DE102012223128A1

DE102012223128A1 - Autofokusverfahren für Mikroskop und Mikroskop mit Autofokuseinrichtung

Info

Publication number: DE102012223128A1
Application number: DE201210223128
Authority: DE
Inventors: Peter Westphal; Reiner Mitzkus
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2012-12-13
Filing date: 2012-12-13
Publication date: 2014-06-18
Anticipated expiration: 2032-12-14
Also published as: US9389405B2; US20140168404A1; DE102012223128B4

Abstract

Autofokusverfahren für ein Mikroskop mit einem Objektiv (4), das eine in einer Objektebene liegende Probe (2) abbildet, wobei a) ein längserstreckter Gitterspalt (G1), der in einer Gitterspaltebene liegt, auf die Probe (2) projiziert wird und die Projektion des Gitterspalts (G1) als Gitterspaltbild auf eine Autofokuskamera (16, 18), die eine Kamerabildebene hat, abgebildet wird, wobei entweder die Gitterspaltebene oder die Kamerabildebene schräg zu einer Ebene liegt, die zur Objektebene konjugiert ist, b) eine Intensitätsverteilung des Gitterspaltbildes ermittelt und daraus eine Vorgabe für eine Relativverstellung von Probe (2) und Objektebene abgeleitet wird, wobei c) ein ebenfalls längserstreckter Vergleichsspalt (R1; R2), der parallel zum Gitterspalt (G1) in der Gitterspaltebene liegt und entlang der Längserstreckung nicht strukturiert ist, auf die Probe (2) projiziert wird, und die Projektion des Vergleichsspalts (R1; R2) als Vergleichsspaltbild (30) auf die Autofokuskamera (16, 18) abgebildet wird, und, d) die Breite (B1, B2) des Vergleichsspaltbilds (30) quer zur Längserstreckung an mindestens zwei Stellen (x1, x2), die entlang der Längserstreckung beabstandet sind, ausgewertet wird, daraus ein Breitenverlauf des Vergleichsspaltbilds (30) ermittelt wird, ein Gradient des Breitenverlaufs bestimmt wird und daraus eine Richtung der Relativverstellung abgeleitet wird.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Autofokusverfahren für ein Mikroskop mit einem Objektiv, das eine in einer Objektebene liegende Probe abbildet, wobei

a) ein längserstreckter Gitterspalt, der in einer Gitterspaltebene liegt, auf die Probe projiziert wird und die Projektion des Gitterspalts als Gitterspaltbild auf eine Autofokuskamera, die eine Kamerabildebene hat, abgebildet wird, wobei entweder die Gitterspaltebene oder die Kamerabildebene schräg zu einer Ebene liegt, die zur Objektebene konjugiert ist,
b) eine Intensitätsverteilung des Gitterspaltbildes ermittelt und daraus eine Vorgabe für eine Relativverstellung von Probe und Objektebene abgeleitet wird.

Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein Mikroskop mit einem Objektiv, das eine in einem Probenraum liegende Objektebene aufweist, und einer Autofokuseinrichtung, die aufweist

– einen längserstreckten Gitterspalt, der in einer Gitterspaltebene liegt,
– eine Autofokus-Beleuchtungsoptik, die den Gitterspalt in den Probenraum projiziert,
– eine Autofokus-Kamera mit einer Kamerabildebene,
– eine Autofokus-Abbildungsoptik, die ein Bild der im Probenraum liegenden Projektion des Gitterspaltes als Gitterspaltbild auf die Autofokus-Kamera abbildet,
– wobei entweder die Gitterspaltebene oder die Kamerabildebene schräg zu einer Ebene liegt, die zur Objektebene konjugiert ist, und
– das Mikroskop eine Steuereinrichtung aufweist, die ausgebildet ist, mit dem Mikroskop ein Autofokusverfahren auszuführen.

Ein gattungsgemäßes Mikroskop sowie ein gattungsgemäßes Autofokusverfahren sind aus der WO 2007/144197 A1 bekannt. Sie schildert eine Autofokusvorrichtung, die ein längs einer Richtung periodisch intensitätsmoduliertes Modulationsobjekt in die Probe abbildet und aus dem Bild des Modulationsobjektes ein Autofokussignal erzeugt.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mikroskop bzw. ein Autofokusverfahren der eingangs genannten Art so weiterzubilden, dass die Autofokusfunktion über einen größeren Tiefenbereich verwirklicht ist.
Die Aufgabe wird gelöst mit einem Autofokusverfahren der eingangs genannten Art, bei dem

c) ein ebenfalls längserstreckter Vergleichsspalt, der parallel zum Gitterspalt in der Gitterspaltebene liegt und entlang der Längserstreckung nicht strukturiert ist, auf die Probe projiziert wird, und die Projektion des Vergleichsspalts als Vergleichsspaltbild auf die Autofokuskamera abgebildet wird, und,
d) wenn die Intensitätsverteilung des Gitterspaltbildes nicht mit einem vorbestimmten Mindestkontrast aufgelöst werden kann, die Breite des Vergleichsspaltbilds quer zur Längserstreckung an mindestens zwei Stellen, die entlang der Längserstreckung beabstandet sind, ausgewertet wird, daraus ein Breitenverlauf des Vergleichsspaltbilds ermittelt wird, ein Gradient des Breitenverlaufs bestimmt wird und daraus eine Richtung der Relativverstellung abgeleitet wird.

Die Aufgabe wird ebenfalls gelöst mit einem Autofokusverfahren der eingangs genannten Art, bei dem

c) ein ebenfalls längserstreckter Vergleichsspalt, der komplementär zum Gitterspalt strukturiert ist und parallel zum Gitterspalt in der Gitterspaltebene liegt, auf die Probe projiziert wird, die Projektion des Vergleichsspalts auf die Autofokuskamera abgebildet und dort mit dem Gitterspaltbild zu einem Vergleichsspaltbild zusammengefasst wird, und,
d) wenn die Intensitätsverteilung des Gitterspaltbildes aufgrund von Defokussierung nicht mit einem vorbestimmten Mindestkontrast aufgelöst werden kann, die Breite des Vergleichsspaltbilds quer zur Längserstreckung an mindestens zwei Stellen, die entlang der Längserstreckung beabstandet sind, ausgewertet wird, daraus ein Breitenverlauf des Vergleichsspaltbilds ermittelt wird, ein Gradient des Breitenverlaufs bestimmt wird und daraus eine Richtung der Relativverstellung abgeleitet wird

