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Die Erfindung betrifft einen optischer Strahlteilerzum Einsatz im Strahlengang eines Lichtmikroskops, zur Darstellung mehrerer Fokusebenen eines Objekts auf einem optischen Detektor. Des Weiteren betrifft die Erfindung einen Bausatz zum Aufbau eines derartigen optischen Strahlteilers. Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Lichtmikroskop mit einem Strahlengang für den Probenstrahl, einem vom Probenstrahl beaufschlagten optischen Detektor und einem in dem Probenstrahl vor dem optischen Detektor angeordneten ebensolchen optischen Strahlteiler.
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Zur simultanen Aufnahme von verschiedenen Fokusebenen eines Objektes wird derzeit das physikalische Phänomen der Beugung wie auch der Reflexion genutzt. Ein Beugungsverfahren ist beispielsweise aus P. M. Blanchard, and A. H. Greenaway, Simultaneous multi-plane imaging with a distorted diffraction grating, Applied Optics, 38(32): p. 6692-9, (1999) bekannt. In dem Verfahren werden über Beugungsgitter Bilder mit unterschiedlichen Fokusebenen simultan in Abhängigkeit der Beugungsordnung aufgenommen. Mit Hilfe eines Beugungsgitters lässt sich der einkommende Lichtstrahl in die Maxima des Interferenzmusters aufteilen. Die Brechkraft des Gitters ist über denfolgenden Zusammenhang gegeben: fBeugung(λ) ~ 1 / (Anzahl der Schlitze·Beugungsordung·Wellenlänge)
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Die Fokusebenen sind jedoch abhängig von der Wellenlänge und auf ein begrenztes „Field of View“ (FOV) festgelegt. Dies schränkt die Nutzbarkeit stark ein.
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Die
WO 2009/146016 A1 zeigt ein Verfahren zur simultanen Aufnahme zweier Fokusebenen, bei dem über einen Strahlteiler der einfallende Strahl in zwei Teile aufgeteilt wird. Beide Teilstrahlen fallen auf einen CCD-Chip. Ein Teilstrahl wird im Strahlteiler umgelenkt und von einen Spiegel auf den CCD-Chip reflektiert. Die Teilstrahlen werden somit über Wegstrecken unterschiedlicher Länge auf den CCD-Chip gelenkt. Durch die unterschiedliche optische Weglänge können zwei Fokusebenen nebeneinander mit einem CCD-Chip aufgenommen werden.
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Für eine vollständige Aufnahme eines 3D-Datensatzes müssen jedoch mehrere Fokusebenen aufgenommen werden, was mit dargestellten Verfahren nicht möglich ist. Der optische Aufbau ist außerdem speziell auf das in der
WO 2009/146016 A1 dargestellte Mikroskopsystem abgestimmt und kann nicht ohne Aufwand an einem weiteren Mikroskope verwendet werden. Dies macht das Verfahren wenig flexibel, eine einfache Erweiterung verschiedener Standard-Mikroskope zu einem 3D-Mikroskop ist mit diesem Verfahren nicht durchführbar. Zudem ist der Aufbau nicht variabel, es ist nicht möglich, die Anzahl der Fokusebenen je nach Fragestellung zu verändern.
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Zudem sind die auf dem Array der Kamera abgebildeten Fokusebenen gegen die optische Achse verkippt, was in einer Fokusvariation in einer Richtung über dem Bildfeld resultiert. Dies führt zu einer Variation der „Point Spread Function“ (PSF). Eine saubere Rekonstruktion der 3D-Bilder über die gängigen Entfaltungsverfahren ist damit nicht mehr möglich.
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Der
WO 2009/146016 A1 ist noch ein alternatives Verfahren zu entnehmen, in welchem anstelle des Strahlteilers ein halbdurchlässiger Spiegel verwendet wird. Damit können die Autoren das Problem der Verkippung lösen, jedoch eignet sich das Verfahren kaum für die Aufnahme von mehr als 2 Ebenen. So müsste mit dem dargestellten Verfahren bereits bei der Verwendung von 4 Fokalebenen
6 Spiegel zueinander justiert werden.
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Der hierfür erforderliche optische Aufbau wäre somit sehr komplex und ist nicht mehr für jeden beliebigen Anwender geeignet. Ein kompakter Aufbau ist mit der Kombination von einem Strahlteiler mit einem Spiegel bzw. zwei Spiegeln kaum möglich.
