JP2009145242A - 光測定装置 - Google Patents

Abstract

【課題】標準の蛍光色素分子を用いずに偏光度を測定する光測定装置を提供する。
【解決手段】波長の異なる偏光を出射する第１及び第２の光源（１）と、この偏光を対象に導く導光光学系と、この偏光によって生ずる対象からの偏光を、偏光面が直交する２つの偏光成分に分離して、それぞれ第１及び第２の光検出器（２）に導く測定光学系と、両光検出器からの検出信号に基づいて試料の偏光度を測定する演算装置とを有し、演算装置は、対象を光を反射する部材とし、第１の光源からの偏光を照射して得られた両光検出器からの検出信号（Ｉ_１，Ｉ_２）及び第１の光源からの偏光の偏光面を９０度回転した偏光を照射して得られた両光検出器からの検出信号（Ｉ^’ _１，Ｉ^’ _２）と、対象を試料を収容した容器とし、第２の光源からの偏光を照射して得られた両光検出器からの検出信号（Ｑ_１，Ｑ_２）とに基づいて試料の偏光度（Ｐ）を算出する光測定装置である。
【選択図】図１

Description

本発明は、所望の分子に蛍光物質を標識した生物学的な試料溶液中に偏光を照射し、蛍光物質から発せられた蛍光の偏光の強度を解析して、試料分子の反応や反応による状態変化を測定する光測定装置及び光測定方法に関する。

近年の光を用いた測定技術の進歩に伴い、生体の細胞内外に極めて小さな光スポットを形成し、細胞内外の分子の挙動を動的に調べる方法が注目されている。例えば、蛍光物質を細胞内のターゲットとする生体分子に標識し、蛍光物質から発せられる蛍光の強度の時間的な変化を解析することにより、分子の溶液中での振舞いを高感度に捉えることができる。

このような解析方法として、蛍光相関分光解析法（Fluorescence Correlation Spectroscopy : FCS）や蛍光強度分布解析法（Fluorescence Intensity Distribution Analysis : FIDA）等が良く用いられている。

ＦＣＳでは、測定したい分子に蛍光物質を標識し、マイクロプレートなど試料容器内に収納する。そして試料容器の試料槽の中にレーザ光を微小な光スポットとして照射して、蛍光物質を励起する。このとき蛍光物質から発せられる蛍光の強度は時間と共にゆらぐ。これは、媒質中の蛍光分子がブラウン運動をしているためである。蛍光分子のブラウン運動の拡散速度は、分子の化学反応や結合反応などにより変化する。従って、蛍光分子の拡散速度は、標識した蛍光分子の見かけの大きさの変化や媒質の温度の変化に伴って変化する。

そこでこの分子の溶液内での化学反応や結合反応などによるブラウン運動の速度の変化を、蛍光の光強度の時系列信号の統計的な変化として捉えて相関解析を行なうことで、分子や微粒子の並進拡散係数や、平均の分子数などを測定することができる。そして、測定結果として分子の化学反応や結合反応などを動的に捉えることができる。

ＦＩＤＡでは、ＦＣＳと同様に測定したい分子に蛍光物質を標識し、マイクロプレートなど試料容器の試料槽の中にレーザ光を微小な光スポットとして照射して、蛍光物質を励起する。そして、単位時間当たりに蛍光物質から発せられる蛍光の光強度を測定し、これの統計分布を解析する。単位時間に検出される蛍光の光子の数の統計分布を解析することによって、蛍光分子の明るさと濃度、即ち、対象とする分子の数と明るさについての情報を得ることができる。この明るさに関する情報を用いることにより、化学反応や結合反応などによる蛍光標識された分子の見かけの大きさの変化を高感度で検出することができる。

さらに偏光を用いたＦＩＤＡ-Polarization（Fluorescence Intensity Distribution Analysis-Polarization）では、例えば、所定の波長の偏光を用いて分子を励起し、発生する蛍光の偏光成分から偏光度を測定することで、回転ブラウン運動を行なう分子の数や分子の見かけの大きさの変化を調べることができる。
さらにＦＩＤＡでは、溶液中で光の照射領域を積極的に移動させて、試料中のできるだけ広い領域で測定を行ない、１回当たりの測定時間を短縮させることもできる。なお、ＦＩＤＡは光強度の統計分布を求めるためにＦＣＳに比べて光照射領域を大きめにとる必要がある。
ＦＩＤＡについては、特許文献１、非特許文献１，２等に記述されている。
米国特許第６，３７６，８４３号 Peet Kask, Kaupo Palo, Dirk Ullmann and Karsten Gall PNAS Nov23, 1999, vol.96, No24, p.13756-13761 Biophysical Journal Vol.79, (2000) p.2858-2866

