JP2005181891A - レーザ顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】 スペクトル成分情報の安定した分光データを取得できるレーザ顕微鏡を提供する。
【解決手段】 標本１５からの検出光を第２のビームスプリッタユニット１６および第３のビームスプリッタユニット１１６により第１の分光チャンネル１００と第２の分光チャンネル２００に分割し、それぞれの分光チャンネル１００，２００ごとに設けられる検出光を結像する共焦点レンズ１７（１１７）と共焦点レンズの焦点位置に配置される共焦点絞り２２（１２２）との間に、共焦点レンズの結像位置と共焦点絞りの中心位置とのずれを補正する平行平面板状の光学素子１９（１１９）を設ける。
【選択図】 図１

Description

本発明は、レーザ光を標本に照射したときに発せられる光（蛍光）を検出するレーザ顕微鏡に関するものである。

レーザ顕微鏡として、蛍光色素を標識した標本に対し対物レンズを介してレーザ光を照射することで蛍光色素を励起し、この励起により標本から発せられる光（蛍光）をスペクトル分解し、そのスペクトル成分から任意の波長領域の分光データを検出する走査型レーザ顕微鏡が知られている。

従来、このような走査型レーザ顕微鏡として、例えば、特許文献１に開示されるように、標本からの検出光をスペクトル分解する手段（プリズム）と、あらかじめ定められたスペクトル領域を選択する手段と検出装置を備え、検出光をスペクトル分解する手段とスペクトル領域を選択する手段を互いに制御することで任意の波長領域の分光データを検出可能にしたものがある。

しかし、かかる特許文献１のものは、蛍光色素を標識した標本から発せられる蛍光をそのまま取り込み、スペクトル分解して任意の波長領域の分光データを検出するようにしたもので、１種類の蛍光色素を標識した標本について適用されるものである。
特開２００２−１２２７８７号公報

ところで、最近、１つの標本に複数の蛍光色素を標識した多重染色標本が用いられるようになっており、このような多重染色標本について、それぞれの蛍光色素に対応する蛍光を検出するには、標本からの検出光を各蛍光色素ごとに複数チャンネルに分光し、これらチャンネルごとに検出光を取り込み、スペクトル分解して分光データを得るようにしている。

この場合、標本からの検出光を複数チャンネルに分光するには、光路分割のための切替えミラーが用いられ、これら切替えミラーを蛍光色素による蛍光の波長に対応させて切り替えるようにしている。また、切替えミラーの切り替え手段には、例えば回転ターレットなどが用いられている。

ところが、ターレットは、回転中心軸のぶれ、位置決めのためのクリック位置精度のばらつきなどの様々な誤差が存在している。このため、このようなターレットにより切替えミラーの切り替えを行なうと、光軸ずれが発生し、各チャンネルごとに用意された分光手段に入射される検出光の角度が変化してしまい、スペクトル成分情報の安定した分光データを取得できないという問題を生じる。

本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、スペクトル成分情報の安定した分光データを取得できるレーザ顕微鏡を提供することを目的とする。

請求項１記載の発明は、レーザ光を発生するレーザ光源と、前記レーザ光源からのレーザ光を標本に照射する照明光学系と、前記レーザ光の波長ごとに切換え可能に設けられる波長選択光学素子を有するとともに、前記標本からの検出光を複数のチャンネルに分割する光路分割手段と、前記チャンネルごとに設けられ、少なくとも前記検出光を結像する共焦点レンズ、該共焦点レンズの焦点位置に配置される共焦点絞りを有する検出光学系と、前記共焦点絞りを通った検出光を取り込みスペクトル分解して分光データを検出する分光手段と、前記共焦点レンズと共焦点絞りとの間に配置され、前記共焦点レンズの結像位置と前記共焦点絞りの中心位置とのずれを補正することによって前記分光手段に入射する検出光の角度を一定にする補正手段とを具備したことを特徴としている。

請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記補正手段は、前記光路分割手段の波長選択光学素子の切換えに関する誤差に応じた補正情報を記憶する記憶手段を有し、前記波長選択光学素子の切換えにより、前記記憶手段に記憶された補正情報に基づいて前記分光手段に入射する検出光の角度を一定に補正することを特徴としている。

請求項３記載の発明は、請求項２記載の発明において、前記補正手段は、前記共焦点レンズと共焦点絞りとの間の光軸上に配置される平行平面板状の光学素子を有し、前記記憶手段に記憶された補正情報に基づいて前記平行平面板状の光学素子の前記光軸に対する傾きを変更可能にしたことを特徴としている。

請求項４記載の発明は、請求項１乃至３のいずれかに記載の発明において、前記光路分割手段は、前記波長選択光学素子として、ターレットに搭載された複数のビームスプリッタを有し、前記ターレットにより前記ビームスプリッタの切換えを可能にしたことを特徴としている。

