EP3283918A1 - Verfahren und vorrichtung zur spim-untersuchung einer probe - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur spim-untersuchung einer probe

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EP3283918A1
EP3283918A1 EP16716886.3A EP16716886A EP3283918A1 EP 3283918 A1 EP3283918 A1 EP 3283918A1 EP 16716886 A EP16716886 A EP 16716886A EP 3283918 A1 EP3283918 A1 EP 3283918A1
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EP
European Patent Office
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detection
sample
beam path
optical
detection beam
Prior art date
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Pending
Application number
EP16716886.3A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Werner Knebel
Frank Sieckmann
Florian Fahrbach
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leica Microsystems CMS GmbH
Original Assignee
Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leica Microsystems CMS GmbH filed Critical Leica Microsystems CMS GmbH
Publication of EP3283918A1 publication Critical patent/EP3283918A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
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    • G01J3/28—Investigating the spectrum
    • G01J3/30—Measuring the intensity of spectral lines directly on the spectrum itself
    • G01J3/36—Investigating two or more bands of a spectrum by separate detectors
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
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    • G02B21/06—Means for illuminating specimens

Definitions

  • the invention relates to a method for SPIM examination of a sample.
  • the invention further relates to an apparatus for carrying out such a method and to a device for SPIM examination of a sample, comprising a lighting device for generating a light sheet and a detection arrangement comprising a detection objective and a detection beam path.
  • SPIM Single Plane Illumination Microscopy
  • a well-known application of SPIM technology is the field of fluorescence microscopy, in which fluorophores in the sample are excited by laser light.
  • this excitation takes place in a sample layer illuminated by an illumination light sheet (also called "light strip”) .
  • illumination light sheet also called "light strip”
  • the sample is transilluminated with the light sheet, while the observation of the thus illuminated sample layer in FIG
  • a three-dimensional representation of the sample can be produced
  • a sample is illuminated with a thin strip of light, while the observation is made perpendicular to the plane of the illuminating light strip
  • the illumination and the detection are carried out via two separate optical paths, each with a separate Op tik, in particular with two separate, mutually perpendicular lenses.
  • the light strip is generated by an illumination objective and a cylinder optics connected in front of it.
  • the sample is moved through the fixed relative to the detector strip of light to record layer by layer fluorescent and / or scattered light with a flat detector.
  • the slice image data thus obtained can then be converted into a three-dimensional image of the sample compile the corresponding dataset.
  • an arrangement for illuminating a sample in SPIM microscopy includes a light source for generating a light beam, means for generating a light strip from the light beam, and at least one objective having optics which is designed and intended to supply detection light emanating from the sample directly or indirectly to a detector.
  • the arrangement includes a the optics of the lens downstream deflection device for deflecting the light strip.
  • the object is achieved by a method in which a plurality of sample layers are illuminated simultaneously with a single light sheet and in which the detection light emanating from the individual sample layers is detected separately in time and / or spatially separately from one another.
  • This object is achieved by a device of the aforementioned type, which is characterized in that the illumination device simultaneously illuminates a plurality of sample layers of a sample to be examined with the light sheet and the detection arrangement separately detects the detection light emanating from the individual sample layers separately in time and / or space ,
  • the invention has the very special advantage that image data of these sample layers can be obtained very quickly, simultaneously or sequentially by simultaneously illuminating a plurality of sample layers, in particular without the sample having to be displaced relative to the detection arrangement. In this way, it is possible to record a stack of images quickly and without sacrificing the sample, which allows a three-dimensional reconstruction of the sample.
  • a more sample-friendly examination of a sample in three dimensions is made possible in particular because the exposure to the illumination light can be reduced due to the faster image data acquisition and because, as will be explained in detail below, the sample does not have to be displaced relative to the detection arrangement.
  • illumination of the plurality of sample layers with a single light sheet can be carried out in a particularly advantageous manner, the spatial thickness of which is greater than the depth of field of the detection arrangement, so that the sample layers illuminated simultaneously by one and the same light sheet each outgoing detection light, simultaneously or sequentially, can be detected separately.
  • the detection light emanating from the different sample layers is spatially separated, in particular simultaneously, focused on separate area detector elements.
  • the detection light of the different sample layers, in particular simultaneously, is detected with a plurality of separate area detector elements.
  • the detection beam path is branched and has a plurality of detection beam path branches, each with at least one surface detector element.
  • the branching of the detection beam path can be achieved in particular with the aid of beam splitters, which can be designed, for example, as a beam splitter cube and / or as a neutral beam splitter.
  • the optical path lengths of the detection beam path branches are adjusted with an adjustment device such that the detection light emanating from a sample layer is focused on a first area detector element of a first detection beam path branch and the detection light emanating from another sample layer is focused on a second area detector element of a second detector beam path branch.
  • a third and further detection beam path branches may also be present, the detection light of a third and further sample layers being focused correspondingly on the area detector elements of these detection beam path branches.
  • each of the illuminated sample layers is assigned a separate area detector element, wherein in each case the detection light emanating from a sample layer is focused on the assigned area detector element.
  • detection light of another sample layer also reaches an area detector element not assigned to it; however, this detection light is not focused on this area detector element, so that it only contributes to background noise in obtaining image data with this area detector element.
  • this background noise can be at least subsequently reduced in the processing of the acquired image signals and / or image data. It has been shown that the described effect plays a subordinate role anyway in practice anyway.
  • the detection light is divided into different detection straw gong branches depending on at least one detection light property.
  • the detection light property may comprise the spatial orientation of a linear polarization and / or the membership of a predetermined or predefinable wavelength range.
  • the branching of the detection beam path is effected by color beam splitter. In this way it can be achieved that with respect to each sample layer only the detection light of a specific wavelength or a specific wavelength range is detected.
  • the setting device makes it possible to adapt the optical path lengths of the detection straw gong branches in a sample-specific manner such that an area detector element is located in each of the sample layers in an optically corresponding plane.
  • the optical light paths of the detection straw gong branches can be set in such a way that each of the surface detector elements "looks" at its own sample layer
  • Such an adaptability of the optical path lengths has the particular advantage that the different configurations of different samples, in particular with respect to expansion and / or In particular, it may be considered whether the detection light has to travel a longer or a shorter path through the sample before it emerges from the sample, and also, for example, an adaptation of the optical path lengths when exchanging optical components in the sample Detection beam, such as when changing the detection lens, be made precisely.
  • the optical path lengths of the individual detection straw gene branches are set independently of one another and / or can be set independently of one another.
  • the adjusting device may comprise a plurality of adjusting elements, wherein each detection beam path branch may have its own adjusting element with which the optical path length of the respective detection beam path branch is set and / or adjustable.
  • the detection beam path branches can, in particular in the area from the detection objective to a beam splitter, partially overlap and, moreover, in particular in the area in each case from a beam splitter to the respective area detector element, be spatially separated from one another.
  • each detection beam path branch has its own setting element for adjusting the optical path length in the region in which it does not overlap with any other detection beam path.
  • a common setting element which acts on a plurality of detection beam path branches and with which the optical path lengths of a plurality of detection beam path branches can be simultaneously changed.
  • the detection light emanating from the different sample layers is focused in succession on the same area detector element.
  • the detection light emanating from one of the sample layers and passing through a detection lens is guided on a detection beam path whose optical path length is set by means of an adjustment device such that the detection light emanating from this sample layer is focused on the surface detector element , wherein the area detector element for obtaining image data of this sample layer is read out in this setting of the path length, and in that time thereafter the optical path length of the detection beam path by means of Adjustment device is set such that the detection light emanating from another of the sample layers is focused on the area detector element, wherein the area detector element is read out again to obtain image data of the other sample layer at the other setting of the optical path length.
  • the plurality of sample layers which may in particular be arranged perpendicular to the optical axis of the detection objective and parallel to one another, can be successively successively imaged onto the area detector element and image data specific to each sample layer can be obtained.
  • the sample layers to be examined can advantageously be aligned parallel to one another.
  • Such a procedure has the particular advantage that a simple arrangement of the area detector element (in the case of an unbranched detection beam path) or of the area detector elements (in the case of a branched detection beam path) is made possible.
  • sample layers are aligned perpendicular to the optical axis of the detection objective because the detection light emanating from different positions of the respective sample layer then has to cover approximately the same light path through the sample.
  • the sample layers to be examined at a distance from one another, which is greater than the optical resolution the detection arrangement used.
  • the light sheet for simultaneously illuminating the plurality of sample layers can be formed, for example, by means of a cylinder optic from an illumination light bundle, in particular a laser illumination light bundle.
  • a quasi-light sheet by reciprocating a light bundle, which is circular in particular, in cross section, in a plane of the light sheet.
  • a cross-sectionally round illuminating light beam is generated, which swivels back and forth in such a way that it adjusts a beam deflecting device that is adjustable with respect to the deflection angle, which can be in particular the scanner of a scanning microscope Quasi-light sheet forms.
  • the plane of the light sheet is oriented perpendicular to the optical axis of the detection objective and / or that the light sheet is directed such that it strikes and / or passes through the angle to the optical axis of the detection objective at a non-zero angle the sample runs.
  • An alignment of the plane of the light plane perpendicular to the optical axis of the detection objective has the particular advantage that the sample layers can be illuminated in such a way that the light paths of the detection light are at least largely the same, relative to each detection layer, until they exit the sample.
  • the light sheet in the direction of the optical axis of the detection lens has an extension which is greater than the depth of field of the detection arrangement, which comprises at least the detection objective and the detection beam path, it is possible To illuminate multiple sample layers simultaneously and to be able to detect the detection light emanating from the sample layers, simultaneously or sequentially, without having to move the sample.
  • the detection light emanating from the plurality of sample layers has been detected and image data has been taken with respect to each desired sample layer, in a next step, other sample layers can be illuminated with the light sheet simultaneously and the detection light emanating from the different other sample layers can be detected as described above.
  • the sample in order to illuminate a plurality of other sample layers with the light sheet, after having previously examined several sample layers, for example, the sample can be moved relative to the light sheet.
  • Such an approach has the advantage that the entire optical structure with respect to illumination and detection, at least largely, can remain unchanged. It may only be necessary to slightly adjust the optical length of the detection beam path if the path length of the detection light through the sample changes until it leaves the sample.
  • the sample could be damaged by moving the sample.
  • moving the sample may be problematic if instruments such as microelectrodes or microneedles protrude into the sample during the examination.
  • the adjustment device can then be used to determine the optical path length of the detection beam path and / or of the individual detection beam path branches adapted such that a focusing of the emanating from the individual other sample layers detection light is ensured on the surface detector element or the area detector elements.
  • the area detector elements are parts of the same area detector, which can be designed, for example, as a CCD detector or as a CMOS detector or as an sCMOS detector.
  • the area detector has a sensor area, wherein different spatial proportions of the sensor area form the different area detector elements.
  • Such an embodiment is particularly suitable for simultaneous detection of the detection light emanating from the plurality of illuminated sample layers. In particular, by reading the entire area detector all information of all sample layers can be obtained simultaneously.
  • the area detector elements can be separate area detectors or at least to be parts of separate area detectors.
  • Such an embodiment has the advantage that the individual area detector elements can be operated and read completely independently of each other.
  • the adjusting device for adjusting the optical path length of the detection beam path or for adjusting the optical path lengths of the detection tube path branches can be realized in quite different ways.
  • the adjusting device or an adjusting element of the adjusting device comprises a plurality of different, transparent optical components, such as a plurality of glass blocks of different lengths, which can be inserted into the detection beam path or into a detection beam path branch in exchange for one another.
  • a longer optical component or a component with a higher refractive index By replacing such an optical component with a longer optical component or a component with a higher refractive index, an extension of the optical path length can be effected, while by exchanging such an optical component for another optical component that is shorter and / or one Lower refractive index, a reduction of the optical path length of the detection beam path and the detection beam path branch can be achieved.
  • the material glass for example in “glass block”
  • any materials and material combinations can be used for the optical components of the setting device and also for all other optical components used.
  • large parts of the optical components used or depicted in the figures can be partly or wholly made from air and / or other gases or gas mixtures or also from liquids
  • the mirrors used may be designed as reflection prisms or, alternatively, only as simple single mirror surfaces also be beam splitter cube.
  • the adjustment device has a plurality of transparent optical components which can be inserted independently of one another into the detection beam path and / or into a detection beam path branch.
  • a plurality of optical components in the detection beam path or a detection beam path branch, wherein an extension of the optical path length can be achieved by adding a further optical component, while a shortening of the optical path length can be effected by removing one of the optical components.
  • the adjustment device or at least one adjusting element of the adjustment device has a plurality of optical components arranged on a revolver or on a displacement arrangement , In this way it is possible, for example by simply rotating the revolver, an optical component in the detection beam path or in a detection beam path branch to replace it with another optical component. It is also possible to simultaneously exchange the optical components of a plurality of detection beam path branches by a single rotating operation or by a single shifting operation, which makes it possible to quickly and efficiently adjust the optical path lengths of a plurality of detection beam path branches in a setting step.
  • the adjusting device or an adjusting element of the adjusting device has at least one transparent block, for example a glass block, which is movable, in particular rotatable and / or displaceable, such that it is in the detection beam path and / or in a detection beam path branch located portion of the block is changeable.
  • a transparent block for example a glass block, which is movable, in particular rotatable and / or displaceable, such that it is in the detection beam path and / or in a detection beam path branch located portion of the block is changeable.
  • the surface detector element could either be firmly anchored in its focus position or be kept movable in the sense that its position along the optical axis, for example by means of a mechanical, pneumatic, electrical or based on the piezoelectric effect drive, can be adjusted to a to reach certain position on the optical axis.
  • This drive can be part of the adjustment. Such an adjustment could be automated or even performed manually during individual measurements or image recordings.
  • the adjustment device or an adjustment element of the adjustment device has at least one optical component which can be set in the geometric and / or optical thickness.
  • the adjusting device or an adjusting element of the adjusting device can have at least one optical component that can be changed in its shape exhibit.
  • This adjustable optical component can be realized in particular in such a way that it has a fluid arranged in a container, in particular a liquid, wherein the shape of the container is variable. In this way, the geometric length of the irradiated by the detection light part of the optical component can be changed. This can be done, for example, by directly changing the shape of the vessel. However, it is also possible to change the shape of the optical component by applying pressure to the fluid or by generating a negative pressure.
  • the adjustable optical component can have two transparent limiting disks, between which a fluid, in particular liquid, optical medium is arranged.
  • the transparent limiting discs can form a receiving space for the optical medium, for example with a flexible elastic, in particular tubular, film together.
  • the boundary plates By pressurizing the fluid with a pressure, the boundary plates can be pushed apart and thus the optical path length can be increased.