ところで、蛍光強度の偏光特性である偏光度から、分子の大きさに関する情報を得ることができる１分子蛍光分析の手法であるＦＩＤＡ−ＰＯ測定を行う場合、装置の偏光特性に関する補正因子（Ｇ−factor）をあらかじめ求めておく必要がある。これは、装置を構成する光路中の光学素子によって偏光成分が影響を受けるため、偏光度の算出に際しては装置毎にその影響を補正する必要があるためである。

そこで、先ず、偏光度が既知である標準の蛍光色素分子を測定して、その装置の補正因子を算出する。次に、蛍光色素分子で標識された測定対象の分子の偏光測定を行い、先に求めた補正因子を用いて所望の偏光度を算出する。

しかし、装置毎に標準の蛍光色素分子を用いて補正因子を測定するのは煩雑であり、かつ熟練を要する作業を必要とする。例えば、標準の蛍光色素分子は所定の濃度、所定のＰＨとなるように溶媒に溶解して調整しなければならない。また、標準の蛍光色素分子を保存するためには冷凍保存が必要であり、有効期限など品質を保証するための条件が確保されているか否かを常に管理しなければならない。
従って、標準の蛍光色素分子を用いることなく偏光度を測定することのできる技術が望まれるが、このような技術は未だ知られていない。

本発明は係る事情に鑑みてなされたものであり、標準の蛍光色素分子を用いずに偏光度を測定することのできる光測定装置を提供することを目的とする。

上記課題を解決するための、本発明に係る光測定装置は、波長の異なる偏光を出射する第１及び第２の光源と、前記第１及び第２の光源からの偏光を対象に導いて集光させる導光光学系と、前記第１の光源からの偏光の偏光面を９０度回転させる角度切替え装置と、前記対象として、試料を収容した容器と、光を反射する部材とを選択的に配設する配設装置と、前記第１及び第２の光源からの偏光によって生ずる前記対象からの偏光を、偏光面が直交する２つの偏光成分に分離して、それぞれ第１及び第２の光検出器に導く測定光学系と、前記第１及び第２の光検出器からの検出信号に基づいて前記試料の偏光度を測定する演算装置とを有する光測定装置であって、前記演算装置は、前記対象を前記光を反射する部材とし、前記第１の光源からの偏光を照射して得られた前記第１及び第２の光検出器からの検出信号（Ｉ_１，Ｉ_２）、及び前記第１の光源からの偏光の偏光面を９０度回転した偏光を照射して得られた前記第１及び第２の光検出器からの検出信号（Ｉ^’ _１，Ｉ^’ _２）と、前記対象を前記試料を収容した容器とし、前記第２の光源からの偏光を照射して得られた前記第１及び第２の光検出器からの検出信号（Ｑ_１，Ｑ_２）とに基づいて前記試料の偏光度（Ｐ）を算出する。

また本発明に係る光測定装置は、上記記載の発明である光測定装置において、前記試料は、蛍光色素によって標識され、前記第２の光源は、前記蛍光色素を励起する波長を有し、前記第１の光源からの偏光の波長は、励起された前記蛍光色素から発生する蛍光の最大強度を与える波長の近傍の値である。

また本発明に係る光測定装置は、上記記載の発明である光測定装置において、前記蛍光色素がＲｈｏｄａｍｉｎｅ １１０のときは、前記第１の光源からの偏光の波長は、５３５±２５ｎｍの範囲にあり、前記蛍光色素がＦＩＴＣのときは、前記第１の光源からの偏光の波長は、５３５±２０ｎｍの範囲にあり、前記蛍光色素がＧＦＰのときは、前記第１の光源からの偏光の波長は、５０５±２０ｎｍの範囲にあり、前記蛍光色素がＴＡＭＲＡのときは、前記第１の光源からの偏光の波長は、５９０±３０ｎｍの範囲にあり、前記蛍光色素がＡｔｔｏ ６３３のときは、前記第１の光源からの偏光の波長は、６８５±２５ｎｍの範囲にある。

また本発明に係る光測定装置は、上記記載の発明である光測定装置において、前記角度切替え装置は、前記第１の光源をその光軸を中心軸として回転する機構を備える。

また本発明に係る光測定装置は、上記記載の発明である光測定装置において、前記角度切替え装置は、前記第１の光源からの偏光ビームを平行光とするコリメータ部材を回転する機構を備える。

また本発明に係る光測定装置は、上記記載の発明である光測定装置において、前記第１の光源が出射する偏光はランダム偏光であり、前記角度切替え装置は、偏光面を０度と９０度とにする少なくとも２つの偏光素子を前記測定光学系の光路中に挿脱する機構を備える。

