DE102009060490A1 - Hochauflösendes Mikroskop und Bildteileranordnung - Google Patents
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Abstract
Mikroskop mit einem Beleuchtungsstrahlengang mit einer Weitfeldbeleuchtung einer Probe und einem ersten Detektionsstrahlengang mit einem ortsaufgelösten Flächenempfänger, auf den ein erster Teil des von der Probe kommenden Detektionslichtes über den ersten Detektionsstrahlengang gelangt oder Bildteileranordnung für ein Mikroskop wobei zur Verlängerung der optischen Weglänge mindestens ein zweiter Teil des von der Probe kommenden Detektionslichtes aus dem Detektionsstrahlengang ausgeblendet ist und über Umlenkmittel zum Detektionsstrahlengang mindestens in einem zweiten Detektionsstrahlengang geführt ist und vorzugsweise über weitere Umlenkmittel in Richtung der Detektion so zurückgelenkt wird, dass auf dem Flächenempfänger nebeneinander mindestens zwei Teilgebiete mit Detektionslicht beaufschlagt sind, wobei mindestens der zweite Teil des Detektionslichtes zumindest teilweise zur Verlängerung der optischen Weglänge in einem optischen Element mit gegenüber dem ersten Detektionsstrahlengang erhöhter optischer Dichte verläuft und das optische Element in einem Winkel, vorzugsweise senkrecht zur optischen Achse des ersten Detektionsstrahlengangs zur Verstellung der optischen Weglänge verschiebbar ausgebildet ist und zumindest an seiner Lichteintritts- und Lichtaustrittsseite ebene Flächen aufweist und vorzugsweise mindestens im zweiten Detektionsstrahlengang nach einer ersten Strahlumlenkung ein Prisma, bevorzugt ein Glasprisma zur Umlenkung in eine zum ersten Detektionsstrahlengang parallele Richtung zur Erhöhung der Weglänge und zur Rückumlenkung vorgesehen ist.
Description
- Problembeschreibung und Stand der Technik
- Literatur:
-
- [1] Betzig et. al, Science 313, 1642–1645 (2006)
- [2] Hess et al., PNAS 104, 17370–17375 (2007)
- [3] Hess et al., Biophys J. 91, 4258–427 (2006)
- [4] Shroff et al., PNAS 104, 20308–2031 (2007)
- [5] Rust et al., Nat Methods 3, 793–796 (2006)
- [6] Egner et al., Biophys J. 93, 3285–3290 (2007)
- [7] Toprak et al., Nano Lett. 7, 3285–3290 (2007)
- [8] Juette et al., Nature Methods 5, 527 (2008)
- [9] Huang et al., Science 319, 810 (2008)
- Seit einiger Zeit werden verschiedene Verfahren zur Überwindung der Beugungsgrenze in der Fluoreszenzmikroskopie entwickelt und angewendet (PALM, STED, Strukturierte Beleuchtung) Eine sich derzeit rasant entwickelnde Methode zur hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie basiert auf der hochgenauen Lokalisierung einzelner Moleküle. Es ist bekannt, dass die Lokalisierung, also die Bestimmung des Ortes eines einzelnen fluoreszierenden Moleküls nicht der Beugungsbeschränkung unterliegt (Literatur). Diese Ortsbestimmung kann mit hochempfindlichen Kameras im Weitfeld mit einer Genauigkeit bis in den nm-Bereich erfolgen, wenn genügend Photonen des Moleküls detektiert werden können. Bei der lokalisierungsbasierten, hochaufgelösten Mikroskopie wird aus den so gewonnenen Molekülpositionen ein Bild zusammengesetzt. Entscheidend dabei ist, dass sich immer nur eine Untermenge der Moleküle der Probe im fluoreszierenden Zustand befindet, so dass im Mittel die ”Nächste-Nachbar” Distanz der aktiven Moleküle immer größer als die PSF des Mikroskops ist. Erreicht wird dies durch Verwendung optisch oder chemisch schaltbarer Fluorophore: in einem dicht markierten Bereich einer Probe werden durch Einstrahlen einer geeigneten Konversionswellenlänge stochastische Untermengen der Fluorophore im betrachteten Bereich in den fluoreszierenden Zustand geschaltet. Dabei wird die Dichte der Spots so eingestellt, dass ein kontinuierliches Lokalisieren der Molekülpositionen ermöglicht wird. Dieses optische Schaltverfahren wird z. B. bei der Photo Activated Localization Microscopy (PALM) verwendet. Dieses grundlegende Verfahren ist in verschiedenen Variationen eingehend in der Literatur beschrieben [1–6].