  • the boundary plates By reducing the pressure acting on the fluid, the boundary plates can be moved towards each other and thereby a reduction of the optical path length can be achieved.
  • At least one of the boundary layers, in particular all boundary layers located in the detection beam path is arranged at an angle different from 90 degrees to the direction of incidence of the detection light. or that at least one of the boundary layers, in particular all boundary layers located in the detection beam path, are arranged at an angle different from 90 degrees to the optical axis.
  • filters for example bandpass filters
  • filters can be applied to the boundary layers of the beam splitters and / or the optical components, in particular sputtered on. This, for example, in order to realize a wavelength-specific detection and / or to hide light of the excitation wavelength.
  • at least one of the beam splitters and / or at least one of the optical components is designed so that aberrations are avoided or at least reduced and / or that aberrations are at least compensated.
  • At least one of the beam splitters and / or at least one of the optical components can have at least one curved interface, in particular an aspherically curved interface.
  • at least one of the beam splitters or one of the optical components has an inhomogeneous refractive index over its cross section and thus unfolds a lens effect (GRIN lens).
  • GRIN lens lens effect
  • the effective refractive power of the beam splitters and / or the optical components can be zero in an easily realizable way, which means that the focal length of these elements is infinite.
  • an effective refractive power of zero also means that the angle of convergence of the respective detection beam focused on an area detector element is not changed by the respective beam splitter and the respective optical component.
  • an effective refractive power of the element of zero for elements consisting of a single material is achieved by the front and the rear interface being flat.
  • a beam splitter and / or an optical component whose boundary surfaces are curved, yet a refractive power of zero can be achieved by equaling the curvature of its front interface and its rear interface.
  • a beam splitter and / or such an optical component it is also possible with such a beam splitter and / or such an optical component to achieve an axial offset of the focus of the detection light; this, without - unlike a lens - changes the convergence angle of the respective focused on a surface detector element detection light beam.
  • the first boundary surface of the first beam splitter which is hit by the detection light, and which in each case are curved the same way for the individual detection beam path branches.
  • at least one radius of curvature must be adjusted accordingly to achieve the same effect.
  • the adjustable optical component can have two transparent, curved boundary plates, between which a fluid, in particular liquid, optical medium is arranged.
  • the transparent, curved boundary plates can together form a receiving space for the optical medium, for example with a flexible elastic, in particular tubular, film.
  • the boundary plates can be pushed apart and thus the optical path length can be increased.
  • the boundary plates can be moved towards each other and thereby a reduction of the optical path length can be achieved.
  • the two limiting discs are curved in the same direction and have the same radius of curvature.
  • the refractive index of the fluid medium is adapted to the refractive index of the boundary writing.
  • the refractive index of the medium is the same as that of the delineating letter.
  • the device according to the invention may advantageously include a scanning microscope or a confocal scanning microscope and / or from a scanning microscope and / or a confocal scanning microscope.
  • the beam deflecting device of the scanning microscope or confocal scanning microscope which can be adjusted with regard to the deflection angle, can be used to produce a quasi-continuous scan, as described above.
  • FIG. 1 shows a first exemplary embodiment of a device according to the invention with a branched detection beam path and surface deflector elements which are parts of the same surface detector
  • FIG. 2 shows a second embodiment of a Vorrichfung invention mif a branched Detekfionsstrahlengang and separate mecanicnerteekforen
  • FIG. 4 shows a fourth exemplary embodiment of a device according to the invention
  • FIG. 5 shows a fifth embodiment of a device according to the invention mif a particular Einfellvoroplasty in a first setting
  • FIG. 7 shows a sixth embodiment of a Vorrichfung invention
  • 8 shows a seventh exemplary embodiment of a device according to the invention with infinitely adjustable setting elements
  • FIG. 9 shows an illustration of the mode of operation of the continuously adjustable setting elements
  • Fig. 1 an embodiment of a multi-dimensionally branched detection beam path
  • FIG. 12 shows a ninth embodiment of a device according to the invention with bandpass filters
  • FIG. 13 shows schematically the operating principle when using curved interfaces
  • FIG. 14 is a detail view of a tenth embodiment, with curved interfaces
  • Fig. 15 shows an embodiment of an adjustable optical component with curved boundary surfaces
  • Fig. 1 6 an eleventh embodiment of a device according to the invention with direct placement of the detectors in the focal planes.
  • Fig. 1 shows schematically a first embodiment of a device according to the invention.
  • the device has a light source 1, which may be formed for example as a laser and which generates a light beam 2.
  • the light beam 2 is formed by means of a cylindrical lens 3 to form a light sheet 4, which is focused with a lighting objective 5 on a sample 6.
  • the light-leaf plane is perpendicular to the plane of the drawing.
  • the light-plane is arranged perpendicular to the optical axis 7 of a detection objective 49.
  • the light sheet 4 simultaneously illuminates a plurality of sample layers 8, 9, 10.
  • the detection light 11 originating from the individual sample layers 8, 9, 10 becomes of the de ⁇ ekionsobjek ⁇ iv 49 kollimier ⁇ and focused by a tube lens 12 and then passes to a first beam splitter 13, which reflects 2/3 of the detection light and transmits 1/3 of the detection light.
  • the reflected portion of the detection light 1 1 reaches a further beam splitter 15, which transmits half of the incident light and reflects the other half.
  • the part of the detection light 1 1 reflected by the first beam splitter 13 and transmitted by the second beam splitter 15 passes to a first area detector element 18 after passing through a first optical component 16 which is part of an adjustment device 17 for setting the optical path lengths of the detection beam path branches Path length of this detection beam path branch, at the end of which the first area detector element is located, is set such that the first area detector element 18 is located in an optically corresponding plane to the first sample layer 8.
  • the transmitted by the first beam splitter 13 part of the detection light 1 1 passes to a mirror 14 and is deflected by this to a second surface detector element 19, which is the transmitted portion of the detection light 1 1 after passing through a second optical component 20, which is also part of the setting device 17th is reached.
  • the second area detector element 19 is arranged in a plane which corresponds to the second sample layer 9 in an optically corresponding manner.
  • the detection light reflected by the second beam splitter 15 likewise impinges on the mirror 14 and is deflected by the latter to a third area detector element 21, wherein a third optical component 22, which is also part of the setting device 1 7, passes.
  • the third area detector element 21 is located in a plane which corresponds optically to the third sample layer 10.
  • the detection light 1 1 of the different sample layers 8, 9, 10, in particular simultaneously, with the separate area detector elements 18, 19, 21 are detected.
  • the area detector elements 18, 19, 21 are parts of the same area detector.
  • the device has the very special advantage that image data from three sample layers 8, 9, 10 can be recorded simultaneously. However, there is no limitation to only three sample layers. Rather, in practice a significantly higher number of sample layers can be illuminated simultaneously and the detection light emanating from these sample layers can be detected, in particular simultaneously.
  • FIG. 2 shows a second exemplary embodiment of a device according to the invention, which has a similar structure to the device illustrated in FIG.
  • the first area detector element 18 and the second area detector element 19 and the third area detector element 21 are not components of one and the same area detector, but each designed as separate area detectors. This can be, for example, three CCD cameras.
  • FIG. 3 schematically shows a third exemplary embodiment of a device according to the invention, in which the detection light 1 1 focused by the tube lens 12 is split by a first beam splitter 13, which transmits 1/3 of the detection light and reflects 2/3.
  • the reflected part of the detection light 1 1 reaches a second beam splitter 15 which reflects and transmits in the ratio 50:50.
  • the of the second beam splitter 15th ⁇ ransmi ⁇ ⁇ ⁇ e ⁇ e ⁇ ek ⁇ tionlich ⁇ it 1 1 passes after passing a first optical component 16 to adjust the optical path length to a first area detector 18.
  • the transmitted from the first beam splitter 13 detection light 1 1 1 passes after passing of a second optical component 20 without further deflection directly to the second area detector element 19, while the reflected by the second beam splitter 15 detection light 1 1 passes after passing through a third optical component 22 to a third area detector element 21.
  • the surface detector elements 18, 19, 21 are in planes that are optically corresponding planes to the planes in which the sample layers 8, 9, 10 are located.
  • FIG. 4 shows a fourth exemplary embodiment of a device according to the invention, in which the detection light 1 1 focused by the tube lens 12 is split by a first beam splitter 13, which transmits 1/3 of the detection light and reflects 2/3.
  • the reflected part of the detection light 1 1 reaches a second beam splitter 15 which reflects and transmits in the ratio 50:50.
  • the part of the detection light 1 1 transmitted by the second beam splitter 15 is deflected by means of a deflecting mirror 23 before it reaches the first surface detector element 18 after passing through a first optical component 1 6, which serves to adjust the optical path length of the detection beam path branch.
  • FIG. 1 shows schematically a fifth embodiment of an inventive Device which essentially corresponds to the construction of the device shown in FIG.
  • the adjusting device 17 includes five glass blocks 24, 25, 26, 27, 28 which can be guided by means of a displacement device, not shown, and moved together and of which - depending on the respective displacement position - each a glass block 24, 25, 26, 27, 28 is arranged in one of the detection beam path branches.
  • a rotating device may be present as part of the adjusting device 17, the several different lengths of glass blocks 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 , 37, 38, such that by varying the rotational position, different glass blocks 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 can be positioned in the detection beam path branches to match the optical path lengths of the detection beam path branches realized in the embodiment shown in Figure 7.
  • Figure 8 shows a particular embodiment, which largely corresponds in its basic structure of the embodiment of Figure 1.
  • a continuously adjustable optical component 39 is arranged in each of the detection beam path branches.
  • the infinitely adjustable optical components 39 can be adjusted independently of each other, so that the optical path lengths of the individual detection beam path branches can be adjusted independently of each other.
  • FIGS. 9a and 9b The operation of the continuously variable optical components 39 is illustrated in more detail in FIGS. 9a and 9b.
  • Each of the continuously variable optical components 39 has two transparent limiting discs 40, which together with an annular, elastic foil 41 form a receiving space for a fluid 42.
  • the distance between the transparent boundary plates 40 can, for example, by Changing the pressure on the fluid 42 are changed.
  • FIG. 10 a shows an eighth exemplary embodiment of a device according to the invention with an unbranched detection beam path.
  • the detection light 1 1 emanating from the different sample layers 8, 9, 10 is not focused simultaneously but sequentially onto an area detector element 43.
  • the detection light 1 1 collimated by the detection objective 49 is collimated by a tube lens 12 and then deflected by a deflection mirror 14, so that after passing through an optical component, namely a glass block 44, an adjustment device 17 has a revolver 48 with several different lengths Glass blocks 44, 45, 46, 47 includes, comes to the surface detector element 43.
  • the area detector element 43 is located in an optical plane corresponding to a first sample layer 8.
  • the setting device 17 After reading the optical surface detector element 43, the setting device 17 is rotated, so that another of the glass blocks 44, 45, 46, 47 passes into the detection beam path, which is dimensioned so that now the surface detector element 43 in a second sample layer 9 optically corresponding plane is arranged.
  • FIG. 11 shows an exemplary embodiment of a multi-dimensionally branched detection beam path, in which a plurality of surface detector elements 50, 51, 52, 53 of a surface detector 54 are each assigned to one of four sample layers.
  • the multi-dimensional branching is achieved by first spatially splitting the detection light 1 1 in a first splitter stage 55 by a first beam splitter 57, the transmitted part of the detection light 11 being deflected by a first deflecting mirror 58.
  • a further splitting of both the transmitted part of the detection light 1 1, and the reflected part wherein the second beam splitter 59, 60 and the second deflection mirror 61, 62 of the second divider stage 56 relative to the respective optical axis and relative to the first beam splitter 57 and the first deflection mirror 58 are rotated by 90 degrees.
  • FIGS. 1 to 16b have boundary surfaces which are oriented perpendicular to the direction of incidence of the incident light and / or which are plane-parallel to one another. However, this does not necessarily have to be so realized.
  • the interfaces under one of 90 Degree to the direction of incidence of the detection light is arranged at different angles and / or that at least one of the interfaces, in particular all interfaces located in the detection beam path, are arranged at an angle different from 90 degrees to the optical axis.
  • the following boundary surfaces are not aligned parallel to one another along the detection beam path at least immediately one after the other.
  • a filter in particular a bandpass filter
  • FIG. 12 illustrates an exemplary embodiment that substantially corresponds to the exemplary embodiment according to FIG. 2, but with a bandpass filter 63 being applied in each case by way of example to the first optical component 16, the second optical component 20 and the third optical component 22.
  • These bandpass filters 63 can be used, for example, for wavelength-specific detection and in particular for suppressing the light of an excitation wavelength of the light sheet 4.
  • the bandpass filters 63 may be similar. However, it is also possible for the bandpass filters 63 to be designed differently with regard to the wavelength range of the transmitted light, for example in order to be able to detect light of different wavelength ranges with the area detector elements 18, 19, 21.
  • the bandpass filters 63 could also be arranged elsewhere on one of the beam splitters 13, 15, 57, 59, 60 and / or one of the optical components 16, 20, 22, 24 to 38 in the non-overlapping parts of the detection beam path branches.
  • the beam splitters 1 3, 1 5, 57, 59, 60 and / or the optical components 1 6, 20, 22, 24 to 38 need not be made of the same material, but can. In particular, different materials can advantageously also be used. Although contiguous elements are made of the same material, these elements need not necessarily be made in one piece with one another. However, this is quite possible and particularly advantageous in some applications.
  • At least one of the beam splitters 13, 1 5, 57, 59, 60 and / or at least one of the optical components 1 6, 20, 22, 24 to 38 can be designed so that aberrations are avoided or at least reduced, and / or compensated.
  • at least one of the beam splitters 1 3, 15, 57, 59, 60 and / or at least one of the optical components 1 6, 20, 22, 24 to 38 for example, at least one curved interface, in particular an aspherical curved interface have.
  • At least one of the beam splitters 1 3, 1 5, 57, 59, 60 and / or at least one optical component 1 6, 20, 22, 24 to 38 has an inhomogeneous refractive index over its cross section ( and unfolds a lens effect (GRIN lens)) and / or is composed of several elements with different optical properties.
  • GRIN lens lens effect
  • At least one of the beam splitters 13, 1 5, 57, 59, 60 and / or at least one of the optical components 16, 20, 22, 24 to 38 has a diffractive structure.
  • FIGS. 1 to 12 and 16a, 16b have beam splitters 13, 15, 57, 59, 60 and optical components 16, 20, 22, 24 to 38 whose effective power is zero; or in other words, the focal length of these elements is at infinity.
  • an effective refractive power of zero means that the convergence angle ⁇ of the respective detection beam focused on an area detector element is not changed by the respective beam splitter 13, 15, 57, 59, 60 and the respective optical component 1 6, 20, 22, 24 to 38 becomes.
