JPH1096697A

JPH1096697A - 蛍光顕微鏡装置

Info

Publication number: JPH1096697A
Application number: JP28664597A
Authority: JP
Inventors: Akira Tamagawa; 彰玉川; Kazuo Ozaki; 一穂尾崎; Toru Makino; 徹牧野; Atsuo Miyagawa; 厚夫宮川
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1997-10-20
Filing date: 1997-10-20
Publication date: 1998-04-14

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明の課題は、蛍光顕微鏡や画像処理装置
等を組合わせて用いて高速で画像処理を行い、細胞内の
カルシウムイオン濃度や水素イオン濃度等のイオン濃度
や巨大分子濃度を、平面的な濃度分布として把握し得る
蛍光顕微鏡装置を提供するものである。【解決手段】透過波長の異なる複数の干渉フィルタ５
からなるフィルタユニット６のうちの所望のフィルタ５
を光軸上に選択配置する移動台２７と、選択配置された
干渉フィルタ５を通した励起光をサンプル１０へ投射
し、得られる透過光又は反射光を光軸上に配置されたエ
ミッションフィルタ１９に通し、撮像された異なる二つ
の波長の励起光による蛍光像の強度から画素毎の強度の
比を求め、サンプル１０の各位置の蛍光強度の比の分布
を示す像を形成して出力する画像処理装置を備える。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、細胞のカルシウム
イオン濃度や水素イオン濃度等を平面的に測定する蛍光
顕微鏡装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】最近、神経科学や細胞生物学分野におけ
る新しい研究手法として、細胞内遊離カルシウムイオン
濃度を定量する方法が、急速に広がっている。しかる
に、例えば細胞の代謝機能を研究する場合、細胞内に蛍
光物質を導入して蛍光顕微鏡により観察し、同時に蛍光
強度を測定することにより定量することは重要な方法で
ある。こうした方法により生きた細胞内のカルシウムイ
オン濃度に限らず、生きた細胞内の水素イオン濃度等の
ようなイオン濃度や、巨大分子（蛋白質，核酸）が測定
されている。この場合、測定のための蛍光性プローブと
装置の開発が重要となる。

【０００３】ところで、生きた細胞内イオン濃度の測定
の場合、夫々のイオンと特異的に結合し、結合により励
起スペクトルや蛍光スペクトルの変化する様なプローブ
が用いられる。一方、蛋白質や核酸のような巨大分子の
場合は、蛍光物質をこれら巨大分子に共有的に結合し、
定量される。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従来、細胞内の例えば
カルシウムイオン濃度を測定するときは、サンプルであ
る細胞に例えば蛍光試薬fura−２を投与した後、この蛍
光試薬とカルシウムイオンとが特異的に結合して励起ス
ペクトルが変化するのを分光蛍光光度計により測定又は
顕微鏡により観察することによりおこなっていた。な
お、顕微鏡による観察は、蛍光像上の円形の微少領域内
の蛍光量変化を測光することにより行っていた。

【０００５】しかしながら、従来のこうした測定方法で
は、細胞中のカルシウムイオン濃度を部分的には測定す
ることができるが、平面的な濃度分布を得ることはでき
ない。また、仮に平面的な濃度分布を得ようとして測定
を行えばかなり多くの点でサンプルを採取して顕微鏡に
よる観察を行わなければならず、多大な観察時間を必要
とする。

【０００６】本発明は、上記事情に鑑みてなされたもの
で、蛍光顕微鏡や画像処理装置等を組合わせて用いて高
速で画像処理を行い、細胞内のカルシウムイオン濃度や
水素イオン濃度等のイオン濃度や巨大分子濃度を、平面
的な濃度分布として把握し得る蛍光顕微鏡装置を提供す
ることを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】請求項１に記載の発明
は、光源と、この光源からの光軸に配置され透過波長の
異なる複数の干渉フィルタからなる励起光用フィルタユ
ニットと、この励起光用フィルタユニットのうちの所望
の干渉フィルタを光軸上に選択配置するための励起フィ
ルタ切換装置と、前記選択配置された励起光用の干渉フ
ィルタを通過した励起光をサンプルへ投射して得られる
サンプルからの透過光または反射光の光軸上に配置され
た蛍光用干渉フィルタと、この蛍光用干渉フィルタを通
過した蛍光像を撮像し、撮像された異なる二つの波長の
励起光による蛍光像の強度から画素毎の強度の比を求
め、サンプルの各位置の蛍光強度の比の分布を示す像を
形成して出力する画像処理装置とを具備することを特徴
とする。

