JP2017219400A - レーザ顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】複数の励起光を用いたλスキャンを実行する際においても、正確な蛍光の分光スペクトルを取得することができるような観察技術を提供する。
【解決手段】レーザ顕微鏡１は、標本Ｓに励起光を照射することで標本Ｓから発生する蛍光を分光して検出するレーザ顕微鏡であって、標本Ｓから発生する蛍光と励起光を波長に応じて分離し、その分離する波長を変更可能な蛍光分離手段であるフィルタユニット１８と、フィルタユニット１８によって分離された蛍光を分光する回折格子２２と、ＰＭＴ２６によって検出される回折格子２２によって分光された蛍光の波長を変更するミラー２３と、フィルタユニット１８を制御する制御ユニット３０と、を備え、制御ユニット３０は、ミラー２３による、ＰＭＴ２６によって検出される回折格子２２によって分光された蛍光の波長の変更に応じて、フィルタユニット１８が分離する波長の変更を制御することを特徴とする。
【選択図】図１

Description

本発明は、標本から発生する蛍光を分光して検出するレーザ顕微鏡に関する。

従来、レーザ顕微鏡を用いて蛍光の分光スペクトルを取得する方法として、標本へ励起光を照射することで発生する蛍光を分光し、さらに分光した蛍光が検出器で検出される波長を変更していくことでその蛍光の分光スペクトルを取得する方法（以下λスキャンと記載する）が知られている。λスキャンは、例えば、分光した蛍光を検出器へ送るためのミラーの反射角度を変更することによって行われる。

また、標本を異なる複数の蛍光色素によって予め多重染色しておき、照射する励起光の波長を変更しながらλスキャンを実行することで、複数の蛍光色素に対応する蛍光の分光スペクトルを一度のλスキャンによって取得することもできる。そのような技術は、例えば、特許文献１に記載されている。

上記のような複数の蛍光色素によって多重染色された標本についてλスキャンを行う場合、取得する蛍光の波長に合わせて波長の異なる複数の励起光を照射することになる。従って、励起光と蛍光を分離する構成において、使用する複数の励起光を蛍光に対して分離する必要がある。複数の励起光を分離する構成としては、複数の波長域で光を透過するようなマルチバンドパスのダイクロイックミラー（以下、ＤＭとも記載する）を使用することが考えられる。

特開2005-326351号公報

一方で、複数の励起光を用いたλスキャンを実行する際にマルチバンドパスのＤＭを使用した場合、励起光を分離するための励起波長域（ＤＭによって検出光路から除外される波長域）と検出する蛍光波長域が重なると、その重なった波長域において蛍光の分光スペクトルを取得することができないという問題が生じ得る。

また、例えば、蛍光を検出する構成としてビームスプリッターを用いた場合、標本を反射した励起光が検出器に入り込んでしまうため、ノイズが多く発生して正確な蛍光の分光スペクトルを取得することができないという問題が生じ得る。

以上の実情を鑑みて、本発明では、複数の励起光を用いたλスキャンを実行する際においても、正確な蛍光の分光スペクトルを取得することができるような観察技術を提供することを目的とする。

本発明の一態様のレーザ顕微鏡は、標本に励起光を照射することで前記標本から発生する蛍光を分光して検出するレーザ顕微鏡であって、前記標本から発生する前記蛍光と前記励起光を波長に応じて分離し、その分離する波長を変更可能な蛍光分離手段と、前記蛍光分離手段によって分離された前記蛍光を分光する分光手段と、検出器によって検出される前記分光手段によって分光された前記蛍光の波長を変更する検出波長変更手段と、前記蛍光分離手段を制御する制御手段と、を備え、前記制御手段は、前記検出波長変更手段による、前記検出器によって検出される前記分光手段によって分光された前記蛍光の波長の変更に応じて、前記蛍光分離手段が分離する波長の変更を制御する。

本発明のレーザ顕微鏡によれば、複数の励起光を用いたλスキャンを実行する際においても、正確な蛍光の分光スペクトルを取得することができる。

第１の実施形態におけるレーザ顕微鏡の構成を示す図。 光源の状態と、その状態における検出器が検出を行う残りの検出波長域を示す図。 別の光源の状態と、その状態における検出器が検出を行う残りの検出波長域を示す図。 さらに別の光源の状態と、その状態における検出器が検出を行う残りの検出波長域を示す図。 さらに別の光源の状態と、その状態における検出器が検出を行う残りの検出波長域を示す図。 マルチバンドパスのＤＭを光学フィルタとして用いた場合に検出される分光スペクトルの一例を示す図。 光学フィルタが配置された状態での、検出される蛍光の分光スペクトルを示す図。 別の光学フィルタが配置された状態での、検出される蛍光の分光スペクトルを示す図。 さらに別の光学フィルタが配置された状態での、検出される蛍光の分光スペクトルを示す図。 さらに別の光学フィルタが配置された状態での、検出される蛍光の分光スペクトルを示す図。 第１の実施形態のレーザ顕微鏡を用いて行う、λスキャンに応じて、光源の切替と、フィルタユニットの光学フィルタの切替の制御の手順を示すフローチャート。 図１１のフローチャートによって検出される蛍光の分光スペクトルを示す図。 第２の実施形態におけるレーザ顕微鏡の構成を示す図。 第３の実施形態におけるレーザ顕微鏡の構成を示す図。 第３の実施形態のレーザ顕微鏡を用いて行う、λスキャンに応じて、光源の切替と、フィルタユニットの光学フィルタの切替の制御の手順を示すフローチャート。 光学フィルタが配置された状態での、検出される蛍光の分光スペクトルを示す図。 別の光学フィルタが配置された状態での、検出される蛍光の分光スペクトルを示す図。 第４の実施形態におけるレーザ顕微鏡の構成を示す図。