Die Aufgabe wird auch mit einem Mikroskop der eingangs genannten Art gelöst, dessen Autofokuseinrichtung einen ebenfalls längserstreckten Vergleichsspalt, der parallel zum Gitterspalt in der Gitterspaltebene liegt und entlang der Längserstreckung entweder nicht oder komplementär zum Gitterspalt strukturiert ist, aufweist, wobei die Autofokus-Kamera auch den Vergleichsspalt in den Probenraum projiziert, und dessen Autofokus-Abbildungsoptik auch ein Bild der im Probenraum liegenden Projektion des Vergleichsspaltes als Vergleichsspaltbild auf die Autofokus-Kamera abbildet, und dessen Steuervorrichtung zur Ausführung einer der beiden Verfahren geeignet ausgebildet, beispielsweise programmiert, ist.
Im Stand der Technik wird der Arbeitsbereich einer Autofokuseinrichtung als Fangbereich bezeichnet. Die Erfindung ergänzt das Autofokusprinzip der WO 2007/144197 A1 hinsichtlich des Fangbereiches. In Bereichen, in denen das bekannte Autofokusprinzip keinen ausreichenden Gitterkontrast mehr für die bekannte Autofokusfunktion hat, wird ermittelt, in welche Richtung die Relativverschiebung von Probe und Objektebene erfolgen muss, um wieder einen ausreichenden Gitterkontrast zu gewinnen. Die Erfindung wertet dazu die Breite des Vergleichsspaltbildes aus. Da das Vergleichsspaltbild ebenso wie das Gitterspaltbild schräg zur Objektebene liegt – was durch die Neigung der Gitterspaltebene oder der Kamerabildebene zur optischen Achse der Abbildung erreicht ist – variiert die Breite des Vergleichsspaltbildes entlang der Längserstreckung, wenn das Objektiv defokussiert ist. Dies führt dazu, dass aus dem Breitenverlauf des Vergleichsspaltbildes unter Kenntnis der Richtung der Schrägstellung abgeleitet werden kann, in welche Richtung ggf. die Relativverschiebung von Probe und Objektebene erfolgen muss, um in den Fangbereich des Autofokus mit herkömmlicher Gitterkontrastauswertung zu gelangen.
Das Vergleichsspaltbild kann aus zwei Varianten erzeugt werden. Zum einen ist es möglich, einen in Längserstreckung nicht strukturierten Vergleichsspalt zu verwenden. Zum anderen ist es möglich, einen Vergleichsspalt zu verwenden, der komplementär zum Gitterspalt strukturiert ist. Er ergänzt das Gitterspaltbild zu einem nicht strukturierten Vergleichsspaltbild, das aus einer Zusammenfassung von Gitterspaltbild und Bild der Projektion des Vergleichsspaltes in der Kameraebene genommen wird. Als Ergebnis beider Varianten hat man ein Vergleichsspaltbild, das entlang seiner Längserstreckung keine gitterbedingten Intensitätsschwankungen hat, wodurch die Breite des Vergleichsspaltbildes problemlos ausgewertet werden kann.
Unter den Begriff eines nicht in Längserstreckung strukturierten Vergleichsspaltes fällt im Rahmen dieser Erfindung auch ein Vergleichsspalt, der eine Gitterkonstante hat, welche von der Abbildung, insbesondere der Autofokusabbildung, nicht mehr aufgelöst werden kann. Ein solcher Vergleichsspalt hat ein Bild ohne Struktur längs seiner Längserstreckung.
Wenn die Intensitätsverteilung des Gitterspaltes nicht mit einem vorbestimmten Mindestkontrast aufgelöst werden kann, ist ein kontrastbasierter Autofokus nicht mehr möglich, und es wird die Breite des Vergleichsspaltbildes ausgewertet. Optional wird zusätzlich die Projektion des längserstreckten Vergleichsspaltes auch nur unter dieser Bedingung durchgeführt.
Die Entscheidung, ob die Intensitätsverteilung des Gitterspaltbildes mit einem vorbestimmten Mindestkontrast aufgelöst werden kann, kann anhand mehrerer Kriterien erfolgen, die jedes für sich ausreichen, aber auch in Kombination eingesetzt werden können:

1. Der Gitterspalt hat eine bekannte Gitterfrequenz. Man kann deshalb das Bild des Gitterspaltes einer Fourier-Analyse unterwerfen. Sind in dieser Fourier-Analyse die Frequenzen, welche durch die Struktur des Gitterspaltes vorgegeben sind, nicht vorhanden bzw. nur mit Vorfaktoren vorhanden, die unterhalb von Mindestwerten liegen, kann dies zur Entscheidung verwendet werden, dass die Intensitätsverteilung des Gitterspaltes nicht mit dem vorbestimmten Mindestkontrast aufgelöst werden kann.
2. Bei ausreichendem Mindestkontrast sind im Gitterspaltbild starke Intensitätsschwankungen längs des Gitterspaltbildes vorhanden. Eine nicht ausreichende Auflösung kann deshalb daran erkannt werden, dass der Abstand zwischen Intensitätsminimum und -maximum im Gitterspaltbild unterhalb eines Mindestwertes bleibt.
3. Anstelle einer solchen absoluten Auswertung ist es auch möglich, eine Relativauswertung über in Längsrichtung des Gitterspaltbildes nebeneinanderliegende Pixel der Autofokus-Kamera durchzuführen. Dabei muss die Auswertung nicht auf unmittelbar benachbarte Pixel beschränkt werden; es ist gleichermaßen möglich, innerhalb eines gewissen Fensters auf Intensitätsunterschiede zu achten. Dieses Fenster kann auch über das Gitterspaltbild verschoben werden, so dass mit einer statistischen Auswertung der innerhalb des Fensters auftretenden Intensitätsminima und -maxima geprüft werden kann, ob die Intensitätsverteilung des Gitterspaltbildes mit einem vorbestimmten Mindestkontrast aufgelöst werden kann.
4. Schließlich ist es auch möglich, eine Kontrast-Gütefunktion zur Anwendung zu bringen, wie sie im Stand der Technik für die Bewertung des Bildkontrastes bekannt ist.