【０００８】また、請求項１の前記蛍光用干渉フィルタ
は、透過波長の異なる複数の干渉フィルタからなり、該
複数の干渉フィルタからなる蛍光用フィルタユニット
と、この蛍光用フィルタユニットのうちの所望の干渉フ
ィルタを光軸上に選択配置するための蛍光フィルタ切換
装置とを備えているのが好ましい。

【０００９】請求項３に記載の発明は、光源と、この光
源からの光軸上に配置された励起光用干渉フィルタと、
前記励起光用の干渉フィルタを通過した励起光をサンプ
ルへ投射して得られるサンプルからの透過光または反射
光の光軸上に配置され、透過波長の異なる複数の干渉フ
ィルタからなる蛍光用フィルタユニットと、この蛍光用
フィルタユニットのうちの所望の干渉フィルタを光軸上
に選択配置する蛍光フィルタ切換装置と、前記選択配置
された蛍光用の干渉フィルタを通過した蛍光像を撮像し
て画像処理する画像処理装置とを具備することを特徴と
する。

【００１０】また、請求項１、２又は３の前記画像処理
装置は、予め入力された濃度と蛍光強度比との関係を基
に、求めた比を対応した濃度に変換し、サンプルの各位
置の濃度分布を示す像を形成して出力するのが好まし
い。

【００１１】さらに、請求項１、２、３又は４の前記画
像処理装置は、撮像する蛍光像の蛍光の明るさによって
積算回数を決めるのが好ましい。また、請求項１、２、
３又は４の前記画像処理装置は、蛍光強度の比又は濃度
の値に応じた疑似カラーが与えられ、画像データを疑似
カラーで出力するのが好ましい。

【００１２】また、請求項１、２、３又は４の蛍光顕微
鏡装置は、顕微鏡観察用の透過照明装置を備えるのが好
ましい。また、請求項１、２、３又は４記載の蛍光顕微
鏡装置は、前記励起フィルタ切換装置に防振手段を備え
るのが好ましい。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明において、細胞を顕微鏡で
観察するときは細胞に予め蛍光試薬を投与するが、かか
る蛍光試薬としては次のものが挙げられる。

【００１４】1）カルシウムイオン濃度の測定の場合；
商品名fura−２，商品名Quin−２，商品名Indo−１（下
記式（Ｉ））、いずれもモレキュラープローブス社
（製）ここで、上記Indo−１を利用したカルシウムイオン濃度
測定の場合、その分光特性により後に詳述するfura−２
と比べ次のような違いがある。即ち、fura−２の場合カ
ルシウムイオン濃度に応じて励起スペクトルの変化がみ
られるが、Indo−１の場合蛍光スペクトルが図１２に示
す如く変化する。つまり、340nmで励起すると図１２の
ような蛍光スペクトルが得られ、カルシウムイオン濃度
に応じて400nm付近で最も大きく変化し、460nmでは変化
しない。また、460nmから550nmの範囲では逆向きの変化
をする。そこで、励起光の波長を固定しておき蛍光側で
二つの波長を選択することにより、二波長測定が可能と
なる。波長の組合せは、410nmと460nm，または410nmと4
80nmが選ばれる。細胞への導入法はIndo−１／ＡＭを用
い、fura−２の場合と同じである。また、ＮＤフィルタ
を利用して二波長間の比を調整する点もfura−２の利用
の場合と同じである。更に、画像を得たあとの処理も全
く同じである。なお、ステッピングモータのコントロー
ルはfura−２の場合と同様にパーソナルコンピューター
により行われる。

【００１５】

【数１】

【００１６】2）ｐＨ測定の場合；商品名ＢＣＥＣ
Ｆ（２′，７′−Biscarboxyethyl carboxy fluorescei
n、モレキュラープローブス社（製）） 3）膜電位の測定の場合；S tyryl系色素、例えばＲＨ 4
21，ＲＨ 460（A.Grinvald，et al，Biophys，J，198
2，pp301−308）本発明の作用について、カルシウムイオン濃度測定の場
合について以下に述べる。

