JPH1194742A

JPH1194742A - 蛍光顕微鏡

Info

Publication number: JPH1194742A
Application number: JP25113297A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Sasaki; 浩佐々木
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1997-09-16
Filing date: 1997-09-16
Publication date: 1999-04-09

Abstract

(57)【要約】【課題】蛍光標本を励起する２種以上の励起光の光量
比を蛍光標本に照射することなく、調整する。【解決手段】２種以上の蛍光を発する多重染色標本１
１を励起する２種以上の励起波長の励起光を発する光源
１と、光源１と対物レンズ１０との間に配置され、２種
以上の励起波長の励起光のそれぞれの光量を測定する測
定手段１５ａ、１５ｂと、測定手段１５ａ、１５ｂの測
定値に基づいて対物レンズ１０に入射する２種以上の励
起波長の光量比を調整する調整手段３とを備えることに
よって、標本１１の照射することなく、光量比を調整す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光染色された標
本を励起する２つ以上の波長を持つ照明光源を有した蛍
光顕微鏡に関する。

【０００２】

【従来の技術】複数の蛍光色素により多重染色された標
本を効率よく励起し、しかも蛍光色素に対応した各蛍光
像の明るさの比を任意に可変させるために各蛍光色素を
励起する各々の波長の強度を変える技術が開発されてい
る。図１８は、このために特開平５−１５０１６４号公
報に記載された落射蛍光顕微鏡を示している。この落射
蛍光顕微鏡は落射光源２０１からの光束を励起フィルタ
２０２を通過させて複数の狭帯域励起波長に変換し、こ
の複数の狭帯域励起波長の光をダイクロイックミラー２
０５から対物レンズ２０３に通して標本２０４に照射す
るようになっている。そして、標本２０４から発せられ
る複数の種類の蛍光はダイクロイックミラー２０５を透
過し、接眼観察光学系２０６又はＣＣＤ等の光検出器へ
の光路２０７へ導かれる。

【０００３】この落射蛍光顕微鏡の光路系には、複数の
狭帯域励起波長の光量比を可変するための透過波長シフ
ト用干渉フィルタ（励起光量バランサ）２０８が落射光
源２０１と励起フィルタ２０２の間に設けられている。
そして、この透過波長シフト用干渉フィルタ２０８を、
光の入射角度を変化させるように回転させることによ
り、励起フィルタ２０２が抽出する複数の狭帯域励起光
波長の光量比を変化させることができる。

【０００４】一方、特開平７−３１８８１１号公報に
は、複数の波長を同時発振するマルチラインレーザを用
いて、複数の蛍光色素を励起し複数の波長の光量を調整
することが可能な走査型光学顕微鏡が開示されている。
この走査型光学顕微鏡は、上述した励起光量バランサ
（透過波長シフト用干渉フィルタ）２０８と複数の光量
可変フィルタとを切り換えるように光路に挿入及び離脱
するものである。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】一般的に、多重染色標
本を励起する各波長の観察に適した光量比は、標本の種
類、選択した蛍光色素の種類により異なる。また、蛍光
顕微鏡の落射光源に用いられている水銀灯から発せられ
る輝線を含めた光量比や、走査型光学顕微鏡の光源に用
いられているＫｒＡｒレーザが発する４８８、５６８、
６４７ｎｍ等の複数のそれぞれの波長の光量比は使用時
間とともに変化する。さらに、各波長の光量比は、マル
チラインレーザの管電流を変化させ、総合パワー（各出
力波長の合計出力）を変化させた時も変化する。

【０００６】従って、実際の観察では標本に励起光を照
射し、像や画像を見ながら各波長の光量比を調整しなけ
ればならず、光量比の調整に長時間を要することとな
る。ところが、蛍光標本の退色は短時間で生じるため、
このような調整をしている間に退色が進行し、良好な状
態で標本を観察できなくなる問題を有している。

【０００７】本発明は、このような従来の問題点を考慮
してなされたものであり、標本に励起光を照射しなくて
も、正確な励起光量比の調整が可能な蛍光顕微鏡を提供
することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、請求項１の発明は、２種以上の蛍光を発する多重染
色標本を励起する２種以上の励起波長の励起光を発する
光源と、この光源と対物レンズとの間に配置され、２種
以上の励起波長の励起光のそれぞれの光量を測定する測
定手段と、この測定手段の測定値に基づいて前記対物レ
ンズに入射する２種以上の励起波長の光量比を調整する
調整手段とを備えていることを特徴としている。

【０００９】この発明では、励起波長の光量を測定する
測定手段を対物レンズと光源の間の光路に設けて光量を
測定し、この測定値に基づいて調整手段が励起波長の光
量比を調整するため、標本に励起光を照射することな
く、励起光の光量比を調整することができる。このた
め、光量比の調整と標本の観察とを別個に行うことがで
き、光量比の調整中に標本が退色することがなくなる。

【００１０】請求項２の発明は、請求項１記載の発明で
あって、前記光源が複数の波長の光を同時に発する単一
光源であることを特徴とする。

【００１１】光源を単一光源とすることによって、構成
が簡単となる。また、単一光源の持つ使用時間や、管電
流により励起光量比が変化するという問題点も、請求項
１記載の光量比調整により対応が容易となる。

【００１２】請求項３の発明は、請求項１又は２のいず
れかに記載の発明であって、前記励起光と蛍光観察光と
を分離する光学素子が前記対物レンズと光源の間の光路
内に挿入され、前記測定手段は、前記励起光がこの光学
素子を通過した後から前記対物レンズに入射するまでの
光路内に配置されていることを特徴とする。

【００１３】測定手段が、励起光と蛍光観察光とを分離
する光学素子と対物レンズとの間の光路内に配置される
ため、波長特性のある光学素子の影響をうけない。ま
た、測定手段が対物レンズに接近して設けられる。この
ため、対物レンズを通過して標本に入射する光に極めて
近い光量を測定でき、正確な光量比が可能となる。