本発明の第１の実施形態におけるレーザ顕微鏡について、図面を用いて説明する。図１は、第１の実施形態におけるレーザ顕微鏡１の構成を示す図である。レーザ顕微鏡１は、標本から発生する蛍光を分光して検出するレーザ顕微鏡であって、照射する励起光の波長が異なる光源２〜５と、ダイクロイックミラー（ＤＭ）６〜９と、カップリングレンズ１１と、光ファイバー１０と、コリメートレンズ１２と、フィルタユニット１８と、スキャンミラー１３と、瞳投影レンズ１４と、結像レンズ１５と、ミラー１６と、対物レンズ１７と、標本Ｓを固定する図示しないステージと、共焦点レンズ１９と、共焦点ピンホール２０と、コリメートレンズ２１と、回折格子２２と、ミラー２３と、集光レンズ２４と、スリット２５と、高感度光検出器である光電子増倍管（photomultiplier tube：PMT）２６と、制御ユニット３０とを備えている。

光源２〜５は、それぞれ出力する励起光の波長が異なり、光源毎に励起光のON、OFFの切替がなされる。つまり、光源２〜５は、光ファイバー１０等を経由し、対物レンズ１７を通して標本Ｓへ照射する励起光を、波長の異なる複数の励起光の中から選択的に出力可能な光源ユニットとして機能する。尚、光源毎のON、OFFの切替は、後述する制御ユニット３０によって制御される。また、本実施形態において使用する励起光を、光源２が出力する励起光の波長を４０５ｎｍ、光源３が出力する励起光の波長を４８８ｎｍ、光源４が出力する励起光の波長を５６１ｎｍ、光源５が出力する励起光の波長を６４０ｎｍとして事実上規定する。

標本Ｓは、光源２〜５のそれぞれが出力する励起光を吸収して蛍光を発するような複数の蛍光色素によって予め染色されている。尚、光源２〜５の出力する各励起光の波長は、対応する蛍光色素の励起スペクトルのピーク波長であってもよい。

スキャンミラー１３は、ＯＮにされた光源から出力される励起光が標本Ｓ上に照射される位置を対物レンズ１７の光軸に垂直な平面上で変更することで、その励起光を用いた標本Ｓの走査を行う。例えば、スキャンミラー１３は、ラスタスキャンを実行するための一対のガルバノミラーからなる構成が考えられる。

フィルタユニット１８は、透過させる光と反射させる光とをそれぞれ異なる特定の波長で分離する光学フィルタ１８ａ、１８ｂ、１８ｃ、１８ｄを含み、光路上に配置する光学フィルタを切替可能な構成を有している。図１では、光学フィルタ１８ａが光路上に配置されている様子を示している。フィルタユニット１８は、例えば、光路上に配置する光学フィルタを切り替える駆動機構を有するフィルタカセットである。

フィルタユニット１８が含む各光学フィルタは、ある特定の波長より短い光を反射させ、ある特定の波長以上の光を透過させるようなロングパスフィルタであり、光学フィルタ毎に上記分離する特定の波長が異なる。より詳しくは、フィルタユニット１８は、光源２〜５のそれぞれが出力する励起光の波長より僅かに長い波長を特定の波長とするような、光源２〜５のそれぞれに対応する光学フィルタ１８ａ、１８ｂ、１８ｃ、１８ｄを含んでいる。フィルタユニット１８は、標本Ｓから発生する蛍光と励起光を波長に応じて分離する蛍光分離手段であり、その分離する波長は各光学フィルタの切替に対応して変更することができる。使用する光源に対応する光学フィルタ（使用する光源の励起波長より僅かに長い波長で分離する光学フィルタ）を光路上に配置することで、検出器であるPMT２６へ向かう検出光路中に励起光が入ることを防止すると共に、その励起光によって標本Ｓで発生する蛍光を検出光路中へ通過させる。尚、各光学フィルタの切替は、後述する制御ユニット３０によって制御される。

回折格子２２は、コリメートレンズ２１によりコリメートされた蛍光（フィルタユニット１８により分離された励起光は含まれない）を分光する回折格子である。即ち、回折格子２２は、蛍光分離手段であるフィルタユニット１８によって分離された蛍光を分光する分光手段である。

