DE102015116452A1

DE102015116452A1 - Mikroskop

Info

Publication number: DE102015116452A1
Application number: DE102015116452.3A
Authority: DE
Inventors: Matthias Pospiech; Steffen Leidenbach
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2015-09-29
Filing date: 2015-09-29
Publication date: 2017-03-30
Also published as: US20170090176A1; US10254526B2

Abstract

Es wird ein Mikroskop mit einem Halter (2) zum Haltern eines Probenträgers (9), einer Abbildungseinheit, die einen ersten Detektor (5) und eine erste Abbildungsoptik (3) zum Abbilden zumindest eines Teils einer vom Probenträger (9) gehalterten Probe (8) entlang einer ersten optischen Achse auf den ersten Detektor (5) aufweist, einer Steuereinheit (S) und einer Detektionseinheit (11), die ein Beleuchtungsmodul (12), einen zweiten Detektor (20) und eine zweite Abbildungsoptik aufweist, bereitgestellt, wobei das Beleuchtungsmodul (12) einen Probenträger (9), der vom Halter (2) gehaltert ist, mit einem vorbestimmten Muster (M) beleuchtet, das mittels der zweiten Abbildungsoptik (3) auf den zweiten Detektor (20) abgebildet wird, wobei der zweite Detektor (20) so maskiert ist, dass ein Detektionsbereich des zweiten Detektors (20), den das Muster (M) bei fokussierter Abbildung belegt, oder ein Teil des Detektionsbereiches als Auswertebereich (24; 241, 242) festgelegt ist, und wobei die Steuereinheit (S) vom zweiten Detektor (20) nur die aus dem Auswertebereich (24; 241, 242) stammenden Messwerte auswertet, um die Richtung der Änderung der Lage des Fokus der ersten Abbildungsoptik (3) entlang der ersten optischen Achse mit dem Ziel zu bestimmen, die zur Probenseite gerichtete Grenzfläche des Probenträgers (9) im Tiefenschärfebereich der ersten Abbildungsoptik (3) zu positionieren.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mikroskop mit einem Halter zum Haltern eines Probenträgers, einer Abbildungseinheit, die einen ersten Detektor und eine erste Abbildungsoptik zum Abbilden zumindest eines Teiles einer vom Probenträger gehalterten Probe entlang einer ersten optischen Achse auf den ersten Detektor aufweist, und einer Steuereinheit. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein entsprechendes Mikroskopierverfahren.
Da man in der Regel nach dem Einlegen des Probenträgers mit einer neuen zu untersuchenden Probe den Abstand zwischen dem Probenträger und der ersten Abbildungsoptik nicht kennt, muss man z.B. bei vollautomatisierten Bildaufnahmeprozessen zunächst diesen Abstand so ändern, dass die Probe im Tiefenschärfebereich der ersten Abbildungsoptik liegt. Dann kann der vollautomatisierte Bildaufnahmeprozess durchgeführt werden.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mikroskop der eingangs genannten Art so weiterzubilden, dass die vom Probenträger gehalterte Probe sicher im Tiefenschärfebereich der ersten Abbildungsoptik positioniert werden kann.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe bei einem Mikroskop der eingangs genannten Art dadurch gelöst, dass eine Detektionseinheit mit einem Beleuchtungsmodul, einem zweiten Detektor und einer zweiten Abbildungsoptik vorgesehen ist, wobei das Beleuchtungsmodul einen Probenträger, der vom Halter gehaltert ist, mit einem vorbestimmten Muster beleuchtet, das mittels der zweiten Abbildungsoptik auf den zweiten Detektor abgebildet wird, wobei der zweite Detektor so maskiert ist, dass ein Detektionsbereich des zweiten Detektors, den das Muster bei fokussierter Abbildung belegt, oder ein Teil des Detektionsbereiches als Auswertebereich festgelegt ist, und wobei die Steuereinheit vom zweiten Detektor nur die aus dem Auswertebereich stammenden Messwerte auswertet, um die Richtung der Änderung der Lage des Fokus der ersten Abbildungsoptik entlang der ersten optischen Achse mit dem Ziel zu bestimmen, die zur Probenseite gerichtete Grenzfläche des Probenträgers in den Tiefenschärfebereich der ersten Abbildungsoptik zu bekommen.