【００１４】

【発明の実施の形態】

（実施の形態１）図１は、本発明の実施の形態１の構
成、図２〜図４は前記光量バランサの各々の回転位置と
の励起光の温度特性を示す。この実施の形態１は、走査
型レーザ顕微鏡に適用したものであり、光源１として４
８８ｎｍ、５６８ｎｍの２種類の波長の光を同時発振す
るＫｒＡｒレーザを用いている。

【００１５】光源１の光路上には、光源１から発振した
レーザビームの径を所望の大きさに拡大するビームエク
スパンダ２及び４８８ｎｍ、５６８ｎｍの２つの波長の
光量比を可変する励起光量バランサ３が配置されてい
る。励起光量バランサ３は、点線及び実線で示すように
光路内で回転可能となっている。

【００１６】そして、励起光量バランサ３が３ａで示す
ように光軸に対して直角な状態に配置された時の特性は
図２に示すように、４８８ｎｍの波長光の透過率が極め
て低く、５６８ｎｍの波長光の透過率が高くなる。励起
光量バランサ３が光軸に対して傾けて３ｂに位置した場
合の特性は、図３に示すように、４８８ｎｍ、５６８ｎ
ｍの波長光の透過率が共に高くなる。さらに、励起光量
バランサ３を３ｃの位置まで光軸に対して傾けた場合の
特性は、図４に示すように、４８８ｎｍの波長光の透過
率が高く、５６８ｎｍの波長光の透過率が極めて低くな
る。

【００１７】このようなことから、波長４８８ｎｍ、５
６８ｎｍの間では、位置３ａの状態から位置３ｂの状態
までは、５６８ｎｍに対する４８８ｎｍの光量比が徐々
に増大し、位置３ｂの状態から位置３ｃの状態までは４
８８ｎｍに対する５６８ｎｍの波長光の光量比が徐々に
減少する。従って、励起光量バランサ３を位置３ａの状
態から位置３ｂ、３ｃに徐々に回転させることにより、
４８８ｎｍ、５６８ｎｍの２種の波長光の光量比を連続
的に変化させることがことが可能となる。

【００１８】このような励起光量バランサ３の出射側に
は、反射ミラー４、ダイクロイックミラー５が配置され
ている。図５は、ダイクロイックミラー５の透過率特性
を示し、励起波長である４８８ｎｍ、５６８ｎｍの波長
光を反射する一方、４８８ｎｍの波長光によって励起さ
れる蛍光色素（Ｆｉｔｃ）が発する蛍光５１０〜５４０
ｎｍ近辺及び５６８ｎｍの波長光により励起される蛍光
色素（ローダミン）等の蛍光５８０〜６２０ｎｍ近辺の
波長帯域を透過する。

【００１９】このダイクロイックミラー５の反射光の光
路上には、レーザビームを標本上で２次元平面に走査さ
せるガルバノミラー６が配置されている。この内、６ａ
はＹガルバノミラー、６ｂはＹガルバノミラーと直交す
る方向にレーザビームを走査するＸガルバノミラーであ
る。ガルバノミラー６の反射光の光路上には、反射ミラ
ー７、瞳投影レンズ８、結像レンズ９、対物レンズ１０
が順に配置されている。なお、瞳投影レンズ８及び結像
レンズ９により、ガルバノミラー６は対物レンズ１０の
瞳と共役に近い位置関係となっている。１１はＦｉｔｃ
とローダミンによって染色された２重染色標本である。

【００２０】１２は、ダイクロイックミラー５とＹガル
バノミラー６ａで反射したレーザビーム（励起光）に含
まれる４８８ｎｍと５６８ｎｍの各々の波長光の光量を
測定する光量測定光路である。この光量測定光路１２へ
は、Ｙガルバノミラー６ａの角度を標本１１上の２次元
走査に用いる回転角の範囲外に回転させることにより、
レーザビームを導くことができる。この光路１２には、
４８８ｎｍの波長光を反射し、５６８ｎｍの波長光を透
過する特性を有したダイクロックミラー１３が配置さ
れ、このダイクロイックミラー１３の反射光（波長４８
８ｎｍの光）の光路１４ａ及び透過光（波長５６８ｎｍ
の光）の光路１４ｂ上には、フォトセンサー等の光検出
器１５ａ、１５ｂがそれぞれ配置されて、光量が測定さ
れる。

【００２１】また、ダイクロイックミラー５の左方の透
過光路上にはコンフォーカル結像レンズ１６、反射ミラ
ー１７が配置され、反射ミラー１７の反射光の光路上に
は、ピンホール開口１８が位置している。ピンホール開
口１８は、コンフォーカル結像レンズ１６の焦点位置で
あり、かつ標本１１と共役な位置となっている。

【００２２】このピンホール開口１８の後側には、Ｆｉ
ｔｃが発する発する波長５１０〜５４０ｎｍ近辺の蛍光
を反射し、ローダミンが発する波長５８０〜６２０ｎｍ
近辺の蛍光を透過する特性を有した測光ダイクロイック
ミラ１９が配置されている。２０、２１はホトマルチプ
ライヤ（光検出器）であり、２２、２３はレーザの反射
光等不要な光を遮断するバリアフィルタである。

【００２３】次に、以上の構成の動作について説明す
る。図１において、ＫｒＡｒレーザ１から発振した４８
８、５６８ｎｍの各波長の光は、ビームエクスパンダ２
により所望の大きさの径に拡大される。この光は、励起
光量バランサ３を透過し、反射ミラー４で反射される。
そして、ダイクロイックミラー５によって４８８ｎｍ、
５６８ｎｍの波長光が共に反射されてＸ，Ｙガルバノミ
ラー６ａ、６ｂにより偏向される。偏向された光は、反
射ミラー７、瞳投影レンズ８、結像レンズ９を通り、対
物レンズ１０により標本１１上にスポットを結ぶ。