Um die Richtung der Relativverstellung abzuleiten, kann es in den meisten Ausführungsformen genügen, die Breite des Mindestspaltes an zwei Stellen zu ermitteln. Die Bestimmung des Gradienten des Breitenverlaufs erfolgt dann durch die Differenzbildung zwischen den Breiten, und die Richtung der Relativverstellung wird aus dem Vorzeichen der Differenz abgeleitet.
Die Ermittlung der Breiten kann an bestimmten Pixelstellen im Autofokus-Kamerabild erfolgen. Zur Vermeidung von Artenfakten, die aus Reflektivitätssprüngen der Probe herrühren, ist es zu bevorzugen, die Stellen durch Fenster zu definieren, in denen ein Breitenwert durch Mittlung oder andere statistische Auswertung berechnet wird.
Der erfindungsgemäß bereitgestellte erweiterte Fangbereich dient bevorzugt dazu, die Relativlage von Probe und Objektebene möglichst schnell so einzustellen, dass der kontrastbasierte Autofokus, d. h. die Auswertung der Intensitätsverteilung des Gitterspaltbildes zur Anwendung kommen kann. Es ist deshalb bevorzugt, die Schritte c) und d) so oft zu wiederholen, bis entweder diese kontrastbasierte Autofokusfunktion realisiert werden kann oder eine vorbestimmte Anzahl an Wiederholungen erreicht ist (Abbruchkriterium).
Der Gradient des Breitenverlaufes (im einfachsten Fall die Breitendifferenz) liefert die Richtung der Relativverstellung. In welche Richtung die Verstellung erfolgt, wird entschieden anhand der Richtung des Gradienten (im einfachsten Fall dem Vorzeichen der Differenz) und unter Berücksichtigung der Richtung der Schrägstellung von Gitterspaltebene oder Kamerabildebene zur Objektebene. Die Relativverstellung muss dabei so erfolgen, dass sie die Objektebene in Richtung der geringeren Breite des Vergleichsspaltbildes verschiebt.
Wertet man den Absolutwert einer der Breiten oder beider Breiten oder das Verhältnis der Breiten aus, lässt sich abschätzen, um welchen Betrag die Relativverschiebung erfolgen muss, um in den Fangbereich des Autofokus, der auf der Intensitätsverteilung des Gitterspaltbildes beruht, zu gelangen. Hierzu kann auf eine zuvor ermittelte Kennlinie o. ä. zugegriffen werden.
Reflektivitätssprünge innerhalb der Probe können dazu führen, dass das Gitterspaltbild oder das Vergleichsspaltbild nicht homogen ist. Für solche Fälle ist es zu bevorzugen, die Lage des Gitterspaltes und/oder des Vergleichsspaltes innerhalb der Gitterspaltebene zu verschieben. Die Notwendigkeit für eine solche Verschiebung kann beispielsweise daran erkannt werden, dass das Vergleichsspaltbild entlang der Längsrichtung lokale Intensitätsschwankungen aufweist, die über ein vorbestimmtes Mindestmaß hinausgehen.
Im Falle solcher Intensitätsschwankungen kann zusätzlich oder alternativ auch die Lage der Stellen, an denen die Breiten des Vergleichsspaltes erfasst werden, so gewählt werden, dass sie außerhalb solcher Intensitätsschwankungsbereiche liegen.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten sowie auch die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnung beispielhalber noch näher erläutert. Es zeigen:
1 ein Mikroskop mit einer Autofokuseinrichtung für Reflexionsmessungen,
2 ein Mikroskop mit einer Autofokuseinrichtung für Fluoreszenzmessungen,
3 eine Draufsicht auf einen exemplarischen Lichtmodulator,
4 bis 6 Kontrastsignale zur Erläuterung der Funktion der Autofokuseinrichtung, und
7 Kurven zur Weiterbildung eines Autofokusverfahrens.
1 zeigt ein Mikroskop 1, mit dem eine Probe 2, die sich auf einem Probenträger 3 befindet mittels eines Objektivs 4 auf einen Detektor 5 abgebildet wird. Das Mikroskop entspricht in seiner Grundstruktur dem aus WO 2007/144197 A1 bekannten Mikroskop. Dies gilt für die dort beschriebenen Bauweisen grundsätzlich. Alternativ zur Bauweise der 1 sind also auch die Bauweisen möglich, die in der WO 2007/144197 A1 beschrieben sind. Die Offenbarung dieser Druckschrift wird deshalb hier vollumfänglich einbezogen. Der Unterschied zu den Mikroskopen der WO 2007/144197 A1 liegt zum einen im Aufbau des Lichtmodulators 12, der nachfolgend anhand der 3 noch näher erläutert werden wird, und zum anderen in einer zusätzlichen Autofokusfunktion, die anhand der 4 bis 8 beschrieben werden wird.
Die exemplarische Darstellung in 1 ist stark vereinfacht. Bei dem Mikroskop 1 kann es sich um ein Weitfeldmikroskop handeln, d. h. der Detektor 5 ist z. B. eine Kamera oder ein Okulareinblick. Aber auch jede andere Mikroskopbauweise kommt für das Mikroskop 1 in Frage, beispielsweise ein Laser-Scanning-Mikroskop. Dann ist dem Mikroskopstrahlengang noch eine Scananordnung vorgesehen, die auf der optischen Achse OA1 liegt. Das Objektiv 4 ist in seiner Fokuslage verstellbar, wie der Doppelpfeil andeutet. Alternativ kann auch der Probenträger 3 verstellbar sein. Insgesamt kann damit eine Relativlage zwischen Objektebene der Abbildung im Mikroskop 1 und einer Probe 2 verstellt werden. Im Rahmen der Erfindung liegt es auch, eine sogenannte Innenfokussierung zu verwenden, bei der nicht das gesamte Objektiv, sondern nur bestimmte, im Mikroskop oder Objektiv liegende, Linsen bewegt werden.
An einem Strahlteiler 6, der gegebenenfalls als Dichroit oder als plattenförmiger Farbteiler ausgebildet sein kann, ist Mikroskop-Beleuchtungsstrahlung aus einer Mikroskop-Beleuchtungsquelle 8 eingekoppelt, die über eine Beleuchtungstubusoptik 7 die Probe 2 durch das Objektiv 4 beleuchtet. In diesen Beleuchtungsstrahlengang ist mittels eines Strahlteilers 11 eine Autofokuseinrichtung eingekoppelt. Die Autofokuseinrichtung verfügt über einen Lichtmodulator 12, der je nach Ausbildung (transmittiv oder reflektiv) von einer Lichtquelle 13, beispielsweise eine LED, für Transmissionsbetrieb oder von einer Lichtquelle 14 (z. B. eine LED) für Reflexionsbetrieb beleuchtet ist. Der beleuchtete Lichtmodulator 12 generiert einen Gitterspalt als Modulationsobjekt. Dieses wird über den Strahlteiler 11, die Beleuchtungstubusoptik 7, den Strahlteiler 6 sowie das Objektiv 4 in die Probe 2 projiziert, also abgebildet. Dadurch ist eine Autofokus-Beleuchtung mit dem Modulationsobjekt realisiert. Die in der Probe 2 erzeugte Projektion des Modulationsobjektes wird im gegenläufigen Weg mittels einer Kamera 16 erfasst, der ein weiterer Strahlteiler 15 auf der optischen Achse OA2 der Autofokuseinrichtung vorgelagert ist. Die dabei erhaltene optische Achse OA3 ist optional weiter noch über einen Strahlteiler 17 auf eine Kamera 18 geleitet.
