DE102018126232B3

DE102018126232B3 - Scanning-Lichtmikroskop mit verschiedenen Eingängen für Licht unterschiedlicher Wellenlängen zum Abtasten einer Probe

Info

Publication number: DE102018126232B3
Application number: DE102018126232.9A
Authority: DE
Inventors: Gerald Donnert; Benjamin Harke; Lars KASTRUP; Matthias Reuss; Andreas SCHÖNLE
Original assignee: Abberior Instruments GmbH
Current assignee: Abberior Instruments GmbH
Priority date: 2018-10-22
Filing date: 2018-10-22
Publication date: 2020-03-26
Anticipated expiration: 2038-10-23

Abstract

Bei einem Scanning-Lichtmikroskop (1) mit einem Scanner (8), einem Detektionslichtausgang (10) für Detektionslicht (6), einem Strahlengang (9), der sich zwischen dem Scanner (8) und dem Detektionslichtausgang (10) erstreckt, und mit Beleuchtungslichteingängen (24 bis 27) für Beleuchtungslicht (3 bis 5), denen jeweils ein dichroitischer Spiegel (11 bis 13) zugeordnet ist, um das jeweilige Beleuchtungslicht (3 bis 5) durch wellenlängenselektive Reflektion in den Strahlengang (9) zu dem Scanner (8) hin einzukoppeln, wobei sich der Strahlengang (9) durch den jeweiligen dichroitischen Spiegel (11 bis 13) hindurch erstreckt und wobei der jeweilige dichroitische Spiegel (11 bis 13) als mit einer reflektierenden Schicht (34) beschichteter Bereich eines planparalleles Substrat (35) ausgebildet ist, ist den dichroitischen Spiegeln (11 bis 13) jeweils eine Wechselvorrichtung (28 bis 30) zugeordnet, die dazu ausgebildet ist, den jeweiligen dichroitischen Spiegel (11 bis 13) gegen eine planparallele transparente Platte (31 bis 33) auszuwechseln, die dem Strahlengang (9) einen gleichen Parallelversatz (37) aufprägt wie der jeweilige dichroitische Spiegel (11 bis 13).

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf ein Scanning-Lichtmikroskop mit einem Scanner, einem Detektionslichtausgang für Detektionslicht, einem Strahlengang, der sich zwischen dem Scanner und dem Detektionslichtausgang erstreckt, und mit mehreren Beleuchtungslichteingängen für Beleuchtungslicht, denen jeweils ein dichroitischer Spiegel zugeordnet ist, um das jeweilige Beleuchtungslicht durch wellenlängenselektive Reflektion in den Strahlengang zu dem Scanner hin einzukoppeln, wobei sich der Strahlengang durch den jeweiligen dichroitischen Spiegel hindurch erstreckt und wobei der jeweilige dichroitische Spiegel als mit einer reflektierenden Schicht beschichteter Bereich eines planparallelen Substrats ausgebildet ist.
Das Scanning-Lichtmikroskop kann ein Laser-Scanning-Lichtmikroskop sein. Es kann sich um ein Fluoreszenz-Lichtmikroskop mit zur Anregung konfokaler Detektion handeln. Das Scanning-Lichtmikroskop kann auch ein hochauflösendes Fluoreszenz-Lichtmikroskop sein, wie beispielsweise ein STED-Lichtmikroskop, ein RESOLFT-Lichtmikroskop oder ein MINFLUX-Lichtmikroskop. In diesem Fall können die mehreren Beleuchtungslichteingänge einmal für Fluoreszenzanregungslicht und einmal für Fluoreszenzverhinderungslicht vorgesehen sein.
STAND DER TECHNIK
In einem Scanning-Lichtmikroskop wird eine Probe mit einer fokussierten Lichtintensitätsverteilung von Beleuchtungslicht abgetastet. Daraufhin aus der Probe emittiertes Licht wird mit einem Detektor detektiert und dem Ort zugeordnet, an dem die Lichtintensitätsverteilung zum Zeitpunkt der Detektion des emittierten Lichts angeordnet war. Dieses Detektionslicht wird typischerweise von Farbstoffen in der Probe emittiert, so dass deren Verteilung in der Probe mit dem Scanning-Lichtmikroskop erfasst wird. Zur selektiven Erfassung unterschiedlicher Farbstoffe sind diese selektiv mit Beleuchtungslicht unterschiedlicher Wellenlängen anzuregen und das aus der Probe emittierte Detektionslicht ist wellenlängenselektiv zu registrieren. Zu diesem Zweck ist es bei Scanning-Lichtmikroskopen bekannt, mehrere Lichtquellen vorzusehen, um die jeweilige Probe mit Beleuchtungslicht unterschiedlicher Wellenlängen abtasten zu können. Dieses Beleuchtungslicht von den verschiedenen Lichtquellen wird über jeweils einen auf die jeweilige Wellenlänge abgestimmten dichroitischen Spiegel in den Strahlengang des Scanning-Lichtmikroskops eingekoppelt, über den in Gegenrichtung das Detektionslicht von der Probe zu dem Detektor gelangt. Wenn die Probe neben Beleuchtungslicht zur Anregung von Lichtemissionen auch mit Fluoreszenzverhinderungslicht beleuchtet wird, um die räumliche Auflösung des Scanning-Lichtmikroskops zu erhöhen, wird hierfür mindestens eine weitere Beleuchtungslichtquelle für Beleuchtungslicht einer weiteren Wellenlänge verwendet, das über einen weiteren dichroitischen Spiegel in den Strahlengang zu dem Scanner hin eingekoppelt wird. In Gegenrichtung von dem Scanner zu dem Detektor hat jeder dichroitische Spiegel die Funktion, die Anteile des mit ihm eingekoppelten Beleuchtungslichts, die von der Probe reflektiert werden, und auch etwaige mit dem Beleuchtungslicht in der Probe stimulierte Emission aus der Probe zu blockieren. Jeder der dichroitischen Spiegel in dem Strahlengang entfernt daher von dem von der Probe kommenden Detektionslicht ein Wellenlängenband, nämlich das Wellenlängenband der Wellenlängen, bei denen er Licht reflektiert. Beleuchtungslicht aus diesem Wellenlängenband gelangt somit nicht mehr zu dem Detektor. Die Breite jedes dieser Wellenlängenbänder kann zwar auf weniger als 10 nm begrenzt werden. Dennoch führen mehrere in dem Strahlengang eines Scanning-Lichtmikroskops angeordnete dichroitische Spiegel dazu, dass das dem Detektor zugeführte Detektionslicht eine Vielzahl von Lücken aufweist, die auf jeweils einen der dichroitischen Spiegel zurückzuführen sind. Diese Lücken treten auch dann auf, wenn die jeweilige Beleuchtungslichtquelle gar nicht aktiv ist, so dass der jeweilige dichroitische Spiegel nicht benötigt wird. Ein Entfernen eines nicht benötigten dichroitischen Spiegels aus dem Strahlengang ist jedoch nicht ohne weiteres möglich, weil sich jeder dichroitische Spiegel auch auf das von ihm transmittierte Detektionslicht auswirkt. Daher müsste das Scanning-Lichtmikroskop nach dem Entfernen jedes dichroitischen Spiegels aus seinem Strahlengang oder nach jedem Wiedereinfügen jedes dichroitischen Spiegels in seinen Strahlengang neu justiert werden.