Durch diese Festlegung des Auswertebereiches kann in einfacher Art und Weise z.B. durch Auswerten der gesamten Intensität aus dem Auswertebereich für beispielsweise mindestens zwei verschieden Fokuslagen der zweiten Abbildungsoptik sicher die Richtung der Änderung der Lage des Fokus der ersten Abbildungsoptik entlang der ersten optischen Achse bestimmt werden. So wird die gesamte Intensität aus dem Auswertebereich umso größer, je näher der Fokus der zweiten Abbildungsoptik an einer Grenzfläche des Probenträgers liegt. Mit dem erfindungsgemäßen Mikroskop wird somit die reflektierende Eigenschaft der Grenzfläche des Probenträgers genutzt, um ihre Position entlang der ersten optischen Achse aufzufinden. Man kann auch sagen, dass die Lage des Fokus der ersten Abbildungsoptik bezüglich einer Grenzfläche des Probenträgers ermittelt wird. Darunter wird insbesondere verstanden, ob sich der Probenträger oberhalb oder unterhalb der aktuellen Fokusposition der ersten Abbildungsoptik befindet. Aus dieser Kenntnis kann somit auf die Richtung der Fokuskorrektur geschlossen werden. Die ermittelte Lage kann somit dazu genutzt werden, den Abstand zwischen der ersten Abbildungsoptik und dem Probenträger so zu ändern, dass die zur Probenseite gerichtete Grenzfläche des Probenträgers und somit die vom Probenträger getragene Probe in dem Tiefenschärfebereich der ersten Abbildungsoptik positioniert wird.
Insbesondere kann mit dem erfindungsgemäßen Mikroskop die zur ersten Abbildungsoptik weisende Grenzfläche des Probenträgers gefunden werden. Damit kann man beispielsweise mit Kenntnis der Dicke des Probenträgers die von der ersten Abbildungsoptik wegweisende Grenzfläche des Probenträgers anfahren. Alternativ ist es möglich, mit dem erfindungsgemäßen Mikroskop direkt die von der ersten Abbildungsoptik wegweisende Grenzfläche des Probenträgers aufzufinden. Wenn man dann die obere Grenzfläche so anfährt, dass der Fokus der ersten Abbildungsoptik direkt an der oberen Grenzfläche liegt, wird sich die auf dem Probenträger getragene Probe, die sich direkt an der oberen Grenzfläche befindet, in der Tiefenschärfe der ersten Abbildungsoptik befinden. Darüber hinaus kann in vorteilhafter Weise nach Ermittlung der Position zumindest einer Grenzfläche des Probenträgers die so ermittelte Position für bekannte Autofokusverfahren genutzt werden, um eine Fokusstabilisierung über den Reflex an einer solchen Grenzfläche durchzuführen.
Mit dem erfindungsgemäßen Mikroskop kann somit eine Reflexionsfläche (bzw. deren Position) ermittelt werden.
Wenn die Probe vom Probenträger an seiner Grenzfläche gehaltert wird, kann eine schnelle Positionierung der Probe im Tiefenschärfebereich der ersten Abbildungsoptik erreicht werden. Selbst wenn die Probe von der zur Probenseite gerichteten Grenzfläche beabstandet sein sollte, ist eine schnelle Positionierung im Tiefenschärfebereich der ersten Abbildungsoptik der ersten Abbildungsoptik möglich. So kann der Probenabstand so gering sein, dass er nicht größer als der Tiefenschärfebereich ist. In diesem Fall, führt schon die Positionierung der zur Probenseite gerichteten Grenzfläche in dem Tiefenschärfebereich der ersten Abbildungsoptik dazu, dass auch die Probe im Tiefenschärfebereich (oder sehr nah dazu) positioniert ist. Sollte der Probenabstand von der zur Probenseite gerichteten Grenzfläche größer als der Tiefenschärfebereich sein, so führt die Positionierung der zur Probenseite gerichteten Grenzfläche im Tiefenschärfebereich der ersten Abbildungsoptik dazu, dass nur noch eine geringe Nachfokussierung (im Vergleich zu dem Fall, in dem nicht erst die Grenzfläche in dem Tiefenschärfebereich positioniert wird) notwendig ist, um die Probe in dem Tiefenschärfebereich zu positionieren.