Der Strahlteiler 11 ist in einer erfindungsgemäßen Bauweise dichroitisch ausgebildet und die Lichtquelle 13 bzw. 14 strahlt bei einer Wellenlänge, die von der Mikroskop-Beleuchtungsquelle 8 nicht wesentlich abgegeben oder für die Probenabbildung nicht benötigt wird. Die Autofokuseinrichtung arbeitet somit in einem Spektralbereich der für die Abbildung der Probe 2 ansonsten nicht verwendet ist. Dieses Merkmal ist nicht zwingend, d. h. die Bildgebung und die Autofokusfunktion können auch denselben Wellenlängenbereich nutzen, wobei ggf. kein Simultanbetrieb mehr möglich ist. Es ist auch möglich, dass für die Bildgebung und die Autofokusfunktion dieselbe Lichtquelle und/oder dieselbe Kamera verwendet wird.
Von den Kameras sind in den Figuren generell nur die Bildebenen gezeichnet. Die Kameras können z. B. CCD- oder CMOS-Kameras sein.
In der Bauweise der 1 liegt der Lichtmodulator 12 und damit das Modulationsobjekt senkrecht zur optischen Achse OA2 und in einer zur Objektebene konjugierten Ebene. Die Kamera 16 steht mit ihrer Bildebene dagegen schräg zur optischen Achse OA3 und zu einer konjugierten Ebene der Objektebene. Dadurch liegt der maximale Kontrast des Gitterspaltes in einer senkrecht zur Zeichenebene liegenden Zeile der Kamera 16. Die Lage der Zeile längs der Kamera 16 ist ein Maß für die Lage der Fokusebene längs der optischen Achse, d. h. in z-Richtung. Alternativ kann auch der Lichtmodulator 12 verkippt sein und die Kamera-Bildebene gerade stehen.
Mit Hilfe der Beleuchtungstubusoptik 7 und des Objektivs 4 wird das Modulationsobjekt, das vom Lichtmodulator 12 je nach Ausführung in Transmissionsbetrieb (Lichtquelle 13) oder im Reflexionsbetrieb (Lichtquelle 14) erzeugt wird, in die Probe abgebildet. Durch die schräggestellte Kamera 16 erfolgt eine Tiefenauflösung. Mittels der Kamera 18 kann zusätzlich eine laterale Verschiebung der strukturiert beleuchteten Probe detektiert werden.
Im Falle eines Fluoreszenzmikroskops werden ein Anregungsfilter 10 sowie ein Emissionsfilter 9 (für die Fluoreszenzstrahlung) verwendet. Das Mikroskop 1 kann ohne weitere Einschränkung hinsichtlich der Autofokuseinrichtung auch als scannendes Mikroskop, insbesondere als Laser-Scanning-Mikroskop, Nipkow-Scheiben-Mikroskop oder SPIM-Mikroskop ausgebildet sein.
2 zeigt eine alternative Gestaltung des Mikroskops der 1 hinsichtlich der Autofokuseinrichtung. Im Mikroskop der 2 sind Bauteile, die bereits anhand 1 erläutert wurden, mit denselben Bezugszeichen versehen; auf ihre wiederholte Beschreibung wird deshalb verzichtet. Die Kamera 16 detektiert hier den Fluoreszenzkontrast der Probe, welcher durch die strukturierte Autofokus-Beleuchtung noch verstärkt werden kann. Die Abbildung des Modulationsobjektes erfolgt ähnlich wie bei der Bauweise gemäß 1. Die Erfassung des in die Probe 2 abgebildeten Modulationsbildes geschieht jedoch nicht aus dem Beleuchtungsstrahlengang heraus, sondern über einen eigenständigen Strahlteiler aus dem Mikroskopstrahlengang. Dieser ist an die Wellenlänge der Autofokus-Beleuchtung angepasst und z. B. im gleichen Masse dichroitisch, wie der Strahlteiler 11. Um das in die Probe abgebildete Modulationsobjekt bzw. dadurch erzeugte Reflexe oder Rückstreuungen mittels der Kamera 16 erfassen zu können, ist dieser Kamera eine entsprechende Relaisoptik 20 vorgeordnet, deren optische Charakteristik dafür sorgt, dass die Bildebene der Kamera 16 eine konjugierte Ebene zum Modulationsobjekt schneidet, idealerweise nahe oder auf der optischen Achse (wie bei 1 auch).
Die von der Fokuseinrichtung, insbesondere der Kamera 16 gelieferten Signale werden zur Ansteuerung einer Fokusverstellung längs der z-Achse verwertet. Dies ist in 1 schematisch durch einen Doppelpfeil veranschaulicht. Ein Steuergerät 26 steuert die Autofokusfunktion des Mikroskops 1.
Ist das Mikroskop 1 in 2 als Laser-Scanning-Mikroskop ausgebildet, wird wiederum die Kombination aus Emissionsfilter 9 und Anregungsfilter 10 vorgesehen, wie auch optional ein weiterer Spektralfilter 21, der dafür sorgt, dass auf die Kamera 16 der Spektralbereich des leuchtenden Modulationsobjektes fällt und nicht weiter interessierende Spektralbereiche ausgeblendet sind, insbesondere die Spektralbereiche der Probenabbildung.
Die möglichen Bauweisen des Mikroskops entsprechen, bis auf die Ausgestaltung des Steuergerätes 26, dem Stand der Technik gemäß WO 2007/144197 A1 .
Die Bauweisen der 1 und 2 zeigen die Anordnung der Autofokuseinrichtung bei einem aufrechten Mikroskop 1 mit einem Objektträger als Probenhalter. Zwischen Objektträger und Objektiv kann sich ein Deckglas wie auch eine Immersionsflüssigkeit (z. B. Öl, Wasser, Glycerin) befinden. Dies ist aber nicht zwingend erforderlich. Es gibt damit zwei zu unterscheidende Anwendungsfälle: Ohne Immersionsflüssigkeit erhält man den höchsten Gitterkontrast von der Luft/Glas-Grenzfläche an der Deckglas- oder Objektträgeroberseite. Mit Immersionsflüssigkeit erhält man den höchsten Gitterkontrast von der Grenzfläche zwischen Deckglas-Unterseite und Einbettmedium. Zur Unterdrückung von Streulicht oder unerwünschten Reflexen können Blenden, z. B. halbkreisförmige Blenden, in den Autofokus-Strahlengang eingebracht werden.