【００１７】（1）蛍光指示薬の投与まず、神経系の株化細胞（ＮＧ 1O8，Ｎ 115）、グリア
由来の株化細胞（Ｃ６Ｂｕ−１）に蛍光試薬fura−２
（細胞の外から投与し、細胞内に導入できるようにアセ
トキシメチルエステル化された誘導体fura−２／ＡＭを
導入した。このfura−２の構造は、下記式（II）に示す
通りである。

【００１８】

【数２】

【００１９】上記式（II）に示すfura−２は、カルシウ
ムイオンと特異的に結合し、図８に示す様な励起スペク
トルの変化が見られる。なお、蛍光スペクトルは510nm
にシングルピークをもち、バンドパスは10nmである。図
８から明らかのように、カルシウムの変化に対し異なる
波長で異なった強度変化が起こる場合、二波長測定が有
効であり、異なる二つの波長で励起し、夫々の蛍光強度
の比を求めることにより定量する。ここで、二波長測定
は蛍光指示薬の濃度，照明強度のばらつき，蛍光指示薬
の滅衰を標準化できる。また、二波長のうち、一点は大
きく変化する波長（図８の場合、波長340nm励起）で、
他の一点は変化しない波長（360nm；カルシウム依存性
のない点）又は逆向きの変化をする波長（380nm）が選
ばれる。

【００２０】ところで、励起光として340nmと360nmを選
択した場合、図８に従えば蛍光強度の比（Ｉ₃₄₀／
Ｉ₃₆₀）はカルシウム濃度により0．64〜1．89の間で変
化する。但し、図９は蛍光分光光度計での測定値であ
り、測定装置，方法により変化する。特に、本発明の場
合の様に顕微鏡を用いると、光源，レンズ，反射鏡の波
長特性により、Ｉ₃₄₀／Ｉ₃₆₀比が図８とは異なる値とな
る。そこで、励起光強度を濃淡フィルタ（Neutral Dens
ity Filter）を用いて調節し、蛍光強度の比がカルシウ
ム濃度の変化する範囲の中心で約1．0となるようにす
る。こうすることにより、使用するカメラのダイナミッ
クレンジを、図９に示す如く有効に利用できる。なお、
蛍光物質を用いて測定をする場合、励起による蛍光の減
衰が問題となる。つまり、図１０の最少検出値以下にな
れば出力の変化が小さく、測定不能となる。従って、励
起光量を出来るだけ少なくし、また光の当たっている時
間を最少にする必要がある。

【００２１】（２）細胞内のカルシウムイオン濃度及び
分布の時間的変化の測定；即ち、測定光340nmと、リフ
ァレンス光360nmを目的とする時間内に移動させ、二波
長測定をする。このとき前述したＴＶカメラ（ＳＩＴ）
の積算時間内は各干渉フィルタ，ＮＤフィルタを停止さ
せる機能が必要である。つまり、連続的に340nm又は360
nm等の波長の光を細胞に照射する様なことを最時間する
と、細胞内の蛍光色素fura−２の蛍光が減衰してしま
い、測定に不利になる。従って、ＴＶカメラの積算時間
外では、細胞標本に励起光が照射されない様に前述した
シャッターなどを必要とする。また、各波長でのＴＶカ
メラの積算時間，測定間隔時間は、細胞内カルシウム濃
度の変化具合やfura−２濃度等の実験条件により、様様
に変化する。そのため、これらの時間はプログラム的及
びメカニカル的にも対応がとれる様にする事が重要であ
る。しかるに、本発明の場合、上記の内容をパソコンヘ
ユーザーが入力指示する事により自動的に実施させる様
に構成されている。

【００２２】即ち本発明によれば、光源からの光のうち
励起光用フィルタユニットにより選択された波長の光だ
けがサンプルに投射される。励起光用フィルタユニット
は透過波長の異なる複数の干渉フィルタを切換装置によ
り任意に切換えられるから波長の切換えが高速かつ容易
にでき、例えば前述のfura−２を用いたカルシウムイオ
ン濃度測定のような、複数の異なる波長を励起光として
用いる二波長測定が簡単に行える。また、サンプルから
得られる透過光または反射光は、蛍光用干渉フィルタを
介して画像処理装置により撮像、画像処理される。得ら
れる試料像は画像処理装置で処理されるため、画像の二
次元的な強度分布などの分析も迅速かつ容易に行える。