  • an effective refractive power of the element of zero for elements consisting of a single material is achieved by the front and the rear interface being flat.
  • a beam splitter 13, 15, 57, 59, 60 and / or an optical component 16, 20, 22, 24 to 38 symbolized in FIG. 13 generally by the optical system X
  • its boundary surfaces are curved
  • a zero refractive power can be achieved by making the curvature of the front interface 64 and the rear interface 65 equal, as illustrated by way of example and quite schematically in FIG.
  • This, without - unlike a lens - the Konvergenzwinkel ß of the respective focused on a surface detector element detection light beam changes. It follows that: ß ß '.
  • the boundary surfaces of the same curvature in order to achieve the described effect, it is not necessary to act around the boundary surfaces of the same beam splitter 13, 15, 57, 59, 60 and / or optical component 16, 20, 22, 24 to 38 , Rather, it can also advantageously be provided that, for example, the first boundary surface 66 of the first beam splitter 13, which is hit by the detection light 1 1, and the last interface 67, 68, 69 respectively for the individual detection beam paths branches (provided they have the same refractive index) are curved.
  • Fig. 14 shows a detail view of a tenth embodiment, wherein the first Boundary surface 66 of the first beam splitter 13, which is hit by the detection light 1 1, is convexly curved, while each of the individual detection beam path branches last interface 67, 68, 69 is concavely curved. Otherwise, the embodiment substantially corresponds to the embodiment shown in Figure 1.
  • FIG. 16a shows an eleventh exemplary embodiment in which the three area detector elements 18, 19, 21 can be displaced along their optical axis perpendicular to them, such that the three area detector elements lie in the respectively optimum focus position.
  • the three area detector elements could either be firmly anchored in their respective focus position or be kept movable in the sense that their position along the optical axis, for example by means of a mechanical, pneumatic, electrical or based on the piezoelectric effect drive, can be adjusted to reach a certain position on the optical axis.
  • FIG. 16b the arrangement of FIG.
  • 16a equivalent to the previous embodiments, has been extended by three optical components 16, 20, 22 forming part of a setting device 17 for adjusting the optical path lengths of the detection beam path branches in that an optical component is arranged in front of each surface detector element for the purpose of fine adjustment of the focal position on the respectively associated surface detector element.
  • This can be achieved according to the invention in any of the previously described ways, for example by the use of suitable glass blocks and / or by using a variable in its thickness optical component 16, 20, 22nd

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur SPIM-Untersuchung einer Probe (6) und eine Vorrichtung zur SPIM-Untersuchung einer Probe (6), aufweisend eine Beleuchtungsvorrichtung zum Erzeugen eines Lichtblattes und eine Detektionsanordnung, die ein Detektionsobjektiv und einen Detektionsstrahlgang umfasst. Das Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass mehrere Probenschichten (8, 9, 10) simultan mit einem einzigen Lichtblatt (4) beleuchtet werden und dass das von den einzelnen Probenschichten (8, 9, 10) ausgehende Detektionslicht (11) zeitlich separat und/oder räumlich separat voneinander detektiert wird.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur SPIM-Untersuchung einer Probe
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur SPIM-Untersuchung einer Probe. Des Weiteren betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zum Ausführen eines solchen Verfahrens und eine Vorrichtung zur SPIM-Untersuchung einer Probe, aufweisend eine Beleuchtungsvorrichtung zum Erzeugen eines Lichtblattes und eine Detektionsanordnung, die ein Detektionsobjektiv und einen Detektionsstrahlgang umfasst. Die SPIM-Technik (Single Plane Illumination Microscopy), bei der eine schichtweise Beleuchtung der Probe erfolgt, erlaubt eine schnellere und probenschonendere Erfassung von Bilddaten als beispielsweise bei einer punktweisen Abtastung einer Probe. Ein bekanntes Einsatzgebiet der SPIM-Technologie ist der Bereich der Fluoreszenz-Mikroskopie, bei der Fluorophore in der Probe mit Laserlicht angeregt werden. Bei der bekannten SPIM-Technologie findet hierbei eine Anregung in einer von einem Beleuchtungs-Lichtblatt (auch „Lichtstreifen" genannt) beleuchteten Probenschicht statt. Zum Erzeugen einer SPIM-Abbildung wird die Probe mit dem Lichtblatt durchleuchtet, während die Beobachtung der so beleuchteten Probenschicht in senkrechter Richtung durch Detektion des Fluoreszenz- und/oder Streulichtes erfolgt. Aus den sukzessive gewonnenen Abbildungen unterschiedlicher Probenschichten, insbesondere aus einem Stapel von Abbildungen zueinander paralleler Probenschichten, kann eine dreidimensionale Darstellung der Probe erzeugt werden. Ein nach dem SPIM-Verfahren arbeitendes Mikroskop ist in DE 102 57 423 AI beschrieben. Bei diesem Mikroskop wird eine Probe mit einem dünnen Lichtstreifen beleuchtet, während die Beobachtung senkrecht zu der Ebene des beleuchtenden Lichtstreifens erfolgt. Die Beleuchtung und die Detektion erfolgen über zwei separate optische Strahlengänge mit jeweils separater Optik, insbesondere mit zwei separaten, zueinander senkrechten Objektiven. Der Lichtstreifen wird von einem Beleuchtungsobjektiv und einer ihm vorgeschalteten Zylinderoptik erzeugt. Für die Bildaufnahme wird die Probe durch den bezüglich des Detektors feststehenden Lichtstreifen bewegt, um schichtweise Fluoreszenz- und/oder Streulicht mit einem flächigen Detektor aufzunehmen. Die so gewonnenen Schichtbilddaten lassen sich anschließend zu einem aus einer dreidimensionalen Abbildung der Probe entsprechenden Datensatz zusammensetzen.
Aus DE 10 2004 034 957 AI ist eine Anordnung zur mikroskopischen Beobachtung einer Probe über ein Mikroskopobjektiv bekannt, in dessen Gehäuse außerhalb der Linsenoptik zusätzliche Lichtführungen für das Beleuchtungslicht vorgesehen sind. Das Beleuchtungslicht verläuft dabei zunächst parallel zur optischen Achse des Objektivs innerhalb der Lichtführungen und trifft danach auf einen am Objektivgehäuse angebrachten, ringförmigen Reflektor mit geringer Apertur, die das Beleuchtungslicht mit Hilfe zusätzlicher Abbildungselemente senkrecht zur optischen Achse des Mikroskopobjektivs und damit senkrecht zur Beobachtungsrichtung in die Probe fokussieren. Auch hier erfolgt die Beleuchtung der Probe flächenartig nach dem SPIM-Prinzip. Bei diesem Mikroskop ist insbesondere problematisch, die Probe jeweils räumlich innerhalb des ringförmigen Reflektors positionieren zu müssen. Auch aus DE 20 201 1 1 10 077 U l ist eine Anordnung zum Beleuchten einer Probe bei der SPIM-Mikroskopie bekannt. Die Anordnung beinhaltet eine Lichtquelle zum Erzeugen eines Lichtbündels, Mittel zum Erzeugen eines Lichtstreifens aus dem Lichtbündel, und wenigstens ein Objektiv, das eine Optik aufweist, die dazu ausgebildet und bestimmt ist, von der Probe ausgehendes Detektionslicht direkt oder indirekt einem Detektor zuzuführen. Außerdem beinhaltet die Anordnung eine der Optik des Objektivs nachgeschaltete Umlenkeinrichtung zum Umlenken des Lichtstreifens.
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren anzugeben, das ein noch schnelleres Untersuchen und/oder probenschonenderes Untersuchen einer Probe in drei Dimensionen erlaubt.
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, bei dem mehrere Probenschichten simultan mit einem einzigen Lichtblatt beleuchtet werden und bei dem das von den einzelnen Probenschichten ausgehende Detektionslicht zeitlich separat und/oder räumlich separat voneinander detektiert wird.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung anzugeben, die noch schnelleres und/oder probenschonenderes Untersuchen einer Probe in drei Dimensionen erlaubt. Diese Aufgabe wird durch eine Vorrichtung der eingangs genannten Art gelöst, die dadurch gekennzeichnet ist, dass die Beleuchtungsvorrichtung mehrere Probenschichten einer zu untersuchenden Probe simultan mit dem Lichtblatt beleuchtet und die Detektionsanordnung das von den einzelnen Probenschichten ausgehende Detektionslicht zeitlich separat und/oder räumlich separat voneinander detektiert.
Die Erfindung hat den ganz besonderen Vorteil, dass durch das gleichzeitige Beleuchten mehrerer Probenschichten sehr schnell, simultan oder sequentiell, Bilddaten dieser Probenschichten gewonnen werden können, insbesondere ohne dass die Probe relativ zu der Detektionsanordnung verschoben werden muss. Auf diese Weise ist es ermöglicht, schnell und probenschonend einen Bildstapel aufzunehmen, der eine dreidimensionale Rekonstruktion der Probe erlaubt.
Ein probenschonenderes Untersuchen einer Probe in drei Dimensionen ist insbesondere deshalb ermöglicht, weil die Belastung durch das Beleuchtungslicht auf Grund der schnelleren Bilddatengewinnung verringert werden kann und weil, was weiter unten noch im Detail erläutert ist, die Probe nicht relativ zu der Detektionsanordnung verschoben werden muss.
Wie weiter unten noch im Detail erläutert ist, kann in ganz besonders vorteilhafter Weise eine Beleuchtung der mehreren Probenschichten mit einem einzigen Lichtblatt erfolgen, dessen räumliche Dicke größer ist als die Schärfentiefe der Detektionsanordnung, so dass das von den simultan mit ein und demselben Lichtblatt beleuchteten Probenschichten jeweils ausgehende Detektionslicht, simultan oder sequentiell, separat voneinander detektiert werden kann.
Bei einer besonderen Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das von den unterschiedlichen Probenschichten ausgehende Detektionslicht räumlich getrennt, insbesondere simultan, auf separate Flächendetektorelemente fokussiert wird. Alternativ oder zusätzlich kann auch vorgesehen sein, dass das Detektionslicht der unterschiedlichen Probenschichten, insbesondere simultan, mit mehreren separaten Flächendetektorelementen detektiert wird. Eine solche Ausführung ermöglicht es in ganz besonders vorteilhafter Weise, gleichzeitig Bilddaten von mehreren unterschiedlichen Probenschichten aufnehmen zu können.
Hierbei kann insbesondere vorteilhaft vorgesehen sein, dass der Detektionsstrahlengang verzweigt ist und mehrere Detektionsstrahlengangzweige mit jeweils wenigstens einem Flächendetektorelement aufweist. Die Verzweigung des Detektionsstrahlengangs kann insbesondere mit Hilfe von Strahlteilern, die beispielsweise als Strahlteilerwürfel und/oder als Neutralstrahlteiler ausgebildet sein können, erreicht werden. In ganz besonders vorteilhafter Weise werden zum Abbilden der mehreren beleuchteten Probenschichten die optischen Weglängen der Detektionsstrahlengangzweige (jeweils gemessen von dem Detektionsobjektiv zu dem jeweiligen Flächendetektorelement) mit einer Einstellvorrichtung derart eingestellt, dass das von einer Probenschicht ausgehende Detektionslicht auf ein erstes Flächendetektorelement eines ersten Detektionsstrahlengangzweigs fokussiert ist und das von einer anderen Probenschicht ausgehende Detektionslicht auf ein zweites Flächendetektorelement eines zweiten Detektorstrahlengangzweigs fokussiert ist. Natürlich können auch ein dritter und weitere Detektionsstrahlengangzweige vorhanden sein, wobei das Detektionslicht einer dritten und weiterer Probenschichten entsprechend auf die Flächendetektorelemente dieser Detektionsstrahlengangzweige fokussiert ist.
Auf diese Weise kann erreicht werden, dass jeder der beleuchteten Probenschichten ein eigenes Flächendetektorelement zugeordnet ist, wobei jeweils das von einer Probenschicht ausgehende Detektionslicht auf das zugeordnete Flächendetektorelement fokussiert ist. Insbesondere, wenn die Verzweigung des Detektionsstrahlenganges durch Neutralstrahlteiler realisiert ist, gelangt natürlich auch Detektionslicht einer anderen Probenschicht auf ein ihr nicht zugeordnetes Flächendetektorelement; jedoch ist dieses Detektionslicht auf diesem Flächendetektorelement nicht fokussiert, so dass es bei der Gewinnung von Bilddaten mit diesem Flächendetektorelement lediglich zu einem Hintergrundrauschen beiträgt. Dieses Hintergrundrauschen kann jedoch nachträglich bei der Verarbeitung der gewonnenen Bildsignale und/oder Bilddaten zumindest reduziert werden. Es hat sich gezeigt, dass der beschriebene Effekt ohnehin in der Praxis allenfalls eine untergeordnete Rolle spielt. Es ist auch möglich, dass das Detektionslicht in Abhängigkeit von wenigstens einer Detektionslichteigenschaft auf unterschiedliche Detektionsstrohlengongzweige aufgeteilt wird. Beispielsweise kann die Detektionslichteigenschaft die räumliche Ausrichtung einer Linearpolarisation und/oder die Zugehörigkeit zu einem vorgegebenen oder vorgebbaren Wellenlängenbereich umfassen. Beispielsweise ist es möglich, dass die Verzweigung des Detektionsstrahlenganges durch Farbstrahlteiler bewirkt wird. Auf diese Weise kann erreicht werden, dass bezüglich jeder Probenschicht ausschließlich das Detektionslicht einer bestimmten Wellenlänge oder eines bestimmten Wellenlängenbereichs detektiert wird.
Die Einstellvorrichtung ermöglicht es, die optischen Weglängen der Detektionsstrohlengongzweige probenspezifisch derart anzupassen, dass sich zu jeder der Probenschichten in einer optisch korrespondierenden Ebene ein Flächendetektorelement befindet. Oder anders ausgedrückt: Die optischen Lichtwege der Detektionsstrohlengongzweige können derart eingestellt werden, dass jedes der Flächendetektorelemente auf eine eigene Probenschicht„schaut". Eine solche Anpassbarkeit der optischen Weglängen hat den ganz besonderen Vorteil, dass die unterschiedliche Ausbildung unterschiedlicher Proben, insbesondere hinsichtlich Ausdehnung und/oder Brechungsindex, berücksichtigt werden kann. Insbesondere kann berücksichtigt werden, ob das Detektionslicht einen längeren oder einen kürzeren Weg durch die Probe zurücklegen muss, bevor es aus der Probe austritt. Darüber hinaus kann beispielsweise auch eine Anpassung der optischen Weglängen beim Austausch von optischen Komponenten im Detektionsstrahlengang, wie beispielsweise bei einem Wechsel des Detektionsobjektivs, präzise vorgenommen werden.