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In dem von der
WO 2009/146016 A1 gezeigten Aufbau können die verschiedenen Fokalebenen zudem nur über die unterschiedlichen Weglängen erreicht werden.
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Die Verschiebung der Fokalebene hängen jedoch nicht nur vom optischen Weg ab, sondern istgemäß: Δz = d · (n – 1) / n ebenfalls vom optischen Medium abhängig.
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Für den Spezialfall von 5 mm optischer Weglänge durch ein Prisma mit der optischen Dichte von 1.5 ergibt sich so eine Veränderung der Fokusebene um ~1.6 µm. Diese Einstellung der Fokusebenen wird in dem Verfahren nicht genutzt. Um den entsprechenden Abstand zwischen den Fokusebenen für die 3D-Bildgebung von größeren Objekten zu erreichen, muss der Abstand zwischen Strahlteiler und Spiegel entsprechend groß gewählt werden. Mit dem gezeigten Aufbau wird lediglich ein Abstand der Fokusebenen von -350 nm erreicht. Für eine 3D-Bildgebung von größeren Objekten, wie beispielsweise Spermien, müsste die optische Weglänge des einen Teilstrahls somit deutlich vergrößert werden.
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Der große Abstand zwischen Spiegel und Strahlteiler führt auch dazu, dass ein CCD-Chip nicht optimal ausgeleuchtet werden kann, so dass nicht beleuchtete Bereiche auf dem CCD-Chip verbleiben. Dies ist insbesondere für die Aufnahme von größeren Objekten sowie für mehrere Fokalebenen problematisch, da das FOV eingeschränkt wird. Bei sich schnell bewegenden Objekten ist so eine Beobachtung nur schwer möglich.
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Bei der Beobachtung von schnell beweglichen Objekten sind noch weitere Aspekte zu beachten. Lassen sich Drei-Dimensionale-Datensätze (3D-Datensätze) von unbewegten Objekten auf einfache Weise durch Überlagerung verschiedener Fokusebenen in einem Z-Stapel gewinnen, ist dies bei sich schnellbewegenden Objekten nicht möglich. Aufgrund der innerhalb des Z-Stapels stattfindenden schnellen Bewegung können die Bilder nicht mehr einfach überlagert werden.
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Ein Anwendungsbeispiel aus dem Bereich der 3D-Mikroskopie für ein zu beobachtendes Objekt mit schnellen Bewegungen ist die dreidimensionale Beobachtung der Bewegung von Zilien und Flagellen eines Spermiums.
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Das Flagellum von Spermien schlägt mit einer hohen Frequenz, die bei humanen Spermien: ca. 50 Hz beträgt. Zur genauen Darstellung des dreidimensionalen Schlages müssten 3D Datensätze nach der Nyquist-Grenze mindestens mit doppelter Frequenz aufgenommen werden. Diese Aufnahme müsste ohne zeitliche Verzögerung innerhalb des Z-Stapels erfolgen. Zudem sollte der Abstand zwischen den Fokusebenen entsprechend der Fragestellung wählbar sein. Für die Begutachtung von Spermien ist ein Abstand von ca. 1-2 µm notwendig.
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Aufgabe der vorliegenden Anmeldung ist es, einen optischen Strahlteiler vorzuschlagen, der kompakt aufgebaut ist, sich einfach und flexibel handhaben lässt und die simultane Aufnahme verschiedener Fokusebenen auch von sich schnell bewegenden Objekten ermöglicht. Zugleich ist es Aufgabe einen Bausatz zum Aufbau des entsprechenden optischen Strahlteilers und ein Lichtmikroskop mit einem Strahlengang für den Probenstrahl, einer vom Probenstrahl beaufschlagten Digitalkamera und den in dem Probenstrahl vor der Digitalkamera angeordneten ebensolchen optischen Strahlteiler vorzuschlagen.
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Diese Aufgaben werden gelöst durch die Ansprüche 1, 4 und 6. Vorteilhafte Ausgestaltungen werden in den jeweiligen Unteransprüchen genannt.