Insbesondere kann erfindungsgemäß die Grenzfläche des Probenträgers und/oder die Grenzfläche der Probe, die vom Probenträger getragen ist, so relativ zur ersten Abbildungsoptik positioniert werden, dass diese Grenzfläche im Tiefenschärfebereich der ersten Abbildungsoptik liegt.
Unter dem Abbilden des Musters mittels der zweiten Abbildungsoptik auf den zweiten Detektor wird hier insbesondere verstanden, dass die Reflexion des Musters an zumindest einer Grenzfläche des Probenträgers auf den zweiten Detektor abgebildet wird.
Das erfindungsgemäße Mikroskop kann mittels der ersten Abbildungsoptik insbesondere eine vergrößernde Abbildung durchführen.
Da die Detektionseinheit den zweiten Detektor aufweist, der nicht der erste Detektor der Abbildungseinheit ist, können die Aufnahmen mittels des ersten Detektors unabhängig von der Ermittlung der Lage der Probenträgergrenzfläche mittels der Detektionseinheit durchgeführt werden. Dies führt zu einem Geschwindigkeitsgewinn in der Datenverarbeitung zur Bestimmung der Lage der Probenträgergrenzfläche und der Bildgewinnung, da eine Parallelverarbeitung möglich ist.
Insbesondere kann die Beleuchtung des Probenträgers mit dem vorbestimmten Muster über zumindest einem Teil der ersten Abbildungsoptik durchgeführt werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Mikroskop kann die Steuereinheit die Detektionseinheit und/oder den Halter so ansteuern, dass das vorbestimmte Muster bei zwei verschiedenen Fokuslagen der zweiten Abbildungsoptik auf den zweiten Detektor abgebildet wird, wobei die Steuereinheit anhand der Messwerte ermittelt, in welche Richtung die Fokuslage zu verschieben ist, um die Lage der Grenzfläche des Probenträgers ermitteln zu können. Die verschiedenen Fokuslagen können z.B. durch Verschieben eines Objektives der Detektionseinheit (die Detektionseinheit und die Abbildungseinheit können dasselbe Objektiv aufweisen) und/oder des Halters entlang der Abbildungsrichtung eingestellt werden. Zusätzlich oder alternativ ist es möglich, den zweiten Detektor entlang der Abbildungsrichtung zu verschieben.
Ferner kann die Detektionseinheit zumindest zwei zweite Detektoren aufweisen, deren optischer Abstand in Abbildungsrichtung zum Halter unterschiedlich ist, so dass das vorbestimmte Muster gleichzeitig in unterschiedlichen Fokuslagen aufgenommen werden kann. Damit kann schon mit einem einzelnen Aufnahmevorgang, bei dem die relative Lage zwischen dem Halter und der Detektionseinheit unverändert bleibt, die Richtung bestimmt werden, in die die Fokuslage zu verschieben ist, um die gewünschte Positionierung der zur Probenseite gerichteten Grenzfläche des Probenträgers in dem Tiefenschärfebereich der ersten Abbildungsoptik durchzuführen.
Insbesondere kann die Änderung der Fokuslage zur Aufnahme des vorbestimmten Musters mit der Detektionseinheit mit geringer werdendem Abstand zum Zielzustand kleiner und mit größer werdenden Abstand größer gewählt werden. Es wird somit eine dynamische Schrittweitenanpassung an die Signalsteigung durchgeführt. D.h. bei großem Abstand große Schritte und bei Annäherung an den Zielzustand kleinere Schritte. Damit kann eine hohe Geschwindigkeit und eine hohe Genauigkeit bei der Positionierung der Grenzfläche des Probenträgers in dem Tiefenschärfebereich der ersten Abbildungsoptik erreicht werden.
