JP2003014646A - 蛍光測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 標本から発せられる各蛍光のピーク波長のシ
フトによる蛍光フィルターの最大透過率の波長域とのず
れを修正して、最大の蛍光量を取り込むことができる、
簡単な構成の蛍光測定装置を提供すること。 【解決手段】 光源１からの光束の内の特定の波長を反
射させて標本５に照射し、標本５から発せられる蛍光を
透過するダイクロイックミラー３と、前記蛍光に対応す
る特定の波長域を透過させる蛍光フィルターである干渉
フィルター８と、前記干渉フィルター８を傾斜可能に保
持するフィルター保持部材７と、該干渉フィルター８の
入射面の光軸に対する傾斜角を調整可能なフィルター傾
斜手段を設けたこと。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、医学、生物分野に
おいて、生物組織の観察や遺伝子を解析する蛍光測定装
置に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、生物組織の観察や遺伝子を解析す
る装置においては、標本に添加した蛍光試薬から発せら
れる２種類以上の蛍光を測定する蛍光測定装置を備えて
いるものがある。この蛍光測定装置においては、一般
に、複数の蛍光を取得しようとする場合に、それぞれの
蛍光色素から出る蛍光を観察するために、観察する蛍光
の波長に合った励起フィルター、ダイクロイックミラ
ー、蛍光フィルターのそれぞれを切り替えることにより
蛍光像をビデオメモリ等に記録するという方式を採って
いる。

【０００３】最近、各種の蛍光試薬が開発されており、
それに伴って、この蛍光試薬が標本観察に利用されてき
ている。例えば、最も光強度が強くなる波長（以後、ピ
ーク波長と言う）が近接する２つの蛍光試薬を細胞中に
導入して、それぞれのピーク波長の蛍光が透過する蛍光
フィルターを交換し、それぞれの蛍光強度を受光器で検
出することが行われている。具体的な参考例として、図
７に示すように、ある蛍光試薬Ａのピーク波長が５７０
ｎｍで半値幅１０ｎｍ、別の蛍光試薬Ｂのピーク波長が
６００ｎｍで半値幅が１０ｎｍを同時に使用することが
ある。この場合、２つの蛍光を分離するために半値幅が
狭い蛍光フィルターが必要になる。使用する蛍光フィル
ターはピーク波長が５７０ｎｍで半値幅が５ｎｍ、もう
１つの蛍光フィルターはピーク波長が６００ｎｍ、半値
幅が５ｎｍのフィルターを使用して２つの蛍光波長を分
離する。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
上記蛍光測定装置においては、例えば、標本に２種類の
蛍光試薬を添加した場合、波長が５ｎｍシフトすると蛍
光フィルターの透過率が小さくなってしまうので、受光
器で検出できる斜線部で示す蛍光量Ａ１、Ｂ１が低下
し、特に、微弱光を検出する場合に測定の感度が低下し
てしまう。このように、ピーク波長が近接する２つの蛍
光試薬Ａ、Ｂを用いて蛍光波長を検出する場合に、半値
幅が狭い蛍光フィルターを使用すると、検出する蛍光量
が少なくなって測定の感度が低下してしまうという問題
点があった。

【０００５】さらに、蛍光試薬Ａ、Ｂを励起した際に発
せられる蛍光波長は製造のバラツキにより蛍光波長のピ
ークが標準値より±５ｎｍ程度シフトしてしまうことが
ある。例えば、図８に示すように、６００ｎｍにピーク
波長を持つ蛍光試薬Ｂが、製造のバラツキによりピーク
波長が５９５ｎｍへずれた場合、ピーク波長６００ｎｍ
用の蛍光フィルターにより取得できる蛍光量は斜線部で
示す蛍光量Ｂ２となり、この蛍光量Ｂ２は製造バラツキ
が無い時の蛍光量Ｂ１（図７参照）よりも１／３程度減
少してしまうという問題点があった。当然、標本に１種
類の蛍光試薬を添加する場合にもピークのシフトの問題
は生じる。