- Die Varianten (PALM, STORM, D-STORM etc.) unterscheiden sich dabei hauptsächlich in der Wahl der Fluorophore und der Art des optischen Schaltprozesses.
- Allen Verfahren gemeinsam ist jedoch die Lokalisierung der Moleküle durch Abbildung auf eine hochempfindliche (z. B. EMCCD) Kamera. Die quasi-punktförmige Lichtquelle (Molekül) wird dabei durch die Punktbildverwaschungsfunktion (PSF) des Mikroskops auf mehrere Kamerapixel abgebildet. Die genaue Position des Moleküls in der x/y Ebene kann nun entweder durch fitten der bekannten PSF (Gauss) oder durch Schwerpunktsbestimmung oder durch eine Mischung von beidem (Gaussian Mask Fit) bestimmt werden.
- Typische Lokalisierungsgenauigkeiten liegen (je nach experimentellen Bedingungen) bei 5–30 nm; das ist dann in etwa auch die beste laterale Auflösung dieses Verfahrens.
- Praktisch bedeutet die Forderung nach nicht zu dicht beieinander liegenden Molekülen einerseits und einer möglichst kompletten Wiedergabe der untersuchten Strukturen andererseits, dass viele Einzelbilder (typisch 20000) der Probe aufgenommen werden müssen. In jedem Bild werden die Positionen der zu diesem Zeitpunkt aktiven Moleküle bestimmt und gespeichert. Zu der schon beträchtlichen Bildaufnahmezeit für 20000 Bilder kommt also noch die (je nach verwendetem Algorithmus und Rechnersystem) deutlich längere Rechen- oder Auswertezeit hinzu, bevor das eigentliche hochaufgelöste Bild zur Verfügung steht.
- Das oben beschriebene Verfahren der lokalisierungsbasierten Hochauflösung ist allerdings auf Oberflächen bzw. 2 Dimensionen beschränkt, da die Lokalisierung der einzelnen Farbstoff-moleküle in der dritten Raumrichtung (z-Richtung) ungleich komplexer ist. Hierzu sind mehrere Ansätze aus der Literatur bekannt, die im Folgenden kurz erläutert werden.
- Astigmatismus/Zylinderlinse ([9]):
- Bei diesem Ansatz wird im Detektionsstrahlengang eine schwache Zylinderlinse eingebracht, die zu einer Astigmatischen PSF führt. Entsprechend wird das Bild des Moleküls elliptisch verzerrt, wenn sich das Molekül ober- oder unterhalb des Symmetriepunktes der PSF befindet. Aus Orientierung und Stärke der Verzerrung lässt sich dann die Information über die z-Position des Moleküls extrahieren. Ein Problem dieses Verfahrens liegt darin, dass auch die lokale Umgebung und die Orientierung des molekularen Dipols zu einer Verzerrung des Spots des Moleküls führen kann (Literatur). Diesen Molekülen würde dann, je nach ihrer Orientierung, ein falscher z-Wert zugeordnet.
- Detektion in zwei Ebenen:
- Hier wird ein 50/50 Strahlteiler im Detektionsstrahlengang eingeführt, der das Bild in zwei Teilbilder aufspaltet (dupliziert). Diese zwei Bilder werden entweder auf zwei identische Kameras oder nebeneinander auf einen Kamerachip abgebildet. In einen der zwei Teilstrahlengänge wird eine optische Weglängendifferenz dergestalt eingeführt, dass sich aus den zwei Teilstrahlengängen zwei Objektebenen ergeben, die um etwa eine halbe bis eine z-PSF (700 nm) in z-Richtung auseinanderliegen. Die z-Position für Moleküle, die zwischen diesen beiden Ebenen liegen, ergibt sich nun z. B. durch Subtraktion der zwei Teilbilder des Moleküls bzw. durch fitten einer dreidimensionalen PSF.