【００２４】このため、４８８ｎｍの励起波長により発
せられる蛍光色素Ｆｉｔｃ及び５６８ｎｍの励起波長に
より発せられる蛍光色素ローダミンが標本１１から発光
する。この標本１１からの光は、上述したものと逆の光
路をたどり、対物レンズ１０、結像レンズ９、瞳投影レ
ンズ８を透過し、反射ミラー７、Ｘ、Ｙガルバノミラー
６ａ、６ｂで反射されてダイクロイックミラー５に達す
る。

【００２５】ダイクロイックミラー５は図５に示す特性
を有しているため、Ｆｉｔｃが発した蛍光５１０〜５４
０ｎｍの範囲の光とローダミンが発した波長５８０〜６
２０ｎｍの範囲の蛍光が透過する。透過した蛍光は、コ
ンフォーカル結像レンズ１６によりピンホール開口１８
上に結像される。そして、ピンホール開口１８を透過し
たＦｉｔｃからの波長５１０〜５４０ｎｍの蛍光は測光
ダイクロイックミラー１９により反射されてホトマルチ
プライヤ２０で検出される。また、ピンホール開口１８
を透過したローダミンからの波長５８０〜６２０ｎｍの
蛍光は、測光ダイクロイックミラー１９を透過し、ホト
マルチプライヤ２１で検出される。

【００２６】ホトマルチプライヤ２０、２１で検出され
た光は電気信号に変換され、図示しないモニター上に表
示される。この場合、ホトマルチプライヤ２０の光強度
は緑色、２１の光強度は赤色の擬似カラーで信号強度に
応じて階調表示される。次に、ホトマルチプライヤ２０
で検出されるＦｉｔｃの緑色とホトマルチプライヤ２１
で検出されるローダミンの赤色の明るさの比を適切にす
るために励起光量比を調節する方法を示す。ＫｒＡｒレ
ーザ１から発振される４８８ｎｍ、５６８ｎｍの各励起
光の光量比を適切にして、蛍光クロストークを除去する
とともに、適切な明るさを得るために、励起光量バラン
サ３の回転角を調整する。

【００２７】すなわち、Ｙガルバノミラー６ａを回動さ
せて波長４８８ｎｍ及び５６８ｎｍの励起光を光量測定
光路１２へ導き、ダイクロイックミラー１３により波長
４８８ｎｍの光を反射させてフォトセンサー１５ａへ導
き、５６８ｎｍの光をフォトセンサー１５ｂへ導き、そ
れぞれの励起光量を測定する。そして、その光量比が標
本１１を励起するのに適切となるように励起光量バラン
サ３の回転角を調整する。通常４８８ｎｍと５６８ｎｍ
の波長の励起光量比は、標本１１の種類や蛍光色素の種
類によってほぼ決まっている。

【００２８】このように蛍光観察の前処理段階で、標本
１１に励起光を照射することなく励起光量バランサの調
整が可能となり、調整中の励起光による標本１１へのダ
メージがなくなる。また、光源１としてＫｒＡｒレーザ
光源を用いた場合には４８８ｎｍ、５６８ｎｍの波長の
それぞれの発振強度の比が寿命によって変化したり、レ
ーザ光源の管電流を変化させて総合パワー（４８８ｎ
ｍ、５６８ｎｍ等の合計出力）を上下させることによっ
て４８８ｎｍ、５６８ｎｍのそれぞれの波長光の発振強
度比が変化した時の光量比調整の場合にも、レーザビー
ムを標本１１に照射することなく行うことができる。

【００２９】また、仮に標本１１の染色状態等により画
像で得られた結果に満足できないことがあっても、おお
まかな励起光量比設定が終了しているので、その後に画
像を見ながら短時間で調整を行うことができる。このた
め、標本の退色を少なくできる。さらに、光量比だけで
なく、光量の絶対値の調整を合わせて行うこともレーザ
光源の管電流を変化させたり、ビームエクスパンダ２と
励起光量バランサ３の間に調光用減光フィルタを投入す
ることによって簡単に行うことができる。

【００３０】（実施の形態２）図６は、本発明の実施の
形態２を示す。実施の形態１では４８８ｎｍと５６８ｎ
ｍの励起光をダイクロイックミラー１３で２つの光路に
分けて２つのフォトセンサー１５ａ、１５ｂでそれぞの
波長の光量を測定したが、この実施の形態２ではフォト
センサーを１つにして４８８ｎｍの波長光のみを透過す
るレーザラインフィルタと５６８ｎｍの波長光のみを透
過するレーザラインフィルタを切り換えて光路に挿脱す
るものである。これにより１つのフォトセンサーで２つ
の波長の光量を測定することができる。

【００３１】図６において、実施の形態１と同じ機能の
部材には同一の符号を付して対応させてある。光量測定
光路１２には、波長４８８ｎｍの光のみを透過するレー
ザラインフィルタ２４ａと波長５６８ｎｍのみの光を透
過するレーザラインフィルタ２４ｂとを有したスライダ
２４が配置されている。このスライダ２４は光路１２と
交差する方向にスライドすることによってレーザライン
フィルタ２４ａ、２４ｂを切り換えて光路１２上に配置
するものである。２５は光検出を行うフォトセンサーで
ある。

【００３２】図６は２つの照明用励起波長（４８８ｎ
ｍ、５６８ｎｍ）の光量を測定している状態を示し、Ｙ
ガルバノミラー６ａを実施の形態１と同様に回動させて
波長４８８ｎｍ、５６８ｎｍの励起光を光量測定光路１
２へ導いている。ＫｒＡｒレーザ光源１から発振した波
長４８８ｎｍ、５６８ｎｍのレーザビームは、実施の形
態１（図１）と同様にビームエクスパンダ２、励起光量
バランサ３、反射ミラー４、ダイクロイックミラー５、
Ｙガルバノミラー６ａを介して光量測定光路１２へ導か
れる。

