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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Weitfeldmikroskopie, nämlich zur hochauflösenden PAL-Mikroskopie, wobei ein Probenfeld auf eine Detektorfläche eines Detektors abgebildet wird. Die Erfindung bezieht sich gleichermaßen auf ein Weitfeldmikroskop, nämlich zur hochauflösenden PAL-Mikroskopie, das einen Detektor, der eine strahlungsempfindliche, ortsauflösende Detektorfläche hat, eine Abbildungsoptik, die ein Probenfeld auf die Detektorfläche des Detektors abbildet, und eine Steuereinrichtung aufweist, die Detektionsdaten des Detektors ausliest.
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Für die Weitfeldmikroskopie sind grundsätzlich die physikalischen Gesetze der optischen Abbildung auflösungsbestimmend. Man spricht bekanntermaßen auch von der Beugungsgrenze. Seit einiger Zeit werden verschiedene Verfahren zur Überwindung dieser Beugungsgrenze in der Mikroskopie, insbesondere der Lumineszenz- oder Fluoreszenzmikroskopie (Lumineszenz wird hier, wie allgemein üblich, als Oberbegriff für Phosphoreszenz und Fluoreszenz verstanden) entwickelt und angewendet.
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Ein Verfahren, das eine Auflösung jenseits der Beugungsgrenze erreicht, ist beispielsweise aus der
WO 2006/127692 A2 bekannt. Dort werden ein gattungsgemäßes Verfahren und ein gattungsgemäßes Mikroskop beschrieben. Das als PALM (Photo Activated Light Microscopy) abgekürzte Verfahren verwendet eine Markierungssubstanz, welche mittels optischer Strahlung aktiviert werden kann. Nur im aktivierten Zustand kann die Markierungssubstanz dann zur Abgabe von bestimmter Fluoreszenzstrahlung angeregt werden. Für die Aktivierung und die Fluoreszenzanregung können je nach Substanz Strahlungen verschiedener Wellenlängen oder auch Strahlung ein und derselben Wellenlänge verwendet werden. Nicht aktivierte Moleküle der Markierungssubstanz senden auch nach Einstrahlung von Anregungsstrahlung keine oder zumindest keine merkliche Fluoreszenzstrahlung ab. Die Aktivierung bewirkt deshalb ein Umschalten und man spricht deshalb von einem Umschaltsignal. Im PALM-Verfahren wird das Umschaltsignal so aufgebracht, dass zumindest ein gewisser Anteil der aktivierten Markierungsmoleküle von benachbarten aktivierten Molekülen so beabstandet sind, dass sie gemessen an der optischen Auflösung des verwendeten Weitfeldmikroskops getrennt oder nachträglich trennbar sind. Die aktivierten Moleküle erscheinen im aufgenommenen Weitfeldbild weitgehend isoliert. Für diese isolierten Moleküle kann man rechnerisch das Zentrum deren auflösungsbegrenzt bedingter Strahlenverteilung ermitteln und die Lage der Moleküle mit höherer Genauigkeit bestimmen, als es das verwendete Weitfeldmikroskop eigentlich zulässt. Diese gesteigerte Auflösung durch rechnerische Schwerpunktbestimmung der Beugungsverteilung wird in der englischsprachigen Fachliteratur auch als „super resolution“ bezeichnet.
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Die verwendeten Verfahren, für das die oben erwähnte PAL-Mikroskopie nur ein Beispiel ist, nutzen zum Isolieren einzelner Markierungsmoleküle in der Regel die Tatsache, dass die Wahrscheinlichkeit, mit der ein Markierungsmolekül durch das Umschaltsignal aktiviert wird, für alle Moleküle gleich ist. Dadurch kann dafür gesorgt werden, dass die Wahrscheinlichkeit, in einem gegebenen Flächenbereich der Probe vorhandene Markierungsmoleküle zu aktivieren, so gering ist, dass es ausreichend große Bereiche gibt, in denen innerhalb der optischen Auflösung des verwendeten Weitfeldmikroskops nur unterscheidbare Markierungsmoleküle Fluoreszenzstrahlung emittieren. Durch passende Gestaltung der Umschaltung, beispielsweise durch passende Wahl der Intensität des Umschaltsignals, wird nun erreicht, dass möglichst nur bezogen auf die optische Auflösung des Weitfeldmikroskops isoliert liegende Markierungsmoleküle aktiviert werden und nachfolgend Fluoreszenzstrahlung aussenden. Die Ortsbestimmung erfolgt deshalb als Ausgangsbasis einer hochempfindlichen Weitfeldmikroskopie und erreicht in deren Bildern eine hochgenaue Lokalisierung einzelner Moleküle im Nanometerbereich.
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Da in einem einzelnen Bild nur eine Untermenge der Moleküle der Probe im fluoreszierenden Zustand ist, wird das Verfahren sehr oft wiederholt, so dass verschiedene stochastische Untermengen der Markierungsmoleküle fluoreszieren. Die verschiedenen Varianten dieser Mikroskopie, welche auch mit den Kürzeln PALM, STORM, D-STORM, etc. bezeichnet werden, unterscheiden sich hauptsächlich in der Wahl der Markierungsmoleküle (Fluorophore) und in der Art der Umschaltung.