- Für diese Methode sind zwei hochempfindliche Kameras notwendig oder beide Bilder müssen auf einen Kamerachip nebeneinander angeordnet werden. Letzteres führt naturgemäß zu einer Einschränkung des Bildfeldes. Beide Varianten erfordern außerdem eine präzise Justage der Strahlengänge bzw. Kalibriermessungen, um die subpixelgenaue Überlappung der zwei Teilbilder zu gewährleisten.
- Die oben beschriebenen Verfahren zur Lokalisierung in der x/y-Ebene und/oder in z-Richtung sind nicht nur für die hochauflösende Mikroskopie einsetzbar sondern auch für Partikel- bzw. Molekültracking. Entsprechendes gilt für die im Folgenden vorgestellten Lösungsansätze.
- Zur Detektion in mehreren Ebenen sind verschiedene Ansätze vorbekannt:
Strahlteilung und Erzeugung zweier Objektebenen durch unterschiedliche Bildweiten: Bewersdorf et al. [7], Toprak et al [8] -
AT 402 863 B -
WO 95/00871 -
US 5982497 beschreibt eine Chromatische Strahlteilung und lateral versetzte Bildgebung bei gleicher Objekt- und Bildweite zur Darstellung von zwei oder mehr Farbkanälen auf einem Bildsensor - Zur hochaufgelösten Tiefenlokaliserung in Z-Richtung einzelner Moleküle sind vor allem [7] und [8] relevant. Die dort realisierten Lösungen zeigen jedoch folgende Nachteile und Limitierungen:
- – schiefer Einfall auf den Bildsensor bewirkt Verzerrungen der PSF abhängig von z-Position, Schwerpunkt lateral abhängig von z-Position
- – der Abbildungsmaßstab verändert sich als Funktion der z-Position
- – Es ist keine Verstellung der Aufspaltung möglich und damit keine Anpassung des optimalen Arbeitspunktes an unterschiedliche Mikroskopobjektive
- – Wenn (theoretisch) eine Verstellung realisiert würde (z. B. durch Verfahren des Spiegels in [8]) dann wäre es aufgrund des einen, längeren Strahlengangs in Luft unmöglich, die z-Aufspaltung der beiden Ebenen auf „Null” einzustellen.
- – Eine so realisierte Verstellung würde bei hochaufgelöster Vermessung von Objekten in Deckglasnähe bei Erhöhung der z-Aufspaltung die bewegte Objektebene in das Deckglas hinein verlagern, so dass das gesamte System nachfokussiert werden muss
- Aufgabe der vorgestellten Erfindung ist daher, die Aufspaltung eines Mikroskopbildes in zwei Teilbilder auf zwei Teilbereiche eines Bildsensors unter Vermeidung der o. g. Nachteile und Limitierungen.