【００３３】光量測定光路１２では、レーザラインフィ
ルタ２４ａを光路１２内に配置させて（図６の状態）、
波長４８８ｎｍの光だけを透過させ、その光量をフォト
センサ２５で測定する。次に、スライダ２４を矢印２４
ｄ方向にスライドさせて、レーザラインフィルタ２４ｂ
を光路１２内に配置し、波長５６８ｎｍの光だけを透過
させて、その光量を測定する。

【００３４】これらの４８８ｎｍの波長の光量と５６８
ｎｍの波長の光量の比を計算し、この光量比が観察する
標本の種類、蛍光色素の種類に応じて適切となるように
励起光量バランサ３の回転角を調整する。これにより実
施形態１と同様に標本１１に励起光を照射することな
く、光量比の調整が可能であり、調整時の標本への励起
光（レーザ）照射によるダメージや退色を防ぐことがで
きる。また、フォトセンサが単一のため、構造が簡単と
なると共に、小型化できる。

【００３５】（実施の形態３）図７は、本発明の実施の
形態３を示す。この実施の形態では、励起光量バランサ
３をパルスモータ３１によって回転させて目標の光量比
になるように制御するものである。励起光量バランサ３
を回転させるパルスモータ３１の回転角は、フォトセン
サー１５ａ、１５ｂの出力により制御される。

【００３６】図７に示すように、励起光量バランサ３は
パルスモータ３１の回転軸に取り付けられており、パル
スモータ３１の駆動により回転可能となっている。ＣＰ
Ｕ３２はフォトセンサー１５ａ、１５ｂの信号を演算
し、パルスモータ３１へ回転角の指示を出力する。この
ＣＰＵ３２には、光量比の目標設定値が入力される。

【００３７】この実施の形態では、実施の形態１と同様
に、ＫｒＡｒレーザ光源１から発振した波長４８８ｎｍ
と５６８ｎｍの励起光はビームエクスパンダ２、励起光
量バランサ３、反射ミラー４、ダイクロイックミラー
５、Ｙガルバノミラー６ａを介して光量測定光路１２へ
導かれる。そして、ダイクロイックミラー１３により４
８８ｎｍはフォトセンサー１５ａへ、５６８ｎｍはフォ
トセンサ１５ｂへ導かれて、その光量が検出される。検
出された光量はＣＰＵ３２に出力され、ＣＰＵ３２はフ
ォトセンサー１５ａ、１５ｂの出力値からパルスモータ
３１の回転角を算出する。

【００３８】図８は、このＣＰＵ３２の作動のアルゴリ
ズムである。まず、既知のデータから目標光量比Ｓを決
定し、この目標光量比ＳをＣＰＵ３２に入力する（ステ
ップ３３）。次に、励起光量バランサ３の回転角が光軸
に対して直角になるように、すなわち３ａの位置になる
ようにパルスモータ３１を回転するようにＣＰＵ３２か
ら指令を行う（ステップ３４）。その後、フォトセンサ
出力Ａ（波長４８８ｎｍ）、Ｂ（波長５６８ｎｍ）を測
定し（ステップ３５）、光量比Ａ／Ｂ＝Ｃを計算する
（ステップ３６）。この光量比Ｃを入力されている目標
光量比Ｓで割り、その値がＣ／Ｓ≧０．９５であるか判
断する（ステップ３７）。

【００３９】通常では、励起バランサ３ａの位置は４８
８ｎｍの透過率が最も低い状態、すなわちＡ／Ｂが最も
小さい状態であるため、Ｃ／Ｓは最も小さい値になって
いる。そこでＣ／Ｓが０．９５未満の場合は、励起光量
バランサ３を左方向に、１ステップ分のパルスにより回
転させる（ステップ３８）。これにより、４８８ｎｍの
透過率が少し上昇し、光量比Ａ／Ｂ＝Ｃも大きくなる。
その後、再度ステップ３５のフォトセンサ出力Ａ、Ｂの
測定を繰り返す。

【００４０】以上のようにして目標光量比Ｓに対する実
際の光量比Ｃの誤差が５％以内になった時点で終了し、
励起光量バランサ３の回転角を決定する。このような操
作によって、標本１１に励起光（レーザ）を照射するこ
となく、自動制御での４８８ｎｍと５６８ｎｍの光の励
起光量比の調整が可能となり、調整中に標本１１が退色
することを防止することができる。

【００４１】なお、本実施の形態では、目標光量比Ｓに
対する実際の光量比Ｃの誤差を５％以内に設定している
が、この誤差はパルスモータの１パルスの回転幅とその
時の励起光量バランサ３の回転による透過率の変化量か
ら任意に設定することができるものである。また、パル
スモータ３１に代えて、ＤＣサーボモータによって励起
光量バランサ３を回転させても良い。

【００４２】（実施の形態４）図９は、本発明の実施の
形態４を示す。この実施の形態では、４８８ｎｍと５６
８ｎｍの波長の光量比を調整する励起光量バランサをタ
ーレット上に配置された複数の干渉フィルタに代えたも
のである。

【００４３】図９において、ターレット４１、４２は、
ビームエクスパンダ２からの光の光路上に配置されてい
る。一方のターレット４１には、図１０（ａ）で示すよ
うに、５６８ｎｍの波長光に対しては高い透過率を有す
ると共に、４８８ｎｍの波長光に対しては透過率を段階
的に減少させる特性を有した複数の干渉フィルタ４１
ｂ、４１ｃ、４１ｄ、４１ｅ、４１ｆが同一円上に配置
されている。４１ａはターレット４１に形成された空穴
である。他方のターレット４２には、図１０（ｂ）で示
すように、４８８ｎｍの波長光に対しては高い透過率を
有すると共に、５６８ｎｍの波長光に対しては透過率を
段階的に減少させる特性の複数の干渉フィルタ４２ｂ、
４２ｃ、４２ｄ、４２ｅ、４２ｆが同一円上に配置され
ている。４２ａはターレット４２に形成された空穴４２
ａである。