Um das Detektionslicht, das bei einem Scanning-Lichtmikroskop dem Detektor zugeführt wird, wellenlängenabhängig zu detektieren, ist es aus der DE 198 35 070 B4 zur Erzeugung eines einstellbaren Bandpasses im Detektionsstrahlengang bekannt, in dem Detektionsstrahlengang eine Kombination aus mindestens einem Kurzpass- und mindestens einem Langpassfilter anzuordnen. Dabei kann mindestens ein Filter gegen ein anderes Filter anderer Wellenlängencharakteristik auswechselbar und/oder bezüglich seiner Wellenlängencharakteristik einstellbar sein. Weiterhin können für das Kurzpass- und das Langpassfilter Filterwechsler vorgesehen sein. Die Filterwechsler können Filterschieber oder Filterräder sein. Weiterhin kann mindestens ein dreh- und/oder verschiebbares kontinuierlich variierendes Kurzpass- und/oder Langpassfilter vorgesehen sein, d. h. ein sogenanntes Gradientenfilterkurzpass- und/oder -langpassfilter. Die Filter und/oder Filterwechsler können motorisch angetrieben werden. Der Kombination aus dem Kurzpass- und dem Langpassfilter kann eine konfokale Lochblende vorgeschaltet sein. Bei der bekannten Anordnung kann durch das Verschieben des Gradientenlangpassfilters und des Gradientenkurzpassfilters relativ zu dem Detektionsstrahlengang festgelegt werden, in welchem Wellenlängenbereich Detektionslicht auf den Detektor trifft, und der Wellenlängenbereich kann auch fortlaufend verschoben werden, um das Spektrum des Detektionslichts abzutasten.
Ein Scanning-Lichtmikroskop mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 ist aus der DE 10 2009 006 729 A1 bekannt. Hier ist der jeweilige dichroitische Spiegel als Hauptfarbteiler bezeichnet und auf einer planparallelen Glasplatte eines Hauptfarbteiler-Rads angeordnet. Durch Verdrehen des Hauptfarbteiler-Rads kann der jeweilige dichroitische Spiegel gegen einen anderen dichroitischen Spiegel mit einem anderen Reflexionsband ausgewechselt werden. Durch die Auswahl des Reflexionsbands kann in Verbindung mit einer an den jeweiligen Beleuchtungslichtgang angeschlossenen durchstimmbaren Laserquelle die Wellenlänge des Beleuchtungslichts festgelegt werden, das mit dem jeweiligen dichroitischen Spiegel zu dem Scanner hin eingekoppelt wird.
Aus der JP 2015 - 118 246 A ist ein Scanning-Lichtmikroskop bekannt, bei dem ein optischer Pfadschalter zwischen Scanner und Objektiv angeordnet ist. Der optische Pfadschalter ordnet wechselweise einen dichroitischen Spiegel und eine Glasplatte in dem Strahlengang an. Der dichroitische Spiegel lässt IR-Beleuchtungslicht zu einem Objekt hin passieren und koppelt von dem Objekt kommendes IR-Licht zu einem IR-Detektor aus. Die Glasplatte lässt Fluoreszenzanregungslicht zu dem Objekt hin passieren und in umgekehrter Richtung von dem Objekt emittiertes Fluoreszenzlicht, das von dem Objekt aus gesehen hinter dem Scanner mit einem dichroitischen Spiegel zu einem Fluoreszenzlichtdetektor ausgekoppelt wird. Der dichroitische Spiegel und die damit auswechselnde Glasplatte prägen dem hindurchtretenden Licht einen gleichen Parallelversatz auf. Für den Wechsel zwischen dem dichroitischen Spiegel und der Glasplatte ist eine Wechselvorrichtung mit einem elektrischen Antrieb vorgesehen.
Aus der US 2017 / 0 351 077 A1 ist ein Scanning-Mikroskop mit einer Filtereinheit bekannt, die mit einem dichroitischen Spiegel einen Beleuchtungslichtstrahlengang von einem Detektionsstrahlengang auf der einem Objektiv abgekehrten Seite eines Scanners trennt. Die Filtereinheit umfasst verschiedene dichroitische Spiegel, die bei unterschiedlichen spezifischen Wellenlängen reflektieren. Die Filtereinheit ist beispielsweise eine Filterkassette mit einem Antrieb zum Umschalten zwischen den verschiedenen dichroitischen Spiegeln.
Aus der DE 10 2006 047 911 A1 ist eine Anordnung zur Aufteilung von Detektionslicht in einem Laser-Scanning-Mikroskop bekannt, bei der motorisch betriebene Filterräder zur Einstellung von mit verschiedenen Detektoren detektierten Wellenlängen dienen. Die eingestellten Filter der Filterräder lassen dabei jeweils einen Teil des einfallenden Lichts zu dem jeweiligen Detektor passieren und reflektieren alles andere Licht zu den weiteren Detektoren.
AUFGABE DER ERFINDUNG
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Scanning-Lichtmikroskop mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 aufzuzeigen, das eine weitergehende Analyse des von der jeweiligen Probe kommenden Detektionslichts ermöglicht.
LÖSUNG
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein Scanning-Lichtmikroskop mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Scanning-Lichtmikroskops sind in den abhängigen Patentansprüchen definiert.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bei einem erfindungsgemäßen Scanning-Lichtmikroskop mit einem Scanner, einem Detektionsausgang für Detektionslicht, einem Strahlengang, der sich zwischen dem Scanner und dem Detektionslichtausgang erstreckt, und mit Beleuchtungslichteingängen für Beleuchtungslicht, denen jeweils ein dichroitischer Spiegel zugeordnet ist, um das jeweilige Beleuchtungslicht durch wellenlängenselektive Reflektion in den Strahlengang zu dem Scanner hin einzukoppeln, wobei sich der Strahlengang durch die dichroitischen Spiegel hindurch erstreckt und wobei der jeweilige dichroitische Spiegel als mit einer reflektierenden Schicht beschichteter Bereich eines planparallelen Substrats ausgebildet ist, ist den dichroitischen Spiegeln jeweils eine Wechselvorrichtung zugeordnet, die dazu ausgebildet ist, den jeweiligen dichroitischen Spiegel gegen eine planparallele transparente Platte auszuwechseln, die dem Strahlengang einen gleichen Parallelversatz aufprägt wie der jeweilige dichroitische Spiegel.
Mit der jeweiligen Wechselvorrichtung ist der jeweilige dichroitische Spiegel insbesondere dann gegen die planparallele Platte auswechselbar, wenn über den Beleuchtungslichteingang, dem der jeweilige dichroitische Spiegel zugeordnet ist, gerade kein Licht in den Strahlengang des Scanning-Mikroskops einzukoppeln ist. Dann blockiert die planparallele transparente Platte vorteilhafterweise auch kein Wellenlängenband des aus der jeweiligen Probe kommenden Lichts, weil eine solche Blockade zur Unterdrückung von Streulicht oder stimulierter Emission aus der Probe auch nicht erforderlich ist. Trotzdem wird der sonst dem Strahlengang von dem jeweiligen dichroitischen Spiegel bzw. dessen planparallelen Substrat eingeführte Parallelversatz durch die planparallele transparente Platte aufgeprägt, so dass die Justage des Scanning-Lichtmikroskops erhalten bleibt. Damit können bei dem erfindungsgemäßen Scanning-Lichtmikroskop sehr viele Beleuchtungslichteingänge mit zugeordneten dichroitischen Spiegeln vorhanden sein, um Beleuchtungslicht unterschiedlicher Wellenlängen in den Strahlengang des Scanning-Lichtmikroskops anzukoppeln, ohne dass die Vielzahl der dichroitischen Spiegel eine Vielzahl von Wellenlängenbändern aus dem zu dem Detektionsausgang gelangenden Detektionslicht ausblenden, wenn sie nicht benötigt werden.
Wenn im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Scanning-Lichtmikroskop von dem „Detektionslichtausgang“ die Rede ist, so schließt dies neben der Möglichkeit, dass dieser als mechanischer Anschluss für einen Detektor oder einen zu einem Detektor führenden faseroptischen Lichtleiter ausgebildet ist, auch die Möglichkeit ein, dass dort direkt ein Detektor angeordnet ist, dessen Eingang dann mit dem Detektionsausgang zusammenfällt. Ebenso schließt die Formulierung „Beleuchtungslichteingang“ neben der Möglichkeit, dass dort ein mechanischer Anschluss für eine Beleuchtungslichtquelle oder ein zu einer Beleuchtungslichtquelle führenden faseroptischen Lichtleiter vorhanden ist, auch die Möglichkeit ein, dass dort direkt eine Lichtquelle vorgesehen ist. Dann fällt der Beleuchtungslichtausgang der Lichtquelle mit dem jeweiligen Beleuchtungslichteingang zusammen.