- Problemlösung:
- Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche vorteilhaft gelöst. Besonders vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
- Die Erfindung findet ihre besonders vorteilhafte Verwendung in einem hochauflösenden Mikroskop zur dreidimensionalen Positionsbestimmung von Objekten, insbesondere einzelner Fluorophore, vorzugsweise zur räumlich hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie einer Probe, die mit Markierungsmolekülen markiert ist, welche mit einem Signal derart aktivierbar oder umschaltbar sind, dass sie erst im aktivierten oder umgeschalteten Zustand zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung anregbar sind, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:
- a) Einbringen des Signals auf die Probe derart, dass nur eine Teilmenge der in der Probe vorhandenen Markierungsmoleküle aktiviert werden, wobei in der Probe Teilbereiche bestehen, in denen aktivierte Markierungsmoleküle zu den ihnen nächst benachbarten aktivierten Markierungsmoleküle mindestens einen Abstand haben, der größer oder gleich einer Länge ist, welche sich aus einer vorbestimmten optischen Auflösung ergibt,
- b) Anregung der aktivierten Moleküle zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung,
- c) Detektion der Fluoreszenzstrahlung mit der vorbestimmten optischen Auflösung, und
- d) Erzeugen eines Einzelbildes aus der in Schritt c) aufgenommenen Lumineszenzstrahlung, wobei die geometrischen Orte der Fluoreszenzstrahlung abgebenden Markierungsmoleküle mit einer über die vorbestimmte optische Auflösung gesteigerten Ortsauflösung ermittelt werden, wobei die Schritte mehrfach wiederholt werden und die so erhaltenen, mehreren Einzelbilder zu einem Gesamtbild zusammengefügt werden,
- In
1 ist das hier vorgestellte, variable Bildteilermodul zur z-Aufspaltung skizziert. Die Bezugszeichen bedeuten im Einzelnen: - E1, E2:
- Objektebenen
- BM:
- Bildteilermodul
- O:
- Objektiv
- Dic1:
- Hauptfarbteiler
- L1
- Lichtquelle
- EF:
- Emissionsfilter
- TL:
- Tubuslinse
- SP:
- Umlenkspiegel
- B:
- Blende (telezentrische Blende)
- L1, L2:
- Linsengruppen
- Dic2:
- Farbteiler zu optionalen Ausblendung
- BS:
- Strahlteilerwürfel
- P1
- Zweifach-Umlenkprisma, verstellbar senkrecht zur optischen Achse
- P2
- Umlenkprisma
- DE
- Weitfelddetektor
- S1, S2:
- Sensorhälften
- e1, e2
- Bildebenen
-
1 zeigt einen Weitfeld-Strahlengang mit einer aufgeweiteten Lichtquelle und einem ortsaufgelösten Flächendetektor, beispielsweise einer CCD Kamera. - Das Licht der Lichtquelle L1 gelangt (reflektiert) über Dic1 und das Objektiv O auf eine Probe Pr.
- Das reflektierte und fluoreszierende Probenlicht gelangt über das Objektiv in Richtung der Detektion.
- Am Teiler Dic1 und durch den Filter EF erfolgt eine Selektion des erwünschten Lichtes, hier eine Unterdrückung des reflektierten Lichtes, das heißt nur das Fluoreszenzlicht gelangt in Richtung der Detektion.
- Über SP, L1. L2 gelangt das Probenlicht in die erfindungsgemäße Anordnung aus BS, P1 und P2 und dann auf den Detektor DE.
- E1 und E2 sind unterschiedliche Objektebenen in der Probe Pr.
-
1a zeigt eine vergrößerte Ansicht des erfindungsgemäßen variablen Bildteilermoduls BM. Ein Bild der Probe Pr wird über den Strahlteilerwürfel BS in zwei Teilbilder auf dem Detektor DE aufgespaltet. Das Prisma P1 wird motorisch senkrecht zur optischen Achse verschoben, um die Aufspaltung der beiden Objektebenen einzustellen. - Über P2 (fest) wird das verschobene Teilbild wieder in den durchgehenden Strahlengang, durch P2 räumlich, versetzt zum durchgehenden Strahlengang das heißt seitlich auf DE versetzt, eingespiegelt.
- Anhand von Bildebenen e1–e3 ein- und derselben Objektebene in Pr, beispielsweise E1, wird die Erfindung weiter erläutert:
Die gestrichelte Position von P1 deutet die kürzeste mögliche Position von BM an; die damit erzielte Bildebene e3 läge hinter dem Detektor DE. - Die Bildebene e2 des nicht abgelenkten Teilbildes liegt auf dem Sensor (Teilbereich S2 des Sensors). Durch Verschieben des Prismas P1 nach außen in die untere Stellung in
1a wird der Weg verlängert und die Bildebene e1 wandert (entgegengesetzt zum Lichtweg) nach vorne. - Daraus folgt, dass ein Objekt (Molekül), das sich in Objektebene E2 befindet, auf Sensorhälfte S2 scharf und auf Sensorhälfte S1 unscharf abgebildet wird. Entsprechendes gilt für ein Objekt, das sich in Objektebene E1 befindet, bzw. zwischen E1 und E2 E1 wäre scharf auf S1 und E2 wäre scharf auf S2 alles andere wäre unscharf bei der gleichen Prismenposition).