Ferner kann das Beleuchtungsmodul so ausgebildet sein, dass das vorbestimmte Muster, mit dem der Probenträger beleuchtet ist, zwei lateral voneinander beabstandete Teilmuster aufweist, die den Probenträger in unterschiedlichen Fokuslagen beleuchten. Hierunter wird insbesondere verstanden, dass die beiden Teilmuster im Bereich des Probenträgers bei Beleuchtung vorhanden sind. Dabei kann das Beleuchtungsmodul ein Muster so auf den Probenträger zur Beleuchtung richten (z.B. abbilden), dass der angegebene Beleuchtungszustand erreich wird. Das Muster wird durch das Beleuchtungsmodul vervielfacht und der Probenträger wird mit dem vervielfachten Muster in unterschiedlichen Fokuslagen beleuchtet. Es ist auch möglich, das Muster schon mit den Teilmustern bereitzustellen, so dass das Beleuchtungsmodul die Teilmuster zur Beleuchtung auf den Probenträger richtet oder abbildet. Auch in diesem Fall kann man schon mit einem einzelnen Aufnahmevorgang auf die Richtung schließen, in die die Fokuslage zu verschieben ist, um die gewünschte Positionierung der Grenzfläche des Probenträgers in dem Tiefenschärfebereich der ersten Abbildungsoptik durchzuführen.
Natürlich kann das Beleuchtungsmodul den Probenträger mit dem vorbestimmten Muster so beleuchten, dass mehr als zwei lateral voneinander beabstandete Teilmuster vorgesehen sind, die jeweils den Probenträger in unterschiedlichen Fokuslagen beleuchten.
Die zumindest zwei Teilmuster können gleiche Form oder auch unterschiedliche Form aufweisen.
Der zweite Detektor kann als z.B. als Zeilensensor oder als flächiger Detektor ausgebildet sein, der parallel zu einer Ebene, in die das vorbestimmte Muster abgebildet wird, ausgerichtet ist. Es ist jedoch auch möglich, dass der zweite Detektor als flächiger Detektor ausgebildet ist und gegenüber einer Ebene, auf die das vorbestimmte Muster abgebildet wird, geneigt angeordnet ist. Durch diese geneigte Anordnung können mit einer Aufnahme Informationen aus unterschiedlichen Fokuslagen gleichzeitig gewonnen werden. Dies kann vorteilhaft sein, wenn die Aufnahme mit einer Fokuslage durchgeführt ist, die einen relativ großen Abstand zum gewünschten Tiefenschärfenbereich der ersten Abbildungsoptik aufweist. Es ist ferner möglich, den Auswertebereich in einen ersten und zweiten Teilbereich aufzuteilen, um somit aufgrund der Schrägstellung Messwerte aus unterschiedlichen Fokuslagen zu erhalten. Damit kann man beispielsweise mit einer einzigen Aufnahme auf die Richtung schließen, in die die Fokuslage zu verschieben ist, um die gewünschte Positionierung der zur Probenseite gerichteten Grenzfläche des Probenträgers in dem Tiefenschärfebereich der ersten Abbildungsoptik durchzuführen.
Ferner kann das Beleuchtungsmodul zwei zweite Detektoren aufweisen, wobei ein erster der zweiten Detektoren gegenüber einer Ebene, in die das vorbestimmte Muster abgebildet wird, geneigt ist, und ein zweiter der zweiten Detektoren parallel zu der Ebene, in die das vorbestimmte Muster abgebildet wird, angeordnet ist. Dies kann insbesondere dazu benutzt werden, um mit dem geneigten zweiten Detektor die Richtung der Verschiebung der Fokuslage aus großen Abständen zur Probenträgergrenzfläche zu ermitteln und mit dem nicht-geneigten zweiten Detektor die Richtung der Verschiebung der Fokuslage aus geringeren Abständen zur Probenträgergrenzfläche zu bestimmen. Der nicht-geneigte zweite Detektor liefert aus geringen Abständen eine präzisere Information über die Richtung und in der Nähe des Maximums (Reflex in der Tiefenschärfe der ersten Abbildungsoptik) kann die Position der Grenzfläche sehr viel präziser bestimmt werden als mit dem geneigten zweiten Detektor. Damit kann im Vergleich zu herkömmliche Verfahren eine größere Reichweite und eine höhere Auflösung erreicht werden.