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Die
DE 10 2009 060 490 A1 befasst sich mit einem Verfahren zur PAL-Mikroskopie, bei dem zwei oder mehr Teilbilder gleichzeitig aufgenommen werden, welche die Proben in unterschiedlichen Tiefenlagen abbilden. Die
US 2002/0030811 A1 befasst sich mit einem Verfahren, wie Diffusionsbewegungen eines mit einem Fluoreszenzstoff markierten Moleküls verfolgt werden können. Die
US 2006/0171846 A1 befasst sich mit Mikropumpen. Die
DE 10 2005 027 077 A1 beschreibt ein Lichtscheibenmikroskop, mittels welchem auch ohne ein Pinhole eine verbesserte z-Auflösung erreicht werden kann. Die
DE 694 16 671 T2 betrifft ein autostereoskopisches Videogerät. Die
DE 695 11 903 T2 befasst sich mit einem System zur automatischen Fokuseinstellung außerhalb der PAL-Mikroskopie. Die
DE 60 2004 012 274 T2 befasst sich mit einer Rasterabbildungseinrichtung für konfokale Mikroskopie. Die
US 2009/0242798 A1 befasst sich mit einem Verfahren zur PAL-Mikroskopie, bei der zwei in z-Richtung gegeneinander verschobene Probenebenen gleichzeitig auf eine Detektorfläche abgebildet werden.
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Um eine zu untersuchende Probe möglichst komplett wiederzugeben, erfordert das Prinzip, nur eine Untermenge der Moleküle der Probe in den fluoreszierenden Zustand zu bringen, viele Einzelbilder (typisch 5000 bis 20.000) der Probe aufzunehmen, um möglichst viele verschiedene Untermengen der Fluorophore und damit möglichst viele unterschiedliche Einzelbilder zu gewinnen. Diese Grundvoraussetzung der hochauflösenden Weitfeldmikroskopie führt nachteiliger Weise zu relativ langen Aufnahmedauern für ein Gesamtbild.
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Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Weitfeldmikroskopie und ein Weitfeldmikroskop anzugeben, mit dem eine schnelle Bildgewinnung für Mikroskopietechniken erreicht werden kann, bei denen eine Vielzahl von Einzelbildern eines Probenfeldes aufgenommen werden muss.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst mit einem Verfahren zur Weitfeldmikroskopie, nämlich zur hochauflösenden PAL-Mikroskopie, wobei ein Probenfeld auf eine Detektorfläche eines Detektors abgebildet wird, wobei das Probenfeld in ein Bildfeld abgebildet wird, das kleiner ist als die Detektorfläche, und das Bildfeld auf der Detektorfläche verschoben wird, so dass dasselbe Probenfeld bei verschiedenen, nebeneinander liegenden Lagen des Bildfeldes abgebildet wird, um Informationen über zeitliche Veränderungen im Probenfeld zu ermitteln.
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Die Aufgabe wird gleichermaßen gelöst durch ein Weitfeldmikroskop, nämlich ausgebildet zur hochauflösenden PAL-Mikroskopie, das einen Detektor, der eine strahlungsempfindliche, ortsauflösende Detektorfläche hat, eine Abbildungsoptik, die ein Probenfeld auf die Detektorfläche des Detektors abbildet, und eine Steuereinrichtung aufweist, welche Detektionsdaten des Detektors ausliest, wobei die Abbildungsoptik das Probenfeld in ein Bildfeld abbildet, das kleiner ist als die Detektorfläche, und eine steuerbare Scaneinrichtung umfasst, mit der eine Lage des Bildfeldes auf der Detektorfläche verschiebbar ist, wobei die Steuereinrichtung die Scaneinrichtung so ansteuert, dass dasselbe Probenfeld bei verschiedenen, nebeneinanderliegenden Lagen abgebildet ist, und basierend auf den ausgelesenen Detektionsdaten eine Information über zeitliche Veränderungen im Probenfeld ermittelt.
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Die Erfindung geht von der Erkenntnis aus, dass ein wesentliches zeitkritisches Kriterium bei der Aufnahme von Einzelbildserien die Dauer des Auslesens der Daten ist. Zwar könnte man in erster Betrachtung davon ausgehen, dass z. B. bei PALM auch die Lokalisierung der isolierten Moleküle in einem Einzelbild zeitbegrenzend ist, jedoch ergibt eine genaue Betrachtung, dass die Zeitdauer dieses Verfahrensschrittes mit gesteigertem Rechenaufwand gesenkt werden kann. Auch die auf den ersten Blick ebenfalls zeitkritische Belichtungsdauer auf der Kamera erweist sich bei genauer Überlegung als wesentlich unkritischer, da durch Erhöhung der Anregungsintensität und Wahl geeigneter Moleküle die Anzahl der verfügbaren Photonen pro Zeiteinheit verbessert werden kann, was sich positiv auf die Belichtungszeit auswirkt. Der Auslesevorgang des Detektors selbst, der in der Literatur auch als Kamera bezeichnet wird, erfordert jedoch eine stets vorhandene Zeitdauer, die nicht vermieden werden kann.