【０００６】本発明は、上述した従来例の有する不都合
を改善し、標本から発せられる各蛍光のピーク波長のシ
フトによる蛍光フィルターの最大透過率の波長域のずれ
を修正して、最大の蛍光量を取り込むことができる、簡
単な構成の蛍光測定装置を提供することを課題としてい
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記課題を達成するため
に、請求項１では、光源からの光束の内の特定の波長を
反射させて標本に照射し、標本から発せられる蛍光を透
過するダイクロイックミラーと、前記蛍光に対応する特
定の波長域を透過させる蛍光フィルターである干渉フィ
ルターと、前記蛍光フィルターを傾斜可能に保持するフ
ィルター保持部材と、該蛍光フィルターの入射面の光軸
に対する傾斜角を調整可能なフィルター傾斜手段を設け
たことを特徴としている。

【０００８】また、前記フィルター保持部は、複数の蛍
光フィルターを保持し、前記標本から発せられた蛍光に
応じて、前記複数の蛍光フィルターから１つの蛍光フィ
ルターを選択するフィルター選択手段を備えたことが好
ましい。

【０００９】また、前記フィルター保持部材は円盤形状
であって、前記フィルター選択手段は、このフィルター
保持部材と、このフィルター保持部材の中心部を支持
し、当該保持部材を任意に回転可能とする回転駆動手段
とから成っており、この回転駆動手段で前記フィルター
保持部材を回転させて前記蛍光フィルターの選択を行う
ことが好ましい。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明の一実施形態を図面に基づ
いて説明する。図１は本発明の一実施形態を示す蛍光測
定装置の光学配置図、図２は図１の蛍光フィルターのフ
ィルター保持部材および回転機構を示す構成図、図３は
図２のＡ−Ａ断面図、図４は回転機構の他の実施形態を
示す構成図、図５は蛍光フィルターの透過領域のシフト
を示す説明図、図６は蛍光フィルターの透過領域をシフ
トさせた状態を示す特性線図である。

【００１１】図１において、１はレーザ光源、２は光源
１からのレーザ光を平行光束とするためのコレクターレ
ンズ、３は所定の波長以下を反射し、所定の波長以上を
透過するダイクロイックミラー、４は光束を標本５に集
光するための集光レンズであり対物レンズでもある。標
本５は２色以上の蛍光色素で染色されている。６は標本
５の載置台となるステージ、７は円盤形状のフィルター
保持部材であるフィルターホイール（フィルターチェン
ジャーとも呼ばれる）で、このフィルターホイール７に
は特定の波長の蛍光のみを透過させる干渉フィルターか
ら成る蛍光フィルター８（破線内に示す）が複数個取り
付けられている。９は結像レンズ、１０はＣＣＤカメラ
である。蛍光フィルター８はこの実施形態では４個（図
２参照）であるが、これに限定されるものではない。

【００１２】フィルターホイール７に配置された各蛍光
フィルター８は、光軸に対して直交する方向に取り付け
られた軸を中心に回転可能に保持されている。さらに、
フィルターホイール７には、蛍光フィルター８に対する
入射光の入射角度を任意に変位可能な回転機構１３（図
２参照、後述する）が設けられている。

【００１３】上記フィルターホイール７および蛍光フィ
ルター８の回転機構１３について説明する。図２および
図３において、フィルターホイール７の中心７ａは、装
置本体側に設置された回転駆動手段である回転駆動機構
１４に軸支されている。この回転駆動機構１４はモータ
（図示しない）で駆動し、このモータの駆動によって光
軸を通る蛍光フィルター８の交換を任意に行うことがで
きるようになっている。このフィルターホイール７と回
転駆動機構１４によりフィルター選択手段が構成されて
いる。