ミラー２３は、回折格子２２により分光された蛍光を反射するミラーであり、角度を変更することで、PMT２６へ入射する蛍光の波長を変更することができる。即ち、ミラー２３の角度を変更することで、波長を横軸として縦軸に蛍光の強度を表すような、蛍光の分光スペクトルを得るスキャンを行うことが可能である。以下、そのようなスキャンをλスキャンと表記する。また、ミラー２３は、検出器であるPMT２６によって検出される蛍光の波長を変更する検出波長変更手段であるともいえる。尚、本実施形態では、λスキャンは、検出される波長が短波長側から長波長側へ変更されるようにミラー２３の角度を変更する。

制御ユニット３０は、レーザ顕微鏡１が含む各ユニットの動作を制御するような制御装置であり、例えば、コンピュータである。制御ユニット３０は、特に本実施形態において、ミラー２３の角度の変更と、光源２〜５のON、OFFの切替と、フィルタユニット１８が含む光学フィルタのうち光路上へ配置する光学フィルタの切替、即ち蛍光分離手段とを制御する制御手段である。より詳しくは、制御ユニット３０は、ミラー２３の角度を変更することで行うλスキャンに応じて、光源２〜５のON、OFFの切替と、蛍光分離手段であるフィルタユニット１８が含む光学フィルタの切替、即ち、蛍光分離手段が分離する波長の変更とを制御する。

以上の構成を有するレーザ顕微鏡１によって、特に制御ユニット３０が実行する制御によって、複数の励起光を用いてλスキャンを実行する場合においても、正確な蛍光の分光スペクトルを取得することができる。ここで、本実施形態の制御ユニット３０が実行する制御を説明する前に、複数の励起光を用いてλスキャンを実行する方法について説明する。

以下、図２から図５を用いて、複数の励起光を切り替えてλスキャンを行う方法、即ちλスキャンに応じて使用する光源の切替を実行する方法について説明する。図２から図５では、本実施形態と同様の４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ、６４０ｎｍに対応する４つの励起光を切り替えてλスキャンを実行する場合を記載する。λスキャンを開始する波長（検出器であるＰＭＴ２６が検出を開始する波長）は、出力する励起光のうち最も低い波長よりも僅かに長い波長とされる。これは、標本Ｓで発生する蛍光は、励起光よりも長波長側に表れるためであり、図２〜５の例では、４０５ｎｍの励起光よりも僅かに長い４０５ｎｍ＋Δλを、λスキャンを開始する波長とする。尚、Δλは、励起光が検出器に漏れ込まないようにあらかじめ設定された値である。Δλは、レーザの中心波長の公差程度の値であり、例えば、公称値４０５ｎｍの半導体レーザの中心波長が４０５±５ｎｍとすると、Δλは５ｎｍを超えた程度の値となる。Δλを大きくするほど蛍光画像に発生するノイズを低下させることができる。また、図２〜５の例では、λスキャンによってＰＭＴ２６が検出する検出波長域の終端を８００ｎｍと設定する。従って、この場合、λスキャンによって検出器が検出する全ての検出波長域は、４０５ｎｍ＋Δλから８００ｎｍまでとなる。

図２〜５は、各光源のON、OFFの状態と、その状態における、検出器であるＰＭＴ２６が検出を行う残りの検出波長域を示す図である。図２〜５において、状態Iは、４０５ｎｍの励起光を出力する光源のON、OFFの状態を示し、同様に状態II〜IVは、それぞれ４８８ｎｍ、５６１ｎｍ、６４０ｎｍの励起光を出力する光源のON、OFFの状態を示している。図中で状態I〜IVが実線で示される場合対応する光源がＯＮとなっている状態を示し、破線で示される場合対応する光源がＯＦＦになっている状態を示している。例えば、図２では、状態Iが実線であるため、４０５ｎｍの励起光を出力する光源がＯＮであり、それ以外の状態II〜IVが破線で示されるため、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ、６４０ｎｍの励起光を出力する光源がＯＦＦであることを示している。

また、図２〜５において、大きな破線で囲まれる領域Ｗが、各図に示す状態において、検出器であるＰＭＴ２６が検出を行う残りの検出波長域を示している。

最初は、図２の検出波長域においてλスキャンを実行していき、４０５ｎｍの励起光によって標本Ｓで発生する蛍光の分光スペクトルを順次取得していく。ここで、現在検出している検出波長が、短波長側から数えて二つ目の光源（本実施形態の構成の光源３）の励起光の波長である４８８ｎｍを、例えばΔλだけ超えたとき、４８８ｎｍの励起光を出力する光源をＯＮにする。このとき、λスキャンを行う残りの検出波長域は、図３に示すように、４８８ｎｍ＋Δλから検出波長域の終端である８００ｎｍまでとなる。

以降、同様に図３に示した残りの検出波長域（図３の領域Ｗ）においてλスキャンを実行していき、さらに３つ目の光源（本実施形態の構成の光源４）の励起光の波長である５６１ｎｍをΔλだけ超えたとき、５６１ｎｍの励起光を出力する光源をＯＮにする（図４の状態）。その後、同様に図４に示す残りの検出波長域（図４の領域Ｗ）においてλスキャンを実行していき、さらに４つ目の光源（本実施形態の構成の光源５）の励起光の波長である６４０ｎｍをΔλだけ超えたとき、６４０ｎｍの励起光を出力する光源をＯＮにし（図５の状態）、設定した波長域の終端の８００ｎｍまでλスキャンを実行する。