本発明によれば、標本からの検出光を光路分割手段により波長ごとに分割し、それぞれのチャンネルごとに設けられる検出光を結像する共焦点レンズと共焦点レンズの焦点位置に配置される共焦点絞りとの間に、共焦点レンズの結像位置と共焦点絞りの中心位置とのずれを補正する補正手段を設けるようにしたので、それぞれのチャンネルから分光手段に取り込まれる光の入射角度を各チャンネルについて一定にでき、各スペクトル成分情報の安定した分光データを取得することができる。

また、本発明によれば、予め波長選択光学素子に関する誤差に応じた補正情報を記憶した記憶手段の補正情報に基づいて共焦点レンズの結像位置と共焦点絞りの中心位置とのずれを補正しているので、精度の高いずれ補正を行なうことができる。

さらに、本発明によれば、補正手段として、共焦点レンズと共焦点絞りとの間の光軸上に平行平面板状の光学素子を配置し、この平行平面板状の光学素子の光軸に対する傾きを変更するのみで、ずれ補正を行なっているので、構成を簡単にでき、動作の信頼性が高く、価格的にも安価にできる。

以下、本発明の一実施の形態を図面に従い説明する。

図１は、本発明の一実施の形態にかかるレーザ顕微鏡の概略構成を示している。

図において、１はレーザ光源ユニットで、このレーザ光源ユニット１は、レーザ光源として、４８８ｎｍの波長のレーザ光を発振するアルゴン（Ａｒ）レーザ２と、５４３ｎｍの波長のレーザ光を発振するヘリウムネオンレーザ（ＨｅＮｅ・Ｇ）３を有している。

アルゴンレーザ２からのレーザ光の光路上には、反射ミラー４が配置されている。また、グリーンヘリウムネオンレーザ３からのレーザ光の光路上には、反射ミラー４で反射されるレーザ光との交点上にダイクロイックミラー５が配置されている。ダイクロイックミラー５は、これら２つのレーザ光路を合成するもので、アルゴンレーザ２からのレーザ光を透過し、反射ミラー４で反射されるレーザ光を反射するようになっている。ここでのダイクロイックミラー５は、４８８ｎｍのレーザ光を反射し、５４３ｎｍのレーザ光を透過するような特性を有している。

ダイクロイックミラー５により合成されたレーザ光の光路上には、音響光学可変フィルタ（以下、ＡＯＴＦとする）６が配置されている。ここでのＡＯＴＦ６は、４８８ｎｍと５４３ｎｍの波長を選択するようになっている。

ＡＯＴＦ６のの出射端には、シングルモードファイバ７の入射端が配置され、このシングルモードファイバ７を介してレーザ光源ユニット１からのレーザ光をスキャナユニット８に導くようになっている。

スキャナユニット８は、シングルモードファイバ７の出射側に、ＡＯＴＦ６からのレーザ光を平行光にするコリメートレンズ９が配置されている。

コリメートレンズ９の平行光の光路上には、第１の光路分割手段としての第１のビームスプリッタユニット１０が配置されている。第１のビームスプリッタユニット１０は、回転ターレットからなるもので、モータ１０ｄにより回転駆動されるようになっている。この第１のビームスプリッタユニット１０には、波長選択光学素子としての複数のビームスプリッタ１０ａと１０ｂ（１０ｃ）がターレットの同心円上に配置されており、モータ１０ｄによる回転動作により、ビームスプリッタ１０ａ、１０ｂ（１０ｃ）を光路に対して選択的に切り換えるようになっている。つまり、これらビームスプリッタ１０ａ、１０ｂ（１０ｃ）のいずれか一つを光路上に配置できるようになっている。また、ビームスプリッタ１０ａは、全ての波長域にわたり反射率２０％、透過率８０％の特性を有し、ビームスプリッタ１０ｂは、４８８ｎｍの波長を反射し、それ以外の波長を透過する特性を有し、ビームスプリッタ１０ｃは、４８８ｎｍと５４３ｎｍの波長を反射し、それ以外の波長を透過する特性を有するものが用いられている。

第１のビームスプリッタユニット１０の反射光路上には、ＸＹスキャナミラー１１が配置されている。このＸＹスキャナミラー１１は、直交する２方向に光を偏向するための２枚のミラー１１ａ、１１ｂを有し、これらのミラー１１ａ、１１ｂによりレーザ光を２次元方向に走査するようになっている。

ＸＹスキャナミラー１１で２次元走査されたレーザ光の光路上には、照明光学系を構成する顕微鏡本体側の瞳投影レンズ１２、結像レンズ１３、対物レンズ１４が配置されている。この場合、ＸＹスキャナミラー１１で２次元走査されたレーザ光は、瞳投影レンズ１２、結像レンズ１３、対物レンズ１４を介して標本１５の焦点位置に結像され、標本１５から発生された蛍光は、レーザ光と逆の光路をたどって対物レンズ１４、結像レンズ１３、瞳投影レンズ１２、ＸＹスキャナミラー１１を介して第１のビームスプリッタユニット１０まで戻るようになっている。