また本発明に係る光測定装置は、上記記載の発明である光測定装置において、前記検出信号（Ｉ_１，Ｉ_２,Ｉ^’ _１，Ｉ^’ _２,Ｑ_１，Ｑ_２）から前記光測定装置の健全性を判断する判断装置を更に備える。

本発明の光測定装置によれば、標準の蛍光色素分子を用いずに偏光度を測定することができる。

［第１の実施の形態］
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を詳細に説明する。
図１は光測定装置の基本的な構成図である。
本発明による光測定装置は、主な構成部として、光源部１５、光量モニタ機構７、ビーム走査機構９、対物レンズ１０、液浸水供給機構１１、試料保持機構１８、光検出部１６及び信号処理部１７を備えている。
以下、光測定装置の詳細の構成と動作について説明する。
光源部１５には、レーザ光源１、シャッター２３、ビーム径可変機構５、回転式ＮＤフィルタ３６、ビームシフタ１０２、ミラー１００及びダイクロイックミラー３が設けられている。

光源部１５には少なくとも２種類のレーザ光源１（１ａ、１ｂ）を載置することができる。本実施の形態では、励起用レーザ１ａ、および補助レーザ１ｂが設けられている。
励起用レーザ１ａは、試料を励起して蛍光を発生させるための光源であり、補助レーザ１ｂは、偏光度の補正を行うために用いられる光源である。このレーザ１ａ、１ｂはいずれも偏光レーザである。即ち、このレーザ光源１ａ、１ｂから照射されるレーザ光の振動方向は一つの方向に固定されている。
そして、補助レーザ１ｂには、回転制御機構３００が接続されている。この回転制御機構３００によって、補助レーザ１ｂを、光軸を中心軸として回転することができる。

なお、光源として用いるレーザはパルスレーザであっても良い。また、音響光学チューナブルフィルタ（ＡＯＴＦ）を搭載したマルチラインのレーザも載置可能である。マルチラインのレーザには、複数の波長のレーザ光が含まれているため、ＡＯＴＦによって発振波長の切り替えを行なうように構成することで、載置するレーザの台数を減少することができる。

各レーザ光源１の出射端近傍にはシャッター２３がそれぞれ設置されており、シャッター２３はそれぞれ電子制御により開閉される機構（図示せず）になっている。出射されたレーザ光はレンズを組み合わせたビーム径可変機構５でビーム直径を拡大され、平行光にされる。ビーム径可変機構５を構成するレンズの組み合わせを変えることで、焦点距離を変えて射出ビーム直径を調整することができる。

それぞれ平行光とされたレーザ光は各々の光路に用意された回転式ＮＤ（Neutral Density）フィルタ３６、ビームシフタ１０２を通過した後、ミラー１００、ダイクロイックミラー３で選択的に反射、または透過される。２つのレーザ光源１からの光は同一の光路を進行する。２つの光路を同一の光路にまとめる操作は、ビームシフタ１０２を調整することで行われる。

レーザビームは、ミラー４で方向を曲げられ、円板状のハーフミラー６に入射する。そして、レーザビームの一部はハーフミラー６で反射されて光量モニタ機構７に入る。光量モニタ機構７はレンズ５１、ピンホール５２を備え、レーザビームはこれらの光学素子を通って光検出器５３の受光面に集光する。光検出器５３は半導体光検出器を用いる。

光検出器５３の検知出力は、コンピュータ１４に入力され、コンピュータ１４は、この値に基づいて、あらかじめ設定した光源出力光強度になるように、レーザ駆動電源（図示しない）の駆動電流を制御する。あるいは回転式ＮＤフィルタ３６をコンピュータ１４が制御（図示しない）することで、レーザ光源１からの光出力強度を調整することもできる。

ハーフミラー６を通過したレーザビームは偏芯回転ミラー４０に達する。このとき偏芯回転ミラー４０は回転に伴って反射光の方向が中心軸の周りに回転運動するように傾いて調整されている。そのため、レーザビームは対物レンズ１０の光軸に対して、ある傾き角を持って入射する。偏芯回転ミラー４０をモータ４１で回転させることで、対物レンズ１０を通過した光ビームの集光スポットは試料内で略楕円状に走査される。
なお、集光スポットを走査させるのは、ＦＩＤＡ測定を行なう場合であり、ＦＣＳ測定を行なう場合には集光スポットは固定される。

即ち、ＦＩＤＡ測定を行なう場合は、モータ４１を回転させ、それに伴って偏芯回転ミラー４０が回転運動を行ない、光軸を通った光は対物レンズを通って溶液内のフォーカス位置で略楕円を描きながら試料を照射する。