【００４４】図１１は、これらのターレット４１、４２
に設けられた干渉フィルタの特性を示す。２つのターレ
ット４１、４２に配置された干渉フィルタ及び空穴を２
つのターレット４１、４２を回転させて光路上で組み合
わせることにより、フォトセンサー１５ａで検出する４
８８ｎｍの励起光の光量と、フォトセンサー１５ｂで検
出する５６８ｎｍの励起光の光量の光量比を調整するこ
とができる。これにより、実施の形態１と同様の効果が
得られる。また励起光量バランサ３よりも透過率固定の
干渉フィルタのため、実施の形態１の励起光量バランサ
３よりも容易に設計及び製造することができる。

【００４５】（実施の形態５）図１２は、実施の形態５
を示す。実施の形態１では４８８ｎｍと５６８ｎｍの励
起波長の光量を測定するため専用のフォトセンサー１５
ａ、１５ｂを用いているのに対して、この実施の形態で
は、観察用のフォトマルチプライヤによって測定するも
のである。

【００４６】図１２において、反射ミラー４と、ダイク
ロイックミラー５の間の光路には、反射ミラー４３が挿
入されている。この反射ミラー４３の反射光の光路及び
反射ミラー１７の反射光の光路の重複点には、反射ミラ
ー４４が挿入されている。又、ピンホール開口１８は光
路から退避している。さらに、Ｆｉｔｃが発した蛍光
（５１０〜５４０ｎｍ）とローダミンが発した蛍光（５
８０〜６２０ｎｍ）を分離する測光ダイクロイックミラ
ー１９が光路から退避しており、これに代えて４８８ｎ
ｍの波長光を反射し、５６８ｎｍの波長光を透過する特
性を有したダイクロイックミラー４５が光路に挿入され
ている。加えて、バリアフィルタ２３、２４が光路から
退避されている。

【００４７】この実施の形態では、ＫｒＡｒレーザ光源
１から発振した４８８ｎｍと５６８ｎｍの励起波長の光
は、ビームエクスパンダ２で所望の径のビームに拡大さ
れる。この光は、励起光量バランサ３を透過した後、反
射ミラー４で反射し、さらに反射ミラー４３、４４によ
ってホトマルチプライヤ２０、２１への光路へ導かれ
る。

【００４８】４８８ｎｍの波長光はダイクロイックミラ
ー４５で反射されホトマルチプライヤ２０で検出され、
５６８ｎｍの波長光はダイクロイックミラー４５を透過
した後、ホトマルチプライヤ２１で検出され、これによ
って光量比が測定される。この光量比が適切となるよう
励起光量バランサ３の回転角を調整する。

【００４９】この光量比の設定が終了した時点で、反射
ミラー４３、４４を点線４３ａ、４４ａの位置に退避さ
せると共に、ピンホール開口１８を光路上に挿入し、さ
らにダイクロイックミラー４５をダイクロイックミラー
１９と切り換え、更にバリアフィルタ２３、２４を光路
上に挿入することにより走査型レーザー顕微鏡での画像
観察を行う。これにより、この実施の形態でも４８８ｎ
ｍと５６８ｎｍの波長光の励起光量比を標本１１に照射
することなく調整でき、実施の形態１と同様の効果が得
られる。また、実施の形態１のように励起光量測定用の
専用の検出器を用いずに観察用の検出器によって励起光
量の測定ができるため、構造が簡単となる。

【００５０】（実施の形態６）図１３は、実施の形態６
を示す。この実施の形態では、実施の形態１の励起光測
定用のフォトセンサ１５ａ、１５ｂを、結像レンズ９と
対物レンズ１０の間に設けるものである。

【００５１】図１３において、４６は励起光測定用ユニ
ットであり、結像レンズ９と対物レンズ１０の平行光の
間に挿入されている。この励起光測定用ユニット４６
は、反射ミラー４７を備えている。反射ミラー４７の反
光路である励起光測定光路４８には、集光レンズ４９
と、４８８ｎｍの波長光を反射して５６８ｎｍの波長光
を透過するダイクロイックミラー５０が配置されてい
る。さらに、ダイクロイックミラー５０の反射光路に
は、４８８ｎｍの波長光を測定するフォトセンサ５１ａ
が、ダイクロイックミラー５０の透過光路上には、５６
８ｎｍの波長光を測定するフォトセンサー５１ｂが配置
されている。なお、反射ミラー４７は、励起光測定時は
結像レンズ９と対物レンズ１０の光路上に配置され、標
本１１の観察の時は、点線４７ａで示す位置に退避され
る。

【００５２】この実施の形態では、ＫｒＡｒレーザ光源
１から発振した４８８ｎｍと５６８ｎｍの波長の２つの
励起光はビームエクスパンダ２、励起光量バランサ３、
反射ミラー４、ダイクロイックミラー５、Ｘ，Ｙガルバ
ノミラー６、反射ミラー７、瞳投影レンズ８、結像レン
ズ９を介して励起光測定用ユニット４６に入射する。励
起光測定用ユニット４６では、反射ミラー４７により測
定用光路４８へ反射されて集光レンズ４９で集光され
る。そして、４８８ｎｍの波長の光はダイクロイックミ
ラー５０で反射されてフォトセンサー５１ａに導かれ、
５６８ｎｍの波長の光はダイクロイックミラー５０を透
過してフォトセンサー５１ｂに導かれ、それぞれの波長
の光量が測定される。