以上の方法では、複数の励起光を用い、順次切り替えてλスキャンを実行することで、蛍光の分光スペクトルを取得できる。一方で、光源をＯＮにしている状態では、励起光が検出器で検出されないように、励起光を分離する必要がある。このとき従来では、例えば、複数の波長域で光を透過するようなマルチバンドパスのＤＭを光学フィルタとして用いることで、複数の励起光を照射する場合においても、各励起光を検出器から分離することが考えられた。

図６は、各光源の励起光の波長を透過しないようなＤＭを光学フィルタとして用いた場合であって、４８８ｎｍの励起光を標本Ｓへ照射したときに検出される分光スペクトルの様子を示している。図６では、横軸に波長を示し、縦軸に光の透過率（Ｔ（％））を示している。また、破線Ａで囲まれた領域は、光学フィルタ（ここでは、マルチバンドパスのＤＭ）が検出可能な光の波長域を示し、一点鎖線Ｂは発生する蛍光の分光スペクトルを示し、実線Ｃは光学フィルタを通して実際に検出器で検出される分光スペクトルを示す。図６を参照すると、発生した蛍光は、５６１ｎｍの励起光を除外する（ＤＭによって反射される）波長域において、除外されてしまい、一部の蛍光の分光スペクトルを検出器で検出することができなくなってしまう。このように、複数の異なる波長の励起光を照射することを想定し、その波長の励起光を除外するようなマルチバンドパスのＤＭを光学フィルタとして用いた場合には、測定する蛍光の波長のうち励起光の波長と被るような波長は、除外されてしまうといった問題が発生する。

本実施形態におけるレーザ顕微鏡１では、特に制御ユニット３０が実行する制御によって、複数の励起光を用いてλスキャンを実行する場合においても、上記のような問題を生じさせることなく、正確な蛍光の分光スペクトルを取得することができる。以下、制御ユニット３０が行う制御について図面を用いて詳細に説明する。

図７から図１０は、光源２〜５の各光源のそれぞれをＯＮにし、対応する光学フィルタ（使用する光源の励起波長より僅かに長い波長で分離する光学フィルタ）を設置した状態における、検出される蛍光の分光スペクトルを示す図である。図７では、光源２をＯＮにし、光源２に対応する光学フィルタ１８ａ（光源２が出力する励起光である４０５ｎｍよりも僅かに長い波長で分離するような光学フィルタ）を光路中へ配置した状態における蛍光の分光スペクトルを示す。破線Ａで囲まれた領域は、光学フィルタ（ここでは光学フィルタ１８ａ）が検出可能な光の波長域を示し、一点鎖線Ｂは発生する蛍光の分光スペクトルを示し、実線Ｃは光学フィルタを通して実際に検出器で検出される分光スペクトルを示す。図８〜１０についても同様に、光源３〜５の各光源をＯＮにし、対応する光学フィルタを設置した状態における分光スペクトルを示している。いずれの図においても、発生する蛍光の分光スペクトル（一点鎖線）と、光学フィルタを通して実際に検出器で検出される分光スペクトル（実線）とが略対応しており、発生する蛍光の分光スペクトルを検出することができているといえる。

即ち、励起光を検出器から除外しつつ、図７〜１０に示した状態における、実線Ｃで示されるような蛍光の分光スペクトルを途切れることなく検出できれば、本願の課題である正確な蛍光の分光スペクトルを取得することを達成することができる。

図１１は、制御ユニット３０が実行する、ミラー２３の角度の変更によるλスキャンに応じて、光源２〜５のON、OFFの切替と、フィルタユニット１８の光学フィルタの切替を行う制御の方法を示すフローチャートである。

以下、図１１のフローチャートを、説明する。尚、フローチャートの開始時においては、光源２〜５はいずれもＯＦＦの状態であるとする。λスキャンによって検出を行う検出波長域の終端を８００ｎｍに設定する。

図１１のフローチャートを開始すると、まずＯＮにする光源に関する数値であるｎを初期値である０に設定した上でステップＳ１へ移行する。ステップＳ１では、一つ目の光源である光源２をＯＮにし、光源２に対応する光学フィルタ１８ａ（光源２が出力する励起光である４０５ｎｍよりも僅かに長い波長で分離するような光学フィルタ）を光路中へ配置するようにフィルタユニット１８を制御する。その後、ミラー２３の角度の変更によるλスキャンが開始される。即ち、本フローチャートにおいて、λスキャンによってＰＭＴ２６が検出する全ての検出波長域は、光学フィルタ１８ａが分離する波長（４０５ｎｍよりも僅かに長い波長）から８００ｎｍである。

ステップＳ２では、全ての検出波長域をλスキャンしたかどうかを判定する。尚、前述したように本実施形態では、λスキャンによって検出を行う波長域の終端を８００ｎｍとしており、まだ検出波長域の終端である８００ｎｍまでスキャンはされない。そのため、最初のステップＳ２では、Ｎｏと判定されてステップＳ３へ移行する。

ステップＳ３では、λスキャンによって現在検出している検出波長が、光源３が出力する励起光の波長よりも長い波長となったかどうかを判定する。判定がＮｏである場合、そのままλスキャンを続行し、ステップＳ２とＳ３の判定を繰り返す。判定がＹｅｓである場合、ステップＳ４へ移行する。