【００２３】また、この蛍光顕微鏡装置において蛍光用
干渉フィルタを複数の干渉フィルタを切換可能な蛍光用
フィルタユニットとすることで、試料からの光を複数の
異なる波長で評価する二波長測定も簡単にできるように
なる。

【００２４】さらに、励起光用フィルタユニットにおい
て干渉フィルタに応じたＮＤフィルタを干渉フィルタに
一体的に取付けておくことにより、干渉フィルタの切換
えに伴ってＮＤフィルタが同時に切換わるから、選択し
た透過波長のそれぞれの光量は常に適正に保たれる。

【００２５】また、前述した発明とは逆に、所定の一つ
の波長の光を励起光として用い、試料からの蛍光の波長
を蛍光用フィルタユニットにより任意に選択することが
できるので、例えば前述のIndo−１を用いたカルシウム
イオン濃度測定のように、試料からの蛍光を複数の異な
る波長で評価する二波長測定が簡単に行える。得られる
試料像は、前述した発明と同様に画像処理装置で処理さ
れるため、画像の二次元的な強度分布などの分析も迅速
かつ容易に行える。（第１実施形態）以下、本発明の第1実施形態について
図１〜図６及び図１０を参照して説明する。ここで、図
１は本発明に係る蛍光顕微鏡装置のブロック図、図２は
同装置の概略図、図３は同装置の光学系を示す平面図、
図４は図３のＡ矢視図、図５は前記装置のフィルタユニ
ット周辺の斜視図、図６は上記装置の下部の説明図、図
１０はカルシウムイオン濃度と蛍光強度比との関係を示
す特性図である。

【００２６】図中の１は、内部に光源としてめＨｇラン
プ２を内蔵した落射蛍光照明装置である。ここで、光源
はＨｇランプ以外に必要な波長を放射するものであれば
良く、例えばＸｅランプなども使用できる。この照明装
置１には投光管３が連結され、該投光管３内でかつ前記
Ｈｇランプ２の光軸上にはＮＤフィルタ４ａと干渉フィ
ルタ５からなるフイルタユニット６が配置されている。
図１に示すフィルタユニット６は、ＮＤフィルタ４ａと
干渉フィルタ５を離間して光路中に配置した一例を示し
てある。ここで、前記ＮＤフィルタ４ａは、各波長での
透過率を調整するために使用する。また、前記投光管３
の先端には、図５に示すように後記対物レンズを変えた
ときの補正を目的に使用される（例えば透過率0％，25
％，40％，100％の）ＮＤフィルタ４ｂが複数個設けら
れて、そのうちの一つが光路中に挿入可能にスライダ等
によって切換えられるようになっている。前記Ｈｇラン
プ２の光軸上には、ダイクロイックミラー７が設けられ
ている。ここで、このダイクロイックミラー７は、前記
ランプ２からの光束を対物レンズ８を通してステージ９
上のサンプル１０に照射するとともに、サンプル１０か
らの蛍光を通過させる機能を有する。

【００２７】前記ダイクロイックミラー７の下方には図
３、図４に示すようにエミッションフィルタ１９及び前
記サンプル１０からの蛍光を切換える光路切換部が設け
られ、この光路切換部にはビームスプリッター１１が内
蔵されている。ここで、このビ−ムスプリッター１１に
より、前記サンプル１０からの蛍光のうち20％がミラー
６０を介して図３に示す接眼レンズ１２へ、残りの80％
が図４に示すＴＶカメラ（ＳＩＴ）１３へ送られ撮像さ
れる。

【００２８】このＴＶカメラ１３には、ＴＶカメラコン
トロール機能とデータ処理機能をもつイメージプロセッ
サ１４が連結されている。このイメージプロセッサ１４
には、ＲＡＭディスクを内蔵したコンピュータ１５，モ
ニタ１６，プリンタ１７が順次接続されている。ここ
で、前記コンピュータ１５は、ステッピングモータ１８
のＯＮ，ＯＦＦを行わせるとともに、データの記憶を行
う。なお、図１中の１９は510nm付近の波長の蛍光のみ
を通過させるエミッションフィルタであり、図２中の２
０は透過照明装置である。