【００５３】この測定された光量比を見ながら励起光量
バランサ３の回転角を調整し、２つの励起波長の光量比
を設定する。従って、この本実施の形態においても、実
施の形態１と同様に標本１１に励起光（レーザ）を照射
することなく、光量比の調整が可能となり、標本の退色
を防止できる。また、励起光測定用ユニット４６を走査
型レーザー顕微鏡のスキャナ部（光偏向ミラーやフォト
マルチプライヤのある部分）から独立して設けているた
め、スキャナ部を小さくできる。

【００５４】さらに、この実施の形態では、標本１１に
光を集光する対物レンズ１０に接近した位置に励起光測
定用ユニット４６を配置して光量比を測定するため、光
量比を測定する光が標本１１に入射する光に極めて近い
光量となっている。このため、光量比をさらに正確に測
定することができる。

【００５５】（実施の形態７）図１４は実施の形態７を
示す。この実施の形態では、光源として４８８ｎｍ、５
６８ｎｍ、６４７ｎｍの３波長を同時に発振するＫｒＡ
ｒレーザ５２を使用し、標本にはＦｉｔｃとローダミン
とシアニン５とによって蛍光標識された３重染色標本を
用いるものである。

【００５６】ＫｒＡｒレーザ光源５２は、４８８、５６
８、６４７ｎｍの３つの波長光を同時に発振する。５
３、５４は励起光量バランサであり、当初においては、
５３ａ、５４ａで示すように、光軸に対して直角に配置
されている。

【００５７】図１５は、これらの励起光量バランサの各
回転位置での透過特性を示している光路に対して直交し
た位置５３ａ、５４ａにおいて、励起光量バランサ５３
は図１５（ａ）の５３ａで示すように４８８、５６８、
６４７ｎｍの波長光の全てを高い透過率で透過する。こ
れに対して、励起光量バランサ５４は図１５（ａ）の５
４ａで示すように４８８ｎｍ及び６４７ｎｍの波長光を
高い透過率で透過する一方、波長５６８ｎｍの波長光に
対しては透過率が極めて低い特性になる。

【００５８】この状態から励起光量バランサ５３、５４
を５３ｃ、５４ｃの状態に回転させると、図１５（ｂ）
のような特性となる。すなわち、５３ｃの位置で、励起
光量バランサ５３は４８８ｎｍ、５６８ｎｍの波長光を
高い透過率で透過する一方、６４７ｎｍの波長光の透過
率が極めて低くなる。これに対し、５４ｃの位置で励起
光量バランサ５４は５６８ｎｍ、６４７ｎｍの波長光を
高い透過率で透過する一方、４８８ｎｍの波長光の透過
率が極めて低くなる。

【００５９】このように励起光量バランサ５３では、回
転角を５３ａから５３ｃに徐々に変化させることによ
り、４８８ｎｍ、５６８ｎｍの波長光の透過率を一定に
保ったまま、６４７ｎｍの波長光の透過率を徐々に減少
させることができる。また、励起光量バランサ５４で
は、回転角を５４ａから５４ｃに徐々に変化させること
により４８８ｎｍの波長光の透過率を一定にして、５６
８ｎｍの波長光の透過率を徐々に増加させることがで
き、ある地点からは逆に５６８ｎｍ波長光の透過率を一
定にして、４８８ｎｍの波長の透過率を徐々に減少させ
ることができる。従って、励起光量バランサ５３、５４
の回転角を調整することにより４８８ｎｍと５６８ｎｍ
と６４７ｎｍの波長光の光量比を調整することができ
る。

【００６０】図１４において、反射ミラー４の反射光の
光路上には、ダイクロイックミラー５５が配置されてい
る。このダイクロイックミラー５５は、４８８ｎｍと５
６８ｎｍと６４７ｎｍの波長光を反射し、４８８ｎｍの
波長光により励起されるＦｉｔｃの蛍光（波長５１０〜
５４０ｎｍ）、５６８ｎｍにより励起されるローダミン
の蛍光（波長５８０〜６２０ｎｍ）及び６４７ｎｍによ
り励起されるシアニンの蛍光（波長６６０〜６９０ｎ
ｍ）を透過する特性を有している。

【００６１】このダイクロイックミラー５５の反射光の
光路上には、ＸＹガルバノミラー６及び反射ミラー７が
配置されている。これに対して、ダイクロイックミラー
５５の透過光の光路上には、コンフォーカル結像レンズ
１６、反射ミラー１７、ピンホール開口１８が図１と同
様に配置されている。これに続く測光ダイクロイックミ
ラー５６は、Ｆｉｔｃの発した蛍光（波長５１０〜５４
０ｎｍ）を反射し、ローダミンが発した蛍光（波長５８
０〜６２０ｎｍ）及びシアニンの発した蛍光（６６０〜
６９０ｎｍ）を透過する。次の測光ダイクロイックミラ
ー５７は、ローダミンの発した蛍光（波長５８０〜６２
０ｎｍ）を反射し、シアニンの発した蛍光（波長６６０
〜７００ｎｍ）を透過する。

【００６２】これらの測光ダイクロイックミラー５６、
５７には、ホトマルチプライヤ５８、５９、６０が対向
するように配置されている。また、それぞれのホトマル
チプライヤ５８、５９、６０の前面には、レーザの反射
光等の不要な光をカットするバリアフィルタ６７、６
８、６９が配置されている。

【００６３】ＸＹガルバノミラー６側における６１は、
励起光測定用の光路であり、Ｙガルバノミラー６ａを回
転させることにより導かれる。この光路６１上には、４
８８ｎｍの波長光を反射して、５６８、６４７ｎｍの波
長光を透過するダイクロイックミラー６２と、５６８ｎ
ｍの波長光を反射し６４７ｎｍの波長光を透過するダイ
クロイックミラー６３が配置されており、フォトセンサ
ー６４、６５、６６は、４８８ｎｍ、５６８ｎｍ、６４
７ｎｍの各励起光を測定する。