- In
1b sind vergrößert Punktbilder von Molekülen 1, 2, 3, jeweils aus den Objektebenen E1, E2 auf den Sensorhälften S1 und S2 dargestellt. - Es wird ersichtlich, dass in E1 und E2 jeweils in unterschiedlichen Ebenen angeordnete Moleküle (1 in E1 und 3 in E2) in S1 (Molekül 1) und S2 (Molekül 3) scharf detektiert werden, während Molekül 2 jeweils gleich unscharf detektiert wird, weil es sich offensichtlich zwischen E1 und E2 befindet.
- Aus der Größe der Moleküle auf den Detektorabschnitten kann also auf ihre genaue Lage in Z-Richtung in der Probe geschlossen werden.
- In der Zeichnung angedeutet sind weiterhin die Strahlengänge zweier Moleküle, die sich beide in Objektebene E2 befinden.
- Die Blende B definiert den auf die Hälfte reduzierten Bildausschnitt (entsprechend der Größe der Sensorhälften S1 und S2) und verhindert, dass Licht von außerhalb dieses Bereiches auf die beiden Teilstrahlengänge überspricht.
- Die Aufspaltung in zwei Teilbilder erfolgt am 50/50 Strahlteilerwürfel BS.
- Die Aufgabe, das umgelenkte Teilbild in eine vom direkt abgebildeten Teilbild unterschiedliche Bildebene zu fokussieren, wird durch das Prisma P1 erfüllt. Dieses Prisma P1 verlängert die Schnittweite der entsprechenden Bündel verglichen mit dem entsprechenden Weg in Luft; es ist daher vorzugsweise aus einem hochbrechenden Glas auszuführen, um einen möglichst großen Arbeitsbereich zu erhalten. Diese Bündel werden über das Prisma P2 wieder parallel zum direkten Strahlengang eingespiegelt und auf den Bildsensor DE im Abschnitt S1 gelenkt.
- Mit der Schnittweitenverlängerung nach der letzen Optik/Linse L2 im Prisma P1 kann durch Wahl der Länge des Prismas dafür gesorgt werden, dass trotz zwangsläufig größerer Weglänge des umgelenkten Teilbildes beide Teilbilder aus unterschiedlichen Objektebenen E1, E2 gleichzeitig scharf auf den Detektor DE abgebildet werden.
- Durch Verfahren des Prismas P1 senkrecht zur optischen Achse des direkten Strahlengangs kann die z-Verschiebung der Fokusebenen der beiden Teilbilder aus unterschiedlichen Objektebenen) in der Probe eingestellt werden.
- So kann die Aufspaltung beispielsweise vorteilhaft an unterschiedliche Objektive angepasst werden.
- Dies ist nun auch ohne Nachfokussieren des Systems möglich, da das System so ausgelegt wurde..), dass sich eine Verschiebung von „Null” einstellen lässt und sich insbesondere bei Beobachtung an der Deckglasoberfläche die zweite Fokusebene in die Probe (und nicht in das Deckglas) bewegen lässt.
- In einer weiteren Anordnung bei der man auf den Glasweg des Prismas P1 verzichtet und nur zwei gemeinsam senkrecht zur optischen Achse verfahrbare Umlenkspiegel benutzt, würde man auch vorteilhaft zwei unterschiedliche Objektebenen scharf auf die Kamera abbilden können.