ステップＳ４では、光源３をＯＮとし、また、光源３に対応する光学フィルタ１８ｂ（光源３が出力する励起光よりも僅かに長い波長で分離するような光学フィルタ）を光路中へ配置するようにフィルタユニット１８を制御する。尚、このとき、光源２についてはＯＮの状態のまま切替を行わない。つまり、ステップＳ４後は、光源２が出力する励起光によって発生する蛍光のうち実際に検出器で検出される分光スペクトル（図７の実線Ｃで示した分光スペクトル）と光源３が出力する励起光によって発生する蛍光のうち実際に検出器で検出される分光スペクトル（図８の実線Ｃで示した分光スペクトル）とが合成されて検出される状態となる。また、光学フィルタ１８ｂの配置までに時間が掛かる場合は、λスキャンを一旦停止し、光学フィルタ１８ｂの配置が完了するとλスキャンを再開することにしてもよい。

ステップＳ５では、全ての光源がＯＮであるか（光源２〜５の全てがＯＮであるか）を判定する。判定がＮｏの場合、ｎ＝ｎ＋１としてステップＳ２へ移行する。以下、ステップＳ２で判定がＹｅｓ、即ち全ての検出波長域をλスキャン済みであると判定されるか、ステップＳ５において全ての光源がＯＮとなるまで、ステップＳ２からＳ５を繰り返す。尚、ステップＳ２で判定がＹｅｓである場合には、本フローチャートを終了する。ステップＳ５で判定がＹｅｓとなった場合、ステップＳ６へ移行する。

ステップＳ６では、全ての検出波長域をλスキャン済みであると判定されるまで本ステップを繰り返し、全ての検出波長域をλスキャン済みであると判定されると、本フローチャートを終了する。

以上の図１１のフローチャートによって検出される蛍光の分光スペクトルを表示すると、図１２のようになる。実線Ｄは、図１１のフローチャートによって検出される蛍光の分光スペクトルを示している。図１１のフローチャートのステップＳ３では、λスキャンによる現在の検出波長が光源３＋ｎが出力する励起光の波長よりも長くなってから、光源３＋ｎをＯＮとし、対応する光学フィルタを設置するため、光源３＋ｎが出力する励起光が検出器で検出されてしまうことがなく、また、光学フィルタによってλスキャンによる現在の検出波長の蛍光が分離されてしまうといったこともない。即ち、実線Ｄで示される分光スペクトルは、図６の実線Ｃで示される分光スペクトルのように検出できていない蛍光がなく、λスキャンを実行した全ての検出波長域において、正確な蛍光の分光スペクトルを検出できていることがわかる。

従って、本実施形態におけるレーザ顕微鏡１によれば、複数の励起光を用いたλスキャンを実行する際においても、正確な蛍光の分光スペクトルを取得することができる。特に、レーザ顕微鏡１を用いた蛍光の分光スペクトルの取得の際には、λスキャンに応じて、光源の切替だけでなく、光路上に設置される光学フィルタの切替、即ち蛍光分離手段の制御が実行される。この蛍光分離手段の制御によって、検出している蛍光の波長に応じて分離する波長を変更することで、励起光が検出器で検出されてしまうことを防ぐと共に、蛍光の分光スペクトルを途切れることなく検出することができる。

また、ＤＭ６とカップリングレンズ１１の間に音響光学素子を設けて、標本Ｓへ照射する励起光を選択する構成としてもよい。その場合、光源２〜５を全てＯＮとし、音響光学素子によってカップリングレンズへ通過させる光を、光源２〜５がそれぞれ出力する励起光の波長毎に選択するようにして使用する。

また、本実施形態において図７で示した、λスキャンに応じて蛍光の分光スペクトルを取得する方法では、一度のλスキャンで全ての検出波長域から分光スペクトルを検出しているが、この方法に限らない。例えば、光源とその光源に対応する光学フィルタ毎にλスキャンをわけて行ってもよい。その場合、一つの光源をＯＮとし、その光源に対応する光学フィルタを設置した状態で蛍光の分光スペクトルを十分に検出し終わったら（例えば、蛍光の分光スペクトルが弱くなり検出されなくなった状態）、次の光源をＯＮとし、光路上に設置する光学フィルタをその光源に対応する光学フィルタに切り替えた状態で再度λスキャンにより蛍光の分光スペクトルを検出する。このとき、各λスキャンを行う検出波長域は、一部被っていても構わない。このような方法によれば、一度のλスキャンを実行する方法と比べて分光スペクトルの検出に時間はかかるが、より正確に分光スペクトルの検出を行うことができる。

以下、第２の実施形態におけるレーザ顕微鏡について説明する。図１３は、本実施形態におけるレーザ顕微鏡４０の構成を示す。レーザ顕微鏡４０は、フィルタユニット１８の代わりに、ビームスプリッター４１を備え、さらに、ビームスプリッター４１と共焦点レンズ１９との間の光路上にグラデーションフィルタ４２を備えている点において、レーザ顕微鏡１と異なっているが、その他の構成は、レーザ顕微鏡１と同様である。