Insbesondere im Hinblick hierauf kann vorteilhaft vorgesehen sein, dass die optischen Weglängen der einzelnen Detektionsstrohlengongzweige unabhängig voneinander eingestellt werden und/oder unabhängig voneinander einstellbar sind. Auf diese Weise ist es ermöglicht, jedem Flächendetektorelement individuell eine bestimmte Probenschicht in einer optisch korrespondierenden Ebene zuordnen zu können. Der Benutzer hat insoweit den besonderen Vorteil, sich flexibel an die Probenbegebenheiten anpassen zu können und insbesondere genau die Probenschichten zu untersuchen, die für ihn von Relevanz sind. Insbesondere zu diesem Zweck kann die Einstellvorrichtung mehrere Einstellelemente umfassen, wobei jeder Detektionsstrahlengangzweig ein eigenes Einstellelement aufweisen kann, mit dem die optische Weglänge des jeweiligen Detektionsstrahlengangzweigs eingestellt wird und/oder einstellbar ist.
Die Detektionsstrahlengangzweige können, insbesondere in dem Bereich vom Detektionsobjektiv bis zu einem Strahlteiler, teilweise überlappen und darüber hinaus, insbesondere in dem Bereich jeweils von einem Strahlteiler bis zu dem jeweiligen Flächendetektorelement, räumlich getrennt voneinander verlaufen.
Um die optischen Weglängen der einzelnen Detektionsstrahlengangzweige unabhängig voneinander und individuell einstellen zu können, ist es von Vorteil, wenn jeder Detektionsstrahlengangzweig in dem Bereich, in dem er mit keinem anderen Detektionsstrahlengang überlappt, ein eigenes Einstellelement zum Einstellen der optischen Weglänge aufweist. Es ist - alternativ oder zusätzlich - jedoch auch möglich, dass in dem Bereich, in dem zwei oder mehrere Detektionsstrahlengangzweige überlappen ein gemeinsames Einstellelement vorhanden ist, das auf mehrere Detektionsstrahlengangzweige wirkt und mit dem die optischen Weglängen mehrerer Detektionsstrahlengangzweige gleichzeitig veränderbar ist.
Bei einer anderen Ausführungsart des erfindungsgemäßen Verfahrens, die insbesondere keinen verzweigten Detektionsstrahlengang benötigt, wird das von den unterschiedlichen Probenschichten ausgehende Detektionslicht zeitlich nacheinander auf dasselbe Flächendetektorelement fokussiert.
Dies kann beispielsweise in der Weise realisiert sein, dass das von einer der Probenschichten ausgehende und durch ein Detektionsobjektiv tretende Detektionslicht auf einem Detektionsstrahlengang geführt wird, dessen optische Weglänge mittels einer Einstellvorrichtung derart eingestellt wird, dass das von dieser Probenschicht ausgehende Detektionslicht auf das Flächendetektorelement fokussiert ist, wobei das Flächendetektorelement zur Gewinnung von Bilddaten dieser Probenschicht bei dieser Einstellung der Weglänge ausgelesen wird, und dass zeitlich danach die optische Weglänge des Detektionsstrahlenganges mittels der Einstellvorrichtung derart eingestellt wird, dass das von einer anderen der Probenschichten ausgehende Detektionslicht auf das Flächendetektorelement fokussiert ist, wobei das Flächendetektorelement zur Gewinnung von Bilddaten der anderen Probenschicht bei der anderen Einstellung der optischen Weglänge erneut ausgelesen wird. Auf diese Weise können die mehreren Probenschichten, die insbesondere senkrecht zur optischen Achse des Detektionsobjektivs und parallel zueinander angeordnet sein können, sukzessive nacheinander auf das Flächendetektorelement abgebildet werden und jeweils probenschichtspezifisch Bilddaten gewonnen werden.
Unabhängig davon, ob die Detektion des Detektionslichts nun simultan oder sequentiell erfolgt und unabhängig davon, ob die Detektion des Detektionslichts der einzelnen Probenschichten über einen verzweigten Detektionsstrahlengang oder einen unverzweigten Detektionsstrahlengang erfolgt, können die zu untersuchenden Probenschichten vorteilhaft parallel zueinander ausgerichtet sein. Eine solche Vorgehensweise hat den besonderen Vorteil, dass eine einfache Anordnung des Flächendetektorelements (bei unverzweigtem Detektionsstrahlengang) beziehungsweise der Flächendetektorelemente (bei verzweigtem Detektionsstrahlengang) ermöglicht ist. Insbesondere ist es nicht notwendig, ein Flächenelement zu drehen und/oder irgendwelche optischen Anpassungselemente vorzusehen, um unterschiedlichen Ausrichtungen der einzelnen Probenschichten Rechnung tragen zu können, wenngleich dies jedoch möglich wäre.
Von besonderem Vorteil, insbesondere im Hinblick auf eine schnelle und effektive Detektion, ist es, wenn ein Stapel einer Vielzahl von parallel zueinander ausgerichteten Probenschichten simultan oder sequentiell beleuchtet und abgebildet wird.
Von besonderem Vorteil ist es, wenn die Probenschichten senkrecht zur optischen Achse des Detektionsobjektivs ausgerichtet sind, weil das von unterschiedlichen Positionen der jeweiligen Probenschicht ausgehende Detektionslicht dann in etwa denselben Lichtweg durch die Probe zurückzulegen hat.
Bei einer besonderen Ausführung weisen die zu untersuchenden Probenschichten einen Abstand zueinander auf, der größer ist, als das optische Auflösungsvermögen der verwendeten Detektionsanordnung.
Das Lichtblatt zum simultanen Beleuchten der mehreren Probenschichten kann beispielsweise mit Hilfe einer Zylinderoptik aus einem Beleuchtungslichtbündel, insbesondere einem Laser-Beleuchtungslichtbündel, geformt werden.
Alternativ kann jedoch auch ein Quasi-Lichtblatt durch Hin-und-Her-Wedeln eines, insbesondere im Querschnitt kreisrunden, Beleuchtungslichtbündels in einer Lichtblattebene erzeugt werden. Beispielsweise kann vorgesehen sein, dass zunächst, beispielsweise mit einer Laser-Lichtquelle, ein im Querschnitt rundes Beleuchtungslichtbündel erzeugt wird, das eine hinsichtlich des Ablenkwinkels einstellbare Strahlablenkeinrichtung, die insbesondere der Scanner eines Scanmikroskops sein kann, derart schnell hin- und herwedelt, dass dieser ein Quasi- Lichtblatt bildet. Insbesondere kann vorgesehen sein, dass das Beleuchtungslichtbündel derart schnell hin- und hergewedelt wird, dass das das Detektionslicht empfangende Flächendetektorelement, zumindest weitgehend, die gleichen Detektionssignale erzeugt, wie bei einer Beleuchtung mit einem Lichtblatt, das mit einer Zylinderoptik geformt wurde, und/oder dass das Quasi-Lichtblatt für den eingesetzten Detektor von einem beispielsweise mit einer Zylinderoptik erzeugten Lichtblatt nicht zu unterscheiden ist.
In vorteilhafter Weise kann vorgesehen sein, dass die Lichtblattebene senkrecht zur optischen Achse des Detektionsobjektivs ausgerichtet ist und/oder dass das Lichtblatt derart gelenkt wird, dass es in einem von Null Grad verschiedenen Winkel zur optischen Achse des Detektionsobjektivs auf die Probe trifft und/oder durch die Probe verläuft. Eine Ausrichtung der Lichtblattebene senkrecht zur optischen Achse des Detektionsobjektivs hat den besonderen Vorteil, dass die Probenschichten derart beleuchtet werden können, dass die Lichtwege des Detektionslichts bis zum Austritt aus der Probe bezogen auf jede Detektionsschicht, zumindest weitgehend, gleich sind.
Insbesondere wenn das Lichtblatt in Richtung der optischen Achse des Detektionsobjektivs eine Ausdehnung aufweist, die größer ist als der Schärfentiefenbereich der Detektionsanordnung, die zumindest das Detektionsobjektiv und den Detektionsstrahlengang umfasst, ist es ermöglicht, mehrere Probenschichten simultan zu beleuchten und das von den Probenschichten ausgehende Detektionslicht, simultan oder sequentiell, detektieren zu können, ohne die Probe bewegen zu müssen. Nachdem das von den mehreren Probenschichten ausgehende Detektionslicht detektiert wurde und Bilddaten hinsichtlich jeder gewünschten Probenschicht genommen wurde, können in einem nächsten Schritt andere Probenschichten mit dem Lichtblatt simultan beleuchtet und das von den unterschiedlichen anderen Probenschichten ausgehende Detektionslicht wie oben beschreiben detektiert werden. Insoweit ist es ermöglicht, sukzessive jeweils ein Tupel von n Probenschichten untersuchen zu können und die gewonnenen Bilddaten sämtlicher Tupel beispielsweise für eine 3D-Rekonstruktion der Probe zu verwenden. Dies unabhängig davon, ob die das von den jeweils simultan beleuchteten Probenschichten ausgehende Detektionslicht in einem verzweigten Detektionsstrohlengong oder in einem unverzweigtem Detektionsstrohlengong detektiert wird und unabhängig davon, ob die Detektion des von den unterschiedlichen Probenschichten ausgehende Detektionslicht simultan oder sequentiell erfolgt.
Um mehrere andere Probenschichten mit dem Lichtblatt zu beleuchten, nachdem bereits vorausgehend mehrere Probenschichten untersucht wurden, kann beispielsweise die Probe relativ zu dem Lichtblatt bewegt werden. Eine solche Vorgehensweise hat den Vorteil, dass der gesamte optische Aufbau hinsichtlich Beleuchtung und Detektion, zumindest weitgehend, unverändert bleiben kann. Lediglich kann es erforderlich sein, die optische Länge des Detektionsstrahlengangs etwas anzupassen, wenn sich die Weglänge des Detektionslichts durch die Probe bis zum Austritt aus der Probe ändert.
Allerdings hat eine solche Vorgehensweise den Nachteil, dass die Probe durch das Bewegen der Probe geschädigt werden könnte. Auch kann ein Bewegen der Probe problematisch sein, wenn während der Untersuchung Instrumente, wie beispielsweise Mikroelektroden oder Mikronadeln in die Probe ragen. Insbesondere in einem solchen Fall ist es auch möglich, die Probe ortsfest zu halten und stattdessen das beleuchtende Lichtblatt relativ zur Probe zu verschieben. Darüber hinaus kann die Einstellvorrichtung dann verwendet werden, um die optische Weglänge des Detektionsstrahlenganges und/oder der einzelnen Detektionsstrahlengangzweige derart anzupassen, dass eine Fokussierung des von den einzelnen anderen Probenschichten ausgehenden Detektionslichts auf das Flächendetektorelement beziehungsweise die Flächendetektorelemente gewährleistet ist. Bei einer Ausführung, die mit besonders wenigen Detektorbauteilen auskommt, sind die Flächendetektorelemente Teile desselben Flächendetektors, der beispielsweise als CCD-Detektor oder als CMOS-Detektor oder als sCMOS-Detektor ausgebildet sein kann. Insbesondere kann hierbei vorgesehen sein, dass der Flächendetektor eine Sensorfläche aufweist, wobei unterschiedliche räumliche Anteile der Sensorfläche die unterschiedlichen Flächendetektorelemente bilden. Eine solche Ausführung bietet sich insbesondere bei einer simultanen Detektion des von den mehreren beleuchteten Probenschichten ausgehenden Detektionslichts an. Insbesondere durch Auslesen des gesamten Flächendetektors können sämtliche Informationen sämtlicher Probenschichten simultan gewonnen werden.
Alternativ ist es auch möglich, dass die Flächendetektorelemente separate Flächendetektoren sind oder zumindest Teile voneinander separater Flächendetektoren sind. Eine solche Ausführung hat den Vorteil, dass die einzelnen Flächendetektorelemente vollkommen unabhängig voneinander betrieben und ausgelesen werden können.
Die Einstellvorrichtung zum Einstellen der optischen Weglänge des Detektionsstrahlenganges beziehungsweise zum Einstellen der optischen Weglängen der Detektionsstrohlengangzweige kann auf ganz unterschiedliche Weise realisiert sein.
Beispielsweise kann vorgesehen sein, dass die Einstellvorrichtung oder ein Einstellelement der Einstellvorrichtung mehrere unterschiedliche, durchsichtige optische Bauteile, wie beispielsweise mehrere unterschiedlich lange Glasblöcke, aufweist, die im Austausch gegeneinander in den Detektionsstrahlengang oder in einen Detektionsstrahlengangzweig einfügbar sind. Durch einen Austausch eines solchen optischen Bauteils gegen ein längeres optisches Bauteil oder ein Bauteil mit einem höheren Brechungsindex kann eine Verlängerung der optischen Weglänge bewirkt werden, während durch einen Austausch eines solchen optischen Bauteils gegen ein anderes optisches Bauteil, das kürzer ausgebildet ist und/oder einen geringeren Brechungsindex aufweist, eine Verringerung der optischen Weglänge des Detektionsstrahlengangs beziehungsweise des Detektionsstrahlengangzweigs erreicht werden kann. In diesem Zusammenhang sei darauf hingewiesen, dass hier und im Folgenden das Material Glas (beispielsweise in„Glasblock") nur beispielhaft erwähnt wird. Generell können für die optischen Bauteile der Einstellvorrichtung und auch aller sonstigen verwendeten optischen Bauteile jegliche Materialien und Material kombinationen eingesetzt werden, die die erforderlichen optischen Eigenschaften zur Umsetzung der Erfindung aufweisen. Insbesondere können große Teile der verwendeten bzw. in den Figuren eingezeichneten optischen Bauteile (einschließlich der optischen Bauteile der Einstellvorrichtung) teilweise oder ganz auch aus Luft und/oder sonstigen Gasen oder Gasgemischen oder auch aus Flüssigkeiten (wie beispielsweise Wasser, Öl) bestehen. Beispielsweise können die verwendeten Spiegel als Reflexionsprismen oder alternativ auch nur als eine einfache alleinstehende Spiegelflächen ausgeprägt sein. Die verwendeten Strahlteiler können beispielsweise einfache Strahlteilerplatten oder auch Strahlteilerwürfel sein.