第１のビームスプリッタユニット１０の透過光路上には、第２の光路分割手段として第２のビームスプリッタユニット１６が配置されている。第２のビームスプリッタユニット１６は、第１のビームスプリッタユニット１０と同様に回転ターレットからなるもので、モータ１６ｄにより回転駆動されるようになっている。この第２のビームスプリッタユニット１６には、波長選択光学素子としての複数のビームスプリッタ１６ａ、１６ｂ（１６ｃ）がターレットの同心円上に配置されており、モータ１６ｄによる回転動作により、ビームスプリッタ１６ａ、１６ｂ（１６ｃ）を光路に対して選択的に切り換えるようになっている。つまり、これらビームスプリッタ１６ａ、１６ｂ（１６ｃ）のいずれか一つを光路上に配置できるようになっている。また、ビームスプリッタ１６ａは、全ての波長域の光線を全反射する特性を有し、ビームスプリッタ１６ｂは、５６０ｎｍ以下の波長を反射し、それ以上の波長を透過する特性を有し、ビームスプリッタ１６ｃは、全ての波長域の光線を透過する特性を有するものが用いられている。

第２のビームスプリッタユニット１６の反射光路上には、第１の分光チャンネル１００が配置されている。この第１の分光チャンネル１００は、第２のビームスプリッタユニット１６の反射光路上に検出光学系を構成する共焦点レンズ１７が配置され、この共焦点レンズ１７の集光位置に共焦点絞り（ピンホール）２２が配置されている。共焦点絞り２２には、駆動装置２２ａが設けられている。この駆動装置２２ａは、後述する制御ユニット２９の指示により共焦点絞り２２の共焦点絞り径を対物レンズ１４の瞳径により決まるスポット径に適したものに制御するようにしている。

共焦点レンズ１７と共焦点絞り２２の間には、補正手段を構成する平行平面板状の光学素子１９が配置されている。この光学素子１９には、共焦点レンズ１７により集光した蛍光が入射する。この場合、平行平面板状の光学素子１９は、図２に示すように光軸１８に略直交する第１の回転軸２０により支持され、第１の駆動装置２０ａにより第１の回転軸２０を中心に回転可能になっている。また、第１の駆動装置２０ａは、Ｌ字上の支持金具２０１の一端部に設けられている。この支持金具２０１の他方端部は、光軸１８に略直交すると共に第１の回転軸２０にも直交する第２の回転軸２１により支持されている。これにより平行平面板状の光学素子１９は、第２の駆動装置２１ａにより第２の回転軸２１を中心に、支持金具２０１を介して回転可能になっている。つまり、平行平面板状の光学素子１９は、光軸１８に直交し、且つ互いに直交する第１の回転軸２０と第２の回転軸２１をそれぞれ中心として、光軸１８に対する傾きを変更可能にしている。

平行平面板状の光学素子１９を透過した蛍光の光路には、共焦点絞り２２を介してコリメートレンズ２３が配置されている。コリメートレンズ２３は、共焦点絞り２２を通過して拡散される光を平行光に変換するものである。

コリメートレンズ２３からの平行光は、スキャナユニット８内の分光手段としての分光ユニット２４に入射される。分光ユニット２４は、コリメートレンズ２３からの平行光の光路に、反射面が回折格子であるガルバノミラー２５（以下、回折格子ガルバノミラーと称する）が配置されている。この回折格子ガルバノミラー２５は、回折格子面を図示の回転方向２５ａに回転させることが可能になっている。これにより、回折格子ガルバノミラー２５により分散した各波長の蛍光の反射方向を変えることが可能である。

回折格子ガルバノミラー２５により分散された光路上には、集光レンズ２６が配置されている。集光レンズ２６は、回折格子ガルバノミラー２５の分散面の回転中心に前側焦点位置がくるように配置されている。

集光レンズ２６の結像位置には、スリット２７が配置されている。このスリット２７は、図３（ａ）に示すように回折格子ガルバノミラー２５によるスペクトルの分散方向に垂直な方向に配置される固定マスク２７ｄ、２７ｅと、同図（ｂ）に示す駆動装置２７ａにより、スリット幅をスペクトルの分散方向に変更可能にする移動スリット２７ｂ、２７ｃが設けられている。スリット２７の後方には、光検出手段としてのサイドオン型のフォトマルチプライヤー２８が配置されている。フォトマルチプライヤー２８は、蛍光の分散方向と受光面の長手方向が一致するように配置されている。