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Der Grundgedanke der Erfindung basiert auf der Aufteilung des Probenstrahls mit einem wesentlich vereinfachten Strahlteiler. Vorgeschlagen wird ein insbesondere monolithisches Grundmodul, aufweisend ein Strahlteilermodul mit einer Eintrittsfläche für einen vom Objekt ausgehenden Probenstrahl, einer Durchtrittsfläche, auf die der Probenstrahl schräg, insbesondere in einem Winkel von 45°, auftrifft, wobei ein erster Teilstrahl die Durchtrittsfläche durchdringt und ein zweiter Teilstrahl an der Durchtrittsfläche teilreflektiert wird, und einer Austrittsfläche für den Austritt des zweiten Teilstrahls. Weiter weist das Grundmodul ein Umlenkmodul auf, mittels dem der zweite Teilstrahl zumindest annähernd parallel zum ersten Teilstrahl ausrichtbar ist, wobei das Umlenkmodul an der Austrittsfläche für den Austritt des zweiten Teilstrahls anliegt.
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Ein solches, den einfallenden Strahl in zwei parallele Strahlen aufteilendes Grundmodul ist leicht zu handhabend und auf einfache Weise in den Strahlengang eines Probenstrahls integrierbar. Der erfindungsgemäße Strahlteiler ist flexibel an die jeweilige Aufgabenstellung anpassbar und lässt sich ohne großen Aufwand in die meisten Lichtmikroskope integrieren.
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Die Aufteilung des in das Grundmodul eintretenden Strahl erfolgt an der schräg zum Strahl ausgerichteten Durchtrittsfläche des Strahlteilers über Teilreflexion in zwei, insbesondere rechtwinklig zu einander ausgerichtete Teilstrahlen. Der an der Durchtrittsfläche teilreflektierte zweite Teilstrahl wird im Umlenkmodul erneut umgelenkt, so dass er zumindest annähernd parallel zum ersten Teilstrahl das Grundmodul verlässt. Bei Austritt aus dem Grundmodul hat der zweite Teilstrahl eine längere Wegstrecke im Grundmodul zurückgelegt. Beide Teilstrahlen durchlaufen somit eine unterschiedliche optische Weglänge. Fallen nun die Teilstrahlen auf einen optischen Detektor, beispielsweise einen CCD-Chip einer Digitalkamera, entsprechen die aus den Teilstrahlen resultierenden Bilder verschiedenen Fokusebenen des zu beobachtenden Objekts. Die Aufnahmegeschwindigkeit eines 3D-Datensatzes ist somit nur noch abhängig von der Auslesegeschwindigkeit der Digitalkamera.
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Ein besonderer Vorteil des vorgeschlagenen Grundmoduls ist, dass die Teilstrahlen ihre unterschiedliche optische Weglänge innerhalb des Grundmoduls, also innerhalb eines optisch dichten Mediums durchlaufen. Hierdurch wird es möglich, den Abstand der aufgenommenen Fokusebenen nicht nur über die unterschiedliche optische Weglänge der Teilstrahlen, sondern auch durch die Auswahl eines Grundmoduls mit bestimmter optischer Dichte einzustellen. Dies erlaubt es, den Abstand der aufzunehmenden Fokusebenen auf die jeweilige Aufgabenstellung anzupassen, ohne an der kompakten Bauweise des Strahlteilers etwas verändern zu müssen. Erfindungsgemäß weist der Strahlteiler eine Mehrzahl von Grundmodulen auf, wobei die Grundmodule derart angeordnet sind, dass der aus einem ersten Grundmodul austretende erste und/oder zweite Teilstrahl jeweils in die Eintrittsfläche eines weiteren Grundmoduls einfällt, so dass der erste und/oder zweite Teilstrahl des ersten Grundmoduls in weitere Teilstrahlen aufgeteilt werden. Der Strahlteiler lässt sich somit ohne großen Aufwand um weitere Grundmodule erweitern. Der einfache Aufbau jedes Grundmoduls erleichtert die einfache Aneinanderreihung der Module. Dies ermöglicht dem Anwender mit geringem Justieraufwand die simultane Aufnahme beispielsweise von 4, 8 oder 16 Fokalebenen.