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Das Konzept der Erfindung sieht also vor, dass ein und dasselbe Probenfeld auf ein Bildfeld abgebildet wir, dessen Lage auf der Detektorfläche verstellt wird. Anders als in der bekannten Laser-Scanning-Mikroskopie wird dabei ein Detektor verwendet, der eine zweidimensionale Ortsauflösung verwendet, welche bestimmend für die optische Auflösung des Mikroskops ist. Natürlich liegt ein weiterer, wesentlicher Unterschied zur Laser-Scanning-Mikroskopie auch darin, dass ein und dasselbe Probenfeld wiederholt abgebildet wird. In der Laser-Scanning-Mikroskopie werden hingegen verschiedene Probenabschnitte durch Scannen abgebildet. Das abgebildete Probenfeld wird darüber hinaus ortsauflösend abgebildet, da die vorliegende Erfindung sich der Weitfeldmikroskopie widmet.
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Es ist deshalb vorgesehen, dass der Abbildungsstrahlengang über die Detektorfläche gescannt wird, so dass dasselbe Probenfeld bei verschiedenen, nebeneinander liegenden Lagen des Bildfeldes auf die Detektorfläche abgebildet wird. Dies erlaubt es in einer Ausführungsform der Erfindung mehrere Abbildungen des Bildfeldes auf der Detektorfläche vorzunehmen, bevor der Detektor ausgelesen wird. Ein Ausleseprozess umfasst dann mehrere Bilder, wodurch die Zeitdauer des Auslesens pro Bild auf den entsprechenden Bruchteil sinkt.
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In einer bevorzugten Ausführungsform wird deshalb die Auslesedauer pro Einzelbild auf einen Bruchteil der Auslesedauer reduziert, welche der verwendete Detektor aufweist. Dies wird dadurch erreicht, dass die Verschiebung der Lage mit dem Auslesen des Detektors so abgestimmt wird, dass in einem Auslesevorgang Detektionsdaten mit mehreren verschiedenen Lagen des Bildfeldes ausgelesen werden.
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Besonders bevorzugt wird die Lage des Bildfeldes schrittweise auf der Detektionsfläche verschoben. Erst nach mehreren Verschiebungen werden die Detektionsdaten ausgelesen. In den ausgelesenen Detektionsdaten wird dann jede Lage des Bildfeldes einem Einzelbild des Probenfeldes zugeordnet.
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Verwendet man n-verschiedene Lagen, werden mit einem Auslesevorgang n-Einzelbilder erhalten. Die Auslesedauer sinkt dann pro Einzelbild auf den entsprechenden Kehrwert 1/n.
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In einer Alternative wird ein Sensor verwendet, dessen Detektorfläche teilweise abgedunkelt ist. Während das Bildfeld zur Gewinnung von Einzelbildern im nicht abgedunkelten Teil von einer Stelle zur nächsten weitergeschoben wird und dann auf der nächsten Stelle wiederum ein Einzelbild aufgenommen wird, können bei diesem Konzept die Ladungen vom zuvor aufgenommenen Bild in den abgedunkelten Bereich verschoben werden. Von dort können sie dann zur Auslesung am horizontalen Schieberegister transferiert werden. Dies erlaubt ein nahezu kontinuierliches Auslesen des Detektors.
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Für diese Ausgestaltung ist es bevorzugt, als Detektor einen CCD-Flächendetektor zu verwenden, der an einem Ausleserand seiner Detektorfläche ein horizontales Schieberegister umfasst und dessen Detektorfläche einen strahlungsempfindlichen Teil und einen vor Strahlungseinfall abgedunkelten Teil aufweist, welcher zwischen dem Ausleserand und dem strahlungsempfindlichen Teil liegt. Zur Aufnahme von Einzelbildern wird das Bildfeld schrittweise über den strahlungsempfindlichen Teil der Detektorfläche verschoben. Der Detektor wird weiter so angesteuert, dass Ladungen eines erzeugten Einzelbildes noch während der Aufnahme folgender, bei verschobenem Bildfeld gewonnener Einzelbilder im vor Strahlungseinfall abgedunkelten Teil und dann von dort in das horizontale Schieberegister transferiert werden.
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In einem dritten Konzept wird ein Detektor verwendet, der mindestens zwei eigenständig auslesbare Detektorflächenteile umfasst. Auf diese wird rollierend das Bildfeld gestellt. Bei zwei Detektorflächenteilen werden diese alternierend belichtet. Dadurch kann ein Detektorflächenteil ausgelesen werden, während ein anderes gerade belichtet wird. Dies erlaubt ebenfalls eine nahezu kontinuierliche Belichtung, da die Auslesedauern für ein Detektorflächenteil anfallen, während an einem anderen Detektorflächenteil bereits ein Bild aufgenommen wird.