一方、第２のビームスプリッタユニット１６の透過光路上には、第３の光路分割手段として第３のビームスプリッタユニット１１６が配置されている。第３のビームスプリッタユニット１１６は、第１のビームスプリッタユニット１０および第２のビームスプリッタユニット１６と同様に回転ターレットからなるもので、モータ１１６ｄにより回転駆動されるようになっている。この第３のビームスプリッタユニット１１６は、複数のビームスプリッタ１１６ａ、１１６ｂ（１１６ｃ）がターレットの同心円上に配置されており、モータ１１６ｄによる回転動作により、ビームスプリッタ１１６ａ、１１６ｂ（１１６ｃ）を光路に対して選択的に切り換えるようになっている。つまり、これらビームスプリッタ１１６ａ、１１６ｂ（１１６ｃ）のいずれか一つを光路上に配置できるようになっている。また、ビームスプリッタ１１６ａは、全ての波長域の光線を全反射する特性を有し、ビームスプリッタ１１６ｂは、６３０ｎｍ以下の波長を反射し、それ以上の波長を透過する特性を有し、ビームスプリッタ１１６ｃは、全ての波長域の光線を透過する特性を有するものが用いられている。

第３のビームスプリッタユニット１１６の反射光路上には、第２の分光チャンネル２００が配置されている。この第２の分光チャンネル２００は、上述した第１の分光チャンネル１００と全く同様な構成をなすもので、ここでは、共焦点レンズ１１７からサイドオン型のフォトマルチプライヤー１２８まで、第１の分光チャンネル１００と同一部分には、それぞれの符号先頭に添え字１を付して詳細な説明は省略する。

なお、第３のビームスプリッタユニット１１６の透過光路側は、図示はしていないが、オプションの検出装置などを取り付けて、透過してきた光を検出できるような第３の分光チャンネルの光路となっている。

第１のビームスプリッタユニット１０のモータ１０ｄ、第２のビームスプリッタユニット１６のモータ１６ｄ、第３のビームスプリッタユニット１１６のモータ１１６ｄを始め、第１の分光チャンネル１００に用いられる平行平面板状の光学素子１９の第１の駆動装置２０ａと第２の駆動装置２１ａ、共焦点絞り２２の駆動装置２２ａ、回折格子ガルバノミラー２５、スリット２７の駆動装置２７ａ、第２の分光チャンネル２００に用いられる平行平面板状の光学素子１１９の第１の駆動装置１２０ａと第２の駆動装置１２１ａ、共焦点絞り１２２の駆動装置１２２ａ、回折格子ガルバノミラー１２５、スリット１２７の駆動装置１２７ａには、制御ユニット２９が接続されている。

この制御ユニット２９は、第１のビームスプリッタユニット１０および第２のビームスプリッタユニット１６の切り換えを制御するとともに、共焦点レンズ１７による結像位置を共焦点絞り２２の中心へ導くための平行平面板状の光学素子１９の傾きを制御し、同様に、第１のビームスプリッタユニット１０および第３のビームスプリッタユニット１１６の切り換えを制御するとともに、共焦点レンズ１１７による結像位置を共焦点絞り１２２の中心へ導くための平行平面板状の光学素子１１９の傾きを制御する。

この場合、制御ユニット２９は、第１のビームスプリッタユニット１０、第２のビームスプリッタユニット１６および第３のビームスプリッタユニット１１６の切り換え時のターレットの回転中心軸のぶれ、位置決めのためのクリック位置精度のばらつき、各ビームスプリッタの角度誤差などに原因する共焦点絞り２２（１２２）に対する共焦点レンズ１７（１１７）の結像位置の位置ずれを補正するための補正情報を補正手段を構成する記憶手段２９１に記憶しており、これら第１のビームスプリッタユニット１０、第２のビームスプリッタユニット１６および第３のビームスプリッタユニット１１６の切り換えに応じて記憶手段２９１より、対応する補正情報を読み出し、平行平面板状の光学素子１９、１１９の傾き量を制御するようになっている。

ここで、上述した補正情報の具体的な取得方法の一例を簡単に説明する。

まず、第１の分光チャンネル１００について、第１のビームスプリッタユニット１０に保持されるビームスプリッタ１０ａと第２のビームスプリッタユニット１６に保持されるビームスプリッタ１６ａとの組合せの誤差に応じた第１の駆動装置２０ａと第２の駆動装置２１ａの補正情報の取得について説明する。

この場合、標本１５として、蛍光を発生する不図示の標準標本（例えば蛍光板）を用いて、アルゴンレーザ２からの４８８ｎｍの波長レーザ光により標準標本から発生する蛍光の分光データを取得する。ここで、分光ユニット２４内の回折格子ガルバノミラー２５の回転角を一定の角度に固定し、スリット２７のスリット幅を駆動装置２７ａにより最大のスリット幅にする。これは、フォトマルチプライヤー２８で受光する蛍光の光量を効率よく受光するためである。なお、回折格子ガルバノミラー２５を４８８ｎｍの波長より長い波長がスリット２７を通過しフォトマルチプライヤー２８で受光される角度にしておくとより効果的である。