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Von Vorteil ist es dabei, wenn das Grundmodul in verschiedenen Größen verfügbar ist. Zum einen verlängert sich bei einem größeren Modul die Wegstrecke des Strahls durch das optisch dichte Medium und damit auch der Abstand der aufnehmbaren Fokusebenen. Der Abstand der Fokusebenen kann somit durch die Auswahl eines Grundmoduls bestimmter Größe an die jeweilige Aufgabenstellung angepasst werden. Ein anderer Aspekt betrifft die Vereinfachung des Aufbaus bei der Aufnahme mehreren Fokalebenen. Werden Grundmodule in einfachem und doppeltem Größenverhältnis vorgehalten, können die ein Grundmodul bzw. zwei Grundmodule einfacher Größe verlassenden Teilstrahlen statt in zwei bzw. 4 Grundmodule in ein doppelt so großes Grundmodul eingeleitet werden. Hierdurch wird der Rüstaufwand für die Aufnahme mehrere Fokusebenen deutlich verringert.
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Die Anzahl der Aufteilungen bzw. die Größe der Grundmodule ist nur durch die Lichtempfindlichkeit und die Größe des optischen Detektors limitiert, sowie durch die Lichtintensität der Teilstrahlen, die mit jeder Strahlteilung abnimmt. Vorzugsweise erfolgt die Teilreflexion in einem Verhältnis von 50/100, wodurch der in ein Grundmodul einfallenden Strahl in zwei Teilstrahlen gleicher Lichtintensität aufgeteilt wird.
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Der vorgeschlagene Strahlteiler ist grundsätzlich für verschiedene Kontrastverfahren geeignet, beispielsweise für Hellfeld, Dunkelfeld, Phasenkontrast oder Hoffmann Modulation. Da die 3D-Bildrate nur durch die Bildrate der aufnehmenden Kamera limitiert ist, können einen starken Kontrast aufweisende Objekte mit sehr hohen Bildraten als 3D-Datensätze aufgenommen werden. Für Objekte mit geringem Kontrast wie z. B. das Flagellum von Spermien können 3D Bildstapel mit einer Frequenz deutlich über der Nequist-Grenze aufgenommen werden.
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Der erfindungsgemäße Strahlteiler kann an jedem Lichtmikroskop mit angeschlossenem optischen Detektor eingesetzt werden, er lässt sich leicht in dessen Strahlengang integrieren. Hierzu ist vorteilhafterweise eine standardisierte Halterung vorzusehen, mit welcher ein oder mehrere Grundmodule auswechselbar an definierter Stelle im Strahlengang des Probenstrahls angeordnet werden.
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Besonders vorteilhaft ist eine Modul-Anordnung, bei der die aus dem Strahlteiler austretenden Teilstrahlen vollständig parallel verlaufen. Die Teilstrahlen treffen dann auf voneinander getrennten Feldern des optischen Detektors auf und können einzeln erfasst werden. Durch den kompakten Aufbau des Strahlteilers und den unmittelbar nebeneinander hegend aufgeteilten Bildern kann dieser vor eine beliebige Kamera mit entsprechender Chipgröße installiert werden.
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Darüber hinaus können hinter dem erfindungsgemäßen Strahlteiler auch andere Eigenschaften der Abbildungen analysiert werden. Ein weiterer Vorteil seiner kompakten Bauweise ist es, noch weitere optische Elemente in den Strahlengang hinzufügen zu können. Mit Hilfe dieser optischen Elemente können beispielsweise die Abstände der Fokalebenen weiter variiert werden bzw. bestimmte Wellenlängen herausgefiltert werden.
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Um die aufzunehmenden Fokusebenen zu variieren, kann ein zusätzliches erstes optisches Element, insbesondere eine planparallele Platte, in den Strahlengang eines Teilstrahls eingebracht werden. Vorteilhafterweise werden für eine exakte Einstellung der aufzunehmenden Fokusebenen planparallele Platten unterschiedlicher Dicke in die Strahlengänge verschiedener Teilstrahlen eingesetzt.
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Zur Variation der Brennweite der Teilstrahlen kann ein zusätzliches zweites optisches Element, insbesondere zwei optische Linsen, die vor und hinter dem Strahlteiler in den Strahlengang eingebracht sind, vorgesehen werden. Ist die gleichzeitige Aufnahme unterschiedlicher Spektralbereiche gewünscht, kann eine Filtermatrix vor der Digitalkamera angeordnet werden.