【００２９】なお、第１実施形態でのフィルタユニット
６は、図１に示すようにＮＤフィルタ４ａと干渉フィル
タ５を離間して配置し、それぞれをステッピングモータ
１８，１８で駆動するようにしたが、図７に示す如く、
フィルタ枠４１内に押さえ４２により干渉フィルタ４
４，ＮＤフィルタ４５を一体的に組合わせて取付けた構
造のものでもよい。

【００３０】また、本装置の下部は図６に示すようにな
っている。同図において、２１はベース２２に固定され
た顕微鏡本体である。前記ベース２２上には脚２３が固
定され、この脚２３には計４ケ（片側の脚２３に２ケ）
の防振手段、例えばゴム（以下、防振ゴム）２４を介し
て装置べース２５が固定されている。この装置べース２
５上には、リニアベアリングでレールと移動ブロックを
組合わせたリニアガイドの１本のガイドレール２６が固
定されている。このガイドレール２６には２ケの移動ブ
ロックが組込まれていて移動台２７を直線案内するよう
になっている。この移動台２７にはラック２８が取付け
られ、前記装置べース２５上に防振ゴム２９を介して設
けられたモータ３０のピニオン３１の回転により移動台
２７を駆動するようになっている。こうした防振対策に
より、顕微鏡ステージ上にガラス毛細針をセットし、測
定対象の細胞内に前記ガラス毛細針を進入させた状態で
フィルタユニットを駆動させても、モータ及びメカの振
動の伝達（毛細針への）を防ぐことができ、細胞内のｐ
Ｈ，電位等を同時に測定することが可能になる。なお、
上記の様な防振対策なしでガラス毛細針を細胞内にさし
てフィルタユニットを動かすと、振動により細胞膜がや
ぶれることがある。

【００３１】次に、上述した蛍光顕微鏡装置の画像デー
夕入力システムについて説明する。（１）測定前処理測定条件の入力，及び測定条件ファイルの作成・修正・
保存・削除を、コンピュータ１５で行う。

【００３２】（イ）測定条件ファイルの作成；メモリ上
の測定条件テーブルを作成し、必要ならばファィル名を
入力し、測定条件ファイルとしてフロッピーヘ保存す
る。この際、測定条件としては次の〜が挙げられ
る。

【００３３】ＴＶカメラの積算回数；1〜32000回で、
これにより測定時間が決まる。なお、積算回数は、細胞
の明るさによって決めるもので、明るければ回数を少な
く、暗けれければ回数を多くする。

【００３４】測定時間；1／30秒×積算回数以上測定回数；59以下測定波長；340nm及び360nm又は360nm ＮＤフィルタの選択測定波長の選択画素配列；縦，横ともに最大512 （ロ）測定条件ファイルの修正；フロッピーより測定条
件ファイルを選択し、メモリ上に測定条件テーブルを展
開し、その修正を行い、必要ならばフロッピーへの保存
を行う。なお、測定条件は前記〜である。

【００３５】（ハ）測定条件ファイルの削除；フロッピ
ーより測定条件ファイルを指定し、削除する。（ニ）測定条件のプリンタ出力；フロッピーより測定条
件ファイルを指定し、その内容をプリンタ出力する。

【００３６】（２）測定処理；測定を行い、その画像デ
ータをＴＶカメラより入力し、コンピュータにとり込
む。（３）画像デー夕保存；画像データをフロッピーヘセー
ブする。

【００３７】（４）画像データ出力；画像デー夕をモニ
タ画面に出力し、またモニタ画面のカラーハードコピー
も行なえる。次に、上記システムのソフトウェアについ
て説明する。ここで、このソフトウェアは、下記の５ケ
のメニューに別れる。

【００３８】（１）自由観察；画面からの指示によっ
て、顕微鏡のフィルタを操作し、ピントチェックを行
い、予めカルシウムイオン濃度測定用の蛍光試薬（fura
−２）が投与された細胞を観察する。

【００３９】（２）測定条件登録；自動測定を行うため
の条件を、画面より登録する。（３）自動測定；測定条件に従い、細胞のカルシウムイ
オン濃度を測定し、フレームメモリに書込まれた画像デ
ータを、コンピュータ１５に内蔵したＲＡＭディスクに
保存する。