Die Form des vorbestimmten Musters, mit dem der Probenträger beleuchtet ist, kann grundsätzlich beliebig sein. Das Muster kann insbesondere als Polyeder (z.B. Quadrat oder Rechteck), als Kreis oder Ellipse ausgebildet sein. Es ist jedoch auch möglich, dass das vorbestimmte Muster z.B., als Linie (geradlinig oder gekrümmt), als Wellenlinie oder sonst wie ausgebildet ist. Ferner das das vorbestimmte Muster, mit dem der Probenträger beleuchtet ist, mehrere lateral voneinander beabstandete Teilmuster aufweisen, die in der gleichen und in unterschiedlichen Fokuslage abgebildet sein können. Die Teilmuster können gleiche oder verschiedene Formen aufweisen. Wie bereits beschrieben, ist es auch möglich, dass das Beleuchtungsmodul ein Muster bei der Beleuchtung des Probenträgers vervielfältigt, so dass nur das beleuchtete Muster (das im Bereich des Probenträgers vorliegt) die mehreren Teilmuster aufweist.
Der zweite Detektor kann zumindest eine Lichtdiode aufweisen. Insbesondere kann die Festlegung des Auswertebereichs durch die Anordnung einer oder mehrerer Lichtdioden und/oder das Vorsehen einer mechanischen Blende realisiert werden.
Das Beleuchtungsmodul kann eine Beleuchtungslichtquelle aufweisen, die z.B. als Laser, Halogenlichtquelle, etc. ausgebildet ist.
Das Beleuchtungsmodul kann zur Erzeugung des vorbestimmten Musters, mit dem der Probenträger beleuchtet wird, eine Blende und/oder einen flächigen Lichtmodulator (wie z.B. ein LCD-Modul oder eine Kippspiegelmatrix) aufweisen. Ferner ist es möglich, dass das Beleuchtungsmodul eine diffraktive Phasenmaske und gegebenenfalls ein Modul zur Amplitudenmodulation aufweist. Damit kann ein erzeugtes Muster, das z.B. in Kreisform vorliegt, so auf den Probenträger abgebildet werden, dass es im beleuchteten Muster mehrfach (bevorzugt in unterschiedlichen Fokuslagen) vorliegt.
Die Trennung zwischen dem Licht des Beleuchtungsmoduls und dem Licht zur Abbildung der Probe auf den ersten Detektor kann z.B. über die Wellenlänge durchgeführt werden. Es ist jedoch jede andere Art von Trennung möglich, so kann z.B. der Polarisationszustand zur Trennung genutzt werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Mikroskop kann der zweite Detektor als flächiger Detektor ausgebildet sein, der selektiv parallel zu der Ebene, in die das vorbestimmte Muster abgebildet wird, ausgerichtet und gegenüber dieser Ebene geneigt ausgerichtet werden kann. Wenn der zweite Detektor als Zeilendetektor ausgebildet ist, kann dieser so vorgesehen sein, dass er selektiv in einer gedachten Bezugsebene, die parallel zu der Ebene, in die das vorbestimmte Muster abgebildet wird, positioniert oder gegenüber der Bezugsebene geneigt positioniert wird.
Mit dem erfindungsgemäßen Mikroskop ist insbesondere ein vollautomatisierter Bildaufnahmeprozess möglich, bei dem zunächst die Probe in den Tiefenschärfebereich der ersten Abbildungsoptik positioniert wird und dann die gewünschten Aufnahmen erstellt werden.