Wenn hier von mehreren, das heißt mindestens zwei Beleuchtungslichteingängen die Rede ist, denen jeweils ein dichroitischer Spiegel mit bestimmten Eigenschaften und einer zugeordneten Wechselvorrichtung zugeordnet ist, schließt dies nicht aus, dass es weitere Beleuchtungslichteingänge gibt, denen ein anderer dichroitischer Spiegel oder auch ein anderes optisches Element, wie beispielsweise ein polarisierender Strahlteiler, oder ein gleicher dichroitischer Spiegel, aber ohne Wechselvorrichtung, zum Einkoppeln ihres Beleuchtungslichts in den Strahlengang zwischen dem Scanner und dem Detektionslichtausgang zugeordnet ist.
Die jeweilige planparallele transparente Platte weist eine gleiche Ausrichtung gegenüber dem Strahlengang und vorzugsweise eine gleiche optische Dicke längs des Strahlengangs auf wie der jeweilige dichroitische Spiegel, gegen den sie mit Hilfe der jeweiligen Wechselvorrichtung auswechselbar ist. Dabei kann die jeweilige planparallele transparente Platte ein nicht verspiegelter Bereich desselben planparallelen Substrats sein, das mit dem mit der reflektierenden Schicht beschichteten Bereich den jeweiligen dichroitischen Spiegel ausbildet. In jedem Fall kann die planparallele Platte an der der reflektierenden Schicht entsprechenden Stelle eine Antireflexbeschichtung aufweisen, um möglichst viel des von der Probe kommenden Lichts als Detektionslicht zu dem Detektionslichtausgang durchzulassen.
Ebenfalls unabhängig davon, ob der jeweilige dichroitische Spiegel und die jeweilige planparallele transparente Platte mit demselben oder verschiedenen Substraten ausgebildet sind, weist die jeweilige Wechselvorrichtung einen Spiegelträger auf, der den jeweiligen dichroitischen Spiegel und die jeweilige planparallele transparente Platte trägt und der in einer gemeinsamen Haupterstreckungsebene des jeweiligen dichroitischen Spiegels und der jeweiligen planparallelen Platte in einer translatorischen oder rotatorischen Richtung geführt ist. Durch diese Führung ist der Spiegelträger nur in dieser einen translatorischen oder rotatorischen Richtung beweglich und kann in dieser Richtung so verfahren werden, dass der jeweilige dichroitische Spiegel in dem Strahlengang gegen die jeweilige planparallele transparente Platte ausgewechselt wird oder umgekehrt.
Der jeweilige Spiegelträger der jeweiligen Wechselvorrichtung ist in der jeweiligen translatorischen oder rotatorischen Richtung mit einem Antrieb verfahrbar, um die jeweilige Wechselvorrichtung auf einen automatisierten Wechsel zwischen dem jeweiligen dichroitischen Spiegel und der jeweiligen planparallelen transparenten Platte ansteuern zu können. Der Antrieb ist ein elektrischer Antrieb, so dass er direkt mit einem elektrischen Signal auf den Wechsel zwischen dem jeweiligen dichroitischen Spiegel und der jeweiligen planparallelen transparenten Platte ansteuerbar ist.
Konkret kann der jeweilige elektrische Antrieb einen vorzugsweise bistabilen Dreh- oder Hubmagnet aufweisen. Je nach Ausführungsform des Dreh- oder Hubmagneten ist durch Bestromung des Dreh- oder Hubmagneten in unterschiedlicher Stromflussrichtung oder Bestromung zweier separater Spulen des Dreh- oder Hubmagneten der Spiegelträger zwischen zwei Funktionsstellungen in Form von Endpositionen verfahrbar. Optional kann der Spiegelhalter in seinen Endpositionen durch zusätzliche Permanentmagnete fixiert werden, wodurch die Spule(n) des Dreh- oder Hubmagneten nach Erreichen einer Endposition stromlos geschaltet werden kann/können. Alternativ zur beschriebenen Ausführung mit einem Dreh- oder Hubmagneten kann die Wechselvorrichtung auch mit einem Elektromagneten und einem am Spiegelträger angeordneten Permanentmagneten realisiert werden. In diesem Fall können durch Bestromung des Elektromagneten in unterschiedlicher Stromflussrichtung oder durch Bestromung verschiedener Spulen des Elektromagneten anziehende bzw. abstoßende Kräfte auf den am Spiegelträger angeordneten Permanentmagneten hervorgerufen werden, wodurch der Spiegelträger zwischen den Endpositionen verfahren werden kann. Besonders bevorzugt ist es jedoch, wenn zwei Dreh- oder Hubmagnete oder zwei Elektromagnete mit entsprechenden ferromagnetischen Gegenelementen auf dem jeweiligen Spiegelträger vorgesehen sind, um durch Bestromen jeweils eines der Hubmagnete oder Elektromagnete den jeweiligen Spiegelträger auf einen Wechsel zwischen dem jeweiligen dichroitischen Spiegel und der jeweiligen planparallelen transparenten Platte in dem Strahlengang anzusteuern.
Daneben kann der jeweilige Antrieb beispielsweise auch einen Schritt- oder Linearmotor, einen Piezoschreitmotor, einen Spindel- oder Riemenantrieb oder einen pneumatisch oder hydraulisch bewegten Zylinder aufweisen.
Zudem kann die Wechselvorrichtung einen ortsfesten kugelförmigen Führungskörper, eine ortsfeste konische Vertiefung und/oder eine ortsfeste V-förmige Nut und der Spiegelträger eine dazu komplementäre konische Vertiefung, eine dazu komplementäre V-förmige Nut und/oder einen dazu komplementären kugelförmigen Führungskörper aufweisen, die in mindestens einer Funktionsstellung des Spiegelträgers ineinander eingreifen. Durch diesen Eingriff wird dem Spiegelträger in seiner jeweiligen Funktionsstellung mechanische eine genau definierte Lage gegenüber den ortsfesten Bestandteilen der Wechselvorrichtung vermittelt.
Die Ansteuerung des Antriebs erfolgt durch eine Steuerung für eine Beleuchtungslichtquelle des Scanning-Lichtmikroskops, der der jeweilige dichroitische Spiegel zugeordnet ist, um ihr Beleuchtungslicht in den Strahlengang einzukoppeln. Konkret kann diese Steuerung dazu ausgebildet sein, die Beleuchtungslichtquelle erst dann zur Abgabe ihres Beleuchtungslichts anzusteuern, nachdem sie den jeweiligen elektrischen Antrieb angesteuert hat, um den jeweiligen dichroitischen Spiegel in dem Strahlengang anzuordnen. Außerdem kann die Steuerung dazu ausgebildet, immer dann, wenn keine Ansteuerung der Beleuchtungsquelle zur Abgabe ihres Beleuchtungslichts ansteht, den jeweiligen elektrischen Antrieb mit dem Ziel anzusteuern, den jeweiligen dichroitischen Spiegel in dem Strahlengang gegen die jeweilige planparallele transparente Platte auszuwechseln. Der dichroitische Spiegel ist so immer nur dann in dem Strahlengang angeordnet, wenn er dort auch benötigt wird.