【００４０】（４）データF D保存；自動測定により作
成されたＲＡＭディスク内の画像データを、フロッピー
ディスクに保存する。（５）デー夕表示；ＲＡＭディスクあるいはフロッピー
ディスクにある画像データを、グラフィック画面に疑似
カラーで出力する。なお、表示中の画像データのカラー
ハードコピーが可能である。フロッピーディスクに保存
された各波長（340nmと360nm）の画像は、画像処理プロ
グラムに従って対応する画素間で比が求められ、予め入
力されている検量線（図１０参照）によりカルシウムイ
オン濃度に変換される。そして、濃度に応じた疑似カラ
ーが与えられ、カルシウムイオン濃度分布図が得られ
る。

【００４１】しかして、上記実施形態に係る蛍光顕微鏡
装置によれば、Ｈｇランプ２を有した落射蛍光照明装置
１、干渉フィルタ５，ＮＤフィルタ４ａから構成される
フィルタユニット６、ダイクロイックミラー７、ビーム
スプリッタ１１、及びＴＶカメラ１３，イメージプロセ
ッサー１４，コンピュー夕１５，モニタ１６，プリンタ
１７などからなる画像処理装置から構成されているた
め、画像データをグラフィック画面に疑似カラーで出力
し、これにより高速で画像処理しながら細胞内のカルシ
ウムイオン濃度を平面的な濃度分布として観察すること
ができる。事実、本発明装置により撮影したカルシウム
イオン濃度分布の模式図は、例えば図１１のように表示
される。なお、同図には３つの細胞，，が存在し
ており、例えば各点（Ａ〜Ｅ）のカルシウム濃度（／n
M）はＡ；94．1、Ｂ；82．7、Ｃ；110／6、Ｄ；90．3、
Ｅ；30．9であり、色分けにより各点の濃度が同時に判
別できるようになっている（但し、図１１は模式図の為
色分けは省略している）。（第２実施形態）上記実施形
態では、510nm付近の波長の蛍光のみを通過させるエミ
ッションフィルタを用いる場合について述べたが、これ
に限らず、例えば図１３及び図１４に示すように上記エ
ミッションフィルタの代わりにステッピングモータ５１
に直結した円板状のフィルタホルダー５２を遮光用ボッ
クス内５３内にとりつけてもよい。このホルダー５２に
は例えば３ケのフィルタ装着用穴５４ａ，５４ｂ，５４
ｃがあり、この穴のうち一箇所には例えば410nm（波長
幅10〜20nm）、他の一箇所には460nm（波長幅10〜20n
m）の干渉フィルタ４４を夫々ＮＤフィルタ４５に重ね
て装着し、残りの装着用穴はfura−２測定のとき利用す
るようにフィルタを装着しない（100％透過）。このよ
うにすれば、410nmと460nmでの蛍光像の間で比を求め、
図１５に示すカルシウムイオン濃度と蛍光強度比との関
係を示す特性図によりカルシウムイオン濃度を求めるこ
とができる。ところで、励起光はfura−２で用いて340n
mの干渉フィルタを利用することにより得られる。な
お、図１４において図中の５５はフィルタ位置決め用セ
ンサ、５６は結像用レンズ、５７はモータ支えである。

【００４２】

【発明の効果】以上詳述した如く本発明によれば、蛍光
顕微鏡や画像処理装置等を組合わせて用いて高速で画像
処理を行い、細胞内のカルシウムイオン濃度や水素イオ
ン濃度等のイオン濃度や巨大分子濃度を、平面的な濃度
分布として把握し得る蛍光顕微鏡装置を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明の第１実施形態に係る蛍光顕微鏡
装置のブロック図である。