Der Strahlteiler 11 kann eine planparallele Glasplatte sein, die auf einer Seite entspiegelt ist, ohne störende Sekundärbilder zu vermeiden. Die der Reflexion des Autofokussignals dienende Seite der Glasplatte kann auch eine dichroitische Beschichtung aufweisen, die die Reflektivität für das langwellige Autofokuslicht erhöht (wenn die Variante mit langwelliger Autofokusbeleuchtung verwendet wird) und das kurzwelligere Nutzlicht der Mikroskopie (z. B. Fluoreszenzstrahlung) überwiegend transmittieren. Natürlich sind auch andere spektrale Aufteilungen möglich.
3 zeigt in Draufsicht eine Bauweise des Lichtmodulators 12 zum Erzeugen des Modulationsobjektes, das als Gitterspalt G1 ausgebildet ist. Die Projektion des Gitterspaltes G1 erzeugt Streifenkonturen in der Probe. Neben dem Gitterspalt G1 ist zusätzlich noch ein weiterer Gitterspalt R1 vorhanden, der als Vergleichsgitterspalt ausgebildet ist, mit dem ein erweiterter Fangbereich realisiert wird.
Der Gitterspalt R1 weist eine Gitterfrequenz auf, die so hoch ist, dass sie von der Optik nicht mehr aufgelöst werden kann. Die Projektion des Gitterspaltes R1 ist somit in der Ebene der Autofokuskamera nicht strukturiert oder kann aufgrund der Kamerapixelierung nicht mehr aufgelöst werden.
Zusätzlich zum Gitterspalt R1 ist in der Abbildung der 3 auch noch ein Spalt R2 eingezeichnet, der entlang seiner Längserstreckung nicht strukturiert ist. Wird er auf die Probe projiziert und dann die Projektion auf die Autofokuskamera abgebildet, ist dieses Vergleichsspaltbild um das Tastverhältnis des Gitterspaltes R2 heller.
Der Gitterspalt R2 und der Gitterspalt R1 dienen als Vergleichsspalt für den Gitterspalt G1. Mittels des Gitterspaltes G1 wird folgende, aus dem Stand der Technik bekannte Autofokusfunktion beim Mikroskop 1 realisiert. Der Gitterspalt G1 wird auf die Probe 2 projiziert. Die Projektion des Gitterspaltes G1 wird auf die Autofokuskamera abgebildet. Aufgrund der erwähnten Schrägstellung liefert eine Kontrastauswertung des Gitterspaltbildes an der Autofokuskamera eine Angabe über die Relativlage von Objektebene und erwähnter Grenzfläche der Probe 2. Die Kontrastauswertung erlaubt es damit, die Objektebene auf ein gewünschtes Maß relativ zur Probe 2 einzustellen. Dies ist im Stand der Technik bekannt.
Der Gitterspalt R1 oder der Gitterspalt R2 dienen dazu, einen erweiterten Fangbereich für Situationen zu realisieren, in denen das Gitterspaltbild des Gitterspaltes G1 an der Autofokuskamera keinen ausreichenden Kontrast bildet, weil die Abbildung zu stark defokussiert ist. In einer solchen Situation wird der Gitterspalt R1 oder der Gitterspalt R2 als Vergleichsspalt herangezogen. Nur einer der beiden Spalte muss verwendet werden, und die Eintragung beider Gitterspalte R1 und R2 in 3 soll lediglich unterschiedliche Ausführungsformen in einer Figur zusammenfassen. Die Spalte R1, G1, G2, R2 verlaufen bevorzugt aber nicht zwingend durch die Mitte oder in der Nähe der Mitte des Lichtmodulators 12.
Nachfolgend wird der erweiterte Fangbereich, der durch die als Vergleichsspalt dienenden Gitterspalte R1 oder R2 realisiert wird, exemplarisch am Beispiel des Gitterspaltes R1 erläutert.
Der Gitterspalt R1 wird auf die Probe 2 projiziert und als Vergleichsspaltbild auf die Autofokuskamera 16 abgebildet. 4 zeigt im oberen Graphen die Verhältnisse, die sich einstellen, wenn die Probe fokussiert ist. Man erhält im Kamerabild das Vergleichsspaltbild 30 in x- und y-Koordinaten. Die Intensität des Vergleichsspaltbildes 30 ist durch verschieden schraffierte Zonen 31 (hohe Intensität) 32 (mittlere Intensität) und 33 (niedere Intensität) angedeutet. Die Breite des Vergleichsspaltbildes 30 an zwei Koordinaten x₁ und x₂ ist im wesentlichen gleich. Der mittlere Graph der 4 zeigt die Intensitätsverteilung des Vergleichsspaltbildes 30 an der Koordinate x₁. Die Intensität in y-Richtung ist durch die Kurve 34 gegeben. Die Breite des Vergleichsspaltbildes 30 ist als Halbwertsbreite gegeben und hat an der Koordinate x₁ den Wert B₁. Der unterste Graph der 4 zeigt den Verlauf der Intensität quer zur Längserstreckung des Vergleichsspaltbildes 30 (entsprechend quer zur Längserstreckung des Gitterspaltes R1) an der Koordinate x₂. Da die Probe fokussiert ist und das Vergleichsspaltbild 30 dementsprechend nicht verzerrt ist, ergibt sich auch an der Koordinate x₂ die Breite B₂ = B₁.
5 zeigt die Verhältnisse bei einer Defokussierung oberhalb der Objektebene. Das Vergleichsspaltbild 30 ist verzerrt und der Vergleich der Kurven 34 und 35 verdeutlicht, dass die Breite B₁ größer ist als die Breite B₂.
Die Verhältnisse sind demgegenüber invertiert in der Abbildung der 6, bei der eine Defokussierung unterhalb der Objektebene vorhanden ist.
Auf Basis eines Vergleichs der Breiten (genauer gesagt der Halbwertsbreiten) wird die Richtung der Defokussierung angegeben.
Der experimentell ermittelte Zusammenhang der 7 erlaubt es optional auch, den Betrag der Defokussierung abzuschätzen. 7 zeigt in Kurven 36 und 37 die Breiten B₁ und B₂ als Funktion der Defokussierung, also als Funktion der z-Koordinate. Bei z₀ fällt die Grenzfläche der Probe mit der Objektebene zusammen, d. h. die Probe ist fokussiert. Zwischen den Werten z₁ und z₂ kann eine Kontrastauswertung des Gitterspaltbildes des Gitterspaltes G1 stattfinden. Dies ist der Fangbereich der Autofokustechnik gemäß dem Stand der Technik. Liegt eine Defokussierung bei z-Werten unterhalb von z₁ oder oberhalb von z₂ vor, ist keine Kontrastauswertung mehr möglich. Das Vorzeichen der Differenz zwischen den Breiten B₁ und B₂ erlaubt es, die Richtung anzugeben, in der eine Relativverstellung von Probe und Objektebene erfolgen muss, um die Defokussierung aufzuheben. Links von z₀ verläuft die Kurve 36 über der Kurve 37 – also ist die Halbwertsbreite B₁ größer als die Halbwertsbreite B₂. Rechts von der z-Position z₀ verläuft die Kurve 36 unter der Kurve 37 – die Halbwertsbreite B₂ ist also größer als B₁ (entsprechend den Verhältnissen der 6). Aus dem Absolutwert einer der Halbwertsbreiten B₁ oder B₂ kann unter Kenntnis des Verlaufes der 7 auch der Betrag abgeschätzt werden, um den die Relativverstellung zu erfolgen hat. Aus dem Absolutwert der Breite B₁ kann beispielsweise aus der Kurve 36 ermittelt werden, wie groß in etwa der z-Abstand zum Wert z₀ ist. Eine Relativverstellung um diesen Betrag und in der durch das Vorzeichen gegebenen Richtung führt dann in den Fangbereich der kontrastauswertenden Autofokusfunktion.