次に、ＸＹスキャナミラー１１を２次元走査しながら、第１の駆動装置２０ａを駆動して、平行平面板状の光学素子１９を第１の回転軸２０を中心に回転させる。このとき第２の駆動装置２１ａは停止させておく。第１の駆動装置２０ａの駆動により、共焦点レンズ１７を通過した蛍光は、光軸１８に平行に移動される。結像位置の中心が共焦点絞り２２の中心に近づくにつれて、フォトマルチプライヤー２８で受光する光量が大きくなり、結像位置の中心と共焦点絞り２２の中心が最も近づいたとき最大の光量が受光される。

そのまま第１の回転軸２０を中心に平行平面板状の光学素子１９を回転させると、フォトマルチプライヤー２８で受光される光量が小さくなるので、この時点でＸＹスキャナミラー１１の走査を停止し、光量が最大となった時の第１の駆動装置２０ａの状態を補正情報として記憶手段２９１に記憶させる。

第２の駆動装置２１ａについても同様にＸＹスキャナミラー１１を走査しながら、第２の回転軸２１を中心に平行平面板状の光学素子１９を回転させる。これにより、蛍光が光軸１８に平行に移動するので、結像位置の中心と共焦点絞り２２の中心が最も近づいたとき光量が最大となる。この状態を第２の駆動装置２１ａの補正情報として記憶手段２９１に記憶させる。

これら２つの記憶した補正情報の位置の周辺に共焦点絞り２２の中心位置があるので、先ほど得られた２つの補正情報の位置を中心として、その周辺に蛍光の主光線が移動するように特定の間隔で各駆動装置を駆動して、平行平面板状の光学素子１９の傾きを変えながら２次元走査を行う。この調整においてフォトマルチプライヤー２８で受光される光量が最大となるところが、共焦点絞り２２の中心と共焦点レンズ１７の結像位置が一致した状態となる。

このとき得られた、それぞれの補正情報を記憶手段２９１に記憶させることで、第１の駆動装置２０ａと第２の駆動装置２１ａの２つの補正情報として扱うことができる。そして、これらの補正情報を用いることで、ビームスプリッタ１０ａに対する共焦点レンズ１７の結像位置と共焦点絞り２２の中心位置のずれを調整することができる。

このような補正情報の取得を第１のビームスプリッタユニット１０のビームスプリッタ１０ａと１０ｂ（１０ｃ）と第２のビームスプリッタユニット１６のビームスプリッタ１６ａと１６ｂ（１６ｃ）とのすべての組合せで行い、それぞれの補正情報を記憶手段２９１に記憶させることで、いずれのビームスプリッタが光路上に選択されても、正確に共焦点レンズ１７の結像位置と共焦点絞り２２の中心位置のずれを補正することができる。

同様に、第３のビームスプリッタユニット１１６による反射光を検出する第２の分光チャンネル２００についても、第２のビームスプリッタユニット１６に検出光を透過するビームスプリッタ１６ｃを設定しておき、第１のビームスプリッタユニット１０のビームスプリッタ１０ａと１０ｂ（１０ｃ）と第３のビームスプリッタユニット１１６のビームスプリッタ１１６ａと１１６ｂ（１１６ｃ）とのすべての組合せについて、それぞれ補正情報を取得し、これら得られた補正情報を記憶手段２９１を用いて記憶させることで、第１の駆動装置１２０ａと第２の駆動装置１２１ａの２つの補正情報として扱うことができる。そして、これらの補正情報を用いることで、いずれのビームスプリッタが光路上に選択されても、正確に共焦点レンズ１１７の結像位置と共焦点絞り１２２の中心位置のずれを補正することができる。

次に、このように構成した実施の形態の作用を説明する。

まず、制御ユニット２９により第１のビームスプリッタユニット１０のビームスプリッタ１０ａを光路上に切り換え、レーザ光源ユニット１の４８８ｎｍの波長の光を発振するアルゴンレーザ２と５４３ｎｍの波長の光を発振するグリーンヘリウムネオンレーザ３からのレーザ光を標本１５に照射し、標本１５から発生する蛍光の分析データを取得する場合を説明する。また、標本１５には、５２０ｎｍと５８０ｎｍにそれぞれ蛍光波長のピークを有するＦＩＴＣとＲｈｏｄａｍｉｎｅ−Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎの色素で２重染色がなされているものとする。

レーザ光源ユニット１のＡＯＴＦ６により４８８ｎｍの波長と５４３ｎｍの波長のレーザ光が選択されると、これら４８８ｎｍの波長と５４３ｎｍの波長のレーザ光は、シングルモードファイバ７を介してスキャナユニット８に導かれる。