ＦＣＳ測定を行なう場合は、コンピュータ制御によりモータ４１を停止し、偏芯回転ミラー４０を適切な位置で固定する。このとき、偏芯回転ミラー４０のミラー面の向きは光軸を通った光が対物レンズを光軸に沿って通過する向きに設定されるようにあらかじめモータ４１の停止位置がプログラムされている。
また、ＦＣＳ測定の場合に、偏芯回転ミラー４０とは別の、光軸に対して偏芯していないミラー９０に切り替えるようにしても良い。

レーザ光は続いて切り替え式ダイクロイックミラー１０１で反射され、対物レンズ１０に入射する。対物レンズ１０として、例えば×４０水浸対物レンズ（ＮＡ１．１５）を用いる。対物レンズ１０は補正環が無いドライタイプを用いても良いし、あるいは液浸タイプで補正環を具備しているものを用いてもよい。

この切り替え式ダイクロイックミラー１０１は円板状のガラス板の表面に多層膜コーティングを施して、透過、反射のスペクトル特性が最適になるように製作されている。切り替え式ダイクロイックミラー１０１としては円板状に限らず、プリズムタイプのものを用いても良い。また切り替え式ダイクロイックミラー１０１は裏面反射によるノイズ光が信号光に混入するのを防ぐため、基板となるガラスの厚さを最適に調整してあるものを用いる。

この切り替え式ダイクロイックミラー１０１は光源としてのレーザ光と試料から発せられた蛍光信号を分離する役割がある。測定に用いる波長を変更するときは、透過、反射特性の異なる複数個のダイクロイックミラー１０１の内から最適なものを選択して切り替えて用いる。

試料ステージ１９にはＸ軸、Ｙ軸方向に沿ってステッピングモータ（図示しない）が取り付けられており、マイクロプレート２０を精密に水平方向（Ｘ−Ｙ軸方向）に移動させることができる。そして試料ステージ１９をＸＹ平面内で作動させて、マイクロプレート２０を移動調整しながら、順次測定を繰り返し行なう。
また、試料ステージ１９に替えて、反射ミラー９９を対物レンズ１０上に移動させることもできる。この反射ミラー９９は、偏光度を補正するために使用されるもので、その動作については後で詳しく説明する。

対物レンズ１０の周囲には対物レンズＺ軸保持機構４３が具備されており、コンピュータの指令により、対物レンズＺ軸保持機構４３を光軸方向（Ｚ軸方向）に移動させる。すなわち、ウエル２２内でのレーザ光のフォーカス位置を光軸方向に沿って上下動させることができる。

レーザ光は対物レンズ１０を通って集光されたあと、試料を収容したマイクロプレート２０のウェル２２内で極めて微小な光スポットを形成する。レーザ光の集光位置は水平方向（Ｘ−Ｙ軸方向）についてはウエルの中央部分、垂直方向（Ｚ軸）については、試料内のほぼ中央部分となっている。このとき、ウェル２２内で得られるレーザ光の共焦点領域の大きさは直径０．６μｍ程度、長さ２μｍ程度の略円筒状の光スポットとなる。

試料に直接ラベルして用いる蛍光物質は、例えばＴＡＭＲＡであり、ＴＡＭＲＡは波長５４３ｎｍのヘリウム・ネオンレーザで励起する。

対物レンズ１０で集光されたレーザ光はウエル２２内で試料内の蛍光分子を励起し、蛍光分子から蛍光が発せられる。この蛍光は波長が５８０ｎｍ付近に強度の最大値を有している。この蛍光は再び信号光として対物レンズ１０に取り込まれ、続いて切り替え式ダイクロイックミラー１０１に到達する。信号光の波長は入射レーザ光の波長より長く、そのため切り替え式ダイクロイックミラー１０１を透過して、反射プリズム２００で反射され、レンズ２１０でレンズ２１０の後方に配置されたピンホール２２０のピンホール面に集光される。対物レンズ１０の焦点位置と共役な光軸上の位置にピンホール２２０が位置決めされるようにピンホールホルダー５０が配置されている。

ピンホール２２０の手前にバリア・フィルタ４５が配置されている。バリア・フィルタ４５は蛍光の発光スペクトルに合わせて、透過光のスペクトルが調整されるようになっている。すなわち、バンドパスフィルタとなっており、信号光となる蛍光の発光スペクトルの波長域の光のみが通過する。これにより、試料容器内で発生する散乱光やウェル２２の壁などから反射して入射光路に戻ってくる入射光の一部などのノイズ光をカットすることができる。蛍光の波長とバックグラウンド光の波長が異なるためノイズ光を遮断できる。なお、バリアフィルタ４５として、音響光学素子によるビームスプリッター（ＡＯＢＳ）を用いても良い。