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Für diese Ausführungsform ist ein Verfahren bevorzugt, bei dem ein Detektor verwendet wird, der mehrere, nebeneinander liegende, ortsauflösende Detektorflächenteile umfasst, für die jeweils eigenständig Detektionsdaten auslesbar sind. Das Bildfeld wird intermittierend auf wechselnde der mehreren Detektorflächenteile gestellt. Für jedes Detektorflächenteil werden die Detektorflächendaten ausgelesen, während das Bildfeld auf einen anderen der mehreren Detektorflächenteile gestellt ist. Solche Detektoren sind z. T. in CMOS-Technologie hergestellt und werden auch als Active Pixel Sensor bezeichnet.
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Um in den genannten Varianten die Einzelbilder in den verschiedenen Bildfeldlagen getrennt aufzunehmen, ist es zu bevorzugen, dafür zu sorgen, dass während der Zeitdauer, in der das Bildfeld in die nächste Bildfeldlage gerückt wird, möglichst keine Strahlung vom Detektor detektiert wird. Dies kann beispielsweise durch eine entsprechende Inaktivschaltung eines Beleuchtungsstrahlenganges oder einer Beleuchtungsstrahlenquelle erfolgen. Die Beleuchtung wird so synchronisiert, dass während des Verschiebens der Bildfeldlage keine Beleuchtung der Probe vorgenommen wird bzw. die Probe nicht zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregt oder aktiviert wird. Alternativ oder zusätzlich ist es möglich, ein entsprechendes Abschattungselement im Abbildungsstrahlengang vorzusehen, das während der Verschiebung des Bildfeldes von einer Bildfeldlage in die nächste den Strahlengang abschattet. Als Abschattungselement bzw. für die Abschattung kommen bewegliche Blenden, Chopperräder, AOTF oder geeignete strahlengangabschaltende oder -umlenkende Elemente wie LCD- oder DMD-Elemente etc. in Frage. Als dritte Option kann man eine Kamera verwenden, deren Detektor während des Verschiebens des Bildfeldes inaktiv geschaltet werden kann, so dass er während des Verschiebevorgangs keine Strahlung detektiert. Die entsprechenden Elemente werden natürlich im Weitfeldmikroskop geeignet von der Steuereinrichtung angesteuert, wobei selbstverständlich auch eine Kombination der genannten Maßnahmen möglich ist.
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In einer letzten Variante ist es schließlich möglich, das Bildfeld kontinuierlich über die Detektorfläche zu verschieben. Die Bilder der detektierten Moleküle werden dabei durch die Scanbewegung verwischt. Unter Kenntnis der Scanbewegung kann jedoch die Intensitätsverteilung für die erforderliche Bildauswertung wieder rekonstruiert werden.
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In dieser Gestaltung wird zur hochauflösenden PAL-Mikroskopie das Bildfeld kontinuierlich über die Detektorfläche verschoben. Auf Basis unter der Berücksichtigung der Verschiebung wird die Information über die Veränderung im Probenfeld ermittelt.
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Die Verschiebung des Bildfeldes über die Detektorfläche wird vorzugsweise im Bild markiert, indem ein Fokus der Abbildung gemäß einer Modulation, die synchron zur Verschiebung ist, verstellt wird. Die Fokusverstellung ändert die Intensitätsverteilung in den Bilddaten und erlaubt die aktuelle Verschiebung aus den Bilddaten direkt zu ermitteln.
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Die Einzelbilder entsprechen vorzugsweise jeweils einer Untermenge der fluoreszierenden Markierungsmoleküle in der Probe, wenn das Weitfeldmikroskopieverfahren bzw. das entsprechende Mikroskop in der PAL-Mikroskopie oder einer ihrer Spielarten verwendet wird. Dies kann besonders einfach dadurch erreicht werden, dass die Anregung bzw. Aktivierung synchron zur Verschiebung der Lage des Bildfeldes erfolgt.
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Soweit in dieser Beschreibung Verfahrensmerkmale geschildert werden, können bzw. werden diese Merkmale im entsprechenden Weitfeldmikroskop durch eine geeignete Aktion der Steuereinrichtung realisiert. Die Offenbarung eines Verfahrensmerkmals gelte deshalb gleichermaßen auch als Offenbarung eines entsprechenden gegenständlichen Vorrichtungsmerkmales im Sinne einer entsprechenden funktionellen Definition bzw. Eigenschaft der Steuereinrichtung. Umgekehrt ist natürlich auch die Offenbarung eines funktionellen Merkmales der Steuereinrichtung gleichermaßen als Offenbarung eines entsprechenden Verfahrensmerkmals anzusehen.