Einen störsichereren Ansatz erhält man, wenn beide Breiten B₁ und B₂ in Absolutwerten oder im Verhältnis ausgewertet und unter Kenntnis des Zusammenhangs der 7 zur Ermittlung eines Maßes für die Relativverstellung ausgewertet werden.
Für den derart erreichten erweiterten Fangbereich der Autofokusfunktion kann sowohl der Gitterspalt R1 als auch der Gitterspalt R2 verwendet werden.
In 3 ist zusätzlich noch ein Gitterspalt G2 eingezeichnet, der zum Gitterspalt G1 komplementär ist. Es ist leicht zu erkennen, dass man bei Zusammenfassen des Gitterspaltbildes aus G1 und des Abbildes von G2 in der Kamerabildebene ein Vergleichsgitterspaltbild 30 erhält, das längs des Längsverlaufes von G1 bzw. G2 keine Struktur mehr hat. Das Vergleichsgitterspaltbild 30 kann somit nicht nur durch Verwendung eines Gitterspaltes R1 mit einer Strukturfeinheit, die nicht mehr von der Optik aufgelöst werden kann, oder eines Gitterspaltes R2, der entlang seiner Längserstreckung nicht strukturiert ist, realisiert werden, sondern auch durch Verwendung eines zum Gitterspalt G1, der für die kontrastbasierte Autofokusfunktion verwendet wird, komplementären Gitterspaltes G2, der den Gitterspalt G1 so ergänzt, dass Gitterspalt G1 und G2 zusammengenommen keine Struktur entlang der Längsrichtung haben.
Für den erweiterten Fangbereich genügt es, einen Gitterspalt als Vergleichsgitterspalt heranzuziehen. Die Genauigkeit des Autofokusverfahrens wird jedoch durch die Eigenschaften der Probe mitunter beeinflusst, da die Probe die Projektion des Vergleichsgitterspaltes und damit letztlich das Vergleichsgitterspaltbild moduliert. Das kann zu Ungenauigkeiten in der Autofokusfunktion und im erzeugten Autofokussignal führen, wenn dadurch die Breitenermittlung (z. B. die Halbwertsbreitenermittlung) fehlerhaft wird. Dies kann kompensiert werden, indem die Breite nicht nur an zwei Stellen x₁ und x₂ ausgewertet wird, sondern in einem Fensterbereich, d. h. für mehrere Werte x₁ und mehrere Werte x₂. Auch ist es möglich, mehrere Vergleichsspalte zu verwenden, z. B. den Vergleichsspalt R1 oder den Vergleichsspalt R2 mehrfach im Modulationsobjekt 12 vorzusehen.
Die Erfindung macht sich zunutze, dass für einen erweiterten Fangbereich ein Vergleichsgitterspaltbild verwendet wird, das längs der Längserstreckung des zugrundeliegenden Gitterspaltes, d. h. längs der Richtung, die durch den Gitterspalt, welcher für die kontrastauswertende Autofokusfunktion verwendet wird, vorgegeben ist, nicht strukturiert ist. Die Intensitätsverteilung im Vergleichsgitterspaltbild variiert längs dieser Längsrichtung und ist unterschiedlich breit, wenn Defokussierung vorliegt. Die Abbildung kann dabei bei unterschiedlichen Belichtungszeiten oder Beleuchtungsleistungen erfolgen, um eine ausreichende Intensität in den Bereichen 31 bis 33 des Vergleichsgitterspaltbildes 30 zu erreichen.
Zusätzlich kann als Maß für die Defokussierung auch noch die Höhe der Kurven 34 und 35 herangezogen werden. Das Verhältnis B₁/I₁ bzw. B₂/I₂ ist ebenfalls ein Maß für die Defokussierung und erlaubt, analog zur Verwendung der 7 den Betrag der Relativverstellung zu ermitteln, der nötig ist, um wieder mit dem kontrastbasierten Autofokus zu arbeiten – mit anderen Worten, um vom erweiterten Fangbereich in den normalen Fangbereich zu kommen.
Die Breiten B₁ und B₂ sind üblicherweise Halbwertsbreiten, also die Breite, die sich beim Intensitätsabfall auf die Hälfte ergibt. Es können aber auch andere Breitenmaße angesetzt werden, beispielsweise bei einem Abfall auf 30 %. Zusätzlich oder alternativ können auch Ableitungen aus den Kurven 34 und 35 ermittelt werden, beispielsweise d(B₁/I₁)/dz, wobei z die Variable für den Abstand zwischen Objektebene und Fokusebene ist.
Die Auswertung im erweiterten Fangbereich, d. h. die erwähnte Breitenanalyse des Vergleichsspaltbildes 30 kann iterativ so lange ausgeführt werden, bis ein ausreichender Kontrast für den Gitterspalt G1 erreicht ist, der die herkömmlich Autofokusfunktion erlaubt.
Weist die Probe ein Höhenprofil auf, wie z. B. Leiterbahnen bei Solarzellen, kann es vom Benutzer wahlweise gewünscht sein, einen lichtabsorbierenden Untergrund oder höher liegende Leiterbahnen scharf zu stellen. Für diesen Fall wird optional vorgesehen, in einer Bediensoftware und/oder in einer Bedienkonsole einen Regler vorzusehen, mit dem ein variabler Offset der Fokusposition eingestellt werden kann. Dadurch wird es möglich, eine Probenoberfläche als Reflexionsfläche für den Autofokus zu nutzen, die in einer anderen Tiefenebene liegt als die Fokusebene, in welcher die scharf zu stellenden Merkmale der Probe (z. B. Leiterbahn) liegen. Mit der Offset-Regelung wird z. B. der Höhenunterschied zwischen Untergrund und Leiterbahnen eingestellt. Die Offset-Einstellung kann manuell oder mit Hilfe von mehreren Autofokusmessungen erfolgen. In analoger Weise ist damit auch eine Haltefokus-Funktion an biologischen Proben möglich.
Bei nicht-ebenen Proben, z. B. Linsen- oder Spiegeloberflächen, kann das Autofokusverfahren mit einer motorisierten Winkelverstellvorrichtung zur variablen Verkippung der Probe kombiniert werden. Dazu muss die Oberflächenform der Probe lediglich so grob bekannt sein und vorgegeben werden, dass die Oberfläche beim lateralen Verfahren der Probe im Fangbereich bleibt und stets lokal senkrecht zur optischen Achse steht. Unter diesen Bedingungen kann auch eine gekrümmte Oberfläche bei lateraler Verschiebung der Probe mit dem Autofokusverfahren in konstantem Abstand zum Objektiv gehalten werden, d. h. autofokussiert werden. Alternativ kann diese Vorgehensweise auch dazu genutzt werden, die Form der Probe mittels des Autofokusverfahrens hochgenau (bis auf wenige Nanometer) zu vermessen. Dies ist eine Metrologie-Anwendung.