【００６４】この実施の形態の作動は、ＫｒＡｒレーザ
光源５２から発振した波長４８８、５６８、６４７ｎｍ
の励起光（レーザ）は、ビームエグスパンダ２、励起光
量バランサ５３、５４、反射ミラー４を介してダイクロ
イックミラー５５に導かれ、ダイクロイックミラー５５
によって反射される。そして、ＸＹガルバノミラー６、
反射ミラー７によって反射されて図示しない３重染色標
本上にスポットを結ぶ。この標本から発したＦｉｔｃ
（波長５１０〜５４０ｎｍ）、ローダミン（波長５８０
〜６２０ｎｍ）、シアニン（波長６６０〜７００ｎｍ）
の蛍光は、逆の光路を戻り、ダイクロイックミラー５５
を透過する。

【００６５】この透過光は、コンフォーカル結像レンズ
１６によりピンホール開口１８上に結像し、ピンホール
開口１８を通過する。測光ダイクロイックミラー５６で
は、Ｆｉｔｃの発した蛍光（波長５１０〜５４０ｎｍ）
を反射し、ホトマルチプライヤ５８に導く。一方、ロー
ダミンの発した蛍光（波長５８０〜６２０ｎｍ）及びシ
アニンの発した蛍光（波長６６０〜７００ｎｍ）は、測
光ダイクロイックミラー５６を透過する。そして測光ダ
イクロイックミラー５７によりローダミンの発した蛍光
が反射されて、ホトマルチプライヤ５９に導かれ、シア
ニンの発した蛍光（波長６６０〜７００ｎｍ）は測光ダ
イクロイックミラー５７を透過してホトマルチプライヤ
６０に導かれる。これらの３つのホトマルチプライヤ５
８、５９、６０で受光した蛍光強度を図示しないモニタ
ー等に色分けして階調表示することにより３重染色標本
の画像が得られる。

【００６６】本実施の形態の励起光量の測定では、Ｋｒ
Ａｒレーザ光源５２が発振した４８８ｎｍ、５６８ｎ
ｍ、６４７ｎｍの各励起波長の光はビームエクスパンダ
２、励起光量バランサ５３、５４、反射ミラー４を通り
ダイクロイックミラー５５で反射され、Ｙガルバノミラ
ー６ａにより光路６１に導かれる。ダイクロイックミラ
ー６２により４８８ｎｍの波長光は反射されフォトセン
サー６４により光量測定される。このダイクロイックミ
ラー６２を透過した５６８ｎｍ、６４７ｎｍの波長光は
ダイクロイックミラー６３に達し、同ミラー６３により
５６８ｎｍの波長光が反射されてフォトセンサー６５に
導かれ、６４７ｎｍの波長光は透過してフォトセンサー
６６に導かれ、それぞれ光量測定される。

【００６７】従って、フォトセンサー６４、６５、６６
の測定値を見ながら励起光量バランサ５３、５４を回転
を調整し、４８８ｎｍ、５６８ｎｍ、６４７ｎｍの光量
比を適切に調整できる。このため、４８８ｎｍ、５６８
ｎｍ、６４７ｎｍの各励起光の光量比を標本に照射する
ことなく調整できるので、調整中の退色を防止すること
ができる。

【００６８】（実施の形態８）本実施の形態は、光源に
水銀灯を使用し、Ｆｉｔｃとローダミンで２重染色され
た標本を励起する狭帯域２ケ所の励起光をバンドパスフ
ィルタにより取り出し、その光量比を励起光量バランサ
で調整するものであり、図１８に示す従来の構成に対
し、２狭帯域の波長の励起光量を測定するユニットをダ
イクロイックミラーと対物レンズの間のアフォーカル光
部に挿入するものである。

【００６９】図１６は、この実施の形態の構成を示し、
落射照明ユニット７１及び励起光量測定用ユニット８６
が光路内に挿入されている。落射照明ユニット７１は、
水銀灯７２、レンズ７３、励起光量バランサ７４、ＡＳ
絞り７５、ＦＳ絞り７６、レンズ７７、狭帯域のバンド
パスフィルタ７８及びダイクロイックミラー７９が内部
に順に配置されることによって構成されている。

【００７０】図１７は、バンドパスフィルタ７８の特性
を示し、Ｂ励起部７８ａ及びＧ励起部７８ｂで４８０ｎ
ｍと５５０ｎｍを中心波長として、２つの波長狭帯域を
透過させる。一方、励起光量バランサ７４の特性は、光
軸に対して直交しているとき（７４ａの状態）、図１７
の符号７４ａに示したように、５５０ｎｍを中心とする
波長域（Ｇ励起）は高い透過率となり、４８０ｎｍを中
心とする波長域（Ｂ励起）は透過率が極めて低い。ま
た、光軸に対して傾ける（７４ｃの状態）と、図１７の
符号７４ｃに示したように５５０ｎｍを中心とする波長
域（Ｇ励起）は透過率が極めて低くなり、４８０ｎｍ
（Ｂ励起）を中心とする波長域は透過率が高くなる。従
って、励起光量バランサ７４を７４ａから７４ｃの方向
に徐々に回転させることによりバンドパスフィルタ７８
により選択された２つの狭帯域波長（Ｂ励起とＧ励起）
の光量比を徐々に変化させることができる。

【００７１】落射照明ユニット７１内のダイクロイック
ミラー７９は、Ｂ、Ｇ励起の各波長域の光を反射し、Ｂ
励起により励起されるＦｉｔｃの発する蛍光とＧ励起に
より励起されるローダミンの発する蛍光を透過する。図
１６において、８０は対物レンズ、８１はＦｉｔｃとロ
ーダミンで２重染色された標本である。８２は結像レン
ズ、８３は光路切り換えプリズムであり、光路を目視観
察光路８４、ＴＶ、写真光路８５に分ける。