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Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
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Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen:
- 1 eine Schemadarstellung eines Weitfeldmikroskops, das zur PAL-Mikroskopie geeignet ausgebildet ist,
- 2 eine Draufsicht auf eine Detektorfläche des Mikroskops der 1 zur Veranschaulichung der Weitfeld-Bildaufnahme,
- 3 eine Darstellung ähnlich der 2 für ein Mikroskop mit modifiziertem Detektor,
- 4 eine Zeitreihe zur Veranschaulichung der Bildaufnahme des Mikroskops der 1 mit einem Detektor der Bauweise der 2,
- 5 eine Darstellung ähnlich den 2 und 3 für eine weitere Variante des Detektors des Mikroskops der 1,
- 6-8 Ansichten auf einen Detektor bzw. ein Detektorfeld ähnlich dem der 2 für eine weitere Abwandlung des Mikroskops der 1 und
- 9 eine Darstellung ähnlich der 7 für eine besondere Betriebsform der Variante gemäß 6 bis 8.
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1 zeigt schematisch ein Mikroskop 1, das eine Probe 2 in einer Weitfeldabbildung abbildet. Das Mikroskop 1 ist besonders dazu ausgebildet, eine zeitliche Veränderung in der Probe 2 zu erfassen, wie es beispielsweise im Rahmen der PAL-Mikroskopie erforderlich ist. Soweit das Weitfeldmikroskop der 1 oder Abwandlungen davon nachfolgend mit Bezug auf die PAL-Mikroskopie beschrieben wird, ist dies lediglich exemplarisch bzw. bevorzugte Ausführungsformen betreffend zu verstehen. Das Weitfeldmikroskop der 1 bzw. dessen Weiterbildungen und Abwandlungen kann auch im anderen Zusammenhang vorteilhaft eingesetzt werden, wenn es darauf ankommt, die zeitliche Veränderung einer Probe in möglichst geringen zeitlichen Abständen oder sogar kontinuierlich zu ermitteln.
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Das Weitfeldmikroskop 1 weist ein Objektiv 3 auf, das die Probe 2 auf eine Kamera 4 abbildet, welche einen Detektor D enthält. Es handelt sich bei dieser Abbildung um eine bekannte Weitfeldabbildung, d. h. ein vom Objektiv 3 auf der Probe 2 erfasstes Probenfeld wird in ein Bildfeld abgebildet, das auf dem Detektor D der Kamera 4 liegt.
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Das Weitfeldmikroskop 1 umfasst eine Scaneinrichtung 5, welche die Lage des Bildfeldes auf dem Detektor D verschiebt. In der gezeigten Bauweise umfasst die Scaneinrichtung 5 eine Scanoptik 6, 7, zwischen der sich ein Scanner 8 befindet, der eine zweiachsige Ablenkung bewirkt. Der Scanner 8 befindet sich dabei vorzugsweise in oder nahe einer Pupillenebene. Dem Scanner 8 in Abbildungsrichtung vorgeordnet ist eine Blende 9, die in einer von der Scanoptik 6, 7 bereitgestellten Zwischenbildebene liegt und damit die Größe und Lage des Bildfeldes auf dem Detektor D der Kamera 4 definiert. Zum Einstellen von Größe und Lage kann die Blende 9 in ihrer Größe verstellbar und/oder verschieblich ausgebildet sein.
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Der Betrieb der Scaneinrichtung 5 und auch der Kamera 4 wird von einem Steuergerät 10 gesteuert, das über entsprechende Steuerleitungen mit diesen und ggf. weiteren Bauteilen verbunden ist. Die Steuerleitungen sind in der 1 durch Linien mit Doppelpfeil veranschaulicht. In der Schemadarstellung der 1 ist der Steuereingriff des Steuergerätes 10 bezüglich der Scaneinrichtung 5 am Scanner 8 eingezeichnet. Dies kann natürlich alternativ oder zusätzlich auch an der Blende 9 bzw. einem (in der Figur nicht darstellten) Antrieb zum Verschieben und/oder Größenverstellen der Blende 9 erfolgen.
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Zur Ausführung der PAL-Mikroskopie weist das Mikroskop 1 zusätzlich noch eine Strahlungsquelle 11 auf, die über einen nicht näher bezeichneten Strahlteiler und das Objektiv 3 auf die Probe 2 eingestrahlt wird. Um Rückreflexe der Beleuchtungsstrahlung zur Kamera 4 abzublocken, ist zwischen dem Strahlteiler und der Kamera 4 ein Emissionsfilter 12 in den Abbildungsstrahlengang geschaltet.
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Im Mikroskop 1 sorgt die Scaneinrichtung 5 dafür, dass das Bildfeld auf der Kamera 4 deutlich kleiner ist, als die strahlungsdetektierende Fläche des Detektors D in der Kamera 4. Dies wird durch die Blende 9 bewirkt. Alternativ ist es auch möglich, den Abbildungsstrahlengang grundsätzlich so abzubilden, dass das vom Objektiv 3 erfasste Probenfeld auf ein Bildfeld abgebildet wird, dass kleiner ist als die Detektorfläche.
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Optional ist die Blende 9 variabel, um das auf den Sensor abgebildete Bildfeld optimal an die Erfordernisse (Kompromiss zwischen Bildfeldgröße und Geschwindigkeit) anpassen zu können, bzw. an die verschiedenen im Folgenden erläuterten Varianten.