スキャナユニット８に導かれたレーザ光は、コリメートレンズ９で平行光になって、ビームスプリッタ１０ａで反射され、ＸＹスキャナミラー１１で２次元走査され、瞳投影レンズ１２、結像レンズ１３、対物レンズ１４を介して標本１５に結像される。

標本１５から発生された蛍光は、レーザ光と逆の経路をたどり対物レンズ１４、結像レンズ１３、瞳投影レンズ１２、ＸＹスキャナミラー１１を介してビームスプリッタ１０ａまで戻る。ビームスプリッタ１０ａまで戻った蛍光は、このビームスプリッタ１０ａを透過し、第２のビームスプリッタユニット１６に導かれる。

ここで、第２のビームスプリッタユニット１６は、制御ユニット２９によりビームスプリッタ１６ｂが光路に挿入されているものとする。これにより、標本１５からの蛍光のうち、５６０ｎｍ以下の波長、詳しくは５２０ｎｍにピークを有するＦＩＴＣによる蛍光は、ビームスプリッタ１６ｂで反射し、第１の分光チャンネル１００に導入され、共焦点レンズ１７を介して共焦点絞り２２上に結像される。

この場合、第１のビームスプリッタユニット１０と第２のビームスプリッタユニット１６での切り換えにより、これら第１のビームスプリッタユニット１０および第２のビームスプリッタユニット１６のターレットの回転中心軸のぶれ、位置決めのためのクリック位置精度のばらつき、ビームスプリッタ１０ａおよびビームスプリッタ１６ｂの角度誤差などにより共焦点絞り２２での結像位置が中心からずれることがある。すると、制御ユニット２９は、このときの切り換え状態に応じて記憶手段２９１に記憶されている補正情報を読み出す。そして、この補正情報に基づいて、平行平面板状の光学素子１９の第１の駆動装置２０ａと第２の駆動装置２１ａの駆動を制御し、第１の回転軸２０と第２の回転軸２１をそれぞれ中心に平行平面板状の光学素子１９を回転させ、光軸１８に対する傾きを調整することにより、共焦点レンズ１７の結像位置を共焦点絞り２２の中心に一致させる。

共焦点絞り２２を通過した蛍光は、拡散光となってコリメートレンズ２３に入射し、平行光に変換される。平行光となった蛍光は、分光ユニット２４に導入され、回折格子ガルバノミラー２５に入射して回折格子の分散作用により、スペクトル成分へ分解される。

スペクトル分解された蛍光は、集光レンズ２６によりスリット２７上に結像する。このとき、スリット２７のスリット幅を駆動装置２７ａにより変えることで、フォトマルチプライヤー２８で受光するスペクトル幅を変えることができる。また、回折格子ガルバノミラー２５を回転（走査）することで、受光できるスペクトル波長範囲を変えることができる。つまり、スリット２７のスリット幅の設定と回折格子ガルバノミラー２５の走査を行うことで、所望の分光データを取得することができる。

このようにすれば、標本１５上で走査されるレーザ光の走査ピクセルごとに予め設定したスリット幅の設定（スペクトル成分の分解能の設定）で回折格子ガルバノミラー２５の走査を行うことで、分光データの取得を行うようになるが、このとき、平行平面板状の光学素子１９の傾き調整により共焦点レンズ１７の結像位置と共焦点絞り２２の中心位置とのずれが補正され、共焦点絞り２２上の結像位置と共焦点絞り２２の中心が一致しているので、コリメートレンズ２３を出射した平行光の角度は常に一定となり、第１のビームスプリッタユニット１０および第２のビームスプリッタユニット１６を切換えても、回折格子ガルバノミラー２５へ入射する蛍光に角度ずれが生じることがない。このため、常に回折格子ガルバノミラー２５の回折格子で分散される各スペクトル成分の分散角度が安定し、さらにスペクトルの分散方向へのズレも生じないので、固定マスク２７ｄ、２７ｅをスペクトルの光束径に対し、予めぎりぎりまで狭めて調整してくことができ、漏れ光や共焦点絞り２２の回折光などの影響を極力カットできることから、スペクトル成分データの情報が安定した分光データを取得することができる。

一方、標本１５からの蛍光のうち、５６０ｎｍより大きい波長、詳しくは５８０ｎｍにピークを有するＲｈｏｄａｍｉｎｅ−Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎによる蛍光は、第２のビームスプリッタユニット１６のビームスプリッタ１６ｂを通過し、第３のビームスプリッタユニット１１６に導かれる。ここで、第３のビームスプリッタユニット１１６は、制御ユニット２９によりビームスプリッタ１１６ｂが光路に挿入されているものとする。これにより、６３０ｎｍ以下の波長、すなわちＲｈｏｄａｍｉｎｅ−Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎによる蛍光は、ビームスプリッタ１１６ｂで反射し、第２の分光チャンネル２００に導入され、共焦点レンズ１１７を介して共焦点絞り１２２上に結像される。この後の動作は、第２のビームスプリッタユニット１６により反射されたＦＩＴＣの蛍光の場合と同様なので、説明は省略する。