Es kann insbesondere vorgesehen sein, dass die Einstellvorrichtung mehrere durchsichtige optische Bauteile aufweist, die unabhängig voneinander in den Detektionsstrahlengang und/oder in einen Detektionsstrahlengangzweig einfügbar sind. Beispielsweise ist es möglich räumlich hintereinander mehrere optische Bauteile in den Detektionsstrahlengang beziehungsweise einen Detektionsstrahlengangzweig einzufügen, wobei eine Verlängerung der optischen Weglänge durch Hinzufügen eines weiteren optischen Bauteils erreichbar ist, während eine Verkürzung der optischen Weglänge durch Entfernen eines der optischen Bauteile bewirkt werden kann.
Bei einer ganz besonders vorteilhaften Ausführung, die eine zügige Einstellung der jeweiligen optischen Weglänge erlaubt und die gewährleistet, dass die optischen Bauteile stets optimal justiert sind, weist die Einstellvorrichtung oder wenigstens ein Einstellelement der Einstellvorrichtung mehrere auf einem Revolver oder auf einer Verschiebeanordnung angeordnete optische Bauteile auf. Auf diese Weise ist es ermöglicht, beispielsweise durch einfaches Drehen des Revolvers, ein optisches Bauteil in dem Detektionsstrahlengang oder in einem Detektionsstrahlengangzweig gegen ein anderes optisches Bauteil auszutauschen. Es ist auch möglich, durch einen einzigen Drehvorgang oder durch einen einzigen Verschiebevorgang simultan die optischen Bauteile mehrerer Detektionsstrahlengangzweige auszutauschen, was ein schnelles und effizientes Anpassen der optischen Weglängen mehrerer Detektionsstrahlengangzweige in einem Einstellschritt ermöglicht.
Alternativ oder zusätzlich kann ganz allgemein vorgesehen sein, dass die Einstellvorrichtung oder ein Einstellelement der Einstellvorrichtung wenigstens einen durchsichtigen Block, beispielsweise einen Glasblock, aufweist, der derart beweglich, insbesondere drehbar und/oder verschiebbar, angeordnet ist, dass der in dem Detektionsstrahlengang und/oder in einem Detektionsstrahlengangzweig befindliche Anteil des Blocks veränderbar ist.
Alternativ oder zusätzlich kann des Weiteren ganz allgemein vorgesehen sein, dass zumindest eines der Flächendetektorelemente entlang seiner auf ihn senkrecht stehenden optischen Achse unabhängig von den anderen Flächendetektorelementen so positioniert wird, dass die gewünschte optische Weglänge erreicht wird. Dabei könnte das Flächendetektorelement entweder fest in seiner Fokusposition verankert sein oder aber beweglich gehalten werden in dem Sinne, dass seine Position entlang der optischen Achse, beispielsweise mittels eines mechanischen, pneumatischen, elektrischen oder auf dem piezoelektrischen Effekt basierenden Antriebs, verstellt werden kann, um eine bestimmte Position auf der optischen Achse zu erreichen. Dieser Antrieb kann Teil der Einstellvorrichtung sein. Eine solche Verstellung könnte zwischen oder auch während einzelner Messungen bzw. Bildaufnahmen automatisiert oder auch manuell durchgeführt werden.
Bei einer ganz besonders vorteilhaften Ausführung, die insbesondere auch ein stufenloses Einstellen der optischen Weglänge des Detektionsstrahlengangs beziehungsweise eines Detektionsstrahlengangs oder mehrerer Detektionsstrahlengangzweige erlaubt, weist die Einstellvorrichtung oder ein Einstellelement der Einstellvorrichtung wenigstens ein in der geometrischen und/oder optischen Dicke einstellbares optisches Bauteil auf.
Beispielsweise kann die Einstellvorrichtung oder ein Einstellelement der Einstellvorrichtung wenigstens ein in seiner Form veränderbares optisches Bauteil aufweisen. Dieses einstellbare optische Bauteil kann insbesondere in der Weise realisiert sein, dass es ein in einem Behältnis angeordnetes Fluid, insbesondere eine Flüssigkeit, aufweist, wobei die Form des Behältnisses veränderbar ist. Auf diese Weise kann die geometrische Länge des von dem Detektionslicht durchstrahlten Teils des optischen Bauteils verändert werden. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass die Form des Gefäßes direkt verändert wird. Es ist jedoch auch möglich, die Form des optischen Bauteils dadurch zu verändern, dass auf das Fluid ein Druck ausgeübt wird, oder dadurch, dass ein Unterdruck erzeugt wird. Beispielsweise kann das einstellbare optische Bauteil zwei durchsichtige Begrenzungsscheiben aufweisen, zwischen denen ein fluides, insbesondere flüssiges, optisches Medium angeordnet ist. Durch Verändern des Abstandes der Begrenzungsscheiben kann die geometrische Dicke und damit auch die optische Dicke des einstellbaren optischen Bauteils verändert werden. Die durchsichtigen Begrenzungsscheiben können beispielsweise mit einer flexiblen elastischen, insbesondere schlauchförmigen, Folie zusammen einen Aufnahmeraum für das optische Medium bilden. Durch Beaufschlagen des Fluides mit einem Druck können die Begrenzungsscheiben auseinandergedrückt und somit die optische Weglänge vergrößert werden. Durch eine Verringerung des auf des Fluid wirkenden Drucks können die Begrenzungsscheiben aufeinander zu bewegt werden und dadurch eine Verringerung der optischen Weglänge erreicht werden.
Zur Vermeidung von störenden Mehrfachreflexionen zwischen den Grenzschichten der Strahlteiler und/oder der optischen Bauteile, kann vorteilhaft vorgesehen sein, dass wenigstens eine der Grenzschichten, insbesondere alle im Detektionsstrahlengang befindlichen Grenzschichten, unter einem von 90 Grad zur Einfallsrichtung des Detektionslichtes verschiedenen Winkel angeordnet ist und/oder dass wenigstens eine der Grenzschichten, insbesondere alle im Detektionsstrahlengang befindlichen Grenzschichten, unter einem von 90 Grad zur optischen Achse verschiedenen Winkel angeordnet sind.
Auf die Grenzschichten der Strahlteiler und/oder der optischen Bauteile können vorteilhaft Filter, beispielsweise Bandpassfilter aufgebracht, insbesondere aufgesputtert, sein. Dies beispielsweise, um eine wellenlängenspezifische Detektion zu realisieren und/oder um Licht der Anregungswellenlänge auszublenden. Bei einer ganz besonders vorteilhaften Ausführung ist wenigstens einer der Strahlteiler und/oder wenigstens eines der optischen Bauteile so ausgestaltet, dass Aberrationen vermieden oder wenigstens verringert sind und/oder dass Aberrationen zumindest kompensiert werden.
Zu diesem Zweck kann wenigstens einer der Strahlteiler und/oder wenigstens eines der optischen Bauteile wenigstens eine gekrümmte Grenzfläche, insbesondere einer asphärisch gewölbte Grenzfläche, aufweisen. Alternativ oder zusätzlich ist es beispielsweise auch möglich, dass wenigstens einer der Strahlteiler oder eines der optischen Bauteile über seinen Querschnitt einen inhomogenen Brechungsindex aufweist und so eine Linsenwirkung (GRIN-Linse) entfaltet. Alternativ oder zusätzlich ist es zu dem genannten Zweck auch möglich, dass wenigstens einer der Strahlteiler und/oder wenigstens eines der optischen Bauteile eine diffraktive Struktur aufweist.
Die effektive Brechkraft der Strahlteiler und/oder der optischen Bauteile kann in einfach zu realisierender Weise Null betragen, was so viel bedeutet wie, dass die Brennweite dieser Elemente im Unendlichen liegt. Eine effektive Brechkraft von Null bedeutet im Ergebnis außerdem, dass der Konvergenzwinkel des jeweiligen auf ein Flächendetektorelement fokussierten Detektionslichtbündels durch den jeweiligen Strahlteiler und das jeweilige optische Bauteil nicht verändert wird. Im einfachsten Fall wird eine effektive Brechkraft des Elements von Null bei Elementen, die aus einem einzigen Material bestehen, dadurch erreicht, dass die vordere und die hintere Grenzfläche eben sind.
Es ist jedoch vorteilhaft auch möglich, einen Strahlteiler und/oder ein optisches Bauteil zu verwenden, dessen Grenzflächen gekrümmt sind, wobei dennoch eine Brechkraft von Null erreicht werden kann, indem die Krümmung von dessen vorderer Grenzfläche und von dessen hinterer Grenzfläche gleich sind. Insoweit ist es auch möglich, mit einem solchen Strahlteiler und/oder einem solchen optischen Bauteil einen axialen Versatz des Fokus des Detektionslichtes zu erreichen; dies, ohne dass sich - anders als bei einer Linse - der Konvergenzwinkel des jeweiligen auf ein Flächendetektorelement fokussierten Detektionslichtbündels ändert. Bei den Grenzflächen gleicher Krümmung braucht es sich, um die beschriebene Wirkung zu erzielen, nicht notwendiger Weise um die Grenzflächen desselben Strahlteilers und/oder optischen Bauteils zu handeln. Vielmehr kann vorteilhaft auch vorgesehen sein, dass beispielsweise die erste Grenzfläche des ersten Strahlteilers, auf die das Detektionslicht trifft und die jeweils für die einzelnen Detektionsstrahlengangzweige letzte Grenzfläche entsprechend gleich gekrümmt sind. Für den Fall, dass die Brechungsindizes der genannten Elemente unterschiedlich sind, muss jedoch wenigstens ein Krümmungsradius entsprechend angepasst werden, um dieselbe Wirkung zu erzielen. Auch bei einem einstellbaren optischen Bauteil kann ein besonderer zusätzlicher axialer Versatz des Fokus des Detektionslichtes erreicht werden. Dies, auch hier ohne dass sich - anders als bei einer Linse - der Konvergenzwinkel des jeweiligen auf ein Flächendetektorelement fokussierten Detektionslichtbündels ändert. Beispielsweise kann das einstellbare optische Bauteil zwei durchsichtige, gekrümmte Begrenzungsscheiben aufweisen, zwischen denen ein fluides, insbesondere flüssiges, optisches Medium angeordnet ist. Durch Verändern des Abstandes der Begrenzungsscheiben kann die geometrische Dicke und damit auch die optische Dicke des einstellbaren optischen Bauteils verändert werden. Die durchsichtigen, gekrümmten Begrenzungsscheiben können beispielsweise mit einer flexiblen elastischen, insbesondere schlauchförmigen, Folie zusammen einen Aufnahmeraum für das optische Medium bilden. Durch Beaufschlagen des Mediums mit einem Druck können die Begrenzungsscheiben auseinandergedrückt und somit die optische Weglänge vergrößert werden. Durch eine Verringerung des auf das Medium wirkenden Drucks können die Begrenzungsscheiben aufeinander zu bewegt werden und dadurch eine Verringerung der optischen Weglänge erreicht werden. Vorzugsweise sind die beiden Begrenzungsscheiben gleichsinnig gekrümmt und weisen denselben Krümmungsradius auf. Darüber hinaus kann, unabhängig von der Krümmung der Begrenzungsschreiben, vorteilhaft vorgesehen sein, dass der Brechungsindex des fluiden Mediums an den Brechungsindex der Begrenzungsschreiben angepasst ist. Insbesondere kann vorgesehen sein, dass der Brechungsindex des Mediums derselbe ist, wie der der Begrenzungsschreiben.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann vorteilhaft ein Rastermikroskop oder ein konfokales Rastermikroskop beinhalten und/oder aus einem Rastermikroskop und/oder einem konfokalen Rastermikroskop gebildet sein. Hierbei kann insbesondere die hinsichtlich des Ablenkwinkels einstellbare Strahlablenkeinrichfung des Rastermikroskops beziehungsweise konfokalen Rastermikroskops dazu verwendet werden, ein Quasi-Lichfblatf zu erzeugen, wie es weiter oben beschrieben ist.
In der Zeichnung ist der Erfindungsgegensfand beispielhaft und schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleiche oder gleich wirkende Elemente zumeist mif denselben Bezugszeichen versehen sind. Insbesondere wurde der Übersichtlichkeit halber größtenteils darauf verzichtet, den Einfluss der unterschiedlichen Brechungsindizes der Materialien, die die Sfrahlenbündel durchlaufen, beim Einzeichnen der Sfrahlenbündel zu berücksichtigen. Der Konvergenzwinkel der eingezeichneten Sfrahlenbündel ist also in den Figuren häufig für verschiedene Materialien bzw. optische Baufeile vereinfachend identisch dargestellt. Dabei zeigen:
Fig. 1 ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichfung mif einem verzweigtem Detekfionsstrahlengang und Flächendefektorelemenfen, die Teile desselben Flächendefektors sind,
Fig. 2 ein zweites Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichfung mif einem verzweigtem Detekfionsstrahlengang und voneinander separaten Flächendetekforen,
Fig. 3 ein drittes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichfung,
Fig. 4 ein viertes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichfung,
Fig. 5 ein fünftes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichfung mif einer besonderen Einsfellvorrichtung in einer ersten Einstellung,
Fig. 6 das fünfte Ausführungsbeispiel mif einer anderen Einstellung der Einstellvorrichfung,
Fig. 7 ein sechstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichfung, Fig. 8 ein siebtes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit stufenlos einstellbaren Einstellelementen, Fig. 9 eine Illustration der Funktionsweise der stufenlos einstellbaren Einstellelemente,
Fig. 10 ein achtes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung,
Fig. 1 1 ein Ausführungsbeispiel eines mehrdimensional verzweigten Detektionsstrahlenganges
Fig. 12 ein neuntes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit Bandpassfiltern, Fig. 13 schematisch das Wirkprinzip bei Verwendung gekrümmter Grenzflächen,
Fig. 14 eine Detailansicht eines zehnten Ausführungsbeispiels, mit gekrümmten Grenzflächen, Fig. 15 ein Ausführungsbeispiel eines einstellbaren optischen Bauteil mit gekrümmten Grenzflächen und
Fig. 1 6 ein elftes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit direkter Platzierung der Detektoren in den Fokusebenen.
Fig. 1 zeigt schematisch ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung. Die Vorrichtung weist eine Lichtquelle 1 auf, die beispielsweise als Laser ausgebildet sein kann und die ein Lichtbündel 2 erzeugt. Das Lichtbündel 2 wird mit Hilfe einer Zylinderoptik 3 zu einem Lichtblatt 4 geformt, das mit einem Beleuchtungsobjektiv 5 auf eine Probe 6 fokussiert wird.
Bezogen auf die Figur steht die Lichtblattebene senkrecht zur Zeichenebene. Die Lichtblattebene ist senkrecht zur optischen Achse 7 eines Detektionsobjektivs 49 angeordnet. Das Lichtblatt 4 beleuchtet simultan mehrere Probenschichten 8, 9, 10. Das von den einzelnen Probenschichten 8, 9, 10 ausgehende Detektionslicht 1 1 wird von dem De†ek†ionsobjek†iv 49 kollimier† und von einer Tubuslinse 12 fokussiert und gelangt anschließend zu einem ersten Strahlteiler 13, der 2/3 des Detektionslichts reflektiert und 1 /3 des Detektionslichts transmittiert. Der reflektierte Anteil des Detektionslichts 1 1 gelangt zu einem weiteren Strahlteiler 15, der die Hälfte des einfallenden Lichts transmittiert und die andere Hälfte reflektiert.