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2 zeigt eine mögliche Ausführungsform des Mikroskops 1 bezüglich des Detektors D der Kamera 4. Dort ist eine Draufsicht auf die Detektorfläche 13 dargestellt. Es handelt sich beim Detektor D mit der Detektorfläche 13 beispielsweise um einen CCD-Sensor, der über ein horizontales Schieberegister 14 ausgelesen wird.
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Da der Auslesevorgang, mit dem die Ladungen vom CCD-Sensor über das Schieberegister 14 in Detektorsignale umgewandelt werden, welche von der Kamera 4 an das Steuergerät 10 geliefert werden, für die Aufnahme einer zeitlichen Veränderung in der Probe 2 eine kritische Zeitdauer ist, bewirkt das Steuergerät 10 am Mikroskop 1 einen Betrieb, in dem die Lage des Bildfeldes 15 über die Detektorfläche 13 verschoben ist. 2 zeigt neun verschiedene Bildfeldlagen 15.1-15.9 des Bildfeldes 15. In diesen Lagen werden nacheinander neun zeitlich beabstandete Bilder ein und desselben Probenfeldes der Probe 2 auf die Detektorfläche 13 belichtet. 4 zeigt schematisch den zeitlichen Ablauf. Über eine Belichtungsdauer b wird die Detektorfläche 13 jeweils in den Bildfeldlagen 15.1, 15.2, 15.3, ... belichtet. Zwischen den Belichtungen in diesen Bildfeldlagen wird das Bildfeld 15 in die jeweils neue Bildfeldlage verschoben, was eine Scandauer s bedingt. Wurde die Detektorfläche 13 mit den verschiedenen Bildfeldlagen 15.1-15.9 belegt, wird das Detektorsignal ausgelesen, indem die entsprechenden Ladungen über das Schieberegister 14 erfasst werden.
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Jede Bildfeldlage 15.1-15.9 entspricht somit einem Einzelbild ein und desselben Probenfeldes der Probe 2. Die Aufnahme von neun Einzelbildern nimmt somit eine Zeitdauer von 9*b plus 9*s plus die Dauer des Auslesevorgangs in Anspruch. Die Aufnahme eines einzelnen Einzelbildes benötigt also bei neun Einzelbildern pro Auslesevorgang die Zeitdauer b plus s plus ein Neuntel der Auslesedauer. Da die Scandauer s sehr viel kleiner ist, als die Auslesedauer, welche bei üblichen Kameras 4 das dominierende Zeitelement ist, erreicht man durch dieses Vorgehen eine beträchtliche Beschleunigung der Einzelbildaufnahme.
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Die Verwendung von 9 Bildfeldlagen ist natürlich für dieses Prinzip nicht zwingend erforderlich, sondern rein exemplarisch zu verstehen. Auch ist es nicht zwingend erforderlich, dass, wie in 2 dargestellt ist, die Einzelbildlagen durch einen kleinen Spalt beabstandet sind. Es ist vielmehr zu bevorzugen, die Einzelbildlagen möglichst dicht aneinander zu setzen, wobei mitunter auch überlappende Einzelbildlagen zulässig sein können.
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Bei der Auswertung der Detektorsignale zerlegt das Steuergerät 10 unter Berücksichtigung der zuvor bewirkten Verschiebung der Einzelbildlagen das von der Kamera 4 gelieferte Gesamtbild in die Einzelbilder, im vorliegenden Beispiel die neun Einzelbilder, die den Einzelbildlagen 15.1 - 15.9 entsprechen.
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Um die Einzelbilder in den verschiedenen Bildfeldlagen 15.1-15.9 möglichst getrennt aufzunehmen, ist es zu bevorzugen, dafür zu sorgen, dass während des Scandauer s, also während der Zeitdauer, in der das Bildfeld 15 in die nächste Bildfeldlage gerückt wird, möglichst keine Strahlung an der Detektorfläche 13 detektiert wird. In der PAL-Mikroskopie oder damit verwandten oder ähnlichen hochauflösenden Mikroskopieverfahren kann dies durch eine Synchronisierung mit der Beleuchtung aus der Strahlungsquelle 11 erfolgen. Die Beleuchtung wird dann so synchronisiert, dass während des Verschiebens der Bildfeldlage keine Fluoreszenzstrahlung angeregt oder die Probe 2 nicht zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung aktiviert ist. Alternativ oder zusätzlich ist es möglich, ein entsprechendes Abschattungselement im Abbildungsstrahlengang vorzusehen, das während der Verschiebung des Bildfeldes von einer Bildfeldlage in die nächste der Strahlengang abschattet. Hierzu kommen bewegliche Blenden, Chopperräder oder geeignet den Strahlengang abschaltende oder umlenkende Elemente wie LCD- oder DMD-Elemente etc. in Frage. Auch ist es möglich, eine Kamera 4 zu verwenden, deren Detektor D während des Verschiebens des Bildfeldes von einer, einem Einzelbild zugeordneten Bildfeldlage in die dem nächsten Einzelbild zugeordnete Bildfeldlage inaktiv geschaltet werden kann, so dass er währenddessen keine Strahlung detektiert.