- Allerdings würde man aufgrund des seitlichen Weges den Nullabgleich nicht schaffen und beim seitlichen Wegfahren der Spiegel immer weiter ins „Deckglas” fahren. Zur Variation der zweiten Objektebene im Probenraum müsste man dann die Objektebenenaufspaltung über die Spiegel einstellen und dann objektivseitig so Nachfokussieren, dass das Deckglas wieder scharf über die Umlenkung auf den Detektor abgebildet wird. Aber diese geschilderte Anordnung liegt dennoch im Rahmen der hier offenbarten Erfindung, Eine Auswechslung der Prismas P1 gegen ein anderes Prisma mit unterschiedlichen Glaswegen ist erfindungsgemäß möglich.
- Die Abbildung, vom Objekt auf den Detektor..) durch Linse L2 in Verbindung mit der Optik L1 links vom Strahlteiler Dic2 ist insgesamt vorteilhaft telezentrisch.
- Eine einstellbare, vorzugsweise rechteckige Blende B in einem Zwischenbild dient zur Definition eines rechteckigen und über P1, P2 aufgespalteten Bildbereichs und zur Unterdrückung von Fluoreszenz- und Streulicht aus den Feldbereichen außerhalb dieses neuen Bereichs
- Für Mehrfarbexperimente kann eine zweite Emissionswellenlänge über den Farbteiler Dic2 ausgespiegelt werden und unter Verwendung eines zweiten, vorzugsweise identischen z-Aufspaltungsmoduls und eines weiteren Detektors kann dieser Strahlengang ebenfalls zur hochaufgelösten Lokalisierung verwendet werden.
- Eventuelle Farblängsfehler des Objektivs oder andere chromatische Fehler, die einen Einfluss auf die z-Lokalisierung der einzelnen Moleküle haben, können durch Anpassen der Aufspaltung für den zweiten Farbkanal kompensiert werden.
-
2a ) zeigt eine weitere vorteilhafte Ausbildung eines Moduls zur Aufspaltung eines Kamerabildes in 4 Teilbilder gleicher Intensität zur z-Hochauflösung. - In Fig. a) Links: ist eine Ausführung mit separaten Spiegeln und Strahlteilern dargestellt.
- Ein erster Teiler T1, hier 25/75 Teilung bezüglich Transmission und Reflektion lenkt einen Teil des Lichtes auf die Fläche Q1 des Detektors DE4.
- Ein zweiter Teil wird T1 reflektiert und über einen Spiegel S1 in Richtung eines zweiten Teilers T2 gelenkt mit einem Verhältnis 66/33. Dieser lässt einen Teil des Lichtes in Richtung der Fläche Q2 von DE 4 durch und reflektiert einen Teil in Richtung eines Spiegels S3 der das Licht in Richtung des 50/50 Teilers T3 umlenkt. Ein Teil gelangt durch T3 auf die Fläche Q3 von DE 4 und ein Teil wird über S3 in Richtung der Fläche Q4 von DE 4 umgelenkt.
- Durch die Aufspaltung der z-Ebenen in der monolithischen Bauform um jeweils eine „Würfellänge” eines Strahlteilerwürfels → es ergeben sich vier gleichmäßig verschobene Bild- bzw. Objektebenen, wobei der Quadrant Q1 von DE 4 das Bild im direkten Durchgang sieht, Quadrant Q2 ein um eine „Normdistanz” (= eine Strahlteilerwürfellänge im monolithischen Aufbau rechts), Quadrant Q3 um zwei und Quadrant Q4 ein um 3 Distanzen verschobenes Bild.
- Die hier ohne Einschränkung dargestellten Teilerverhältnisse der 3 Strahlteiler sorgen dafür, dass alle 4 Quadranten vorzugsweise die gleiche Intensität erfassen In
2b ist eine monolithische Ausführung mit 3 Strahlteilerwürfeln für T1–T3 und 3 verspiegelten Prismen für S1–S3 von der Seite, von oben und perspektivisch dargestellt. - Die Anordnung in
2a ) und b) ist vorteilhaft auch geeignet für einen telezentrischen Detektionsstrahlengang wie anhand von1 beschrieben. - Die Vorteile der erfindungsgemäßen Anordnung in
2 bestehen insbesondere auch darin, dass durch vier Bilder aus vier Probenebenen vorteilhaft vier Stützstellen für die z-Bestimmung vorliegen durch Fit??; dadurch ist genauere z-Bestimmung in einem größeren Arbeitsbereich möglich. - Das quadratische Sensorformat der hochempfindlichen EMCCD-Kameras wird weiterhin noch effizienter ausgenutzt.