この場合も、第１のビームスプリッタユニット１０および第３のビームスプリッタユニット１１６での切り換えにより、これら第１のビームスプリッタユニット１０および第３のビームスプリッタユニット１１６のターレットの回転中心軸のぶれ、位置決めのためのクリック位置精度のばらつき、ビームスプリッタ１０ａ１６１ｂの角度誤差などにより共焦点絞り２２での結像位置が中心からずれることがある。すると、制御ユニット２９は、このときの切り換え状態に応じて予め記憶手段２９１に記憶されている補正情報を読み出す。そして、この情報に基づいて、平行平面板状の光学素子１１９の第１の駆動装置１２０ａと第２の駆動装置１２１ａの駆動を制御し、第１の回転軸１２０と第２の回転軸１２１をそれぞれ中心に平行平面板状の光学素子１１９を回転させ、光軸１８に対する傾きを調整することにより、共焦点レンズ１１７の結像位置を共焦点絞り１２２の中心に一致させる。

従って、このようにしても、第１の分光チャンネル１００と同様に、常に回折格子ガルバノミラー１２５で分散される各スペクトル成分の分散角度が安定し、スペクトル成分のデータ情報が安定した分光データを取得することができる。

なお、第２のビームスプリッタユニット１６と第３のビームスプリッタユニット１１６は、目的にあわせ適宜切換えが可能で、例えば第２のビームスプリッタユニット１６に全反射ミラーのビームスプリッタ１６ａを設定して、標本１５からの全ての検出光を第２のビームスプリッタユニット１６による反射光を検出する第１の分光チャンネル１００で処理することも可能である。

また、第２のビームスプリッタユニット１６と第３のビームスプリッタユニット１１６に全ての波長域の光線を透過するビームスプリッタ１６ｃとビームスプリッタ１１６ｃをそれぞれ設定すれば、図示しないオプションの第３の分光チャンネルで検出光を処理することが可能となる。

さらに、第２のビームスプリッタユニット１６に、５６０ｎｍ以下の波長を反射し、それ以上の波長を透過するビームスプリッタ１６ｂを、第３のビームスプリッタユニット１１６に、６３０ｎｍ以下の波長を反射し、それ以上の波長を透過するビームスプリッタ１１６ｂを設定すれば、検出光のうちの５６０ｎｍ以下の波長を第１の分光チャンネル１００で、５６０ｎｍより大きくて６３０ｎｍ以下の波長を、第３のビームスプリッタユニット１１６による反射光を検出する第２の分光チャンネル２００で、６３０ｎｍより大きい波長を図示しない第３の分光チャンネルで処理することが可能となる。

従って、このようにすれば、標本１５からの検出光を第２のビームスプリッタユニット１６および第３のビームスプリッタユニット１１６により第１の分光チャンネル１００と第２の分光チャンネル２００に分割し、それぞれの分光チャンネル１００，２００ごとに設けられる検出光を結像する共焦点レンズ１７（１１７）と共焦点レンズの焦点位置に配置される共焦点絞り２２（１２２）との間に、共焦点レンズの結像位置と共焦点絞りの中心位置とのずれを補正する平行平面板状の光学素子１９（１１９）を設けるようにしたので、共焦点絞り２２（１２２）を出射する光線の光軸の角度、位置がそれぞれ第１の分光チャンネル１００と第２の分光チャンネル２００で常に一定にできる。これにより、分光データを取得する場合に、分光ユニット２４の回折格子ガルバノミラー２５に入射する光線の角度を常に一定に保つことができるので、スペクトル成分の情報が安定した分光データを取得することができる。

また、第１の分光チャンネル１００と第２の分光チャンネル２００ごとにピンホールである共焦点絞り２２（１２２）が設けられているので、各チャンネルで取り込む波長にあわせて、最適なピンホール径を独立に設定できる。

さらに、予め第１のビームスプリッタユニット１０、第２のビームスプリッタユニット１６および第３のビームスプリッタユニット１１６でのビームスプリッタの切換えに関する誤差に応じた補正情報を予め記憶手段２９１に記憶していて、この補正情報に基づいて共焦点レンズ１７（１１７）の結像位置と共焦点絞り２２（１２２）の中心位置とのずれを補正しているので、精度の高いずれ補正を行なうことができる。