Das Autofokusverfahren kann als Kollisionsschutz für Objektiv bzw. Probe verwendet werden. Wenn der Arbeitsabstand des Objektivs bekannt ist, kann abgeleitet werden, wie weit die Probenoberfläche noch vom Objektiv entfernt ist. Entsprechend kann eine Warnung oder automatische Abschaltung des z-Triebs erfolgen, wenn der Abstand zwischen Objektiv und Probe zu gering würde.
Mit dem Autofokusverfahren kann auch ein Höhenprofil einer Probenoberfläche erstellt werden. Dazu wird die Probe lateral verfahren, was kontinuierlich oder schrittweise erfolgen kann. Während des Verfahrens wird dann mittels des Autofokus in regelmäßigen oder stochastischen Abständen der Abstand zwischen Objektiv und Probenoberfläche bestimmt. Das Höhenprofil kann zur Charakterisierung der Probe oder für eine schnelle Fokussierung bei einer späteren gerasterten Bildaufnahme (Image Stitching) verwendet werden.
Verwendet man sehr ebene Referenzproben, so können mit diesem Verfahren auch die Unzulänglichkeiten (z. B. Höhenschlag, Winkelfehler) des Probentisches vermessen werden.
Statt eines Höhenprofils kann auch ein Dickenprofil von transparenten Proben, z. B. Objektträgern, Deckgläsern, Folien oder Glaswafern, mit dem Autofokusverfahren aufgenommen werden. Dazu ist die Objektivvergrößerung vorzugsweise so einzustellen, dass die Gitterreflexe von der Vorderseite und von der Rückseite der transparenten Probe gleichzeitig im primären Fangbereich erscheinen. Der Abstand der beiden Kontrastmaxima der Gittersignale ist dann proportional zur Dicke der Probe.
Das Autofokusverfahren ist für Bildaufnahme- oder Inspektionsvorrichtungen anwendbar. Hierzu gehören insbesondere alle Arten von Mikroskopvorrichtungen, Wafer- und Wafermasken-Inspektionsvorrichtungen, automatisierte Reader und metrologische Messvorrichtungen. Die Proben können anorganischer oder organischer Art sein, wobei auch Gewebeteile oder Oberflächen lebender Objekte eingeschlossen sind.
Natürlich muss der Lichtmodulator 12 nicht, wie in 3 gezeigt, als statische Struktur ausgebildet werden. Er kann mittels eines entsprechend ansteuerbaren Elementes realisiert werden, das die Modulationsstruktur und die für die Vergleichsstruktur zusätzlichen Strukturen bereitstellt. Dies kann auch ganz grundsätzlich sequentiell erfolgen. Das hat den Vorteil, dass Vergleichsstruktur und Modulationsstruktur exakt an derselben Stelle in die Probe 2 abgebildet werden können, so dass der an und für sich geringe Versatz zwischen Vergleichsstruktur und Modulationsstruktur, der beispielsweise zwischen den Gitterspalten G1 und R1 der 8 besteht, aufgehoben ist. Damit ist es völlig unmöglich, dass die Reflektivität der Probe zwischen den Bildern des Gitterspaltes und des Vergleichsspaltes lokal schwankt.
Die den Gitterspaltbildern und den Vergleichsspaltbildern zugeordneten Areale auf der Autofokuskamera können vorzugsweise aus mehreren Spalten und Zeilen bestehen, so dass man zur Rauschminimierung über mehrere Spalten oder Zeilen mitteln kann.
Bei allen Varianten des Autofokus- und Tracking-Systems wird eine rechnerische Steuer- und Auswerteeinrichtung (z. B. ein Computer) verwendet, die die Signalanalyse und die Steuerung des Aktuatoren (z-Trieb, x-y-Tisch, Filter etc.) vornimmt. Auswertung und Steuerung können Firmware- und/oder Software-technisch implementiert werden. Diese Steuerung Auswerteeinrichtung übernimmt sämtliche hier geschilderte Ablaufsteuerung.
Statt verstellbarer, z. B. elektrisch schaltbarer Lichtmodulatoren (z. B. LCD, DMD) können auch statische Lichtmodulatoren (Transmissions- oder Phasengitter) verwendet werden. Das projizierte Modulationsobjekt kann mit verkippbaren Planplatten oder anderen Vorrichtungen probenseitig verschiebbar sein. Ein Austausch der Gitter kann zur Variation der Gitterkonstante oder -struktur ebenfalls möglich sein. Wie erläutert kann auch eine flächige Gitterstruktur verwendet werden, die mehrere unterschiedliche Gitterperioden aufweist, beispielsweise 2 bis 10 nebeneinander angeordnete Streifengitter mit unterschiedlichen Gitterfrequenzen. Je nach Ausbildung kann dabei für jede Struktur ein eigenes Vergleichsobjekt oder auch für mehrere oder alle Gitterstrukturen ein gemeinsames Vergleichsobjekt vorgesehen sein.
Da das Autofokusverfahren bevorzugt (aber nicht zwingend) mit flächigen (zweidimensionalen) Kameras arbeiten kann, kann dann bei mehreren Gitterzeilen für jeden Anwendungsfall das am besten geeignete Gitter durch Auslesen der entsprechenden Kamerazeilen gewählt werden, ohne mechanische Änderungen (z. B. Austausch des Gitters) vornehmen zu müssen.
Das geschilderte Prinzip des Lichtmodulators, der eine Modulationsstruktur und eine Vergleichsstruktur bereitstellt, kann nicht nur bei einem Mikroskop verwendet werden, wie es die WO 2007/144197 A1 beschreibt, sondern auch ein Mikroskop der Bauweise gemäß DE 10319182 A1 kommt in Frage. Die Offenbarung dieser Druckschrift wird deshalb diesbezüglich vollumfänglich einbezogen. Die Modulationsstruktur wie auch die für die Vergleichsstruktur erforderliche Struktur befindet sich dann an einem schräg verlaufenden Rand einer konfokalen Spaltblende. Die Abbildung des Modulationsobjektes sowie des Vergleichsobjektes erfolgt damit weitestgehend durch den Strahlengang, der auch zur Probenabbildung im Mikroskop bereitgestellt ist.
Soweit in dieser Beschreibung Verfahrensschritte bzw. besondere Betriebsweisen oder -modi geschildert sind, werden diese durch ein zur Autofokuseinrichtung gehörenden Steuereinrichtung z. B. wie im Steuergerät 26, realisiert. Natürlich kann auch eine im Mikroskop 1 ohnehin vorhandene Steuereinrichtung die entsprechenden Steueraufgaben mit übernehmen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 2007/144197 A1 [0003, 0008, 0027, 0027, 0027, 0038, 0072]
DE 10319182 A1 [0072]