レンズ２１０の焦点面とピンホール２２０の開口面とが一致するように配置されている。このピンホール２２０には光位置検出器とピンホール駆動装置が取り付けられており（図示しない）、ピンホール２２０はピンホール駆動装置により、Ｘ−Ｙ−Ｚ軸方向に位置調整できるようになっている。従って、レンズ２１０の焦点面にピンホール２２０の開口面を一致させることができる。

また、ピンホール２２０の位置はバリア・フィルタ４５の切り替え、あるいは音響光学素子によるビームスプリッター（ＡＯＢＳ）の切り替えに対して、デフォルト位置に自動的に戻る機構を有している。このピンホール２２０により、ウェル内に形成された光の共焦点領域外からのバックグラウンド光が除去される。

ピンホール２２０を通過した信号光はコリメートレンズ５９により平行光とされてダイクロイックミラー／偏光ビームスプリッター３８により、互いに垂直な２方向に分離される。ダイクロイックミラー／偏光ビームスプリッター３８は、ダイクロイックミラーと偏光ビームスプリッターとを切り替える機構を備えている。この切り替え機構には、例えば、回転機構を用いても良い。２種類の蛍光物質を用いて相互相関測定を行なう場合は、ダイクロイックミラーが自動的に選択されるようになっており、異なる蛍光物質の発光のスペクトに合わせて、反射光、および透過光のスペクトルを規定する。偏光測定を行う場合は、偏光ビームスプリッターが自動的に選択されるようになっており、反射光、および透過光で異なる偏光成分を分離する。分離されたそれぞれの信号光はバンドパスフィルタ６４でそれぞれの励起レーザ光の波長の光を選択的に遮断して、信号光のＳ／Ｎ比を向上させる。

バンドパスフィルタ６４を通過した信号光はレンズ１２により集光されて、光検出器２の受光面に到達する。それぞれの光検出器２には光位置検出器と光検出器駆動装置が取り付けられており、光検出器２の受光面は光検出器駆動装置により、Ｘ−Ｙ−Ｚ軸方向に沿って位置調整できるようになっている。光検出器２は例えばアバランシェ・フォトダイオード（略称：ＡＰＤ）、あるいは光電子増倍管などの微弱光検出器を用いる。光位置検出器は半導体光位置検出器を用いる。

光検出器２で受光される信号光は微弱光であり、フォトン・パルス信号となっている。光検出器２によって、このフォトン・パルス信号は電気信号（光電流パルス信号）に変換され、増幅されて信号処理装置８に送られる。信号処理装置８によって、この電気パルス信号は波形整形され、ｏｎ−ｏｆｆ電圧パルスとされて、コンピュータ１４に導かれる。この電圧パルスはコンピュータ１４のメモリ（図示しない）に記憶され、続いて所要の演算が行なわれる。

次にコンピュータ１４による制御動作について説明すると、コンピュータ１４は測定に用いるレーザ光源１を選択し、電源を投入する。また、シャッター駆動電源（図示しない）に働きかけ、必要に応じて、シャッター２３を開閉する。さらに光量モニタ機構７の光検出器５３の出力をモニタして、レーザ光源１の出力光強度が所望のレベルになるように、モータ（不図示）の駆動電流を調整する。これによってモータに取り付けられている円盤状の回転式ＮＤフィルタ３６を必要な角度だけ回転させる。

回転式ＮＤフィルタ３６は円周方向に沿って変化する透過率分布を備えているため、回転によってレーザ光の強度を変化させることができる。なお、回転式ＮＤフィルタ３６は円盤状ではなく、板の長手方向に沿って段階的に透過率が変化する板状のものを用いても良い。板状のＮＤフィルタを用いる場合はスライドして透過光強度を変化させる。位置を制御する方法として、一般的にはＰＩＤ制御（Proportional:比例,Integral:積分,Differential:微分）を用いるが、その他の制御手法、例えば単純ｏｎ／ｏｆｆ制御により行なってもよい。

次に、本光測定装置の偏光度測定動作について説明する。この動作は、コンピュータ１４が自動的に装置を制御する。

１．ユーザが光測定装置の起動をコンピュータ１４に入力すると、コンピュータ１４は、測定装置のメイン電源を投入する。

２．ユーザが測定項目を設定すると、コンピュータ１４は、予め定められたテーブルに従い、光測定装置内の各光学素子の組み合わせを選定する。ここでは、偏光測定が設定されたものとする。