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Vorzugsweise wird der erfindungsgemäße Strahlteiler als Bausatz mit der Mehrzahl von Grundmodulen bereitgestellt. Ein solcher Bausatz umfasst in einer Grundform ein Grundmodul, insbesondere aus Glas oder Plexiglas, und eine Halterung zur Befestigung des Grundmoduls im Strahlengang eines Lichtmikroskops. Bei einen solchen Bausatz kann der Nutzer das Umlenkmodul insbesondere lösbar am Strahlteilermodul befestigen, und es nach seinen Bedürfnissen zum Strahlteilermodul hin ausrichten. Vorteilhafterweise werden eine Mehrzahl von Strahlteilermodulen und Umlenkmodulen oder schon fertig zusammengesetzter Grundmodule als Bausatz zur Verfügung gestellt. Der Nutzer kann diese Einzel- bzw. Grundmodule dann je nach gewählter Aufgabenstellung zu einem Strahlteiler zusammenstellen.
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Vorzugsweise umfasst der Bausatz einen Haftvermittler zum insbesondere lösbaren Zusammensetzten der Grundmodule. Das Einbringen eines Haftvermittlers, insbesondere eines Refraktionsöls oder eines Kanadabalsams, zwischen die Kontaktflächen der einzelnen Module verhindert Lufteinschlüsse und die hierdurch verursachten Streuungen des Lichtstrahls.
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In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist das Strahlteilermodul eine würfelartige Grundform auf und das Umlenkmodul ist prismenartig mit der Grundform eines rechtwinkligen und insbesondere gleichschenkligen Dreiecks ausgebildet, wobei das Umlenkmodul mit seiner einen Kathetenfläche an der Austrittsfläche des Strahlteilermoduls anliegt und eine den zweiten Teilstrahl reflektierende Hypotenusenfläche umfasst. Bei dieser Ausführungsform ist das Umlenkmodul derart ausgerichtet, dass der an der zweiten Kathetenfläche des Umlenkmoduls austretende zweite Teilstrahl parallel zum dem die Durchtrittsfläche durchdringenden ersten Teilstrahl verläuft. Die parallel aus dem Grundmodul austretenden Teilstrahlen lassen die aufgespalteten Bilder nebeneinander und somit einfach auslesbar auf dem optischen Detektor zu liegen kommen. Aufgrund seiner jeweils senkrecht zu den ein- und austretenden Strahlen hin ausgerichteten Ein- und Austrittsflächen lässt sich ein solches Grundmodul leicht um weitere Grundmodule zu einem Mehrfach-Strahlteiler erweitern. Dank der einfachen Geometrie stellt das Grundmodul keine besonderen Anforderungen an eine Halterung. Sie kann beispielsweise in der Form eines in den Strahlengang am Mikroskop geführten Einschubs ausgebildet sein Vorzugsweise ist sie auch für die Aufnahme mehrerer Grundmodule geeignet.
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Weitere Merkmale des erfindungsgemäßen Grundmoduls werden in den folgenden Figuren beschrieben. Dabei zeigen
- 1: Eine schematische Darstellung des Aufbaus einer bevorzugten Ausführungsform eines Grundmoduls;
- 2: Eine schematische Darstellung des Strahlengangs in einem aus mehreren Grundmodulen gemäß 1 zusammengesetzten Strahlteilers, und
- 3: Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Strahlteilers.
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1 zeigt ein aus einem Strahlteilermodul 1 und einem Umlenkmodul 2 bestehendes Grundmodul 3. Das Strahlteilermodul 1 ist würfelförmig ausgebildet und derart im Strahlengang eines Lichtmikroskops angeordnet, dass eine Eintrittsfläche 4 des Strahlteilermoduls 1 senkrecht zu dem hier stilisiert dargestellten Probenstrahl 5 ausgerichtet ist. Der in das Strahlteilermodul 1 einfallende Probenstrahl 5 trifft in einem Winkel von 45° auf eine im Strahlteilermodul 1 diagonal angeordnete Durchtrittsfläche 6, an der er teilreflektiert wird. Während der nicht reflektierte Teilstrahl 7 die Durchtrittsfläche 6 durchdringt und an einer der Eintrittsfläche 4 gegenüberliegenden Austrittsfläche 8 aus dem Strahlteilermodul 1 austritt, wird der zweite Teilstrahl 9 an der Durchtrittsfläche 6 teilreflektiert. Nach der Reflexion ist er senkrecht zu einer Austrittsfläche 10 ausgerichtet, welche der zweite Teilstrahl 9 durchdringt.