【図２】図２は本発明の第１実施形態に係る蛍光顕微鏡
装置の概略図である。

【図３】図３は本発明の第１実施形態に係る蛍光顕微鏡
装置の光学系を示す平面図である。

【図４】図４は図３に示す蛍光顕微鏡装置のＡ矢視図で
ある。

【図５】図５は本発明の第１実施形態に係る蛍光顕微鏡
装置のフィルタユニット周辺の斜視図である。

【図６】図６は本発明の第１実施形態に係る蛍光顕微鏡
装置のフィルタユニット下部の説明図である。

【図７】図７は本発明に係るフィルタユニットの他の例
を示す断面図である。

【図８】図８は蛍光指示薬fura−２による励起スペクト
ル特性図である。

【図９】図９はＴＶカメラの入力−出力特性図である。

【図１０】図１０はカルシウムイオン濃度と蛍光強度比
との関係を示す特性図である。

【図１１】図１１は本発明に係る蛍光顕微鏡装置により
撮影したカルシウムイオン濃度分布の模式図である。

【図１２】図１２は蛍光強度と波長との関係を示す特性
図である。

【図１３】図１３は本発明の第２実施形態に係る蛍光顕
微鏡装置のフィルタ周辺部の説明図である。

【図１４】図１４は本発明の第２実施形態に係る蛍光顕
微鏡装置のフィルタ周辺部の説明図である。

【図１５】図１５はカルシウムイオン濃度と蛍光強度比
との関係を示す特性図である。

【符号の説明】

１落射蛍光照明装置２Ｈｇランプ３投光管４ａ，４ｂ，４ｃＮＤフイルタ５，４４干渉フィルタ６フィルタユニット７ダイクロイックフィルタ８対物レンズ１０サンプル１１ビームスプリッター１２接眼レンズ１３ＴＶカメラ１４イメージプロセッサ１５コンピュー夕１６モニタ１７プリンタ１８，５１ステッピングモータ２４，２９防振ゴム２８ラック３０モータ

フロントページの続き (72)発明者宮川厚夫東京都渋谷区幡ヶ谷２丁目43番２号オリンパス光学工業株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】光源と、この光源からの光軸に配置され透過波長の異なる複数の
干渉フィルタからなる励起光用フィルタユニットと、この励起光用フィルタユニットのうちの所望の干渉フィ
ルタを光軸上に選択配置するための励起フィルタ切換装
置と、前記選択配置された励起光用の干渉フィルタを通過した
励起光をサンプルへ投射して得られるサンプルからの透
過光または反射光の光軸上に配置された蛍光用干渉フィ
ルタと、この蛍光用干渉フィルタを通過した蛍光像を撮像し、撮
像された異なる二つの波長の励起光による蛍光像の強度
から画素毎の強度の比を求め、サンプルの各位置の蛍光
強度の比の分布を示す像を形成して出力する画像処理装
置とを具備することを特徴とする蛍光顕微鏡装置。
【請求項２】前記蛍光用干渉フィルタは、透過波長の
異なる複数の干渉フィルタからなり、該複数の干渉フィルタからなる蛍光用フィルタユニット
と、この蛍光用フィルタユニットのうちの所望の干渉フィル
タを光軸上に選択配置するための蛍光フィルタ切換装置
とを備えていることを特徴とする請求項１記載の蛍光顕
微鏡装置。
【請求項３】光源と、この光源からの光軸上に配置された励起光用干渉フィル
タと、前記励起光用の干渉フィルタを通過した励起光をサンプ
ルへ投射して得られるサンプルからの透過光または反射
光の光軸上に配置され、透過波長の異なる複数の干渉フ
ィルタからなる蛍光用フィルタユニットと、この蛍光用フィルタユニットのうちの所望の干渉フィル
タを光軸上に選択配置する蛍光フィルタ切換装置と、前記選択配置された蛍光用の干渉フィルタを通過した蛍
光像を撮像して画像処理する画像処理装置とを具備する
ことを特徴とする蛍光顕微鏡装置。
【請求項４】前記画像処理装置は、予め入力された濃
度と蛍光強度比との関係を基に、求めた比を対応した濃
度に変換し、サンプルの各位置の濃度分布を示す像を形
成して出力することを特徴とする請求項１、２又は３記
載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項５】前記画像処理装置は、撮像する蛍光像の
蛍光の明るさによって積算回数を決めることを特徴とす
る請求項１、２、３又は４記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項６】前記画像処理装置は、蛍光強度の比又は
濃度の値に応じた疑似カラーが与えられ、画像データを
疑似カラーで出力することを特徴とする請求項１、２、
３又は４記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項７】顕微鏡観察用の透過照明装置を備えたこ
とを特徴とする請求項１、２、３又は４記載の蛍光顕微
鏡装置。
【請求項８】前記励起フィルタ切換装置に防振手段を
備えたことを特徴とする請求項１、２、３又は４記載の
蛍光顕微鏡装置。