ビームスプリッター４１は、例えば、入射する光の１/４を反射させ、３/４を透過させることで光を分離するものである。

グラデーションフィルタ４２は、透過させる光と反射させる光とを特定の波長に応じて分離する光学フィルタである点においては、第１の実施形態におけるフィルタユニット１８が含む各種光学フィルタと同様である。一方で、グラデーションフィルタ４２は、長辺方向の位置によって、膜厚が異なり、波長毎の透過率が異なっている。例えば、グラデーションフィルタ４２は、長辺方向の一方向に沿って、分離する波長（反射させる波長と透過させる波長の境目の波長）が長波長側へシフトしていくように、膜厚が調整されている。また、グラデーションフィルタ４２は、長辺方向にスライド移動させることが可能であり、光路上に設置される領域が、適宜変更される。即ち、グラデーションフィルタ４２は、標本Ｓから発生する蛍光と励起光を波長に応じて分離する蛍光分離手段であり、その分離する波長はグラデーションフィルタ４２をスライド移動させることによって変更することができる。

制御ユニット３０は、ミラー２３の角度を変更することで行うλスキャンに応じて、光源２〜５のON、OFFの切替とグラデーションフィルタ４２のスライド移動を制御する。

従って、レーザ顕微鏡４０によっても第１の実施形態のレーザ顕微鏡１と同様に、λスキャンに応じて、光源の切替と蛍光分離手段の制御を実行することで、複数の励起光を用いたλスキャンを実行する際においても、正確な蛍光の分光スペクトルを取得することができる。

また、レーザ顕微鏡４０は、蛍光分離手段として一種類のグラデーションフィルタ４２のみを構成として含んでいるため、レーザ顕微鏡１よりも少ない構成で同様の効果を実現できる。

以下、第３の実施形態におけるレーザ顕微鏡について説明する。図１４は、本実施形態におけるレーザ顕微鏡５０の構成を示す。レーザ顕微鏡５０は、フィルタユニット１８が備える光学フィルタの種類と、コリメートレンズ２１以降の検出器側の構成がレーザ顕微鏡１と異なっている。レーザ顕微鏡５０は、コリメートレンズ２１以降の検出器側の構成として、光路を２分割するＤＭ５１と、ＤＭ５１によって分割される１つの光路上に、回折格子５２と、ミラー５３と、集光レンズ５４と、スリット５５と、PMT５６と、を含んでいる。また、レーザ顕微鏡５０は、ＤＭ５１によって分割されるもう一つの光路上に、ミラー５７、５９と、回折格子５８と、集光レンズ６０と、スリット６１と、PMT６２と、を含んでいる。また、レーザ顕微鏡５０は、制御ユニット６５を備えている。ここで、回折格子５２、５８は、蛍光を分光する手段であり、ミラー５３、５９は、回折格子５２、５８によりそれぞれ分光された蛍光を反射するミラーであり、角度を変更していくことで、λスキャンを行うことができる。

また、ＤＭ５１は、光源４が出力する励起光の波長である５６１ｎｍよりも僅かに長い波長を分離する波長とし、その分離する波長よりも短い波長の光を反射し、その分離する波長以上の波長の光を透過する。

即ち、レーザ顕微鏡５０は、蛍光の分光スペクトルを取得する検出器を二つ備えたものであり、ＰＭＴ５６と、ＰＭＴ６２は、ＤＭ５１で分割されたそれぞれの波長域で蛍光の分光スペクトルの検出を行う。例えば、二種類の励起光を標本Ｓに照射して、発生する蛍光の分光スペクトルをＰＭＴ５６と、ＰＭＴ６２とで別々に検出することができ、検出器が一つしかない構成と比べて検出時間を短縮することができる。

また、フィルタユニット１８は、第１の実施形態における光学フィルタ１８ａ〜１８ｄの代わりに、光学フィルタ１８ｅ、１８ｆを含む。光学フィルタ１８ｅ、１８ｆは、使用する励起光の波長を含むようなある特定の波長域の光（ある特定の２波長で定まる、２波長間の波長域）を反射することで分離し、その特定の波長域の光以外の波長域の光を透過するようなノッチフィルタである。特に、光学フィルタ１８ｅは、光源２が出力する励起光の波長である４０５ｎｍを含み、４０５ｎｍの前後を僅かに含む波長域と、光源４が出力する励起光の波長である５６１ｎｍを含み、５６１ｎｍの前後を僅かに含む波長域と、を反射する特定の波長域とするようなノッチフィルタである。また、光学フィルタ１８ｆは、光源３が出力する励起光の波長である４８８ｎｍを含み、４８８ｎｍの前後を僅かに含む波長域と、光源５が出力する励起光の波長である６４０ｎｍを含み、６４０ｎｍの前後を僅かに含む波長域と、を反射する特定の波長域とするようなノッチフィルタである。

制御ユニット６５は、特に本実施形態において、ミラー５３、５９の角度の変更と、光源２〜５のON、OFFの切替と、フィルタユニット１８が含む光学フィルタのうち光路上へ配置する光学フィルタの切替とを制御する。より詳しくは、制御ユニット６５は、ミラー５３、５９の角度を変更することで行うλスキャンに応じて、光源２〜５のON、OFFの切替とフィルタユニット１８が含む光学フィルタの切替とを制御する。