Der von dem ersten Strahlteiler 13 reflektierte und von dem zweiten Strahlteiler 15 transmittierte Teil des Detektionslichts 1 1 gelangt nach Passieren eines ersten optischen Bauteils 16, das Teil einer Einstellvorrichtung 17 zum Einstellen der optischen Weglängen der Detektionsstrahlengangzweige ist, zu einem ersten Flächendetektorelement 18. Die optische Weglänge dieses Detektionsstrahlengangzweiges, an dessen Ende sich das erste Flächendetektorelement befindet, ist derart eingestellt, dass sich das erste Flächendetektorelement 18 in einer optisch korrespondierenden Ebene zu der ersten Probenschicht 8 befindet.
Der durch den ersten Strahlteiler 13 transmittierte Teil des Detektionslichts 1 1 gelangt zu einem Spiegel 14 und wird von diesem zu einem zweiten Flächendetektorelement 19 umgelenkt, das der transmittierte Anteil des Detektionslichts 1 1 nach Passieren eines zweiten optischen Bauteils 20, das ebenfalls Teil der Einstellvorrichtung 17 ist, erreicht. Das zweite Flächendetektorelement 19 ist in einer zur zweiten Probenschicht 9 optisch korrespondierenden Ebene angeordnet. Das von dem zweiten Strahlteiler 15 reflektierte Detektionslicht trifft ebenfalls auf den Spiegel 14 und wird von diesem zu einem dritten Flächendetektorelement 21 umgelenkt, wobei es ein drittes optisches Bauteil 22, das ebenfalls Teil der Einstellvorrichtung 1 7 ist, passiert. Das dritte Flächendetektorelement 21 befindet sich in einer zur dritten Probenschicht 10 optisch korrespondierenden Ebene.
Mit Hilfe der Vorrichtung kann das Detektionslicht 1 1 der unterschiedlichen Probenschichten 8, 9, 10, insbesondere simultan, mit den separaten Flächendetektorelementen 18, 19, 21 detektiert werden. Die Flächendetektorelemente 18, 19, 21 sind Teile desselben Flächendetektors. Die Vorrichtung hat den ganz besonderen Vorteil, dass gleichzeitig Bilddaten von drei Probenschichten 8, 9, 10, aufgenommen werden können. Hierbei gibt es jedoch keine Beschränkung auf lediglich drei Probenschichten. Vielmehr kann in der Praxis auch eine wesentlich höhere Anzahl von Probenschichten gleichzeitig beleuchtet und das von diesen Probenschichten ausgehende Detektionslicht, insbesondere simultan, detektiert werden.
Nachdem die Bilddaten bezüglich der beleuchteten Probenschichten 8, 9, 10, gewonnen sind, können, beispielsweise durch Verschieben des Lichtblattes 4 in Richtung der optischen Achse des Detektionsobjektives 49, weitere Probenschichten simultan beleuchtet und das von diesen weiteren Probenschichten ausgehende Detektionslicht detektiert werden. Allenfalls ist hierbei eine Anpassung der optischen Weglängen der Detektionsstrahlengangzweige nötig, was in dieser Figur nicht weiter illustriert ist.
Alternativ ist auch eine Umsetzung ohne ein erstes optisches Bauteil 16 vorstellbar. Das Einstellen der optischen Weglängen erfolgt dann allein über das zweite optische Bauteil 20 und das dritte optische Bauteil 22. Figur 2 zeigt ein zweites Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, die ähnlich aufgebaut ist, wie die in Figur 1 dargestellte Vorrichtung.
Bei diesem Ausführungsbeispiel sind das erste Flächendetektorelement 18 und das zweite Flächendetektorelement 19 und das dritte Flächendetektorelement 21 nicht Bestandteile ein und desselben Flächendetektors, sondern jeweils als separate Flächendetektoren ausgebildet. Hierbei kann es sich beispielsweise um drei CCD- Kameras handeln.
Figur 3 zeigt schematisch ein drittes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, bei dem das von der Tubuslinse 12 fokussierte Detektionslicht 1 1 von einem ersten Strahlteiler 13, der 1 /3 des Detektionslichtes transmittiert und 2/3 reflektiert, aufgespalten wird.
Der reflektierte Teil des Detektionslichtes 1 1 gelangt zu einem zweiten Strahlteiler 15, der im Verhältnis 50:50 reflektiert und transmittiert. Der von den zweiten Strahlteiler 15 †ransmi††ier†e Teil des De†ek†ionslich†es 1 1 gelangt nach Passieren eines ersten optischen Bauteils 16 zur Anpassung der optischen Weglänge zu einem ersten Flächendetektor 18. Das von dem ersten Strahlteiler 13 transmittierte Detektionslicht 1 1 gelangt nach Passieren eines zweiten optischen Bauteils 20 ohne weitere Umlenkung unmittelbar zu dem zweiten Flächendetektorelement 19, während das von dem zweiten Strahlteiler 15 reflektierte Detektionslicht 1 1 nach Passieren eines dritten optischen Bauteils 22 zu einem dritten Flächendetektorelement 21 gelangt. Auch bei dieser Vorrichtung befinden sich die Flächendetektorelemente 18, 19, 21 in Ebenen, die optisch korrespondierende Ebenen zu den Ebenen sind, in denen sich die Probenschichten 8, 9, 10 befinden.
Figur 4 zeigt ein viertes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, bei dem das von der Tubuslinse 12 fokussierte Detektionslicht 1 1 von einem ersten Strahlteiler 13, der 1 /3 des Detektionslichtes transmittiert und 2/3 reflektiert, aufgespalten wird.
Der reflektierte Teil des Detektionslichtes 1 1 gelangt zu einem zweiten Strahlteiler 15, der im Verhältnis 50:50 reflektiert und transmittiert. Der von den zweiten Strahlteiler 15 transmittierte Teil des Detektionslichtes 1 1 wird mittels eines Umlenkspiegels 23 umgelenkt, bevor es nach Passieren eines ersten optischen Bauteils 1 6, das zur Einstellung der optischen Weglänge des Detektionsstrahlengangzweigs dient zu dem ersten Flächendetektorelement 18 gelangt.
Das von dem ersten Strahlteiler 13 transmittierte Detektionslicht 1 1 gelangt nach Passieren eines dritten optischen Bauteils 22 ohne weitere Umlenkung unmittelbar zu dem dritten Flächendetektorelement 21 , während das von dem zweiten Strahlteiler 15 reflektierte Detektionslicht 1 1 nach Passieren eines zweiten optischen Bauteils 20 zu einem zweiten Flächendetektorelement 19 gelangt. Auch bei dieser Vorrichtung befinden sich die Flächendetektorelemente 18, 19, 21 in Ebenen, die optisch korrespondierende Ebenen zu den Ebenen sind, in denen sich die Probenschichten 8, 9, 10 befinden. Figur 5 zeigt schematisch ein fünftes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, das im wesentlichen Aufbau der in Figur 1 dargestellten Vorrichtung entspricht. Die Einstellvorrichtung 17 beinhaltet fünf Glasblöcke 24, 25, 26, 27, 28 die mittels einer nicht dargestellten Verschiebevorrichtung geführt und gemeinsam verschoben werden können und von denen - in Abhängigkeit von der jeweiligen Verschiebestellung - jeweils ein Glasblock 24, 25, 26, 27, 28 in einem der Detektionsstrahlengangzweige angeordnet ist.
Ausgehend von der in Figur 5 dargestellten Einstellung kann durch Verschieben der Glasblöcke 24, 25, 26, 27, 28 nach links simultan eine Verlängerung der optischen Weglängen aller Detektionsstrahlengangzweige erreicht werden, wie dies in Figur 6 dargestellt ist.
Alternativ oder zusätzlich zu einer Verschiebevorrichtung, wie sie in den Figuren 5 und 6 dargestellt ist, kann auch eine Drehvorrichtung als Bestandteil der Einstellvorrichtung 17 vorhanden sein, die mehrere unterschiedlich lange Glasblöcke 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 beinhalten kann, so dass durch Verändern der Drehstellung unterschiedliche Glasblöcke 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 in den Detektionsstrahlengangzweigen positioniert werden können, um die optischen Weglängen der Detektionsstrahlengangzweige anzupassen, was bei der in Figur 7 dargestellten Ausführung realisiert ist.
Figur 8 zeigt eine besondere Ausführungsform, die weitgehend in ihrem Grundaufbau der Ausführungsform gemäß Figur 1 entspricht. Allerdings ist in jedem der Detektionsstrahlengangzweige jeweils ein stufenlos einstellbares optisches Bauteil 39 angeordnet. Die stufenlos einstellbaren optischen Bauteile 39 können unabhängig voneinander eingestellt werden, so dass auch die optischen Weglängen der einzelnen Detektionsstrahlengangzweige unabhängig voneinander eingestellt werden können.
Die Funktionsweise der stufenlos einstellbaren optischen Bauteile 39 ist in den Figuren 9a und 9b näher illustriert. Jedes der stufenlos einstellbaren optischen Bauteile 39 weist zwei durchsichtige Begrenzungsscheiben 40 auf, die gemeinsam mit einer ringförmigen, elastischen Folie 41 einen Aufnahmeraum für ein Fluid 42 bilden. Der Abstand der durchsichtigen Begrenzungsscheiben 40 kann beispielsweise durch Verändern des Drucks auf das Fluid 42 verändert werden. Es ist alternativ oder zusätzlich auch möglich, den Abstand der durchsichtigen Begrenzungsscheiben 40 unmittelbar, beispielsweise mittels eines Stellmotors, einzustellen. Figur 10 a zeigt ein achtes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einem unverzweigten Detektionsstrahlengang.
Bei dieser Vorrichtung wird das von den unterschiedlichen Probenschichten 8, 9, 10 ausgehende Detektionslicht 1 1 nicht simultan, sondern sequentiell auf ein Flächendetektorelement 43 fokussiert. Konkret wird das von dem Detektionsobjektiv 49 kollimierte Detektionslicht 1 1 von einer Tubuslinse 12 gebündelt und anschließend von einem Umlenkspiegel 14 umgelenkt, so dass es nach Passieren eines optischen Bauteils, nämlich eines Glasblocks 44, einer Einstellvorrichtung 17, die einen Revolver 48 mit mehreren unterschiedlich langen Glasblöcken 44, 45, 46, 47 beinhaltet, zu dem Flächendetektorelement 43 gelangt. Das Flächendetektorelement 43 befindet sich in einer zu einer ersten Probenschicht 8 korrespondierenden optischen Ebene.
Nach dem Auslesen des optischen Flächendetektorelements 43 wird die Einstellvorrichtung 17 gedreht, so dass ein anderer der Glasblöcke 44, 45, 46, 47 in den Detektionsstrahlengang gelangt, der so bemessen ist, dass nun das Flächendetektorelement 43 in einer zur zweiten Probenschicht 9 optisch korrespondierenden Ebene angeordnet ist.
Nach der Detektion des von der zweiten Probenschicht 9 ausgehenden Detektionslichts 1 1 wird der Revolver 48 erneut gedreht und dadurch ein anderer der Glasblöcke 44, 45, 46, 47 in den Detektionsstrahlengang eingefügt; dies derart, dass nun das Flächendetektorelement 43 in einer Ebene angeordnet ist, die zu der Ebene der dritten Probenschicht 10 optisch korrespondiert. Figur 1 1 zeigt ein Ausführungsbeispiel eines mehrdimensional verzweigten Detektionsstrahlenganges, bei dem mehrere Flächendetektorelemente 50, 51 , 52, 53 eines Flächendetektors 54 jeweils einer von vier Probenschichten zugeordnet ist. Der besseren Übersichtlichkeit halber sind die Einstellelemente zur Anpassung der Weglängen der Detektionsstrahlengangzweige in dieser Figur nicht eingezeichnet. Die mehrdimensionale Verzweigung wird dadurch erreicht, dass das Detektionslicht 1 1 in einer ersten Teilerstufe 55 zunächst von einem ersten Strahlteiler 57 räumlich aufgespalten wird, wobei der transmittierte Teil des Detektionslichtes 1 1 von einem ersten Umlenkspiegel 58 umgelenkt wird.
Anschließend erfolgt in einer zweiten Teilerstufe 56 eine weitere Aufspaltung sowohl des transmittierten Teils des Detektionslichtes 1 1 , als auch des reflektierten Teils, wobei die zweiten Strahlteiler 59, 60 und die zweiten Umlenkspiegel 61 , 62 der zweiten Teilerstufe 56 bezogen auf die jeweilige optische Achse und relativ zu dem ersten Strahlteiler 57 und dem ersten Umlenkspiegel 58 um 90 Grad gedreht orientiert sind.
Die Ausführungsbeispiele, die in den Figuren 1 bis 16b dargestellt sind, weisen Grenzflächen auf, die senkrecht zur Einfallsrichtung des einfallenden Lichtes ausgerichtet sind und/oder die zueinander planparallel sind. Dies muss jedoch nicht zwingend so realisiert sein.
Beispielsweise zur Vermeidung von störenden Mehrfachreflexionen zwischen den Grenzschichten der Strahlteiler 13, 15, 57, 59, 60 und/oder der optischen Bauteile 1 6, 20, 22, 24 bis 38 kann vorteilhaft vorgesehen sein, dass wenigstens eine der Grenzflächen unter einem von 90 Grad zur Einfallsrichtung des Detektionslichtes verschiedenen Winkel angeordnet ist und/oder dass wenigstens eine der Grenzflächen, insbesondere alle im Detektionsstrahlengang befindlichen Grenzflächen, unter einem von 90 Grad zur optischen Achse verschiedenen Winkel angeordnet sind. Insbesondere kann - alternativ oder zusätzlich - vorteilhaft vorgesehen sein, dass entlang des Detektionsstrahlengangs wenigstens unmittelbar nacheinander folgende Grenzflächen nicht parallel zueinander ausgerichtet sind.