Claims

Autofokusverfahren für ein Mikroskop mit einem Objektiv (4), das eine in einer Objektebene liegende Probe (2) abbildet, wobei a) ein längserstreckter Gitterspalt (G1), der in einer Gitterspaltebene liegt, auf die Probe (2) projiziert wird und die Projektion des Gitterspalts (G1) als Gitterspaltbild auf eine Autofokuskamera (16, 18), die eine Kamerabildebene hat, abgebildet wird, wobei entweder die Gitterspaltebene oder die Kamerabildebene schräg zu einer Ebene liegt, die zur Objektebene konjugiert ist, b) eine Intensitätsverteilung des Gitterspaltbildes ermittelt und daraus eine Vorgabe für eine Relativverstellung von Probe (2) und Objektebene abgeleitet wird, dadurch gekennzeichnet, dass c) ein ebenfalls längserstreckter Vergleichsspalt (R1; R2), der parallel zum Gitterspalt (G1) in der Gitterspaltebene liegt und entlang der Längserstreckung nicht strukturiert ist, auf die Probe (2) projiziert wird, und die Projektion des Vergleichsspalts (R1; R2) als Vergleichsspaltbild (30) auf die Autofokuskamera (16, 18) abgebildet wird, und, d) die Breite (B₁, B₂) des Vergleichsspaltbilds (30) quer zur Längserstreckung an mindestens zwei Stellen (x₁, x₂), die entlang der Längserstreckung beabstandet sind, ausgewertet wird, daraus ein Breitenverlauf des Vergleichsspaltbilds (30) ermittelt wird, ein Gradient des Breitenverlaufs bestimmt wird und daraus eine Richtung der Relativverstellung abgeleitet wird.
Autofokusverfahren für ein Mikroskop mit einem Objektiv (4), das eine in einer Objektebene liegende Probe (2) abbildet, wobei a) ein längserstreckter Gitterspalt (G1), der in einer Gitterspaltebene liegt, auf die Probe (2) projiziert wird, die Projektion des Gitterspalts (G1) als Gitterspaltbild auf eine Autofokuskamera (16, 18), die eine Kamerabildebene hat, abgebildet wird, wobei entweder die Gitterspaltebene oder die Kamerabildebene schräg zu einer Ebene liegt, die zur Objektebene konjugiert ist, b) eine Intensitätsverteilung des ersten Gitterspaltbildes ermittelt und daraus eine Vorgabe für eine Relativverstellung von Probe (2) und Objektebene abgeleitet wird, dadurch gekennzeichnet, dass c) ein ebenfalls längserstreckter Vergleichsspalt (G2), der komplementär zum Gitterspalt (G1) strukturiert ist und parallel zum Gitterspalt (G1) in der Gitterspaltebene liegt, auf die Probe (2) projiziert wird, die Projektion des Vergleichsspalts (G2) auf die Autofokuskamera (16, 18) abgebildet und mit dem Gitterspaltbild zu einem Vergleichsspaltbild (30) zusammengefasst wird, und, d) die Breite (B₁, B₂) des Vergleichsspaltbilds (30) quer zur Längserstreckung an mindestens zwei Stellen (x₁, x₂), die entlang der Längserstreckung beabstandet sind, ausgewertet wird, daraus ein Breitenverlauf des Vergleichsspaltbilds (30) ermittelt wird, ein Gradient des Breitenverlaufs bestimmt wird und daraus eine Richtung der Relativverstellung abgeleitet wird.
Autofokusverfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt c) und/oder d) nur ausgeführt wird, wenn die Intensitätsverteilung des Gitterspaltbildes nicht mit einem vorbestimmten Mindestkontrast aufgelöst werden kann.
Autofokusverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt d) die Breite des Vergleichsspaltbilds (30) an zwei Stellen (x₁, x₂) ausgewertet wird und der Gradient des Breitenverlaufs bestimmt wird, indem die Differenz der Breiten (B₁, B₂) gebildet wird, und die Richtung der Relativverstellung aus dem Vorzeichen der Differenz abgeleitet wird.
Autofokusverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte c) und d) so lange wiederholt werden, bis entweder die Intensitätsverteilung des Gitterspaltbildes mit dem vorbestimmten Mindestkontrast aufgelöst werden kann oder eine vorbestimmte Anzahl an Wiederholungen erreicht ist.
Autofokusverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem Absolutwert einer der oder beider Breiten (B₁, B₂) ein Betrag der Relativverstellung von Probe (2) und Objektebene abgeleitet wird.
Autofokusverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein Verhältnis beider Breiten (B₁, B₂) gebildet wird und aus dem Verhältnis ein Betrag der Relativverstellung von Probe (2) und Objektebene abgeleitet wird.
Autofokusverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Lage des Gitterspaltes (G1) und/oder des Vergleichsspaltes (R1; R2; G2) innerhalb der Gitterspaltebene verschoben wird, wenn
Mikroskop mit einem Objektiv (4), das eine in einem Probenraum (2) liegende Objektebene aufweist, und einer Autofokuseinrichtung, die aufweist – einen längserstreckten Gitterspalt (G1), der in einer Gitterspaltebene liegt, – einen ebenfalls längserstreckten Vergleichsspalt (R1; R2; G2), der parallel zum Gitterspalt (G1) in der Gitterspaltebene liegt und entlang der Längserstreckung entweder nicht (R1; R2) oder komplementär (G2) zum Gitterspalt (G1) strukturiert ist, – eine Autofokus-Beleuchtungsoptik (7; 20), die den Gitterspalt (G1) und den Vergleichsspalt (R1) in den Probenraum (2) projiziert, – eine Autofokus-Kamera (16, 18) mit einer Kamerabildebene, – eine Autofokus-Abbildungsoptik (7; 20), die ein Bild der im Probenraum (2) liegenden Projektion des Gitterspaltes (G1) als Gitterspaltbild auf die Autofokus-Kamera (16, 18) abbildet, – wobei entweder die Gitterspaltebene oder die Kamerabildebene schräg zu einer Ebene liegt, die zur Objektebene konjugiert ist, und – das Mikroskop (1) eine Steuereinrichtung (26) aufweist, die ausgebildet ist, mit dem Mikroskop (1) ein Autofokusverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 auszuführen.
Mikroskop nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Vergleichsspalt ein Gitterspaltes (R1) ist, dessen Gitterkonstante unterhalb einer Auflösungsgrenze der Autofokus-Abbildungsoptik (7; 20) liegt.