Die planparallelen transparenten Platten können auch dazu genutzt werden das jeweilige Beleuchtungslicht, statt es in den Strahlengang des Scanning-Lichtmikroskops zu der Probe hin einzukoppeln, einer jeweiligen Beleuchtungslichtmesseinrichtung zuzuführen. Dazu kann hinter mindestens einer der planparallelen transparenten Platten, in Richtung des von ihr transmittierten jeweiligen Beleuchtungslichts eine solche Beleuchtungslichtmesseinrichtung angeordnet sein. Die jeweilige Beleuchtungslichtmesseinrichtung kann zur Charakterisierung des jeweiligen Beleuchtungslichtstrahls beispielsweise bezüglich seiner optischen Leistung, Polarisation, Strahlgeometrie, Strahllage, Pulsdauer und/oder zeitlichen Pulslage ausgebildet sein und insbesondere mindestens eine Photodiode, eine Vierquadrantendiode und/oder ein Polarisationsfilter umfassen.
Die reflektierende Schicht des jeweiligen dichroitischen Spiegels ist vorzugsweise für eine nur schmalbandige Reflektion des jeweiligen Beleuchtungslichts ausgebildet. Insbesondere reflektiert sie selektiv Beleuchtungslicht mit Wellenlängen nur innerhalb eines Wellenlängenbands mit einer Breite von nicht mehr als 20 nm, vorzugsweise von nicht mehr als 15 nm und noch mehr bevorzugt von nicht mehr als 10 nm. Je geringer die Breite des Wellenlängenbands ist, desto weniger Detektionslicht blendet der dichroitische Spiegel von dem über den Scanner von der Probe kommenden Licht vor dem Detektionslichtausgang aus. Zudem lassen sich mit geringen Breiten der Wellenlängenbänder aller dichroitischen Spiegel Überlappungen der Wellenlängenbänder vermeiden, die grundsätzlich mit der Gefahr verbunden sind, dass über einen dichroitischen Spiegel eingekoppeltes Beleuchtungslicht durch einen nachfolgenden dichroitischen Spiegel wieder ausgekoppelt wird. So ist es bevorzugt, wenn die reflektierenden Schichten der den verschiedenen Beleuchtungslichteingängen zugeordneten dichroitischen Spiegel Beleuchtungslicht mit Wellenlängen innerhalb nicht überlappender Wellenlängenbänder reflektieren.
Bei dem erfindungsgemäßen Scanning-Lichtmikroskop können Grenzwellenlängen mindestens eines der Wellenlängenbänder mindestens eines der dichroitischen Spiegel über die Fläche des mit der jeweiligen reflektierenden Schicht beschichteten Bereichs des jeweiligen Substrats variieren. Das heißt, der jeweilige dichroitische Spiegel kann als sogenannter Gradientennotchfilter ausgebildet sein, der durch schmalbandige Reflektion für Licht innerhalb eines begrenzten Wellenlängenbands undurchlässig ist, wobei die Grenzwellenlängen dieses Wellenlängenbereichs in einer Richtung über die reflektierende Schicht hinweg stetig variieren. So kann durch Verschieben des dichroitischen Spiegels gegenüber dem Strahlengang in dieser Richtung der dichroitische Spiegel nicht nur gegen die planparallele transparente Platte ausgewechselt werden, sondern stattdessen auch das Wellenlängenband festgelegt werden, über das der jeweilige dichroitische Spiegel Beleuchtungslicht in den Strahlengang einkoppelt bzw. von der Probe reflektiertes Beleuchtungslicht und stimulierte Emission ausblendet.
Insbesondere in Kombination mit einem solchen dichroitischen Spiegel mit variablem Wellenlängenband seiner Reflektion kann die Beleuchtungslichtquelle, der der jeweilige dichroitische Spiegel über einen der Beleuchtungslichteingänge zugeordnet ist, eine Weißlichtquelle sein. Aus dem weißen Licht der Weißlichtquelle selektiert der dichroitische Spiegel mit dem eingestellten Wellenlängenbereich das Beleuchtungslicht, das er in den Strahlengang des Scanning-Lichtmikroskops einkoppelt.
Bei dem erfindungsgemäßen Scanning-Lichtmikroskop ist ein Einfallswinkel des einzukoppelnden Beleuchtungslichts auf mindestens einen der dichroitischen Spiegel vorzugsweise kleiner als 45°, mehr bevorzugt kleiner als 30° und besonders bevorzugt kleiner als 20°. Mit kleiner werdendem Einfallswinkel des einzukoppelnden Beleuchtungslichts nimmt die Wellenlängenselektivität der reflektierenden Schicht des dichroitischen Spiegels zu, d. h. die Flankensteilheit beim Wechsel zwischen Transmission und Reflektion mit sich ändernder Wellenlänge. Es versteht sich, dass eine etwaige Abhängigkeit des von dem dichroitischen Spiegel reflektierten Wellenlängenbands von dem Einfallswinkel des Beleuchtungslichts, der gleich dem Einfallswinkel des Detektionslichts auf seinem Weg von der Probe über den Scanner zu dem Beleuchtungslichtausgang ist, zu berücksichtigen ist.
Vor dem Detektionslichtausgang des erfindungsgemäßen Scanning-Lichtmikroskops ist vorzugsweise ein einstellbares wellenlängenselektives Filter angeordnet, um einen Wellenlängenbereich des über den Detektionslichtausgang ausgegebenen Detektionslichts zu definieren oder auch zum Zwecke einer spektralen Analyse des Detektionslichts zu variieren.
Das wellenlängenselektive Filter kann hinter einer eingangsseitigen konfokalen Lochblende sowie alternativ oder zusätzlich vor einer ausgangsseitigen konfokalen Lochblende oder einem die Funktion einer konfokalen Lochblende erfüllenden faseroptischen Lichtleiter, der zu einem Detektor führt, angeordnet sein.
Das einstellbare wellenlängenselektive Filter kann ein längs seiner Haupterstreckungsebene verfahrbares Gradientenbandpassfilter aufweisen. Durch Verfahren des Gradientenbandpassfilters gegenüber dem Strahlengang kann das Wellenlängenband des zu dem Detektionslichtausgang gelangenden Detektionslichts hinsichtlich seiner Lage festgelegt werden. Alternativ kann das einstellbare wellenlängenselektive Filter eine Reihenschaltung aus einem längs einer Haupterstreckungsrichtung verfahrbaren Gradientenlangpassfilter und einem längs seiner Haupterstreckungsrichtung verfahrbaren Gradientenkurzpassfilter aufweisen. Dabei können das Gradientenlangpassfilter und das Gradientenkurzpassfilter in beliebiger Reihenfolge angeordnet sein. Weiterhin können das Gradientenlangpassfilter und das Gradientenkurzpassfilter parallele Gradientenrichtungen aufweisen, wobei die Gradientenrichtung jeweils die Richtung in der Haupterstreckungsebene des jeweiligen Filters angibt, in der sich die Grenzwellenlänge des Filters ändert, oder die Gradientenrichtungen können auch orthogonal zueinander angeordnet sein. Dann können das Gradientenlangpassfilter und das Gradientenkurzpassfilter auch starr miteinander verbunden sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Scanning-Lichtmikroskops weist das einstellbare wellenlängenselektive Filter einen Vollspiegel oder Retroreflektor hinter dem Gradientenbandpassfilter oder hinter der Reihenschaltung aus dem Gradientenlangpassfilter und dem Gradientenkurzpassfilter auf, so dass das Detektionslicht erst nach zweimaliger Transmission durch das Gradientenbandpassfilter bzw. durch das Gradientenlangpassfilter und das Gradientenkurzpassfilter sowie dazwischen erfolgender Reflektion an dem Vollspiegel oder Retroreflektor zu dem Detektionslichtausgang gelangt. Durch die zweimalige Transmission wird die Selektivität des einstellbaren wellenlängenselektiven Filters für das eingestellte Wellenlängenband signifikant erhöht.
Weiterhin ist es bevorzugt, wenn das wellenlängenselektive Filter vor dem Detektionslichtausgang motorisch einstellbar ist, beispielsweise mit einem oder mehreren Schritt- oder Linearmotoren, um definiert ein bestimmtes Wellenlängenband anzusteuern.