３．コンピュータ１４は、回転制御機構３００を制御して、偏光面が０度となるように補助レーザ１ｂを光軸を中心軸として回転する。そして、対物レンズ１０の焦点位置に反射ミラー９９を挿入する。

４．次に、コンピュータ１４は、補助レーザ１ｂの電源をＯＮする。そして、対物レンズ１０を通して反射ミラー９９に補助レーザ１ｂからの偏光を照射する。

５．反射ミラー９９で反射された光は、対物レンズ１０、ピンホール２２０を通過し、偏光ビームスプリッター３８により異なる偏光成分（Ｐ偏光、Ｓ偏光）に分離され、それぞれの光検出器２でその強度が検出される。なおＰ偏光成分は、補助レーザ１ｂから照射される光の振動方向の成分であり、Ｓ偏光成分は、Ｐ偏光と直交する方向に振動する光の成分である。
２つの光検出器２をそれぞれチャンネル１及びチャンネル２と呼び、測定した偏光強度をそれぞれＩ_１及びＩ_２とする。

補助レーザ１ｂから出射するレーザ光の振幅をＡとし、検出器に届くまでに偏光面が角度θだけ回転すると仮定する。そして、チャンネル１の検出感度をａとし、チャンネル２の検出感度をｂとする。
振幅Ａの光がθ回転するので、その振幅のチャンネル１側の成分はＡｃｏｓθとなり、光の強度としては、その２乗となる。チャンネル１の検出感度がａなので、チャンネル１で測定した偏光強度Ｉ_１は、式（１）で表される。

同様に、その振幅のチャンネル２側の成分はＡｓｉｎθとなり、チャンネル２の検出感度がｂなので、チャンネル２で測定した偏光強度Ｉ_２は、式（２）で表される。

６．コンピュータ１４は、回転制御機構３００を制御して、偏光面が９０度となるように補助レーザ１ｂを光軸を中心軸として回転する。そして、同様に反射された偏光成分をチャンネル１及びチャンネル２で検出し、測定した偏光強度をそれぞれＩ’_１及びＩ’_２とすると式（３）及び式（４）が成立する。

ここで、式（１）と式（４）より、各チャンネルの検出効率の比が式（５）で求められる。

つぎに装置の消光比を求める。ここで消光比とは、Ｐ偏光成分とＳ偏光成分の比のことである。偏光測定では、一方の成分のみの偏光を用いることが精度の良い測定を行う上で望ましい。式（２）と式（４）より、装置の消光比に相当する量が式（６）で求められる。

７．コンピュータ１４は、対物レンズ１０の焦点位置に蛍光色素で標識された分子を収納したマイクロプレート２０を挿入する。次に、コンピュータ１４は、補助レーザ１ｂに代えて励起用レーザ１ａの電源をＯＮする。そして、対物レンズ１０を通して試料に励起用レーザ１ａからの偏光を照射し、チャンネル１及びチャンネル２でそれぞれ蛍光強度Ｑ_１及びＱ_２を測定する。

今、装置の光学系が理想的で、偏光面の回転がなく（θ＝０）、さらにチャンネル１とチャンネル２との検出感度が同じである場合の蛍光強度をｑ_１及びｑ_２とする。
図２は、各偏光成分のなす角αを示している。図２に示すように、角αは励起用レーザ１ａから出射する偏光に２方向の偏光成分が存在することによるものである。
この角αを用いると、公知の偏光度Ｐは、式（７）で表される。

これに対して、実際の測定では偏光面の回転が存在する。そのため、各偏光成分のなす角はα＋θとなる。
図３は、各偏光成分のなす角α＋θを示している。従って、各偏光成分は図３に示す振幅となる。これに各チャンネルの検出感度を考慮すると、蛍光強度Ｑ_１及びＱ_２は、式（８）及び式（９）で表される。

式（８）、式（９）、式（５）より、式（１０）を得る。

従って、αは式（１１）で表される。

以上より偏光度Ｐは次の式で定義される。

従って、コンピュータ１４は、励起用レーザ１ａと補助レーザ１ｂとを用いて演算により偏光度を得ることができる。

なお、上述の測定においては補助レーザ１ｂの波長は、実際に発生する蛍光のうち、強度の最大値を与える波長付近の値であることが望ましい。
図４は、蛍光色素ごとの励起用レーザの波長と吸収フィルタの特性（中心波長／幅）を記載している。ここで、吸収フィルタの特性（中心波長／幅）は発生する蛍光のうち強度の最大値を与える波長に対応している。