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Es sind aber auch Anwendungen möglich, bei denen das Verschieben des Bildfeldes 15 von einer Bildfeldlage in die nächste so schnell geschieht, dass währenddessen aufgenommene Strahlung die Einzelbilder nicht unzulässig verfälschen. Dann muss keine Vorkehrung getroffen werden, während dieses Scan-Schrittes die Kamera 4 bzw. deren Detektor D abzudunkeln oder abzuschalten.
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Die Scaneinrichtung 5 (bzw. im beschriebenen Ausführungsbeispiel der Scanner 8) bewirkt eine schrittweise Verschiebung des Bildfeldes 15 von einer der Bildfeldlagen 15.1-15.9 in die jeweils nächste. Durch diese intermittierende Arbeitsweise liegen die Bildfeldlagen 15.1-15.9 so, dass sie die Detektorfläche 13 möglichst vollständig füllen.
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3 zeigt eine Abwandlung des Mikroskops 1, bei der Detektor D der Kamera 4 eine nahezu kontinuierliche Signalauslesung ermöglicht. Dazu ist ein Teil der Detektorfläche 13 durch eine Blende 25 abgedeckt. Die Blende 25 liegt dabei an dem Rand mit dem Schieberegister 14.
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Dadurch umfasst die Detektorfläche 13 einen aktiven Teil 26, der einfallende Schaltung detektiert, und einen abgedeckten Teil 27, welcher zwischen dem Schieberegister 14 und dem aktiven Teil 26 liegt. Durch diesen abgedeckten Teil 27 können nun kontinuierlich Ladungen zum Schieberegister 14 hin verschoben werden.
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Das Steuergerät 10 steuert nun die Kamera 4 bzw. deren Detektor D und die Scaneinrichtung 5 so an, dass das Bildfeld schrittweise über den aktiven Teil 26 verschoben wird. Im vorliegenden Beispiel sind drei Bildfeldlagen 16.4-16.6 vorgesehen. Sobald der Scanvorgang abgeschlossen ist, werden in den Bildfeldlagen gewonnene Ladungen, die wiederum Einzelbildern entsprechen, in den abgedeckten Teil 27 des Sensors verschoben. Dies geht sehr viel rascher, als das Auslesen am horizontalen Schieberegister 14. Nun können am aktiven Teil 26 wiederum Einzelbilder in drei Bildfeldlagen erfasst werden. Währenddessen werden die zuvor erfassten Ladungen der Einzelbilder zum horizontalen Schieberegister 14 verschoben und dort ausgelesen. 3 zeigt den Zustand, nachdem zuerst drei Einzelbilder entsprechend Bildfeldlagen 16.1-16.3 im aktiven Teil 26 aufgenommen und dann in den abgedunkelten Teil 27 verschoben wurden. Während diese dann zum horizontalen Schieberegister 14 transferiert und dort ausgelesen werden, werden als nächstes drei weitere Bildfeldlagen 16.4-16.6 bzw. damit verbundene Einzelbilder aufgenommen.
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Die Weiterbildung gemäß 3 erlaubt eine nahezu kontinuierliche Aufnahme von Einzelbildern. Ein weiterer Vorteil dieser Variante besteht darin, dass der Scanner 8 lediglich als einachsiger Scanner ausgebildet werden muss, da die Lage des Bildfeldes nur entlang einer Achse, nämlich parallel zum Schieberegister 14 verschoben werden muss.
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Ansonsten gelten die anhand der 2 geschilderten Merkmale auch für die Detektor- bzw. Kameraabwandlung gemäß 3.
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5 zeigt eine weitere Variante hinsichtlich der Kamera 4 bzw. deren Detektor D. Dieser weist nun eine Detektorfläche 17 auf, die zwei Teile 17a und 17b umfasst. Die Detektorteilflächen 17a und 17b verfügen jeweils über eine eigene Ausleseeinrichtung, z. B. ein eigenes Schieberegister 18a und 18b, können also unabhängig voneinander ausgelesen werden. Das Steuergerät 10 bewirkt nun die Verschiebung des Bildfeldes zwischen zwei Bildfeldlagen 19.1 und 19.2, so dass wechselnd die Detektorteilflächen 17a und 17b belichtet werden. Während die Detektorteilfläche 17a belichtet wird, wird von der Detektorteilfläche 17b über die Ausleseeinrichtung, die hier durch das Schieberegister 18b realisiert ist, das Detektorsignal ausgelesen. Analoges gilt während die Detektorteilfläche 17b belichtet wird. Diese alternierende Belichtung der Detektorteilflächen 17a und 17b erlaubt ebenfalls eine nahezu kontinuierliche Datenaufnahme. Falls die Auslesedauer über die Ausleseeinrichtungen der Detektorteilflächen 17a und 17b länger dauert, als die Bildaufnahme für ein Einzelbild, kann die Weiterbildung der 5 mit der der 2 kombiniert werden, indem jede Detektorteilfläche 17a und 17b für sich in der Weise belichtet wird, wie die Detektorfläche 13 der 2. Auch können mehr als zwei Detektorteilflächen verwendet werden. Solche Sensoren werden u. a. als CMOS-Sensoren hergestellt und können sog. Active Pixel Sensoren sein.