以下、制御ユニット６５が行う制御の一例を、図面を用いて説明する。図１５は、制御ユニット６５が実行する、ミラー５３、５９の角度を変更することで行うλスキャンに応じて、光源２〜５のON、OFFの切替と、フィルタユニット１８の光学フィルタの切替の制御の手順を示すフローチャートである。

図１６、１７は、各光学フィルタが配置された状態での、検出される蛍光の分光スペクトルを示す図である。以下、図１５のフローチャートを、図１６、１７を参照しつつ説明する。尚、フローチャートの開始時においては、光源２〜５はいずれもＯＦＦの状態であるとする。λスキャンによって検出を行う検出波長域の終端を８００ｎｍに設定する。

図１５のフローチャートを開始すると、ステップＳ１１では、光源２と光源４をＯＮにし、光源２、４に対応する光学フィルタ１８ｅ（光源２が出力する励起光である４０５ｎｍを含む波長域を反射して分離し、光源４が出力する励起光である５６１ｎｍを含む波長域を反射して分離するような光学フィルタ）を光路中へ配置するようにフィルタユニット１８を制御する。そして、λスキャンが開始される。

この状態で、ミラー５３、５９の角度を変更しながらλスキャンを実行していくことで図１６のような分光スペクトルが検出される。破線Ａで囲まれた領域は、光学フィルタ（ここでは光学フィルタ１８ｅ）が検出可能な光の波長域を示し、一点鎖線Ｂは発生する蛍光の分光スペクトルを示し、実線Ｃは実際に検出器で検出される分光スペクトルを示す。尚、ここで、光学フィルタ１８ｅが分離する特定の波長域は、光源２が出力する励起光によって発生する蛍光の分光スペクトルから十分に離れている。そのため、その特定の波長域では、光源２が出力する励起光によって発生する蛍光の分光スペクトルが十分に減衰しており、その分光スペクトルの検出には略影響しない。

ステップＳ１２では、ＰＭＴ５６によって検出される検出波長が、光源３が出力する励起光の波長よりも長い波長となり、且つ、ＰＭＴ６２によって検出される検出波長が、光源５が出力する励起光の波長よりも長い波長となったかどうかを判定する。判定がＮｏである場合、そのままλスキャンを続行し、ステップＳ１２の判定を繰り返す。判定がＹｅｓである場合、ステップＳ１３へ移行する。

尚、ステップＳ１２では、例えば、ＰＭＴ５６における検出波長のみが、光源３が出力する励起光の波長よりも長い波長となった場合、ミラー５９によるλスキャンによってＰＭＴ６２によって検出される検出波長が、光源５が出力する励起光の波長よりも長い波長となるまで、ミラー５３のλスキャンを一時停止してもよい。逆に、ＰＭＴ６２によって検出される検出波長のみが、光源５が出力する励起光の波長よりも長い波長となった場合、ミラー５３によるλスキャンによってＰＭＴ５６によって検出される検出波長が、光源３が出力する励起光の波長よりも長い波長となるまで、ミラー５９のλスキャンを一時停止してもよい。

ステップＳ１３では、光源３と光源５をＯＮにし、光源３、５に対応する光学フィルタ１８ｆ（光源３が出力する励起光である４８８ｎｍを含む波長域を反射して分離し、光源５が出力する励起光である６４０ｎｍを含む波長域を反射して分離するような光学フィルタ）を光路中へ配置するようにフィルタユニット１８を制御する。尚、光学フィルタ１８ｆの配置までに時間が掛かる場合は、λスキャンを一旦停止し、光学フィルタ１８ｆの配置が完了するとλスキャンを再開することにしてもよい。

この状態で、ミラー５３、５９の角度を変更しながらλスキャンを実行していくことで図１７のような分光スペクトルが検出される。破線Ａで囲まれた領域は、光学フィルタ（ここでは光学フィルタ１８ｆ）が検出可能な光の波長域を示し、一点鎖線Ｂは発生する蛍光の分光スペクトルを示し、実線Ｃは実際に検出器で検出される分光スペクトルを示す。尚、ここで、光学フィルタ１８ｆが分離する特定の波長域は、光源３が出力する励起光によって発生する蛍光の分光スペクトルから十分に離れている。そのため、その特定の波長域では、光源３が出力する励起光によって発生する蛍光の分光スペクトルが十分に減衰しており、その分光スペクトルの検出には略影響しない。

ステップＳ１４では、検出波長域を全てλスキャン済みであると判定されるまで本ステップを繰り返し、検出波長域を全てλスキャン済みであると判定されると、本フローチャートを終了する。

以上の図１５のフローチャートを実行することによっても、図１２のような蛍光の分光スペクトルを検出することができ、即ちλスキャンを実行した全ての検出波長域において、正確な蛍光の分光スペクトルを検出することができる。