この図４より、補助レーザ１ｂの望ましい波長を特定することができる。
例えば、蛍光色素としてRhodamine 110を使用する場合は、励起用レーザ１ａはアルゴンレーザ（波長：４８８ｎｍ）を用いる。このとき補助レーザ１ｂは、波長が５３５±２５ｎｍの範囲にあることが望ましい。また、蛍光色素としてＦＩＴＣを使用する場合は、励起用レーザ１ａはアルゴンレーザ（波長：４８８ｎｍ）を用いる。このとき補助レーザ１ｂは、波長が５３５±２０ｎｍの範囲にあることが望ましい。更に、蛍光色素としてＧＦＰを使用する場合は、励起用レーザ１ａはアルゴンレーザ（波長：４８８ｎｍ）を用いる。このとき補助レーザ１ｂは、波長が５０５±２０ｎｍの範囲にあることが望ましい。

蛍光色素としてＴＡＭＲＡを使用する場合は、励起用レーザ１ａはヘリウムネオンレーザ（波長：５４３ｎｍ）を用いる。このとき補助レーザ１ｂは、波長が５９０±３０ｎｍの範囲にあることが望ましい。蛍光色素としてＡｔｔｏ６３３を使用する場合は、励起用レーザ１ａはヘリウムネオンレーザ（波長：６３３ｎｍ）を用いる。このとき補助レーザ１ｂは、波長が６８５±２５ｎｍの範囲にあることが望ましい。

なお、上述の実施の形態では、回転制御機構３００によって、偏光面が９０度となるように補助レーザ１ｂを回転したが、ビーム径可変機構５を９０度回転することで偏光面が９０度となるようにしても良い。即ち、レーザビームを平行光にするコリメータの部材を９０度回転できるようにする、あるいは偏光方向が９０度異なる２つのコリメータを備え、切換えて使用できるようにしても良い。

[第２の実施の形態]
図５は、第２の実施の形態の光測定装置を示す図である。第１の実施の形態と同一の部位には同一の符号を付してその詳細の説明は省略する。
第２の実施の形態では、補助レーザ１ｂは、ランダム偏光のビームを発生する。また第１に実施の形態の回転制御機構３００は設けられていないが、光路の途中に偏光素子ホルダー２８と偏光素子ホルダー駆動部３９とが新たに設けられている。

レーザ光源１からのレーザビームは、ミラー４で方向を曲げられ、偏光素子ホルダー２８に到達する。偏光素子ホルダー２８はスライド式の板状構造となっており、通常２箇所の円形の偏光素子保持枠が設けられている。一方の保持枠に偏光面が０度となる円形の偏光素子が配置されており、もう一方には偏光面が９０度となる円形の偏光素子が配置されている。そして、この偏光素子ホルダー２８に取り付けられた偏光素子ホルダー駆動部３９によって偏光素子ホルダー２８をスライドさせることにより、必要に応じて偏光素子が光路上に設置されるようになっている。

この偏光素子ホルダー駆動部３９によるスライド調整は、ステッピングモータを用いた制御装置により行なわれる（図示せず）。光測定装置を用いて偏光測定を行なう場合は、偏光素子ホルダー２８に偏光素子が設置され、光路上に偏光素子が載置される。偏光測定を行わない場合は光路上には偏光素子は存しない。なお、偏光素子ホルダー２８は円板状であっても良い。あるいは円板の周囲に複数の偏光素子を載置し、偏光素子ホルダー２８を回転させることで、偏光素子を切り替えて用いても良い。

偏光素子ホルダー２８に配置する偏光素子には、例えばシート状の偏光板を用いることができる。しかし偏光板に限ることなく、例えばグラントムソン・プリズム（Ｇｌａｎ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｐｒｉｓｍ）などの消光比の高い偏光素子を用いると、さらに精度の高い偏光測定を行なうことができる。

なお、本実施の形態の光測定装置においては、偏光度の測定に留まらず、本光測定装置の健全性を検査することもできる。
例えば、式（５）に示す各チャンネルの検出効率の比と１との差が所定値以上のときは、光検出部１６に不具合が生じていると判断することができる。また、式（６）に示す装置の消光比に相当する量が所定値よりも小さい場合、例えば、５０／１よりも小さい場合は、装置の調整が不良と判断しても良い。
更に、不具合の発生、装置の調整不良を検出した場合、コンピュータ１４が検出した内容に応じて、偏光特性に関する光学素子、偏光ビームスプリッタ、レーザなどを交換するなど、ハードの作製にフィードバックすることができる。

以上説明した、各実施の形態によれば従来必要とされた装置の偏光特性に関する補正因子を導く必要がない。そのため、装置毎に標準の蛍光色素分子を用いて補正因子を測定する煩雑であり、かつ熟練を要する作業が不要となる。