- In
3 erfolgt eine vorteilhafte Kombination einer Ausführung nach2 mit verschiebbaren Prismen entsprechend1 . - Rechts ist eine Ansicht aus Sensorrichtung dargestellt, links eine Draufsicht.
- Anstelle der Spiegel S1–S3 in
2 sind hier Prismen 1–3 vorgesehen die einen Lichtweg parallel zur optischen Achse durch ein Medium höherer optischer Dichte definieren. im Vergleich zu2 dienen hier zusätzliche Umlenkelemente 1–3 zu Wiedereinspiegelung in den jeweiligen Teilstrahlengang. - Jede der drei senkrecht zur optischen Achse (Lichtrichtung) verstellbaren Prismen 1–3 ist für jeweils einen Quadranten Q2–4 des Sensors (
2 ) vorgesehen, der vierte Quadrant Q1 wird durch den direkten Durchgang belichtet. Jedes Prisma könnte jetzt auf eine unterschiedliche Ebenenverlagerung eingestellt werden. - ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims (10)
- Mikroskop mit einem Beleuchtungsstrahlengang mit einer Weitfeldbeleuchtung einer Probe und einem ersten Detektionsstrahlengang mit einem ortsaufgelösten Flächenempfänger, auf den ein erster Teil des von der Probe kommenden Detektionslichtes über den ersten Detektionsstrahlengang gelangt oder Bildteileranordnung für ein Mikroskop wobei zur Verlängerung der optischen Weglänge mindestens ein zweiter Teil des von der Probe kommenden Detektionslichtes aus dem Detektionsstrahlengang ausgeblendet ist und über Umlenkmittel zum Detektionsstrahlengang mindestens in einem zweiten Detektionsstrahlengang geführt ist und vorzugsweise über weitere Umlenkmittel in Richtung der Detektion so zurückgelenkt wird, dass auf dem Flächenempfänger nebeneinander mindestens zwei Teilgebiete mit Detektionslicht beaufschlagt sind, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens der zweite Teil des Detektionslichtes zumindest teilweise zur Verlängerung der optischen Weglänge in einem optischen Element mit gegenüber dem ersten Detektionsstrahlengang erhöhter optischer Dichte verläuft und das optische Element in einem Winkel, vorzugsweise senkrecht zur optischen Achse des ersten Detektionsstrahlengangs zur Verstellung der optischen Weglänge verschiebbar ausgebildet ist und zumindest an seiner Lichteintritts- und Lichtaustrittsseite ebene Flächen aufweist.
- Mikroskop nach Anspruch 1, wobei mindestens im zweiten Detektionsstrahlengang nach einer ersten Strahlumlenkung ein Prisma, bevorzugt ein Glasprisma zur Umlenkung in eine zum ersten Detektionsstrahlengang parallele Richtung zur Erhöhung der Weglänge und zur Rückumlenkung vorgesehen ist.