従って、本実施形態におけるレーザ顕微鏡５０によっても、複数の励起光を用いたλスキャンを実行する際において、正確な蛍光の分光スペクトルを取得することができる。また、二種類の励起光を標本Ｓに照射して、発生する蛍光の分光スペクトルをＰＭＴ５６と、ＰＭＴ６２とで別々に検出することができるため、検出器が一つしかない構成と比べて検出時間を短縮することができる。

以下、第４の実施形態におけるレーザ顕微鏡について説明する。図１８は、本実施形態におけるレーザ顕微鏡７０の構成を示す。レーザ顕微鏡７０は、フィルタユニット１８の代わりに、ビームスプリッター４１を備え、ＤＭ５１と回折格子５２との間にグラデーションフィルタ６３を備え、ミラー５７と回折格子５８との間にグラデーションフィルタ６４を備えている点において、レーザ顕微鏡５０と異なっているが、その他の構成は、レーザ顕微鏡５０と同様である。

グラデーションフィルタ６３、６４は、グラデーションフィルタ４２と同様、長辺方向の位置によって、膜厚が異なり、波長毎の透過率が異なっている。また、長辺方向にスライド移動させることが可能であり、光路上に設置される領域が適宜変更される。即ち、グラデーションフィルタ６３、６４も標本Ｓから発生する蛍光と励起光を波長に応じて分離する蛍光分離手段である。

グラデーションフィルタ６３は、ＰＭＴ５６で検出し得る波長域、即ち、ＤＭ５１で反射される波長域の間で、分離される波長が変更されるように設計される。また、グラデーションフィルタ６４は、ＰＭＴ６２で検出し得る波長域、即ち、ＤＭ５１で透過される波長域の間で、分離される波長が変更されるように設計される。

従って、レーザ顕微鏡７０によっても第３の実施形態のレーザ顕微鏡５０と同様に、λスキャンに応じて、光源の切替と蛍光分離手段の制御を実行することで、複数の励起光を用いたλスキャンを実行する際においても、正確な蛍光の分光スペクトルを取得することができる。

上述した実施形態は、発明の理解を容易にするために具体例を示したものであり、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではない。上記のレーザ顕微鏡は、特許請求の範囲に記載した本発明を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。

１、４０、５０、７０ レーザ顕微鏡
２、３、４、５、 光源
６、７、８、９、４１、５１ ＤＭ
１０ 光ファイバー
１１ カップリングレンズ
１２、２１ コリメートレンズ
１３ スキャンミラー
１４ 瞳投影レンズ
１５ 結像レンズ
１６、２３、５３、５７、５９ ミラー
１７ 対物レンズ
１８ フィルタユニット
１８ａ、１８ｂ、１８ｃ、１８ｄ、１８ｅ、１８ｆ 光学フィルタ
２０ 共焦点ピンホール
２２、５２、５８ 回折格子
２４、５４、６０ 集光レンズ
２５、５５、６１ スリット
２６、５６、６２ ＰＭＴ
３０、６５ 制御ユニット
Ｓ 標本
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ 線
Ｗ 領域

Claims (7)

1. 標本に励起光を照射することで前記標本から発生する蛍光を分光して検出するレーザ顕微鏡であって、
   前記標本から発生する前記蛍光と前記励起光を波長に応じて分離し、その分離する波長を変更可能な蛍光分離手段と、
   前記蛍光分離手段によって分離された前記蛍光を分光する分光手段と、
   前記分光手段によって分光された前記蛍光を検出する検出器と、
   前記検出器によって検出される前記蛍光の波長を変更する検出波長変更手段と、
   前記蛍光分離手段を制御する制御手段と、を備え、
   前記制御手段は、前記検出波長変更手段による、前記検出器によって検出される前記蛍光の波長の変更に応じて、前記蛍光分離手段が分離する波長の変更を制御する
   ことを特徴とするレーザ顕微鏡。
2. 請求項１に記載のレーザ顕微鏡であって、さらに、
   前記標本へ照射する波長の異なる複数の励起光を選択的に出力可能な光源ユニットを備え、
   前記制御手段は、前記光源ユニットが出力する前記励起光と前記標本から発生する前記蛍光とが分離されるように、前記蛍光分離手段の分離する波長を変更させる
   ことを特徴とするレーザ顕微鏡。
3. 請求項１または請求項２に記載のレーザ顕微鏡であって、
   前記検出波長変更手段は、前記検出器によって検出される前記波長が短波長側から長波長側へ変更されるように、前記波長を変更する
   ことを特徴とするレーザ顕微鏡。
4. 請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載のレーザ顕微鏡であって、
   前記蛍光分離手段は、前記蛍光と前記励起光を分離する波長が異なる複数の光学フィルタを含む
   ことを特徴とするレーザ顕微鏡。
5. 請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載のレーザ顕微鏡であって、
   前記蛍光分離手段は、位置によって前記蛍光と前記励起光を分離する波長が異なるグラデーションフィルタである
   ことを特徴とするレーザ顕微鏡。
6. 請求項４または請求項５に記載のレーザ顕微鏡であって、
   前記光学フィルタは、ロングパスフィルタである
   ことを特徴とするレーザ顕微鏡。
7. 請求項４に記載のレーザ顕微鏡であって、
   前記光学フィルタは、ノッチフィルタである
   ことを特徴とするレーザ顕微鏡。