Bei dem erfindungsgemäßen Scanning-Lichtmikroskop kann ein weiterer Detektionslichtanschluss vorhanden sein, aus dem von dem einstellbaren wellenlängenselektiven Filter reflektiertes Detektionslicht austritt, wobei vor dem weiteren Detektionslichtausgang ein weiteres einstellbares wellenlängenselektives Filter angeordnet sein kann. Anders gesagt können mehrere einstellbare wellenlängenselektive Filter in kaskadierter Anordnung vorgesehen sein, um jeweils ein Wellenlängenband zu selektieren, das einem separaten Detektionslichtanschluss zugeführt wird. So können parallel verschiedene einstellbare Wellenlängenbänder detektiert werden. Damit wird die Gesamtdauer für die spektrale Analyse des Detektionslichts gegenüber einer kontinuierlichen Veränderung des Wellenlängenbands während des Registrierens des Detektionslichts mit nur einem einzigen Detektor verkürzt werden.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibung genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile zwingend von erfindungsgemäßen Ausführungsformen erzielt werden müssen. Ohne dass hierdurch der Gegenstand der beigefügten Patentansprüche verändert wird, gilt hinsichtlich des Offenbarungsgehalts der ursprünglichen Anmeldungsunterlagen und des Patents Folgendes: weitere Merkmale sind den Zeichnungen - insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung - zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen der Erfindung entfallen.
Die in den Patentansprüchen und der Beschreibung genannten Merkmale sind bezüglich ihrer Anzahl so zu verstehen, dass genau diese Anzahl oder eine größere Anzahl als die genannte Anzahl vorhanden ist, ohne dass es einer expliziten Verwendung des Adverbs „mindestens“ bedarf. Wenn also beispielsweise von einem Detektionslichtausgang die Rede ist, ist dies so zu verstehen, dass genau ein Detektionslichtausgang, zwei Detektionslichtausgänge oder mehr Detektionslichtausgänge vorhanden sind. Die in den Patentansprüchen angeführten Merkmale können durch weitere Merkmale ergänzt werden oder die einzigen Merkmale sein, die das jeweilige Scanning-Lichtmikroskop in seinem hier beschriebenen Bereich zwischen dem Scanner und dem Detektionslichtausgang aufweist.
Die in den Patentansprüchen enthaltenen Bezugszeichen stellen keine Beschränkung des Umfangs der durch die Patentansprüche geschützten Gegenstände dar. Sie dienen lediglich dem Zweck, die Patentansprüche leichter verständlich zu machen.
Figurenliste
Im Folgenden wird die Erfindung anhand in den Figuren dargestellter bevorzugter Ausführungsbeispiele weiter erläutert und beschrieben.

1 ist eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Scanning-Lichtmikroskops.
2 zeigt in vergrößerter Darstellung eine mögliche Ausführungsform eines motorisch verfahrbaren Spiegelträgers.
3 zeigt in schematischer Darstellung ein Substrat, auf dem neben einer Antireflexbeschichtung zur Ausbildung einer transparenten Platte eine reflektierende Beschichtung zur Ausbildung eines Gradientennotchfilters ausgebildet ist.
4 zeigt schematisch eine Ausführungsform eines einstellbaren wellenlängenselektiven Filters des Scanning-Lichtmikroskops gemäß 1.

FIGURENBESCHREIBUNG
Das in 1 dargestellte Scanning-Lichtmikroskop 1 dient zum Untersuchen einer Probe 2, wobei die Probe 2 mit einer Lichtintensitätsverteilung von Beleuchtungslicht 3 bis 5 abgetastet wird und von der Probe 2 als Reaktion auf das Beleuchtungslicht emittiertes Detektionslicht 6 registriert und dem jeweiligen Ort der Intensitätsverteilung des Beleuchtungslichts 3 bis 5 in der Probe zugeordnet wird. Um die Lichtintensitätsverteilung in der Probe 2 auszubilden, ist ein das Beleuchtungslicht 3 bis 5 fokussierendes Objektiv 7 vorgesehen. Mit einem Scanner 8 wird die Lichtintensitätsverteilung gegenüber der Probe verlagert. Der Scanner 8 sorgt auch für ein Entscannen oder Descanning des Beleuchtungslichts 6 von der Probe. Von besonderem Interesse ist hier ein Strahlengang 9 des Scanning-Lichtmikroskops 1 von dem Scanner 8 bis zu einem Beleuchtungslichtausgang 10. In diesen Strahlengang 9 wird das Beleuchtungslicht 3 bis 5 über dichroitische Spiegel 11 bis 13 eingekoppelt, die das Beleuchtungslicht 3 bis 5 reflektieren. Das Detektionslicht 6 tritt hingegen durch die dichroitischen Spiegel 11 bis 13 hindurch. Hinter einer konfokalen Lochblende 14 ist dann ein einstellbares wellenselektives Filter 15 angeordnet, das nur Detektionslicht 6 aus einem ausgewählten Wellenlängenband zu dem Detektionslichtausgang 10 durchlässt. Hier ist ein Ende eines faseroptischen Lichtleiters 16 so angeordnet, dass er als weitere konfokale Lochblende wirkt und nur das durch diese weitere konfokale Lochblende hindurchtretende Licht zu einem Detektor 17 führt. Das Beleuchtungslicht 3 bis 5 stammt von drei verschiedenen Lichtquellen 18 bis 20 und wird von dort über faseroptische Lichtleiter 21 bis 23 zu Beleuchtungslichteingängen 24 bis 27 geführt, von denen aus das Beleuchtungslicht 3 bis 5 auf die dichroitischen Spiegel 11 bis 13 trifft, und zwar unter einem Einfallswinkel 38 von jeweils deutlicher kleiner als 45°. Die Beleuchtungslichtquellen 18 bis 20 unterscheiden sich in der Wellenlänge des von ihnen bereitgestellten Beleuchtungslichts 3 bis 5. Insbesondere handelt es sich bei dem Beleuchtungslicht 3 bis 5 um jeweils weitgehend monochromatisches Licht, d. h. Licht mit einem schmalen Wellenlängenband. Auf dieses schmale Wellenlängenband ist der dem jeweiligen Beleuchtungslichteingang 3 bis 5 zugeordnete dichroitische Spiegel 11 bis 13 abgestimmt. Idealerweise reflektiert der jeweilige dichroitische Spiegel 11 bis 13 nur in dem Wellenlängenband des von der jeweiligen Lichtquelle 18 bis 20 kommenden Beleuchtungslichts 3 bis 5. Entsprechend blockiert der jeweilige dichroitische Spiegel 11 bis 13 das von der Probe 2 zu dem Detektionslichtausgang 10 gelangende Detektionslicht 6 auch nur in dem jeweiligen Wellenlängenband, in dem er reflektiert. Jeder der dichroitischen Filter 11 bis 13 wirkt somit als Notchfilter auf das zu dem Detektionslichtausgang 10 gelangende Detektionslicht. Dies ist dann, wenn mit Hilfe des jeweiligen dichroitischen Spiegels 11 bis 13 Beleuchtungslicht 3 bis 5 in den Strahlengang 9 eingekoppelt wird, auch sinnvoll, um von der Probe gestreutes Beleuchtungslicht 3 bis 5, das dieselbe Wellenlänge wie das Beleuchtungslicht 3 bis 5 aufweist, und durch das Beleuchtungslicht 3 bis 5 in der Probe 2 angeregte stimulierte Emission, die ebenfalls die Wellenlänge des Beleuchtungslichts 3 bis 5 aufweist, aus dem Detektionslicht 6 auszublenden. Wenn jedoch beispielsweise eine der Lichtquellen 18 bis 20 aktuell nicht verwendet wird, führt ihr dichroitischer Spiegel 11 bis 13 trotzdem zu dem Ausblenden des Wellenlängenbands, bei dem er reflektiert, aus dem Detektionslicht 6, so dass Information von der Probe 2 unnötig verlorengeht. Es ist jedoch nicht sinnvoll, den dichroitischen Spiegel 11 bis 13 in diesem Fall einfach aus dem Strahlengang 9 zu entfernen, weil dadurch die Justage des Scanning-Lichtmikroskops 1 verloren ginge. Bei dem erfindungsgemäßen Scanning-Lichtmikroskop 1 ist daher für jeden der dichroitischen Spiegel 11 bis 13 eine Wechselvorrichtung 28 bis 30 vorgesehen, mit deren Hilfe der dichroitische Spiegel 11 bis 13 gegen eine planparallele transparente Platte 31 bis 33 auswechselbar ist, die dem Strahlengang 9 einen gleichen Parallelversatz aufprägt wie der jeweilige dichroitische Spiegel 11 bis 13. Die Wechselvorrichtungen 28 bis 30 umfassen jeweils einen elektrischen Antrieb, der von einer Steuerung 53 angesteuert wird. Dies geschieht derart, dass eine der Lichtquellen 18 bis 20 von der Steuerung 53 nur dann aktiviert wird, wenn sich der zugehörige dichroitische Spiegel 11 bis 13 in dem Strahlengang 9 befindet. Umgekehrt wird die jeweilige Wechselvorrichtung 18 bis 30 dazu angesteuert, den dichroitischen Spiegel 11 bis 13 gegen die planparallele transparente Platte 31 bis 33 auszuwechseln, wenn die jeweilige Lichtquelle 18 bis 20 nicht benötigt wird.