Des Weiteren kann auf wenigstens eine der Grenzflächen ein Filter, insbesondere ein Bandpassfilter aufgebracht, insbesondere aufgesputtert, sein. Figur 12 illustriert ein Ausführungsbeispiel, das im Wesentlichen dem Ausführungsbeispiel gemäß Figur 2 entspricht, wobei jedoch exemplarisch auf das erste optische Bauteil 1 6, das zweite optische Bauteil 20 und das dritte optische Bauteil 22 jeweils ein Bandpassfilter 63 aufgebracht ist. Diese Bandpassfilter 63 können beispielsweise zur wellenlängenspezifischen Detektion und insbesondere dazu dienen, das Licht einer Anregungswellenlänge des Lichtblattes 4 zu unterdrücken. Die Bandpassfilter 63 können gleichartig ausgebildet sein. Es ist jedoch auch möglich, dass die Bandpassfilter 63 hinsichtlich des Wellenlängenbereichs des transmittierten Lichtes unterschiedlich ausgebildet sind, beispielsweise um mit den Flächendetektorelementen 1 8, 1 9, 21 Licht unterschiedlicher Wellenlängenbereiche detektieren zu können. Es ist auch möglich, die Bandpassfilter 63 auf die jeweils andere Grenzfläche des ersten optischen Bauteils 1 6, des zweiten optischen Bauteils 20 und des dritten optischen Bauteils 22 aufzubringen. Alternativ könnten die Bandpassfilter auch an anderer Stelle an einem der Strahlteiler 13, 15, 57, 59, 60 und/oder einem der optischen Bauteile 1 6, 20, 22, 24 bis 38 in den sich nicht überlappenden Teilen der Detektionsstrahlengangzweige angeordnet sein.
Darüber hinaus sei darauf hingewiesen, dass die Strahlteiler 1 3, 1 5, 57, 59, 60 und/oder die optischen Bauteile 1 6, 20, 22, 24 bis 38 nicht aus demselben Material hergestellt zu sein brauchen, aber können. Insbesondere können vorteilhaft auch unterschiedliche Materialien eingesetzt sein. Auch wenn aneinander grenzende Elemente aus demselben Material gefertigt sind, müssen diese Elemente nicht notwendigerweise gemeinsam einstückig hergestellt sein. Jedoch ist dies durchaus möglich und bei manchen Anwendungsfällen besonders vorteilhaft.
In ganz besonders vorteilhafter Weise kann wenigstens einer der Strahlteiler 13, 1 5, 57, 59, 60 und/oder wenigstens eines der optischen Bauteile 1 6, 20, 22, 24 bis 38 so ausgestaltet sein, dass Aberrationen vermieden oder wenigstens verringert, und/oder kompensiert werden. Zu diesem Zweck kann wenigstens einer der Strahlteiler 1 3, 15, 57, 59, 60 und/oder wenigstens eines der optischen Bauteile 1 6, 20, 22, 24 bis 38 beispielsweise wenigstens eine gekrümmte Grenzfläche, insbesondere einer asphärisch gewölbte Grenzfläche, aufweisen. Alternativ oder zusätzlich ist es beispielsweise auch möglich, dass wenigstens einer der Strahlteiler 1 3, 1 5, 57, 59, 60 und/oder wenigstens ein optisches Bauteil 1 6, 20, 22, 24 bis 38 über seinen Querschnitt einen inhomogenen Brechungsindex aufweist (und so eine Linsenwirkung (GRIN-Linse) entfaltet) und/oder aus mehreren Elementen mit verschiedenen optischen Eigenschaften zusammengesetzt ist.
Alternativ oder zusätzlich ist es zu dem genannten Zweck auch möglich, dass wenigstens einer der Strahlteiler 13, 1 5, 57, 59, 60 und/oder wenigstens eines der optischen Bauteile 16, 20, 22, 24 bis 38 eine diffraktive Struktur aufweist.
Die Ausführungsbeispiele, die in den Figuren 1 bis 12 und 16a, 1 6b dargestellt sind, weisen Strahlteiler 13, 15, 57, 59, 60 und optischen Bauteile 16, 20, 22, 24 bis 38 auf, deren effektive Brechkraft Null beträgt; oder anders ausgedrückt, die Brennweite dieser Elemente liegt im Unendlichen. Eine effektive Brechkraft von Null bedeutet im Ergebnis, dass der Konvergenzwinkel ß des jeweiligen auf ein Flächendetektorelement fokussierten Detektionslichtbündels durch den jeweiligen Strahlteiler 13, 15, 57, 59, 60 und das jeweilige optische Bauteil 1 6, 20, 22, 24 bis 38 nicht verändert wird. Im einfachsten Fall wird eine effektive Brechkraft des Elements von Null bei Elementen, die aus einem einzigen Material bestehen, dadurch erreicht, dass die vordere und die hintere Grenzfläche eben sind.
Es ist jedoch vorteilhaft auch möglich, einen Strahlteiler 13, 15, 57, 59, 60 und/oder ein optisches Bauteil 16, 20, 22, 24 bis 38 (in der Fig. 13 allgemein durch das optische System X symbolisiert) zu verwenden, dessen Grenzflächen gekrümmt sind, wobei dennoch eine Brechkraft von Null erreicht werden kann, indem die Krümmung der vorderen Grenzfläche 64 und der hinteren Grenzfläche 65 gleich sind, wie dies beispielhaft und ganz schematisch in Fig. 13 illustriert ist. Insoweit ist es auch möglich, mit einem solchen Strahlteiler 13, 15, 57, 59, 60 und/oder einem optischen Bauteil 1 6, 20, 22, 24 bis 38 einen axialen Versatz des Fokus des Detektionslichtes 1 1 zu erreichen, wie dies schematisch in Fig. 13 dargestellt ist. Dies, ohne dass sich - anders als bei einer Linse - der Konvergenzwinkel ß des jeweiligen auf ein Flächendetektorelement fokussierten Detektionslichtbündels ändert. Es gilt folglich: ß = ß'.
Bei den Grenzflächen gleicher Krümmung braucht es sich, um die beschriebene Wirkung zu erzielen, nicht notwendiger Weise um die Grenzflächen desselben Strahlteilers 13, 15, 57, 59, 60 und/oder optischen Bauteils 1 6, 20, 22, 24 bis 38 zu handeln. Vielmehr kann vorteilhaft auch vorgesehen sein, dass beispielsweise die erste Grenzfläche 66 des ersten Strahlteilers 13, auf die das Detektionslicht 1 1 trifft, und die jeweils für die einzelnen Detektionsstrahlengangzweige letzte Grenzfläche 67, 68, 69 entsprechend gleich (vorausgesetzt sie weisen denselben Brechungsindex auf) gekrümmt sind.
Fig. 14 zeigt eine Detailansicht eines zehnten Ausführungsbeispiels, bei dem die erste Grenzfläche 66 des ersten Strahlteilers 13, auf die das Detektionslicht 1 1 trifft, konvex gekrümmt ist, während die jeweils für die einzelnen Detektionsstrahlengangzweige letzte Grenzfläche 67, 68, 69 konkav gekrümmt ist. Ansonsten entspricht das Ausführungsbeispiel im Wesentlichen dem in Figur 1 dargestellten Ausführungsbeispiel.
Auch bei einem einstellbaren optischen Bauteil kann ein besonderer zusätzlicher axialer Versatz des Fokus des Detektionslichtes 1 1 erreicht werden. Dies, auch ohne dass sich - anders als bei einer Linse - der Konvergenzwinkel ß des jeweiligen auf ein Flächendetektorelement fokussierten Detektionslichtbündels ändert. Das in den Figuren 15a und 15b gezeigte Ausführungsbeispiel entspricht im Wesentlichen dem in den Figuren 9a und 9b gezeigten Ausführungsbeispiel, wobei jedoch die Begrenzungsscheiben 40 zu dem genannten Zweck nicht eben, sondern (beide mit denselben Krümmungsradius) gekrümmt ausgeführt sind.
Fig. 1 6a zeigt ein elftes Ausführungsbeispiel, bei dem die drei Flächendetektorelemente 18, 19, 21 entlang ihrer auf ihnen senkrecht stehenden optischen Achse verschoben werden können, derart, dass die drei Flächendetektorelemente in der jeweils optimalen Fokusposition liegen. Dabei könnten die drei Flächendetektorelemente entweder fest in ihrer jeweiligen Fokusposition verankert sein oder aber beweglich gehalten werden in dem Sinne, dass ihre Position entlang der optischen Achse beispielsweise mittels eines mechanischen, pneumatischen, elektrischen oder auf dem piezoelektrischen Effekt basierenden Antrieb, verstellt werden kann, um eine bestimmte Position auf der optischen Achse zu erreichen. In der in Fig. 1 6b gezeigten Anordnung wurde die Anordnung aus Fig. 1 6a äquivalent zu den vorherigen Ausführungsbeispielen um drei optische Bauteile 1 6, 20, 22, die Teil einer Einstellvorrichtung 17 zum Einstellen der optischen Weglängen der Detektionsstrahlengangzweige sind, erweitert, derart, dass vor jedem Flächendetektorelement ein optisches Bauteil zum Zwecke einer Feineinstellung der Fokuslage auf dem jeweils zugehörigen Flächendetektorelement angeordnet ist. Dies kann erfindungsgemäß auf jedem der bisher oben beschriebenen Wege erreicht werden, beispielsweise durch die Verwendung geeigneter Glasblöcke und/oder durch Verwendung eines in seiner Dicke veränderlichen optischen Bauteils 16, 20, 22.

Claims

Ansprüche
Verfahren zur SPIM-Unfersuchung einer Probe (6), bei dem mehrere Probenschichfen (8, 9, 10) simultan mit einem einzigen Lichtblatt (4) beleuchtet werden und bei dem das von den einzelnen Probenschichten (8, 9, 10) ausgehende Detektionslicht (1 1 ) in einem Detektionsstrahlengang zeitlich separat und/oder räumlich separat voneinander detektiert wird, wobei der Detektionsstrahlengang mit Hilfe von Strahlteilern verzweigt ist und wobei die effektive Brechkraft der einzelnen Strahlteiler Null beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass a. das von den unterschiedlichen Probenschichten (8, 9, 10) ausgehende Detektionslicht (1 1 ) räumlich getrennt, insbesondere simultan, auf separate Flächendetektorelemente (18, 19, 21 , 43, 50, 51 , 52, 53) fokussiert wird und/oder dass b. das Detektionslicht (1 1 ) der unterschiedlichen Probenschichten (8, 9, 10), insbesondere simultan, mit mehreren separaten Flächendetektorelementen (18, 19, 21 , 43, 50, 51 , 52, 53) detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektionsstrahlengang verzweigt ist und mehrere
Detektionsstrahlengangzweige mit jeweils wenigstens einem Flächendetektorelement (18, 19, 21 , 43, 50, 51 , 52, 53) aufweist.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die optischen Weglängen der Detektionsstrahlengangzweige zum Abbilden der Probenschichten (8, 9, 10) auf die Flächendetektorelemente (18, 19, 21 , 43, 50, 51 , 52, 53) dadurch eingestellt werden können, dass die Flächendetektorelemente entlang ihrer optischen Achse bewegt werden können.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die optischen Weglängen der Detektionsstrahlengangzweige zum Abbilden der Probenschichten (8, 9, 10) auf die Flächendetektorelemente (18, 19, 21 , 43, 50, 51 , 52, 53) mit einer Einstellvorrichtung (17) derart eingestellt werden, dass das von einer Probenschicht (8, 9, 10) ausgehende Detektionslicht (1 1 ) auf ein erstes Flächendetektorelement (18) eines ersten
Detektionsstrohlengangzweigs fokussiert ist und dass das von einer anderen Probenschicht ausgehende Detektionslicht (1 1 ) auf ein zweites Flächendetektorelement (19) eines zweiten Detektionsstrahlengangzweigs fokussiert ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass a. die optische Weglänge eines ersten Detektionsstrahlengangzweigs und die optische Weglänge eines zweiten Detektionsstrahlengangzweigs unabhängig voneinander eingestellt werden und/oder einstellbar sind, und/oder dass b. die Einstellvorrichtung (17) mehrere Einstellelemente umfasst und jeder Detektionsstrahlengangzweig ein eigenes Einstellelement aufweist, mit dem die optische Weglänge des jeweiligen Detektionsstrahlengangzweigs eingestellt wird und/oder einstellbar ist, und/oder dass c. die Einstellvorrichtung (1 7) wenigstens ein Einstellelement aufweist, mit dem die optische Weglängen wenigstens zweier Detektionsstrahlengangzweige gleichzeitig verändert werden und/oder veränderbar sind und/oder dass d. die optische Weglängen eines ersten Detektionsstrahlengangzweigs und die eines zweiten Detektionsstrahlengangzweigs unterschiedlich sind.
7. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das von den unterschiedlichen Probenschichten (8, 9, 10) ausgehende Detektionslicht (1 1 ) zeitlich nacheinander auf dasselbe Flächendetektorelement (43) fokussiert wird. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass a. das von einer der Probenschichten (8, 9, 10) ausgehende und durch ein Detektionsobjektiv (49) tretende Detektionslicht (1 1 ) auf einem Detektionsstrahlengang geführt wird, dessen optische Weglänge mittels einer Einstellvorrichtung (17) derart eingestellt wird, dass das von dieser Probenschicht ausgehende Detektionslicht (1 1 ) auf das Flächendetektorelement fokussier† ist, wobei das Flächendetektorelement zur Gewinnung von Bilddaten dieser Probenschicht bei dieser Einstellung der Weglänge ausgelesen wird, und dass b. zeitlich danach die optische Weglänge des Detektionsstrahlenganges mittels der Einstellvorrichtung (1 7) derart eingestellt wird, dass das von einer anderen der Probenschichten (8, 9, 10) ausgehende Detektionslicht (1 1 ) auf das Flächendetektorelement fokussiert ist, wobei das Flächendetektorelement zur Gewinnung von Bilddaten der anderen Probenschicht bei der anderen Einstellung der optischen Weglänge erneut ausgelesen wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass a. die Probenschichten (8, 9, 10) parallel zueinander ausgerichtet sind und/oder dass b. ein Stapel einer Vielzahl parallel zueinander ausgerichteter Probenschichten (8, 9, 10) simultan oder sequentiell beleuchtet und abgebildet wird, und/oder dass c. die Probenschichten (8, 9, 10) senkrecht zur optischen Achse des Detektionsobjektivs ausgerichtet sind, und/oder dass d. die Probenschichten (8, 9, 10) voneinander beabstandet sind und/oder dass e. die Probenschichten (8, 9, 10) voneinander beabstandet sind und einen Abstand voneinander aufweisen, der größer ist, als das optische Auflösungsvermögen der verwendeten Detektionsanordnung.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass a. das Lichtblatt (4) als Quasi-Lichtblatt ausgebildet ist, das durch Hin-und- Her-Wedeln eines Beleuchtungslichtbündels erzeugt wird, und/oder dass b. die Lichtblattebene senkrecht zur optischen Achse des Detektionsobjektivs (49) ausgerichtet ist, und/oder dass c. das Lichtblatt (4) derart gelenkt wird, dass es in einem von Null Grad verschiedenen Winkel zur optischen Achse des Detektionsobjektivs (49) auf die Probe (6) trifft und/oder durch die Probe (6) verläuft, und/oder dass d. das Lichtblatt (4) derart gelenkt wird, dass es senkrecht zur optischen Achse des Detektionsobjektivs (49) auf die Probe (6) trifft und/oder durch die Probe (6) verläuft, und/oder dass e. das Lichtblatt (4) in Richtung der optischen Achse des Detektionsobjektivs (49) eine Ausdehnung aufweist, die größer ist, als der Schärfentiefenbereich der Detektionsanordnung, die das Detektionsobjektiv und den Detektionsstrahlgang umfasst.