【００１４】各蛍光フィルター８はリング形状のフィル
ター枠１１に固定されており、各フィルター枠１１はフ
ィルターホイール７に、光軸と直交する方向に延びる軸
１２により回転可能に支持されている。フィルター枠１
１の軸１２はフィルターの径方向に当該フィルター枠１
１に固定されている。本実施形態において、軸１２の方
向はフィルターホイール１７の中心７ａと交わる方向に
軸支されているが、これに限定されるものではなく、任
意の方向に軸支することができる。この軸１２の内、フ
ィルターホイール７の中心７ａに近い方の軸１２ａは同
ホイール７の軸孔に回転自在に内嵌され、外側の軸１２
ｂは同ホイール７の外周側に設置された回転機構１３の
軸に連結・固定されている。この回転機構１３は小型の
ステッピングモータ（図示しない）である。図３に示す
ように、フィルター枠１１は、このステッピングモータ
により回転機構１３を駆動させることによって軸１２を
中心にして任意の角度に傾けられる。このフィルター枠
１１、軸１２、および回転機構１３によりフィルター傾
斜手段が構成されていることが本発明の特徴となってい
る。

【００１５】したがって、回転駆動機構１４や回転機構
１３を外部から電気的に制御することにより、蛍光フィ
ルター８を異なった波長域を透過させる他の蛍光フィル
ターと交換することができると共に、独立して各蛍光フ
ィルター８の傾きが変えられるようになっている。

【００１６】尚、この実施形態では、回転機構１３は、
フィルターホイール７の外周部に、各蛍光フィルター８
毎に設置したが、この構成に限らず、図４に示すよう
に、回転機構１３’を装置本体側に１つだけ設置し、フ
ィルターホイール７が回転して各蛍光フィルター８が回
転機構１３’位置に来た時に、フィルター枠１１の軸１
２ｂと回転機構１３の回転軸とを連動させる構成として
も良い。この場合は、回転機構１３の数を大幅に減らす
ことができるので、低コスト化、省スペース化に寄与す
るものとなる。

【００１７】また、この実施形態でのフィルター選択手
段は、フィルターホイール７と回転駆動機構１４より構
成されるが、これに限らず、蛍光フィルター８を複数個
保持した板状部材をスライドさせてフィルター交換を行
う方式等、他のものも考えられる。また、フィルター傾
斜手段は、各フィルターに備える必要はなく、少なくと
も１つの蛍光フィルターに備えられている構成でも良
い。さらに、この実施形態では、蛍光フィルター８の径
方向の両端部を軸支したが、他の位置を軸支しても良
い。この蛍光フィルター８を傾ける構成はこの実施形態
も含めて種々のものが考えられるが、要するに、蛍光フ
ィルターの入射面を光軸に対して直交する方向から必要
角度だけ傾斜させることができる構成であれば良い。さ
らに、本発明は本実施形態のように複数の蛍光フィルタ
ーを備えたものに限定されず、フィルター傾斜手段を備
えた１つのフィルターを着脱させる構成でも良い。

【００１８】上記構成の蛍光測定装置の動作について説
明する。図1において、レーザ光源１から射出したレー
ザ光は、コレクターレンズ２で平行光束とされ、ダイク
ロイックミラー３で反射されてから集光レンズと共用の
対物レンズ４を介して標本５に照射される。この照明光
により標本５の蛍光試薬が励起されて生じた蛍光は、対
物レンズ４により集光され、ダイクロイックミラー３を
透過後、フィルターホイール７の蛍光フィルター８を透
過するが、この際、蛍光フィルター８により特定の波長
のみが透過される。蛍光フィルター８を透過した光は、
結像レンズ９により集光されてＣＣＤカメラ１０上に結
像され、その受光強度を測定する。

【００１９】標本５に添加する蛍光試薬としては、図７
に示した蛍光強度分布の特性を持つ、蛍光のピーク波長
が５７０ｎｍで発光領域が狭い蛍光試薬Ａと、ピーク波
長が６００ｎｍで発光領域が狭い蛍光試薬Ｂの近接する
２つの蛍光試薬を使用した。この標本５から発せられる
２つの波長の蛍光強度を取得する時に、それぞれの蛍光
フィルター８に他の蛍光が重ならないようにするため、
この実施形態では、ピーク波長が５７０ｎｍで半値幅が
５ｎｍと、もう１つはピーク波長が６００ｎｍで半値幅
が５ｎｍの、非常に鋭いピークで狭い領域を透過する２
つの蛍光フィルター８Ａ、８Ｂを使用する。図７におい
て、この蛍光フィルター８Ａ、８Ｂのそれぞれのピーク
波長が透過する領域である最大透過率の特定波長域も同
様に８Ａ、８Ｂで示している。