Verschiedene Lichtquellen 18 bis 20, die Beleuchtungslicht 3 bis 5 unterschiedlicher Wellenlängen bereitstellen, können bei dem Scanning-Lichtmikroskop 1 aus verschiedenen Gründen vorgesehen sein. Ein Grund besteht darin, mit dem Beleuchtungslicht 3 bis 5 unterschiedlicher Wellenlängen unterschiedliche Farbstoffe in der Probe 2 zur Emission von Fluoreszenzlicht anzuregen. Dies kann zum Beispiel im Rahmen der konfokalen Fluoreszenzlichtmikroskopie, der MINFLUX-Lichtmikroskopie, der STED-Lichtmikroskopie oder der RESOLFT-Lichtmikroskopie erfolgen, Darüber hinaus kann beispielsweise eine der Lichtquellen 18 bis 20 nicht dafür vorgesehen sein, Beleuchtungslicht 3 bis 5 in Form von Anregungslicht bereitzustellen, sondern Beleuchtungslicht 3 bis 5 in Form von Fluoreszenzverhinderungslicht, insbesondere STED-Licht, mit dessen Hilfe der räumliche Bereich der Probe 2, aus dem mit dem Detektor 17 registriertes Detektionslicht 6 stammen kann, auf Dimensionen unterhalb der Beugungsgrenze des Beleuchtungslichts 3 bis 5 und des Detektionslichts 6 eingegrenzt werden kann. In diesem Fall - und auch bei der MINFLUX-Lichtmikroskopie - ist zwischen der jeweiligen Lichtquelle 18 bis 20 und der Probe 2 typischerweise eine hier nicht dargestellte Strahlformungseinrichtung angeordnet, mit deren Hilfe die Wellenfront oder die Polarisationsverteilung des Beleuchtungslichts 3 bis 5 so eingestellt wird, dass sich am Fokuspunkt des Objektivs 7 eine von Intensitätsmaxima umgebene Intensitätsnullstelle des Fluoreszenzverhinderungslichts ausbildet.
Bei der STED-Lichtmikroskopie ist dann nur noch im Bereich dieser Nullstelle Fluoreszenz möglich. Wenn ein derart für die STED-Fluoreszenzlichtmikroskopie ausgerüstetes Scanning-Lichtmikroskop 1 zur reinen konfokalen Abbildung der Probe 2 verwendet wird, um beispielsweise den Farbstoff in der Probe 2 nicht mit den notwendigerweise hohen Intensitäten des STED-Lichts zu beaufschlagen, wird erfindungsgemäß der der Lichtquelle 18 bis 20 für das STED-Licht zugeordnete dichroitische Spiegel 11 bis 13 gegen die ihm entsprechende planparallele transparente Platte 31 bis 33 ausgewechselt.
2 zeigt ein Ausführungsbeispiel des dichroitischen Spiegels 11, der planparallelen Platte 31 und der zugehörigen Wechselvorrichtung 28. Alle anderen dichroitischen Spiegel 12 und 13, planparallelen transparenten Platten 32 und 33 und zugehörigen Wechselvorrichtungen 29 und 30 können analog aufgebaut sein. Der dichroitische Spiegel 11 ist als mit einer reflektierenden Schicht 34 beschichteter Bereich eines transparenten Substrats 35 ausgebildet. Die planparallele Platte 31 ist als ein anderer Bereich desselben Substrats 35 ausgebildet, auf dem statt der reflektierenden Schicht 34 eine Antireflexbeschichtung 36 aufgebracht ist. Dem in 2 zweimal mit dem gleichen Einfallswinkel dargestellten Strahlengang 9 wird beim Durchtritt durch die planparallele Platte 31 derselbe Parallelversatz 37 aufgeprägt wie beim Durchtritt durch den dichroitischen Spiegel 11. 2 hebt auch noch einmal hervor, dass der Einfallswinkel 38 des Beleuchtungslichts 3 ebenso wie der Einfallwinkel des Strahlengangs 9 deutlich kleiner als 45° ist. Hierdurch wird die Kantensteilheit des dichroitischen Spiegels 11 verbessert, d. h. die Steilheit seiner Transmissions-/Reflektionskurve über der Wellenlänge des einfallenden Lichts sowohl im Bereich der unteren als auch der oberen Grenzwellenlänge des Wellenlängenbands, in dem er reflektiert, erhöht. 2 zeigt weiterhin, dass das Substrat 35 an einem Spiegelträger 39 gelagert ist, für den Linearführungen 40 vorgesehen sind, um den Spiegelträger in der Haupterstreckungsebene des Substrats 35 zu führen. Dabei ist der Spiegelträger 39 ferromagnetisch und die Führungen 40 sind diamagnetisch. Die Wechselvorrichtung 28 umfasst zwei wechselweise bestrombare Elektromagnete 41 und 42, um den Spiegelträger 36 mittels magnetische Kräfte zwischen zwei Positionen zu verfahren, wobei in der einen Position des Spiegelträgers wie dargestellt das Beleuchtungslicht 3 auf den dichroitischen Spiegel 11 trifft und der Strahlengang 9 durch den dichroitischen Spiegel 11 hindurchverläuft, während in der anderen, in 2 nicht dargestellten Position das Beleuchtungslicht 3 auf die planparallele Platte 31 treffen würde und sich der Strahlengang 9 (wie rechts in 2 dargestellt) durch die planparallele transparente Platte 31 hindurcherstrecken würde.
3 zeigt schematisch ein Substrat 35, das neben dem Bereich, in dem es mit der Antireflexbeschichtung 36 beschichtet ist, um die planparallele transparente Platte 31 auszubilden, in einem anderen Bereich mit einer solchen Ausführungsform der reflektierenden Schicht 34 beschichtet ist, das ein Gradientennotchfilter 43 ausgebildet ist, bei dem die untere und die obere Grenzwellenlänge des Wellenlängenbands, über das die reflektierende Schicht 34 reflektiert, in der eingezeichneten Richtung seines Gradienten x_N variieren, und zwar gemäß 3 von links nach rechts zu höheren Wellenlängen. Dabei bleibt idealerweise die Breite des Wellenlängenbands der Reflektion gleich. Wenn dann die Wechselvorrichtung 28 nicht nur zwischen dem von dem mit der reflektierenden Schicht 34 beschichteten Bereich des Substrats 35 auf den mit der Antireflexbeschichtung 36 beschichteten Bereich wechseln kann, sondern verschiedene Relativstellungen des Gradientennotchfilters 43 gegenüber dem Schnittpunkt des Beleuchtungslichts 3 und dem Strahlengang 9 anfahrbar sind, kann der Wellenlängenbereich des Beleuchtungslichts 3, das mit dem dichroitischen Spiegel 34 in den Strahlengang 9 eingekoppelt wird, eingestellt werden. So kann die zugeordnete Lichtquelle 18 auch eine Weißlichtquelle sein, aus der mit Hilfe des als Gradientennotchfilter 43 ausgebildeten dichroitischen Spiegels 11 ein bestimmtes Wellenlängenband für das in den Strahlengang 9 eingekoppelte Beleuchtungslicht 3 ausgewählt wird. Auch nur in diesem ausgewählten Wellenlängenband blockiert dann der dichroitische Spiegel 11 das Detektionslicht 6 auf seinem Weg längs des Strahlengangs 9 von dem Scanner 8 zu dem Detektionslichtausgang 10.