1 1 . Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass nach einer Detektion des von den mehreren Probenschichten (8, 9, 10) ausgehenden Detektionslichtes (1 1 ) weitere mehrere Probenschichten (8, 9, 10) beleuchtet werden und das von diesen weiteren Probenschichten ausgehende Detektionslicht (1 1 ) detektiert wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass a. simultan oder sequentiell Bilddaten bezüglich der mehreren Probenschichten (8, 9, 10) und/oder weiterer mehrerer Probenschichten erzeugt werden, wobei die Probe (6) stets ortsfest bleibt, und/oder dass b. simultan oder sequentiell Bilddaten bezüglich der mehreren Probenschichten (8, 9, 10) und/oder weiterer mehrerer erzeugt werden, wobei die Probe (6) und das Detektionsobjektiv stets ortsfest bleiben, und/oder dass c. simultan oder sequentiell Bilddaten bezüglich der mehreren Probenschichten (8, 9, 10) und/oder weiterer mehrerer erzeugt werden, wobei die Probe (6), das Detektionsobjektiv und das Flächendetektorelement, insbesondere sämtliche Flächendetektorelemente (18, 19, 21 , 43, 50, 51 , 52, 53), stets ortsfest bleiben, und/oder dass d. die Probe (6) während des Einstellens der Einstellvorrichtung ( 1 7) ortsfest bleibt und/oder dass e. die Probe (6) und das Detektionsobjektiv während des Einstellens der Einstellvorrichtung ( 1 7) ortsfest bleiben und/oder dass f. die Probe (6), das Detektionsobjektiv und das Flächendetektorelement, insbesondere sämtliche Flächendetektorelemente ( 18, 19, 21 , 43, 50, 51 , 52, 53), während des Einstellens der Einstellvorrichtung ( 1 7) ortsfest bleiben, und/oder dass g. die geometrische Weglänge wenigstens eines Detektionsstrahlengangzweigs während des Einstellens der optischen
Weglänge des Detektionsstrahlengangzweigs konstant bleibt, und/oder dass h. die geometrische Weglänge des Detektionsstrahlenganges während des Einstellens der optischen Weglänge des Detektionsstrahlenganges konstant bleibt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 1 2, dadurch gekennzeichnet, dass a. die Flächendetektorelemente ( 18, 19, 21 , 43, 50, 51 , 52, 53) Teile desselben Flächendetektors sind oder dass b. die Flächendetektorelemente ( 18, 1 9, 21 , 43, 50, 51 , 52, 53) separate Flächendetektoren sind oder zumindest Teile voneinander separater
Flächendetektoren sind.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren unter Verwendung eines Rastermikroskops und/oder eines konfokalen Rastermikroskops durchgeführt wird. 15. Vorrichtung zum Ausführen eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 1 4.
1 6. Vorrichtung zur SPIM-Untersuchung einer Probe (6), aufweisend eine Beleuchtungsvorrichtung zum Erzeugen eines Lichtblattes und eine Detektionsanordnung, die ein Detektionsobjektiv (49) und einen De†ek†ionss†rahlgang umfass†, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungsvorrichtung mehrere Probenschichten (8, 9, 10) einer zu untersuchenden Probe (6) simultan mit dem Lichtblatt (4) beleuchtet und die Detektionsanordnung das von den einzelnen Probenschichten (8, 9, 10) ausgehende Detektionslicht (1 1 ) in dem Detektionsstrahlengang zeitlich separat und/oder räumlich separat voneinander detektiert, wobei der Detektionsstrahlengang mit Hilfe von Strahlteilern verzweigt ist und wobei die effektive Brechkraft der einzelnen Strahlteiler Null beträgt.
17. Vorrichtung nach Anspruch 15 oder 1 6, dadurch gekennzeichnet, dass a. das von unterschiedlichen Probenschichten (8, 9, 10) ausgehende Detektionslicht (1 1 ) räumlich getrennt, insbesondere simultan, auf unterschiedliche Flächendetektorelemente (18, 19, 21 , 43, 50, 51 , 52, 53) fokussiert ist und/oder dass b. die Detektionsanordnung das Detektionslicht (1 1 ) mehrerer unterschiedlicher Probenschichten (8, 9, 10), insbesondere simultan, mit mehreren unterschiedlichen Flächendetektorelementen detektiert.
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 1 7, dadurch gekennzeichnet, dass a. der Detektionsstrahlengang verzweigt ist und mehrere Detektionsstrahlengangzweige mit jeweils wenigstens einem Flächendetektorelement (18, 19, 21 , 43, 50, 51 , 52, 53) aufweist, und/oder dass b. zum simultanen Abbilden mehrerer Probenschichten (8, 9, 10) die optischen Weglängen der Detektionsstrahlengangzweige derart eingestellt sind, dass das von einer Probenschicht ausgehende Detektionslicht (1 1 ) auf ein erstes Flächendetektorelement (18, 19, 21 , 43, 50, 51 , 52, 53) eines ersten Detektionsstrahlengangzweigs fokussiert ist und dass das von einer anderen Probenschicht ausgehende Detektionslicht (1 1 ) auf ein zweites Flächendetektorelement (18, 19, 21 , 43, 50, 51 , 52, 53) eines zweiten Detektionsstrahlengangzweigs fokussiert ist.
19. Vorrichtung nach Anspruch 15 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung eine Einsteilvorrichtung (17) zum Einstellen der optischen Weglänge des Detektionsstrahlenganges oder wenigstens eines der Detektionsstrahlengangzweige aufweist. 20. Vorrichtung nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass a. die optische Weglängen eines ersten Detektionsstrahlengangzweigs und die eines zweiten Detektionsstrahlengangzweigs unabhängig voneinander einstellbar sind, und/oder dass b. die Einstellvorrichtung (17) mehrere Einstellelemente umfasst und jeder Detektionsstrahlengangzweigs ein eigenes Einstellelement aufweist, mit dem die optische Weglänge des Detektionsstrahlengangzweigs eingestellt wird und/oder einstellbar ist, und/oder dass c. die Einstellvorrichtung (1 7) wenigstens ein Einstellelement aufweist, mit dem die optische Weglängen wenigstens zweier Detektionsstrahlengangzweige gleichzeitig veränderbar sind und/oder dass d. die optische Weglängen eines ersten Detektionsstrahlengangzweigs und die eines zweiten Detektionsstrahlengangzweigs unterschiedlich sind.
21 . Vorrichtung nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass eine Einstellvorrichtung (17) vorhanden ist mit der die optische Weglänge des Detektionsstrahlenganges, insbesondere die optische Weglänge von dem
Detektionsobjektiv (49) zu einem Flächendetektorelement (18, 19, 21 , 43, 50, 51 , 52, 53), wahlweise derart einstellbar ist, dass entweder das von einer ersten der Probenschichten (8, 9, 10) ausgehende Detektionslicht (1 1 ) oder das von einer zweiten der Probenschichten (8, 9, 10) ausgehende Detektionslicht (1 1 ) auf das Flächendetektorelement (18, 19, 21 , 43, 50, 51 , 52, 53) fokussiert ist.
22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass a. simultan oder sequentiell Bilddaten bezüglich der mehreren Probenschichten (8, 9, 10) und/oder weiterer mehrerer Probenschichten erzeugbar sind, wobei die Probe (6) stets ortsfest bleibt, und/oder dass b. simultan oder sequentiell Bilddaten bezüglich der mehreren Probenschichten (8, 9, 10) und/oder weiterer mehrerer Probenschichten erzeugbar sind, wobei die Probe (6) und das Detektionsobjektiv (49) stets ortsfest bleiben, und/oder dass c. simultan oder sequentiell Bilddaten bezüglich der mehreren Probenschichten (8, 9, 10) und/oder weiterer mehrerer Probenschichten erzeugbar sind, wobei die Probe (6), das Detektionsobjektiv (49) und das Flächendetektorelement, insbesondere sämtliche Flächendetektorelemente (18, 19, 21 , 43, 50, 51 , 52, 53), stets ortsfest bleiben, und/oder dass d. die Einstellvorrichtung (17) derart ausgebildet und angeordnet ist, dass die Probe (6) und/oder das Detektionsobjektiv (49) und/oder das Flächendetektorelement, insbesondere sämtliche Flächendetektorelemente (18, 19, 21 , 43, 50, 51 , 52, 53), während des Einstellens der optischen Weglänge ortsfest bleiben, und/oder dass e. die Einstellvorrichtung (17) derart ausgebildet und angeordnet ist, dass die geometrische Weglänge des Detektionsstrahlenganges und/oder wenigstens eines Detektionsstrahlengangzweigs während des Einstellens der optischen Weglänge konstant bleibt.
23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass a. die Einstellvorrichtung (17) oder ein Einstellelement der Einstellvorrichtung (17) mehrere unterschiedliche durchsichtige optische Bauteile aufweist, die im Austausch gegeneinander in den Detektionsstrahlengang und/oder in einen Detektionsstrahlengangzweig einfügbar sind, und/oder dass b. die Einstellvorrichtung (17) oder ein Einstellelement der Einstellvorrichtung (17) mehrere durchsichtige optische Bauteile aufweist, die unabhängig voneinander in den Detektionsstrahlengang und/oder in einen Detektionsstrahlengangzweig einfügbar sind, und/oder dass c. die Einstellvorrichtung (17) oder ein Einstellelement der Einstellvorrichtung (17) mehrere auf einem Revolver oder auf einer Verschiebeanordnung angeordnete, durchsichtige optische Bauteile aufweist, und/oder dass d. die Einstellvorrichtung (17) oder ein Einstellelement der Einstellvorrichtung (17) wenigstens einen durchsichtigen Block aufweist der derart beweglich, insbesondere drehbar und/oder verschiebbar, angeordnet ist, das der in dem Detektionsstrahlengang und/oder in einem Detektionsstrahlengangzweig befindliche Anteil des Blocks veränderbar ist, und/oder dass e. die Einstellvorrichtung (17) oder ein Einstellelement der Einstellvorrichtung (1 7) wenigstens ein durchsichtiges optische Bauteil aufweist, das als Festkörperblock ausgebildet ist, und/oder dass f. die Einstellvorrichtung (17) oder ein Einstellelement der Einstellvorrichtung (17) wenigstens ein durchsichtiges optische Bauteil mit wenigstens einer gekrümmten Grenzfläche, insbesondere mit zwei gleichsinnig und/oder mit demselben Krümmungsradius gekrümmten Grenzflächen, aufweist.
24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass a. die Einstellvorrichtung (17) oder ein Einstellelement der Einstellvorrichtung (17) wenigstens ein in der geometrischen und/oder optischen Dicke einstellbares optisches Bauteil aufweist, und/oder dass b. die Einstellvorrichtung (17) oder ein Einstellelement der Einstellvorrichtung (17) wenigstens ein in seiner Form veränderbares optisches Bauteil aufweist, und/oder dass c. die Einstellvorrichtung (17) oder ein Einstellelement der Einstellvorrichtung (17) wenigstens ein in seiner Form veränderbares Gefäß aufweist, das mit einem Fluid (42) gefüllt ist, und/oder dass d. die Einstellvorrichtung (17) oder ein Einstellelement der Einstellvorrichtung (17) wenigstens ein einstellbares optisches Bauteil mit zwei durchsichtigen Begrenzungsscheiben aufweist, deren Abstand einstellbar ist und zwischen denen ein fluides, insbesondere flüssiges, optisches Medium angeordnet ist, und/oder dass e. die Einstellvorrichtung (17) oder ein Einstellelement der Einstellvorrichtung (17) wenigstens ein einstellbares optisches Bauteil mit zwei durchsichtigen, insbesondere gleichsinnig und/oder mit demselben Krümmungsradius, gekrümmten Begrenzungsscheiben aufweist, deren Abstand einstellbar ist und zwischen denen ein fluides, insbesondere flüssiges, optisches Medium angeordnet ist, und/oder dass f. die Einstellvorrichtung (17) oder ein Einstellelement der Einstellvorrichtung (17) wenigstens ein einstellbares optisches Bauteil mit zwei durchsichtigen Begrenzungsscheiben (40) aufweist, deren Abstand einstellbar ist und zwischen denen ein fluides, insbesondere flüssiges, optisches Medium angeordnet ist, wobei eine flexible, insbesondere elastische, Folie (41 ) zusammen mit den Begrenzungsscheiben (40) einen Aufnahmeraum für das optische Medium umschließt.
25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass a. das Lichtblatt (4) als Quasi-Lichtblatt ausgebildet ist, das Hin-und-Her- Wedeln eines, insbesondere im Querschnitt runden, Beleuchtungslichtbündels erzeugt wird, und/oder dass b. die Lichtblattebene senkrecht zur optischen Achse des Detektionsobjektivs (49) ausgerichtet ist, und/oder dass c. das Lichtblatt (4) derart gelenkt wird, dass es in einem von Null Grad verschiedenen Winkel zur optischen Achse des Detektionsobjektivs (49) auf die Probe (6) trifft, und/oder dass d. das Lichtblatt (4) derart gelenkt wird, dass es senkrecht zur optischen Achse des Detektionsobjektivs (49) auf die Probe (6) trifft, und/oder dass e. das Lichtblatt (4) in Richtung der optischen Achse des Detektionsobjektivs (49) eine Ausdehnung aufweist, die größer ist, als der Schärfentiefenbereich der Detektionsanordnung, die das Detektionsobjektiv und den Detektionsstrahlgang umfasst.
26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass a. die Flächendetektorelemente (18, 19, 21 , 43, 50, 51 , 52, 53) Teile desselben Flächendetektors sind oder dass b. die Flächendetektorelemente (18, 19, 21 , 43, 50, 51 , 52, 53) Teile voneinander separater Flächendetektoren sind.
27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ein Rastermikroskop und/oder ein konfokales Rastermikroskop beinhaltet und/oder aus einem Rastermikroskop und/oder einem konfokalen Rastermikroskop gebildet ist.
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