【００２０】各蛍光フィルター８Ａ、８Ｂはフィルター
ホイール７のフィルター枠１１に取り付けられており、
フィルターホイール７を回転させて光軸を通る蛍光フィ
ルターを交換しつつ、ＣＣＤカメラ１０で蛍光強度を取
得する。各蛍光フィルター８Ａ、８Ｂを透過する領域は
狭いので、取得できる蛍光量は、図７の斜線部で示すよ
うに蛍光量Ａ１、Ｂ１と比較的小さいものとなる。

【００２１】蛍光フィルター８Ａ、８Ｂは干渉フィルタ
ーから成っているので、光軸に対して蛍光フィルターの
傾きが変わると透過する波長がシフトする特性がある。
つまり、図５に示すように、蛍光のピーク波長が透過す
る領域（最大透過率の特定波長域）もａ（破線）からｂ
（二点鎖線）へシフトすることになる。この時のシフト
する波長は干渉フィルターの干渉条件から求めることが
できる。

【００２２】一般的な干渉フィルターの干渉条件は、蛍
光が当該フィルターに対して最大の透過率を示す時の蛍
光の波長（以後、最大透過率の波長と言う）をλ、干渉
フィルターの厚みをｔ、境界による屈折角をφとする
と、次の式で表すことができる。 ２ｔ・ｃｏｓφ＝ｍλ ここで、ｍを定数とし、干渉条件も一定とした時、波長
λはｃｏｓφに比例する。φは屈折角であるがスネルの
法則により入射角と共役なので入射角と同等と考えて良
い。このことは、入射角φを大きくしていけばｃｏｓφ
の値が小さくなって行くので、同時に波長λも小さく
（短く）なって行くことを意味する。したがって、蛍光
フィルター８における蛍光の最大透過率の波長λは、図
５に示したように、蛍光フィルター８を徐々に傾けて光
軸の入射角を大きくしていくと、ａからｂへ連続的にシ
フトさせることができる。

【００２３】そこで、蛍光試薬Ｂに製造バラツキがある
ために、発せられる蛍光のピーク波長がシフトする（図
８、従来技術参照）ことに合わせて、蛍光フィルター８
Ｂをステッピングモータで回転機構１３を駆動して回転
させ、その入射面を光軸に対して直交する方向から所定
角度だけ傾斜させて光軸の入射面に対する入射角φを大
きくする。これにより、蛍光フィルター８Ｂの最大透過
率の特定波長域を波長の短い方へシフトさせる。すなわ
ち、図６に示すように、蛍光の５９５ｎｍへずれたピー
ク波長と蛍光フィルター８Ｂの最大透過率の特定波長域
とを一致させることにより斜線部で示す蛍光量Ｂ３を取
得することができる。この蛍光量Ｂ３は発光領域が狭い
蛍光試薬Ｂから発せられる蛍光から取得できる最大のも
のである。

【００２４】このように、回転駆動機構１４をモータで
駆動してフィルターホイール７を回転させることによ
り、複数の蛍光試薬Ａ、Ｂから発せられる蛍光のピーク
波長に対応した蛍光フィルター８Ａ等を光軸上に配置す
るフィルター交換を任意に行うことができると共に、そ
れぞれの蛍光フィルター８Ａ等は、独立して、光軸方向
に直交する方向から傾けることができるので、各蛍光試
薬Ａ、Ｂ毎の製造バラツキによるピーク波長のずれに対
応して蛍光フィルターの最大透過率の波長域をシフトさ
せることができ、最大の蛍光量を取り込むことができ
る。