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Wie eingangs geschildert, ist es möglich die Einzelbilder mit synchronisierter Belichtung (durch Abschalten der Beleuchtung oder Blockieren des Beleuchtungsstrahlenganges, durch Blockieren des Abbildungsstrahlenganges oder durch Deaktivieren des Detektors) vorzunehmen, so dass während der Verschiebung des Bildfeldes in die neue Bildfeldlage keine Strahlung aufgenommen wird. Es kann jedoch, wie nachfolgend anhand der 6 bis 9 beschrieben wird, auch mit einer bewusst kontinuierlichen Verschiebung des Bildfeldes unter laufender Belichtung gearbeitet werden. Dies zeigt schematisch die 6.
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Das Bildfeld 15 wird kontinuierlich über die Detektorfläche 13 längs einer Verschieberichtung 20 verschoben. Während des Verschiebens sammelt die Detektorfläche 13 Strahlung auf. Das damit erhaltene Bild zeigt schematisch die 7, welche einen Bezugsrahmen 22 darstellt, der der Detektorfläche 13 in den aufgenommen Detektordaten entspricht.
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Im Bezugsrahmen 22 sind einzelne leuchtende Punkte des Probenfeldes zu Leuchtspuren 21 längs der Verschieberichtung 20 ausgedehnt. Der Anfang einer solchen Leuchtspur 21 ist der Zeitpunkt, zu dem ein Bildpunkt beginnt, Fluoreszenzstrahlung auszusenden. Das Ende einer Leuchtspur markiert den Zeitpunkt, zu dem am fraglichen Punkt die Aussendung von Fluoreszenzstrahlung endet. Da die einzelnen leuchtenden Bildpunkte (die in der PAL-Mikroskopie auch als „Leuchter“ bezeichnet werden) in den hier interessierenden hochauflösenden Messverfahren ausreichend vereinzelt sind, so dass das die Leuchtspuren 21 in der Regel nicht überlappen, ist es einfach möglich, aus den Leuchtspuren 21 einzelne Leuchtpunkte 24 zu generieren, die denjenigen Stellen im Bezugsrahmen 22 entsprechen, zu denen der Leuchtpunkt aufleuchtete. Diesen Status der Bildverarbeitung zeigt 8.
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In einem nächsten Schritt müssen nun diese Leuchtpunkte 24 hinsichtlich der kontinuierlichen Verschiebung des Bildfeldes 15 korrigiert werden. Dabei wird z. B. vom Steuergerät berücksichtigt, dass der Bezugsrahmen 22 in horizontaler Richtung einer Zeitachse entspricht, welche durch die Verschiebung des Bildfeldes 15 bedingt ist. Es kann somit aufgrund der bekannten Verschiebung des Bildfeldes 15 für jede horizontale Koordinate die Relativkoordinate im Bildfeld 15 angeben, d. h. die Stelle im Bildfeld, an der der fragliche Leuchtpunkt 24 das erste Mal erschien. Die Lage der Leuchtpunkte 24 liefert im Bezugsrahmen 22 zwei Informationen. Zum einen erhält man die Lage des jeweiligen leuchtenden Punktes im Bildfeld 15 unabhängig von dessen Verschiebung. Zum anderen gewinnt man eine Information über den Zeitpunkt zu dem der Punkt aufleuchtete, auch wenn diese Information für manche Varianten der PAL-Mikroskopie nicht erforderlich ist.
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Wesentlich für die zeitliche Skalierung des Bezugsrahmens 22 ist eine Kenntnis über die Verschiebung des Bildfeldes 15. Falls hier zum Beispiel Nichtlinearitäten der Scanbewegung oder eine mangelnde Auflösung einer Messung der Scanbewegung problematisch sind, wird zusätzlich eine periodische Modulation eines Fokusparameters der Abbildung des Probenfeldes auf das Bildfeld vorgenommen werden. Damit wird im Ergebnis die Detektionspunktverwaschungsverteilung moduliert, so dass ein leuchtender Punkt einen unterschiedlich großen Durchmesser hat. Die Leuchtspur 21 weist damit aufgeweitete Bereiche 23 und nicht-aufgeweitete Bereiche 24 auf, die mit der Modulation des Fokusparameters übereinstimmen. Bei bekannter Modulation lässt sich damit aus dem Bezugsrahmen 22 besonders einfach die Skalierung in der horizontalen Achse gewinnen. Die Modulation des Fokusparameters, beispielsweise der Detektionspunktbildverwaschungsfunktion, ist dabei bevorzugt so auszuführen, dass sie gerade noch in der Leuchtspur 21 detektierbar ist. Dadurch ist ein zu starkes Aufweiten und letztlich ein Auflösungsverlust möglichst vermieden.