さらにまた、共焦点レンズ１７（１１７）と共焦点絞り２２（１２２）との間の光軸上に平行平面板状の光学素子１９（１１９）を配置し、この平行平面板状の光学素子１９（１１９）の光軸に対する傾きを変更するのみで、ずれ補正を行なっているので、構成を簡単にでき、動作の信頼性が高く、価格的にも安価にできる。

なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。例えば、それぞれのビームスプリッタユニットに装着してあるビームスプリッタは本例のものに限定されるものではなく、目的に合わせて種々設定が可能であることはいうまでもない。また本例では検出光路のチャンネル数は３チャンネルとなっているが、これに限定するものではなく、何チャンネルでも応用が可能である。

さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。

本発明にかかるレーザ顕微鏡の一実施の形態の概略構成を示す図。 一実施の形態に用いられる平行平面板状の光学素子の駆動装置の概略構成を示す図。 一実施の形態に用いられるスリットと駆動装置の概略構成を示す図。

符号の説明

１…レーザ光源ユニット、２…アルゴンレーザ
３…グリーンヘリウムネオンレーザ、４…反射ミラー
５…ダイクロイックミラー、６…ＡＯＴＦ
７…シングルモードファイバ、８…スキャナユニット
９…コリメートレンズ、１０…第１のビームスプリッタユニット
１０ａ．１０ｂ、１０ｃ…ビームスプリッタ、１０ｄ…モータ
１１…ＸＹスキャナミラー、１１ａ．１１ｂ…ミラー
１２…瞳投影レンズ、１３…結像レンズ、１４…対物レンズ
１５…標本、１６…第２のビームスプリッタユニット
１６ａ．１６ｂ、１６ｃ…ビームスプリッタ、１６ｄ…モータ
１７…共焦点レンズ、１８…光軸、１９…光学素子
１９．１１９…光学素子、２０…第１の回転軸
２０ａ…第１の駆動装置、２１…第２の回転軸
２１ａ…第２の駆動装置、２０１…支持金具
２２…共焦点絞り、２２ａ…駆動装置、２３…コリメートレンズ
２４…分光ユニット、２５…回折格子ガルバノミラー
２５ａ…回転方向、２６…集光レンズ、２７…スリット
２７ａ…駆動装置、２７ｂ．２７ｃ…移動スリット
２７ｄ．２７ｅ…固定マスク、２８…フォトマルチプライヤー
２９…制御ユニット、２９１…記憶手段、１１６…第３のビームスプリッタユニット
１１６ａ．１１６ｂ、１１６ｃ…ビームスプリッタ
１１６ｄ…モータ、１１７…共焦点レンズ、１１９…光学素子
１２０…第１の回転軸、１２０ａ…第１の駆動装置
１２１…第２の回転軸、１２１ａ…第２の駆動装置
１２２…共焦点絞り、１２２ａ…駆動装置
１２４…分光ユニット、１２５…回折格子ガルバノミラー
１２６…集光レンズ、１２７…スリット、１２７ａ…駆動装置
１２８…フォトマルチプライヤー、１００…第１の分光チャンネル
２００…第２の分光チャンネル

Claims (4)

1. レーザ光を発生するレーザ光源と、
   前記レーザ光源からのレーザ光を標本に照射する照明光学系と、
   前記レーザ光の波長ごとに切換え可能に設けられる波長選択光学素子を有するとともに、前記標本からの検出光を複数のチャンネルに分割する光路分割手段と、
   前記チャンネルごとに設けられ、少なくとも前記検出光を結像する共焦点レンズ、該共焦点レンズの焦点位置に配置される共焦点絞りを有する検出光学系と、
   前記共焦点絞りを通った検出光を取り込みスペクトル分解して分光データを検出する分光手段と、
   前記共焦点レンズと共焦点絞りとの間に配置され、前記共焦点レンズの結像位置と前記共焦点絞りの中心位置とのずれを補正することによって前記分光手段に入射する検出光の角度を一定にする補正手段と
   を具備したことを特徴とするレーザ顕微鏡。
2. 前記補正手段は、前記光路分割手段の波長選択光学素子の切換えに関する誤差に応じた補正情報を記憶する記憶手段を有し、前記波長選択光学素子の切換えにより、前記記憶手段に記憶された補正情報に基づいて前記分光手段に入射する検出光の角度を一定に補正することを特徴とする請求項１記載のレーザ顕微鏡。
3. 前記補正手段は、前記共焦点レンズと共焦点絞りとの間の光軸上に配置される平行平面板状の光学素子を有し、前記記憶手段に記憶された補正情報に基づいて前記平行平面板状の光学素子の前記光軸に対する傾きを変更可能にしたことを特徴とする請求項２記載のレーザ顕微鏡。
4. 前記光路分割手段は、前記波長選択光学素子として、ターレットに搭載された複数のビームスプリッタを有し、前記ターレットにより前記ビームスプリッタの切換えを可能にしたことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。

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