4 gibt ein Beispiel für das einstellbare wellenlängenselektive Filter 15 gemäß 1 wieder. Neben mehreren Vollspiegeln 44 bis 47 zur Strahlführung und -trennung umfasst das Filter 15 einen Gradientenlangpassfilter 48 und einen damit in Reihe geschalteten Gradientenkurzpassfilter 49. Dem Gradientenlangpassfilter 48 ist ein Antrieb 50 zugeordnet, um den Gradientenlangpassfilter 48 in Richtung seines Gradienten x_LP gegenüber dem Strahlengang 9 verlagern. Entsprechend ist ein Antrieb 51 zum Verlagern des Gradientenkurzpassfilters 49 in Richtung seines Gradienten x_SP vorgesehen. Mit Hilfe der Antriebe 50 und 51 kann so einerseits die Grenzwellenlänge λ_LP des Gradientenlangpassfilters und andererseits die Grenzwellenlänge λ_SP des Gradientenkurzpassfilters eingestellt werden, die zusammen das Wellenlängenband des zu dem Detektionslichtausgang 10 gelangenden Detektionslicht 6 festlegen. Die unabhängige Verfahrbarkeit des Gradientenlangpassfilters 48 und des Gradientenkurzpassfilters 49 lässt damit nicht nur eine Veränderung der Lage, sondern auch der Breite des Wellenlängenbands des zu dem Detektionslichtausgang 10 gelangenden Detektionslichts 6 zu. Die Selektivität des wellenlängenselektiven Filters 15 ist dadurch erhöht, dass das Detektionslicht 6, nachdem es einmal durch den Gradientenlangpassfilter 48 und den Gradientenkurzpassfilter 49 hindurchgetreten ist, an dem Vollspiegel 45 reflektiert wird und dann ein zweites Mal bei derselben Grenzwellenlänge λ_SP durch den Gradientenkurzpassfilter 49 und dann auch bei derselben Grenzwellenlänge λ_LP durch den Gradientenlangpassfilter 48 hindurchtritt. Von dem Gradientenlangpassfilter 48, durch den sich der Strahlengang 9 zuerst hindurcherstreckt, reflektiertes Detektionslicht 6' kann über einen weiteren faseroptischen Lichtleiter 16' einem weiteren Detektionslichtausgang 10' oder zuvor einem weiteren einstellbaren wellenselektiven Filter 15' zugeführt werden (davon reflektiertes Detektionslicht kann dann direkt noch einem weiteren Detektionslichtausgang oder zuvor noch einem weiteren einstellbaren wellenselektiven Filter zugeführt werden usw.). Durch fortlaufendes Verfahren des Gradientenlangpassfilters 48 und des Gradientenkurzpassfilters 49 kann aber auch mit Hilfe nur eines Detektors 17 das Spektrum des Detektionslichts 6 analysiert werden.
Bezugszeichenliste

1: Scanning-Lichtmikroskop
2: Probe
3: Beleuchtungslicht
4: Beleuchtungslicht
5: Beleuchtungslicht
6: Detektionslicht
6': weiterer Anteil des Detektionslichts
7: Objektiv
8: Scanner
9: Strahlengang
10: Detektionslichtausgang
10': weiterer Detektionslichtausgang
11: dichroitischer Spiegel
12: dichroitischer Spiegel
13: dichroitischer Spiegel
14: Lochblende
15: einstellbares wellenselektives Filter
15': weiteres einstellbares wellenselektives Filter
16: faseroptischer Lichtleiter
16': weiterer faseroptischer Lichtleiter
17: Detektor
17': weiterer Detektor
18: Lichtquelle
19: Lichtquelle
20: Lichtquelle
21: faseroptischer Lichtleiter
22: faseroptischer Lichtleiter
23: faseroptischer Lichtleiter
24: Beleuchtungslichteingang
25: Beleuchtungslichteingang
26: Beleuchtungslichteingang
27: Beleuchtungslichteingang
28: Wechselvorrichtung
29: Wechselvorrichtung
30: Wechselvorrichtung
31: planparallele transparente Platte
32: planparallele transparente Platte
33: planparallele transparente Platte
34: reflektierende Schicht
35: Substrat
36: Antireflexbeschichtung
37: Parallelversatz
38: Einfallswinkel
39: Spiegelträger
40: Linearführung
41: Elektromagnet
42: Elektromagnet
43: Gradientennotchfilter
44: Vollspiegel
45: Vollspiegel
46: Vollspiegel
47: Vollspiegel
48: Gradientenlangpassfilter
49: Gradientenkurzpassfilter
50: Antrieb
51: Antrieb
53: Steuerung
x_N: Gradient des Gradientennotchfilters 43
x_LP: Gradient des Gradientenlangpassfilters 48
x_SP: Gradient des Gradientenkurzpassfilters 49
λ_LP: Grenzwellenlänge des Gradientenlangpassfilters 48
λ_SP: Grenzwellenlänge des Gradientenkurzpassfilters 49

Claims

Scanning-Lichtmikroskop (1) mit - einem Scanner (8), - einem Detektionslichtausgang (10) für Detektionslicht (6), - einem Strahlengang (9), der sich zwischen dem Scanner (8) und dem Detektionslichtausgang (10) erstreckt, und - Beleuchtungslichteingängen (24 bis 27) für Beleuchtungslicht (3 bis 5), denen jeweils ein dichroitischer Spiegel (11 bis 13) zugeordnet ist, um das jeweilige Beleuchtungslicht (3 bis 5) durch wellenlängenselektive Reflexion in den Strahlengang (9) zu dem Scanner (8) hin einzukoppeln, wobei sich der Strahlengang (9) durch den jeweiligen dichroitischen Spiegel (11 bis 13) hindurch erstreckt und wobei der jeweilige dichroitische Spiegel (11 bis 13) als mit einer reflektierenden Schicht (34) beschichteter Bereich eines planparallelen Substrats (35) ausgebildet ist, - wobei den dichroitischen Spiegeln (11 bis 13) jeweils eine Wechselvorrichtung (28 bis 30) zugeordnet ist, die einen den jeweiligen dichroitischen Spiegel (11 bis 13) tragenden und in einer Haupterstreckungsebene des jeweiligen dichroitischen Spiegels (11 bis 13) in einer translatorischen oder rotatorischen Richtung geführten Spiegelträger (39) aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die jeweilige Wechselvorrichtung (28 bis 30) dazu ausgebildet ist, den jeweiligen dichroitischen Spiegel (11 bis 13) gegen eine planparallele transparente Platte (31 bis 33) auszuwechseln, die dem Strahlengang (9) einen gleichen Parallelversatz (37) aufprägt wie der jeweilige dichroitische Spiegel (11 bis 13), - wobei der Spiegelträger der jeweiligen Wechselvorrichtung (28 bis 30) den jeweiligen dichroitischen Spiegel (11 bis 13) und die jeweilige planparallele transparente Platte (31 bis 33) trägt und in der gemeinsamen Haupterstreckungsebene des jeweiligen dichroitischen Spiegels (11 bis 13) und der jeweiligen planparallelen transparenten Platte (31 bis 33) in der jeweiligen translatorischen oder rotatorischen Richtung geführt und mit einem elektrischen Antrieb verfahrbar ist und - wobei eine Steuerung für eine Beleuchtungslichtquelle des Scanning-Lichtmikroskops (1), der der jeweilige dichroitische Spiegel (11 bis 13) zugeordnet ist, um ihr Beleuchtungslicht (3 bis 5) in den Strahlengang (9) einzukoppeln, dazu ausgebildet ist, die Beleuchtungslichtquelle erst dann zur Abgabe ihres Beleuchtungslichts (3 bis 5) anzusteuern, nachdem sie den jeweiligen elektrischen Antrieb angesteuert hat, um den jeweiligen dichroitischen Spiegel (11 bis 13) in dem Strahlengang (9) anzuordnen, und dann, wenn keine Ansteuerung der Beleuchtungslichtquelle zur Abgabe ihres Beleuchtungslichts (3 bis 5) ansteht, den jeweiligen elektrischen Antrieb anzusteuern, um den jeweiligen dichroitischen Spiegel (11 bis 13) in dem Strahlengang (9) gegen die jeweilige planparallele transparente Platte (31 bis 33) auszuwechseln.
