルター７１ａ〜７１ｃが有する透過率に
従ってその各光量が制限（カット）される。

【００６８】各ＮＤフィルター７１ａ〜７１ｃの透過率
は、各ＮＤフィルター７１ａ〜７１ｃ固有の値であるの
で、透過率の異なる他のＮＤフィルター７１ａ〜７１ｃ
と交換することによって、ダイクロイックミラー８へ入
射する狭帯域励起光波長λ_EA，λ_EB，λ_ECの各光の光量
を任意に調整可能となる。

【００６９】よって、ダイクロイックミラー８で反射さ
れて、標本１１へ照射される各波長λ_EA，λ_EB，λ_ECの
励起光量を任意に設定でき、この励起光に励起して発生
する３種類の蛍光相互間の光量比、及び各蛍光の絶対値
を所望の値に調整することが可能である。

【００７０】したがって、このような実施例の構成によ
れば、３種類の蛍光色素によって蛍光強度に差が生じた
場合や、３種類の蛍光間で褪色の速度に差が生じた場
合、３種類の蛍光像の明るさのバランスが異なる場合、
単位光量調整ユニット６２ａ〜６２ｃの各ＮＤフィルタ
ー７１ａ〜７１ｃを交換するだけの簡便な操作により３
種類の蛍光強度の比を容易に調整できる。

【００７１】その結果、観察や写真撮影等において、各
蛍光像のうちのいずれかの蛍光像が明るすぎたり、暗す
ぎたりする問題を簡単に解消できる。しかも、標本１１
に対する照明光の調光であるので、前述したような励起
効率が低下する懸念もなく、標本１１に対する過大照射
に起因する標本１１の劣化を未然に防止できる。

【００７２】さらに、ＮＤフィルター７１ａ〜７１ｃは
安価であり、一般に市販されているので、簡単に入手で
き、光量調整装置の製造費が特に大幅に上昇することは
ない。

【００７３】なお、このＮＤフィルター７１ａ〜７１ｃ
を用いた光量調整装置であっても、先の実施例の光量調
整装置と同様に、標本１１に対する多重染色数の増減に
簡単に対応できる。

【００７４】

【発明の効果】以上説明したように本発明の落射蛍光顕
微鏡によれば、落射照明用光源からダイクロイックミラ
ーまでの光路に、各狭帯域励起光波長の光の光量をそれ
ぞれ個別に調整する光量調整装置が介挿されている。し
たがって、多重染色蛍光標本においてこの標本から発す
る各蛍光色素の励起光量をそれぞれ独立して簡単に調整
できるので、各蛍光色素毎の蛍光強度の違い及び褪色速
度の違いや観察者の好みに応じて多重染色の蛍光像の明
るさの比を変えることができ、観察又は写真撮影等に際
して蛍光色素の違いによる蛍光像の明るさの相違を確実
に補正でき、観察しやすい蛍光像を得ることができる。

【００７５】また、照射光側で励起光を調整するので、
標本より発し観察光路に導かれる蛍光は従来顕微鏡のよ
うに調節フィルタ―により強度が弱められることがない
ので、蛍光強度を上げるために、通常より多くの励起光
を標本に照射する必要がなく、標本に対して損傷を与え
ることがない。また将来的に多重染色の同期観察の数が
増加したり、減少した場合においても、単位光量調整ユ
ニットを増減することによって簡単に対応できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例に係わる落射蛍光顕微鏡の
概略構成を示す光学系構成図。

【図２】同実施例顕微鏡に組込まれた光量調整装置の
概略構成を示す光学系構成図。

【図３】同光量調整装置の外観図。

【図４】同光量調整装置の内部構成を示す断面図。

【図５】同光量調整装置に組込まれた各分離用ダイク
ロイックミラーの透過波長特性図。

【図６】同光量調整装置に組込まれた各干渉フィルタ
ーの透過波長特性と励起フィルターの透過波長特性との
相互関係を示す図。

【図７】本発明の他の実施例に係わる落射蛍光顕微鏡
に組込まれた光量調整装置の外観図。

【図８】同光量調整装置に組込まれた各ＮＤフィルタ
ーの透過特性と励起フィルターの透過波長特性との相互
関係を示す図。

【図９】一般的な落射蛍光顕微鏡の概略構成を示す光
学系構成図。

【図１０】同落射蛍光顕微鏡における各色素波長領域
における蛍光フィルターセットの各フィルータとダイク
ロイックミラーの各透過波長特性図。

【符号の説明】

１…光源、６…蛍光フィルターセット，７…励起フィル
ター、８…ダイクロイックミラー、９…吸収フィルタ
ー、１０…ステージ、１１…標本、１２…対物レンズ、
１３…ビームスプリッター、１６…光量調整装置、３
２，３２´…全反射ミラー、３３ａ，３３ｂ．３３ｃ…
分離用ダイクロイックミラー、３３ａ´，３３ｂ´３３
ｃ´…集光用タイクロイックミラー、３４ａ，３４ｂ，
３４ｃ…干渉フィルター、４２ａ，４２ｂ，４２ｃ，６
２ａ，６２ｂ，６２ｃ…単位光量調整ユニット、７１
ａ，７１ｂ，７１ｃ…ＮＤフィルター。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】落射照明用光源から出射された光束から
複数の狭帯域励起光波長の光を抽出する励起フィルタ―
と、この励起フィルタ―にて抽出された複数の狭帯域励
起光波長の光を反射させて標本に照射し、当該標本から
発せられる複数種類の蛍光を透過するダイクロイックミ
ラ―と、このダイクロイックミラ―からの透過光に含ま
れる不要波長成分を吸収する吸収フィルタ―と、この吸
収フィルタ―を透過した蛍光像を観察する観察光学系と
を有する落射蛍光顕微鏡において、前記落射照明用光源から前記ダイクロイックミラーまで
の光路に介挿され、前記各狭帯域励起光波長の光の光量
をそれぞれ個別に調整する光量調整装置を備えたことを
特徴とする落射蛍光顕微鏡。
【請求項２】前記光量調整装置は、入射光を前記各帯
域励起光波長の光に分離する複数の分離用ダイクロイッ
クミラ―と、この各分離用ダイクロイックミラ―にて分
離された各光の光量を調整する複数の光量調整用フィル
タ―と、この各光量調整用フィルタ―で光量が調整され
た各光を１本の光束に集光するための複数の集光素子と
を備えたことを特徴とする請求項１記載の落射蛍光顕微
鏡。
【請求項３】前記光量調整装置は、１個の分離用ダイ
クロイックミラ―と１個の光量調整用フィルタ―及び１
個の集光素子が組込まれた複数の単位光量調整ユニット
を有し、かつこの各単位光量調整ユニットは任意に着脱
及び増設可能に構成されたことを特徴とする請求項２記
載の落射蛍光顕微鏡。