なお、この発明は、上記実施形態そのままに限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で構成要素を変形して具体化できる。また、上記実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合せにより種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。更に、異なる実施形態に亘る構成要素を適宜組み合せてもよい。

第１の実施の形態の光測定装置を示す図。 各偏光成分のなす角αを示す図。 各偏光成分のなす角α＋θを示す図。 蛍光色素ごとの励起用レーザの波長と吸収フィルタの特性を示す図。 第２の実施の形態の光測定装置を示す図。

符号の説明

１…レーザ光源、１ａ…励起用光源、１ｂ…補助光源、２…光検出器、３…ダイクロイックミラー、７…光量モニタ機構、９…ビーム走査機構、１１…液浸水供給機構、１４…コンピュータ、１５…光源部、１６…光検出部、２０…マイクロプレート、２８…偏光素子ホルダー、３６…回転式NDフィルタ、４０…偏芯回転ミラー、４１…モータ、４５…バリアフィルタ、９９…反射ミラー、１０２…ビームシフタ、３００…回転制御機構。

Claims (7)

1. 波長の異なる偏光を出射する第１及び第２の光源と、
   前記第１及び第２の光源からの偏光を対象に導いて集光させる導光光学系と、
   前記第１の光源からの偏光の偏光面を９０度回転させる角度切替え装置と、
   前記対象として、試料を収容した容器と、光を反射する部材とを選択的に配設する配設装置と、
   前記第１及び第２の光源からの偏光によって生ずる前記対象からの偏光を、偏光面が直交する２つの偏光成分に分離して、それぞれ第１及び第２の光検出器に導く測定光学系と、
   前記第１及び第２の光検出器からの検出信号に基づいて前記試料の偏光度を測定する演算装置とを有する光測定装置であって、
   前記演算装置は、
   前記対象を前記光を反射する部材とし、前記第１の光源からの偏光を照射して得られた前記第１及び第２の光検出器からの検出信号（Ｉ_１，Ｉ_２）、及び前記第１の光源からの偏光の偏光面を９０度回転した偏光を照射して得られた前記第１及び第２の光検出器からの検出信号（Ｉ^’ _１，Ｉ^’ _２）と、
   前記対象を前記試料を収容した容器とし、前記第２の光源からの偏光を照射して得られた前記第１及び第２の光検出器からの検出信号（Ｑ_１，Ｑ_２）とに基づいて前記試料の偏光度（Ｐ）を算出することを特徴とする光測定装置。
2. 前記試料は、蛍光色素によって標識され、
   前記第２の光源は、前記蛍光色素を励起する波長を有し、
   前記第１の光源からの偏光の波長は、励起された前記蛍光色素から発生する蛍光の最大強度を与える波長の近傍の値であること
   を特徴とする請求項１に記載の光測定装置。
3. 前記蛍光色素がＲｈｏｄａｍｉｎｅ １１０のときは、前記第１の光源からの偏光の波長は、５３５±２５ｎｍの範囲にあり、
   前記蛍光色素がＦＩＴＣのときは、前記第１の光源からの偏光の波長は、５３５±２０ｎｍの範囲にあり、
   前記蛍光色素がＧＦＰのときは、前記第１の光源からの偏光の波長は、５０５±２０ｎｍの範囲にあり、
   前記蛍光色素がＴＡＭＲＡのときは、前記第１の光源からの偏光の波長は、５９０±３０ｎｍの範囲にあり、
   前記蛍光色素がＡｔｔｏ ６３３のときは、前記第１の光源からの偏光の波長は、６８５±２５ｎｍの範囲にあること
   を特徴とする請求項２に記載の光測定装置。
4. 前記角度切替え装置は、前記第１の光源をその光軸を中心軸として回転する機構を備えることを特徴とする請求項１に記載の光測定装置。
5. 前記角度切替え装置は、前記第１の光源からの偏光ビームを平行光とするコリメータ部材を回転する機構を備えることを特徴とする請求項１に記載の光測定装置。
6. 前記第１の光源が出射する偏光はランダム偏光であり、
   前記角度切替え装置は、偏光面を０度と９０度とにする少なくとも２つの偏光素子を前記測定光学系の光路中に挿脱する機構を備えることを特徴とする請求項１に記載の光測定装置。
7. 前記検出信号（Ｉ_１，Ｉ_２,Ｉ^’ _１，Ｉ^’ _２,Ｑ_１，Ｑ_２）から前記光測定装置の健全性を判断する判断装置を更に備えることを特徴とする請求項１に記載の光測定装置。

Images