Scanning-Lichtmikroskop (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die jeweilige planparallele transparente Platte (31 bis 33) eine gleiche optische Dicke längs des Strahlengangs (9) aufweist wie der jeweilige dichroitische Spiegel (11 bis 13).
Scanning-Lichtmikroskop (1) nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die jeweilige planparallele transparente Platte (31 bis 33) ein nichtverspiegelter Bereich desselben planparallelen Substrats (35) ist, das mit dem mit der reflektierenden Schicht (34) beschichteten Bereich den jeweiligen dichroitischen Spiegel (11 bis 13) ausbildet.
Scanning-Lichtmikroskop (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der jeweilige Antrieb - einen Dreh- oder Hubmagnet, - einen mehrere separate Spulenwicklungen oder eine in unterschiedlichen Stromflussrichtungen bestrombare Spule aufweisenden Elektromagnet (41, 42) und einen Permanentmagnet auf dem jeweiligen Spiegelträger (39), - zwei wechselweise bestrombare Elektromagnete (41, 42) und ein ferromagnetisches Gegenelement auf dem jeweiligen Spiegelträger (39), - einen Schritt- oder Linearmotor, - einen Piezoschreitmotor, - einen Spindel- oder Riemenantrieb oder - einen pneumatisch oder hydraulisch bewegten Zylinder aufweist.
Scanning-Lichtmikroskop (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Spiegelträger auf einer Präzisionslinearführung oder einem Präzisionskugellager angeordnet ist.
Scanning-Mikroskop (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine permanentmagnetische Fixiereinrichtung dazu ausgebildet ist, den Spiegelträger in mindestens einer Funktionsstellung zu fixieren.
Scanning-Lichtmikroskop (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Wechselvorrichtung einen ortsfesten kugelförmigen Führungskörper, eine ortsfeste konische Vertiefung und/oder eine ortsfeste V-förmige Nut und der Spiegelträger eine dazu komplementäre konische Vertiefung, eine dazu komplementäre V-förmige Nut und/oder einen dazu komplementären kugelförmigen Führungskörper aufweist, die in mindestens einer Funktionsstellung des Spiegelträgers ineinander eingreifen.
Scanning-Lichtmikroskop (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass hinter mindestens einer der planparallelen transparenten Platten (31 bis 33), in Richtung des von ihr transmittierten jeweiligen Beleuchtungslichts (3 bis 5) eine Beleuchtungslichtmesseinrichtung angeordnet ist.
Scanning-Lichtmikroskop (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die reflektierende Schicht (34) des jeweiligen dichroitischen Spiegels (11 bis 13) selektiv Beleuchtungslicht (3 bis 5) mit Wellenlängen innerhalb eines Wellenlängenbands mit einer Breite von nicht mehr als 20 nm oder 15 nm oder 10 nm reflektiert.
Scanning-Lichtmikroskop (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die reflektierenden Schichten (34) der den verschiedenen Beleuchtungslichteingängen (24 bis 27) zugeordneten dichroitischen Spiegel (11 bis 13) Beleuchtungslicht (3 bis 5) mit Wellenlängen innerhalb nicht überlappender Wellenlängenbänder reflektieren.
Scanning-Lichtmikroskop (1) nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass Grenzen mindestens eines der Wellenlängenbänder über die Fläche des mit der jeweiligen reflektierenden Schicht (34) beschichteten Bereichs des jeweiligen Substrats (35) variieren.
Scanning-Lichtmikroskop (1) nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die oder eine Beleuchtungslichtquelle (18 bis 20) des Scanning-Lichtmikroskops (1), der der jeweilige dichroitische Spiegel (11 bis 13) zugeordnet ist, eine Weißlichtquelle ist.
Scanning-Lichtmikroskop (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Einfallswinkel (38) des einzukoppelnden Beleuchtungslichts (3 bis 5) auf mindestens einen der dichroitischen Spiegel (11 bis 13) kleiner als 45° oder kleiner als 30° oder kleiner als 20° ist.
Scanning-Lichtmikroskop (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die planparallele transparente Platte (31 bis 33) eine Antireflexbeschichtung (36) aufweist.
Scanning-Lichtmikroskop (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Detektionslichtausgang (10) ein einstellbares wellenlängenselektives Filter (15, 15') angeordnet ist.
Scanning-Lichtmikroskop (1) nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das wellenlängenselektive Filter (15, 15') hinter einer eingangsseitigen konfokalen Lochblende (14) und/oder vor einer ausgangsseitigen konfokalen Lochblende (14) oder einem faseroptischen Lichtleiter (16, 16') angeordnet ist.
Scanning-Lichtmikroskop (1) nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass das einstellbare wellenlängenselektive Filter (15, 15') ein längs seiner Gradientenrichtung verfahrbares Gradientenbandpassfilter aufweist.
Scanning-Lichtmikroskop (1) nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das einstellbare wellenlängenselektive Filter (15, 15') einen Vollspiegel (45) oder Retroreflektor hinter dem Gradientenbandpassfilter aufweist, so dass Detektionslicht (6, 6') nach zweimaliger Transmission durch das Gradientenbandpassfilter sowie dazwischen erfolgender Reflexion an dem Vollspiegel (45) oder Retroreflektor zu dem Detektionslichtausgang (10, 10') gelangt.
Scanning-Lichtmikroskop (1) nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass das einstellbare wellenlängenselektive Filter (15, 15') eine Reihenschaltung aus einem längs seiner Gradientenrichtung verfahrbaren Gradientenlangpassfilter (48) und einem längs seiner Gradientenrichtung fahrbaren Gradientenkurzpassfilter (49) aufweist.
Scanning-Lichtmikroskop (1) nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das einstellbare wellenlängenselektive Filter (15, 15') einen Vollspiegel (45) oder Retroreflektor hinter der Reihenschaltung aus dem Gradientenlangpassfilter (48) und dem Gradientenkurzpassfilter (49) aufweist, so dass Detektionslicht (6, 6') nach zweimaliger Transmission durch das Gradientenlangpassfilter (48) und das Gradientenkurzpassfilter (49) sowie dazwischen erfolgender Reflexion an dem Vollspiegel (45) oder Retroreflektor zu dem Detektionslichtausgang (10, 10') gelangt.
Scanning-Lichtmikroskop (1) nach einem der Ansprüche 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das einstellbare wellenlängenselektive Filter (15, 15') motorisch einstellbar ist.
Scanning-Lichtmikroskop (1) nach einem der Ansprüche 15 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass ein weiterer Detektionslichtausgang vorhanden ist, aus dem von dem einstellbaren wellenlängenselektiven Filter (15, 15') reflektiertes Detektionslicht (6, 6') austritt, wobei vor dem weiteren Detektionslichtausgang (10') ein weiteres einstellbares wellenlängenselektives Filter (15') angeordnet ist.