【００７２】励起光量測定用ユニット８６は、、ミラー
８７を光路上に配置することにより、落射照明ユニット
７１のダイクロイックミラー７９で反射したＢ、Ｇ励起
の光を反射して励起光測定光路８８にへ導く。通常の観
察の時は、ミラー８７は図中８７ａの位置に退避させら
れ、励起光が対物レンズ８０、標本８１へ導かれるよう
になっている。８９はＢ励起の波長域を反射し、Ｇ励起
の波長域を透過するダイクロイックミラー、９０ａ、９
０ｂはフォトセンサーである。

【００７３】次に、本実施の形態の動作について説明す
る。水銀灯７２から放射した光はレンズ７３、励起光量
バランサ７４、ＡＳ絞り７５、ＦＳ絞り７６、レンズ７
７、バンドパスフィルタ７８を透過し、４８０ｎｍを中
心とするＢ励起の光と、５５０ｎｍを中心とするＧ励起
の光が取り出される。この光は、ダイクロイックミラー
７９で反射され、励起光量測定ユニット８６内に入射す
る。

【００７４】励起光量測定ユニット８６内では、ミラー
８７によって反射されることにより励起光測定光路８８
へ導かれる。Ｂ励起光はダイクロイックミラー８９で反
射され、フォトセンサ９０ａに導かれ、Ｇ励起光はダイ
クロイックミラー８９を透過してフォトセンサ９０ｂに
導かれる。これらの２つのフォトセンサ９０ａ、９０ｂ
の測定値より光量比を求め、その光量比を見ながら励起
光量バランサ７４を回転調整することにより、標本に励
起光を照射することなく所望の光量比に調整できる。

【００７５】従って、標本の種類、蛍光色素に合わせた
励起光量比の設定や経時変化で水銀灯の輝線を含めた輝
度が変化しても常に同一の励起光量比の設定が可能とな
り、調整中に標本を退色させることを防止できる。ま
た、アフォーカル光学系に励起光量測定ユニット７１を
挿入しているので、このユニットをはずしても光学性能
を確保でき、システムアップでそのユニットを追加する
ことが容易にできる。

【００７６】以上の実施の形態では、光源を単体として
いるが、例えば、波長４８８ｎｍの光を発するＡｒレー
ザ及び波長５４３ｎｍの光を発するＨｅＮｅ−Ｇレーザ
などの２つ以上の光源を併用しても良い、この場合に
は、レーザの出射口が別個となっているため、それぞれ
の出射口にＮＤフィルターを配置して光量比を調整する
ことによって光量比の調整が可能となる。

【００７７】

【発明の効果】請求項１の発明によれば、励起波長の光
量を測定する測定手段を対物レンズの上流側に設けて光
量を測定し、この測定値に基づいて調整手段が励起波長
の光量比を調整するため、標本に励起光を照射すること
なく、励起光の光量比を調整することができる。このた
め、光量比の調整と標本の観察とを別個に行うことがで
き、光量比の調整中に標本が退色することがなくなる。

【００７８】請求項２の発明によれば、光源を単一にで
きるので、構成が簡単となる。また、単一光源の持つ使
用時間や、管電流により励起光量比が変化するという問
題点も請求項１の発明の光量比調整により対応が容易と
なる。

【００７９】請求項３の発明によれば、測定手段が対物
レンズに接近して設けられるため、対物レンズを通過し
て標本に入射する光に極めて近似した性質の光を測定で
き、正確な測定が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施の形態１の構成を示す光路図であ
る。

【図２】実施の形態１の励起光量バランサの透過率特性
図である。

【図３】実施の形態１の励起光量バランサの透過率特性
図である。

【図４】実施の形態１の励起光量バランサの透過率特性
図である。

【図５】実施の形態１のダイクロイックミラーの透過率
特性図である。

【図６】実施の形態２の構成を示す光路図である。

【図７】実施の形態３の構成を示す光路図である。

【図８】実施の形態３に使用するＣＰＵの制御を示すフ
ローチャートである。

【図９】実施の形態４の構成を示す光路図である。

【図１０】（ａ）及び（ｂ）は、実施の形態４で使用す
るターレットの正面図である。

【図１１】実施の形態４のターレットの特性図である。

【図１２】実施の形態５の構成を示す光路図である。

【図１３】実施の形態６の構成を示す光路図である。

【図１４】実施の形態７の構成を示す光路図である。

【図１５】（ａ）、（ｂ）は、実施の形態７の励起光量
バランサの透過率特性図である。

【図１６】実施の形態８の構成を示す光路図である。

【図１７】実施の形態８に使用するバンドパスフィルタ
の特性図である。

【図１８】従来の落射蛍光顕微鏡の光路図である。

【符号の説明】

１ＫｒＡｒレーザ光源３励起光量バランサ６ＸＹガルバノミラー１０対物レンズ１２光量測定光路１３ダイクロイックミラー１５ａ１５ｂフォトセンサ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】２種以上の蛍光を発する多重染色標本を
励起する２種以上の励起波長の励起光を発する光源と、この光源と対物レンズとの間に配置され、２種以上の励
起波長の励起光のそれぞれの光量を測定する測定手段
と、この測定手段の測定値に基づいて前記対物レンズに入射
する２種以上の励起波長の光量比を調整する調整手段と
を備えていることを特徴とする蛍光顕微鏡。
【請求項２】前記光源が複数の波長の光を同時に発す
る単一光源であることを特徴とする請求項１記載の蛍光
顕微鏡。
【請求項３】前記励起光と蛍光観察光とを分離する光
学素子が前記光源と対物レンズの間の路内に挿入され、
前記測定手段は、前記励起光がこの光学素子を通過した
後から前記対物レンズに入射するまでの光路内に配置さ
れていることを特徴とする請求項１又は２記載の蛍光顕
微鏡。