- Mikroskop nach Anspruch 2, wobei das Prisma vom parallelen Teil des zweiten Detektionsstrahlengang durchlaufen wird
- Mikroskop nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Prisma zur Einstellung der optischen Weglänge senkrecht zur optischen Achse verschiebbar ausgebildet ist
- Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein telezentrischer Strahlengang vom der Probe zum Detektor vorgesehen ist
- Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Ausblendung mindestens des zweiten Detektionsstrahlengangs telezentrisch in Richtung der Detektorebene erfolgt oder in einem telezentrischen Teil des Detektionsstrahlengangs liegt
- Mikroskop mit einem Beleuchtungsstrahlengang mit einer Weitfeldbeleuchtung einer Probe und einem ersten Detektionsstrahlengang mit einem ortsaufgelösten Flächenempfänger, auf den ein erster Teil des von der Probe kommenden Detektionslichtes über den ersten Detektionsstrahlengang gelangt oder Bildteileranordnung für ein Mikroskop wobei zur Verlängerung der optischen Weglänge mindestens ein zweiter Teil des von der Probe kommenden Detektionslichtes aus dem Detektionsstrahlengang ausgeblendet ist und über Umlenkmittel zum Detektionsstrahlengang mindestens in einem zweiten Detektionsstrahlengang geführt ist und vorzugsweise über weitere Umlenkmittel in Richtung der Detektion so zurückgelenkt wird, dass auf dem Flächenempfänger nebeneinander mindestens zwei Teilgebiete mit Detektionslicht beaufschlagt sind, dadurch gekennzeichnet wobei mindestens ein Teil der Umlenkmittel senkrecht zur optischen Achse zur Verstellung der optischen Weglänge in einem Winkel, vorzugsweise senkrecht, zur optischen Achse des ersten Detektionsstrahlengangs, verschiebbar ausgebildet ist
- Mikroskop mit einem Beleuchtungsstrahlengang mit einer Weitfeldbeleuchtung einer Probe und einem ersten Detektionsstahlengang mit einem ortsaufgelösten Flächenempfänger, auf den ein erster Teil des von der Probe kommenden Detektionslichtes über den ersten Detektionsstrahlengang gelangt oder Bildteileranordnung für ein Mikroskop wobei zur Verlängerung der optischen Weglänge mindestens ein zweiter Teil des von der Probe kommenden Detektionslichtes aus dem Detektionsstrahlengang ausgeblendet ist und über Umlenkmittel zum Detektionsstrahlengang mindestens in einem zweiten Detektionsstrahlengang geführt ist und vorzugsweise über weitere Umlenkmittel in Richtung der Detektion so zurückgelenkt wird, dass auf dem Flächenempfänger nebeneinander mindestens zwei Teilgebiete mit Detektionslicht beaufschlagt sind, wobei über teildurchlässige Spiegel und Umlenkelemente eine Aufteilung in vier Detektionsstrahlengänge erfolgt die zueinander versetzt auf einem oder mehreren Detektoren auftreffen.
- Mikroskop nach Anspruch 8 wobei drei teildurchlässige Spiegel und drei Umlenkelemente zur Aufteilung vorgesehen sind und die die teildurchlässigen Spiegel vorzugsweise Teilungsverhältnisse von 25/75, 66/33 und 50/50 zwischen transmittierter und reflektierter Strahlung aufweisen
- Verwendung mindestens einer der Anordnungen nacxh Ansapruch 1–9 in einem hochauflösenden Mikroskop, insbesondere zur zwei- oder dreidimensionalen Positionsbestimmung von Objekten, insbesondere einzelner Fluorophore, vorzugsweise zur räumlich hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie einer Probe, die mit Markierungsmolekülen markiert ist, welche mit einem Signal derart aktivierbar oder umschaltbar sind, dass sie erst im aktivierten oder umgeschalteten Zustand zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung anregbar sind, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist: a) Einbringen des Signals auf die Probe derart, dass nur eine Teilmenge der in der Probe vorhandenen Markierungsmoleküle aktiviert werden, wobei in der Probe Teilbereiche bestehen, in denen aktivierte Markierungsmoleküle zu den ihnen nächst benachbarten aktivierten Markierungsmoleküle mindestens einen Abstand haben, der größer oder gleich einer Länge ist, welche sich aus einer vorbestimmten optischen Auflösung ergibt, b) Anregung der aktivierten Moleküle zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung, c) Detektion der Fluoreszenzstrahlung mit der vorbestimmten optischen Auflösung, und d) Erzeugen eines Einzelbildes aus der in Schritt c) aufgenommenen Lumineszenzstrahlung, wobei die geometrischen Orte der Fluoreszenzstrahlung abgebenden Markierungsmoleküle mit einer über die vorbestimmte optische Auflösung gesteigerten Ortsauflösung ermittelt werden, wobei die Schritte mehrfach wiederholt werden und die so erhaltenen, mehreren Einzelbilder zu einem Gesamtbild zusammengefügt werden,
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