【００２５】また、予め、蛍光測定前に各蛍光のピーク
波長に対応する蛍光フィルターに交換し、それぞれの蛍
光量が最大となるようにフィルターを傾けておくことに
より、測定中において蛍光フィルターを回転させて調整
する必要がなくなり、標本に余分なダメージを与えるこ
ともなく、退色も最小限にすることができる。そのた
め、測定中に蛍光フィルターを交換することがあって
も、余分な時間をかけることなく蛍光の受光量を最大に
することができる。この場合、プレスキャンが必要であ
る。つまり、各蛍光試薬に対して、蛍光フィルターを傾
斜させながら、光源からの光を照射し、蛍光量が最大と
なるところの蛍光フィルターの傾斜度を確認し、これを
記憶する。

【００２６】

【発明の効果】以上説明したように、この発明によれ
ば、複数の蛍光フィルターを、フィルター選択手段の一
部のフィルター保持部材にて傾斜可能に保持し、且つ、
この蛍光フィルターの最大透過率を示す特定波長域をシ
フトするために、当該フィルターの入射面を光軸に対し
て直交する方向から必要角度だけ傾斜させるフィルター
傾斜手段を設けたので、フィルター選択手段により、蛍
光試薬から発せられる蛍光のピーク波長に応じた蛍光フ
ィルターを用いることができ、且つ、この蛍光試薬から
発せられる蛍光のピーク波長が、この試薬の製造バラツ
キによりわずかにシフトすることから生じる蛍光フィル
ターの最大透過率波長域とのずれを、フィルター傾斜手
段により修正できるため、蛍光試薬から発せられる蛍光
のピーク波長が所定の波長からはずれても簡単な構成に
より最大の蛍光量を取得することができる。

【００２７】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施形態を示す蛍光測定装置の光学
配置図。

【図２】図１の蛍光フィルターのフィルター保持部材お
よび回転機構を示す構成図。

【図３】図２のＡ−Ａ断面を示す断面図。

【図４】回転機構の他の実施形態を示す構成図。

【図５】蛍光フィルターの透過領域のシフトを示す説明
図。

【図６】蛍光フィルターの透過領域をシフトさせた状態
を示す特性線図。

【図７】蛍光のピーク波長と蛍光フィルターの透過領域
を示す特性線図。

【図８】蛍光のピーク波長がシフトしてズレが生じた状
態を示す特性線図。

【符号の説明】

１ 光源 ２ コレクターレンズ ３ ダイクロイックミラー ４ 対物レンズ ５ 標本 ７ フィルター保持部材（フィルターホイール） ８、８Ａ、８Ｂ 蛍光フィルター １０ ＣＣＤカメラ １１ フィルター枠 １２ 軸 １３ 回転機構 １４ 回転駆動手段（回転駆動機構）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】光源からの光束の内の特定の波長を反射さ
   せて標本に照射し、標本から発せられる蛍光を透過する
   ダイクロイックミラーと、 前記蛍光に対応する特定の波長域を透過させる蛍光フィ
   ルターである干渉フィルターと、 前記蛍光フィルターを傾斜可能に保持するフィルター保
   持部材と、該蛍光フィルターの入射面の光軸に対する傾
   斜角を調整可能なフィルター傾斜手段を設けたことを特
   徴とする蛍光測定装置。
2. 【請求項２】前記フィルター保持部は、複数の蛍光フィ
   ルターを保持し、前記標本から発せられた蛍光に応じ
   て、前記複数の蛍光フィルターから１つの蛍光フィルタ
   ーを選択するフィルター選択手段を備えたことを特徴と
   する請求項１に記載の蛍光測定装置。
3. 【請求項３】前記フィルター保持部材は円盤形状であっ
   て、前記フィルター選択手段は、このフィルター保持部
   材と、このフィルター保持部材の中心部を支持し、当該
   保持部材を任意に回転可能とする回転駆動手段とから成
   っており、この回転駆動手段で前記フィルター保持部材
   を回転させて前記蛍光フィルターの選択を行うことを特
   徴とする請求項２記載の蛍光測定装置。