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An der Austrittsfläche 10 des Strahlteilermoduls 1 liegt das Umlenkmodul 2 in Form eines prismenartigen rechtwinkligen und gleichschenkligen Dreiecks mit seiner einen ersten Kathetenfläche 11 an. Die erste Kathetenfläche 11 ist parallel zur Austrittsfläche 10 für den zweiten Teilstrahl 9 ausgerichtet und weist identische Kantenlängen auf. Der in das Prisma 2 eintretende Teilstrahl 9 wird an der verspiegelten Hypotenusenfläche 12 des Prismas 2 vollreflektiert. Der an der parallel zur Durchtrittsfläche 6 verlaufenden Hypotenusenfläche 12 reflektierte Teilstrahl 9 tritt im rechten Winkel zur zweiten Kathetenfläche 13 des Prismas 2 aus dem Grundmodul 3 aus. Nach Teilreflexion und Vollreflexion ist der zweite Teilstrahl 9 wieder parallel zum ersten Teilstrahl 7 ausgerichtet.
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Die 2 zeigt einen aus drei baugleichen Grundmodulen 3, 14 und 15 zusammengesetzten Strahlteiler 16. Der einfallende Probenstrahl 5 wird wie in 1 dargestellt an der Durchtrittsfläche 6 in zwei Teilstrahlen 7 und 9 aufgeteilt. An der Austrittsfläche 8 für den ersten Teilstrahl 7 liegt die Eintrittsfläche des Grundmoduls 14 und an der zweite Kathetenfläche 13 die Eintrittsfläche des Grundmoduls 15 an, wobei die beiden Grundmodule 14, 15 im Vergleich zum Grundmodul 3 um 90° versetzt angeordnet sind. In den Grundmodulen 14 bzw. 15 werden die jeweiligen Teilstrahlen 7 bzw. 9 in vier zu einander parallele Teilstrahlen 17 - 20 aufgeteilt.
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Die 3 zeigt einen Strahlteiler als Anordnung von Grundmodulen 21 - 24 in einer Halterung 25. Über insgesamt vier Strahlteiler-Ebenen 26 - 29 wird der am Eingang 30 der Halterung 25 einfallende Lichtstrahl von den Grundmodulen 21 - 24 in sechszehn Teilstrahlen aufgeteilt, welche die Halterung 25 über ihrem Ausgang 31 verlassen. In den beiden in Strahlrichtung hinteren Strahlteilerebenen 28 und 29 werden im Vergleich zu den in Strahlrichtung vorderen Strahlteilerebenen 26 und 27 doppelt so große Grundmodule eingesetzt. In der Ebene 26 befindet sich somit ein Grundmodul 21, in der zweiten Ebene 27 zwei Grundmodule 22, von denen eines verdeckt ist. In die dritte Ebene ist ein Grundmodul 23 und in der vierten Ebene zwei Grundmodule 24 eingesetzt, von denen nur eines sichtbar ist. Somit können die in die dritte Ebene 28 eintretenden vier Teilstrahlen durch ein Grundmodul 23 in acht Teilstrahlen aufgeteilt werden. Dabei sind die Grundmodule 21 - 24 einer Strahlteiler-Ebene 26 - 29 jeweils um 90° versetzt zur anliegenden Ebene angeordnet. Die Grundmodule 21-24 werden jeweils über Adapter 32 - 35 in den Ebenen 26 - 29 der Halterung 25 fixiert. Dies kann per Kraftschluss, beispielsweise durch Schrauben, erfolgen. Von Vorteil ist es, wenn sie mittels eines Haftvermittlers einfach im Adapter 32 - 35 verklebt werden.
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Die Halterung 25 selbst ist verschieblich im Strahlengang eines Lichtmikroskops angeordnet. Vorzugsweise weisen Eingang 30 bzw. Ausgang 31 der Halterung 25 Aufnahmen für weitere optische Elemente, insbesondere planparallele Platten oder Linsen, zur Anpassung der Fokusebenen auf.