Es wird ferner ein Mikroskopierverfahren für ein Mikroskop mit einem Halter zum Haltern eines Probenträgers, einer Abbildungseinheit, die einen ersten Detektor und eine erste Abbildungsoptik zum Abbilden (insbesondere zum vergrößernden Abbilden) zumindest eines Teils einer vom Probenträger gehalterten Probe entlang einer ersten optischen Achse auf den ersten Detektor aufweist, und einer Detektionseinheit, die ein Beleuchtungsmodul, einen zweiten Detektor und eine zweite Abbildungsoptik aufweist, bereitgestellt, wobei mittels des Beleuchtungsmoduls ein Probenträger, der vom Halter gehaltert ist, mit einem vorbestimmten Muster beleuchtet wird, das mittels der zweiten Abbildungsoptik auf den zweiten Detektor abgebildet wird, wobei der zweite Detektor so maskiert ist, dass ein Detektionsbereich des zweiten Detektors, den das Muster bei fokussierter Abbildung belegt, oder ein Teil des Detektionsbereichs als Auswertebereich festgelegt wird, und wobei vom zweiten Detektor nur die aus dem Auswertebereich stammenden Messwerte ausgewertet werden, um die Richtung der Änderung der Lage des Fokus der ersten Abbildungsoptik entlang der ersten optischen Achse mit dem Ziel zu bestimmen, die zur Probenseite gerichtete Grenzfläche des Probenträgers in den Tiefenschärfebereich der ersten Abbildungsoptik zu bekommen.
Das erfindungsgemäße Mikroskopierverfahren kann so weitergebildet werden, wie es im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Mikroskop (einschließlich seiner Weiterbildungen) beschrieben ist. Ferner kann das erfindungsgemäße Mikroskop so weitergebildet werden, dass das erfindungsgemäße Mikroskopierverfahren (einschließlich seiner Weiterbildungen) ausgeführt werden kann.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen:
1 eine schematische Darstellung einer ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mikroskops 1;
2 eine vergrößerte Detaildarstellung des Halters 2 von 1;
3 eine schematische Darstellung des vorbestimmten Beleuchtungsmusters M, mit dem die Probe 8 beleuchtet wird;
4 eine schematische Darstellung der fokussierten Abbildung des Beleuchtungsmusters M auf den zweiten Detektor 20;
5 eine schematische Darstellung einer unfokussierten Abbildung des Beleuchtungsmusters M auf den zweiten Detektor 20;
6 eine schematische Darstellung der Lichtmenge aus dem Auswertebereich des zweiten Detektors in Abhängigkeit des Abstandes des Objektivs von der Probe;
7 eine Darstellung gemäß 6, wobei vier Messpunkte x zusammen mit einer linearen Fitgeraden G eingezeichnet ist;
8 eine Darstellung gemäß 6, wobei mehrere Messpunkte x zusammen mit einer Fit-Parabel P eingezeichnet sind;
9 eine schematische Darstellung einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mikroskops;
10 eine Darstellung gemäß 6 zur Erläuterung der Messung mit dem schräggestellten zweiten Detektor 26 gemäß 9;
11 eine schematische Darstellung einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mikroskops;
12 eine schematische Darstellung einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mikroskops;
13 eine schematische Darstellung des zweiten Detektors 26, bei dem der Auswertebereich 24 in zwei Auswertebereiche 24 ₁ und 24 ₂ aufgeteilt wird, wenn der Detektor 26 schräggestellt ist;
14 eine schematische Darstellung des zweiten Detektors 20 zur Erläuterung der Festlegung des Auswertebereiches für den Fall, bei dem das Beleuchtungsmuster zwei lateral voneinander beabstandete Teilmuster mit unterschiedlichen Fokuslagen aufweist, und
15 und 16 weitere möglichen Formen des vorbestimmten Beleuchtungsmusters M.
Bei der in 1 gezeigten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Mikroskop 1 einen Halter 2, ein Objektiv 3, eine erste Teiloptik 4 (z.B. eine Tubusoptik) sowie eine Kamera 5. Des Weiteren umfasst das Mikroskop 1 eine erste Lichtquelle 6, deren Beleuchtungslicht über einen zwischen dem Objektiv 3 und der ersten Teiloptik 4 angeordneten teiltransparenten Spiegel 7 in den Abbildungsstrahlengang eingekoppelt und somit über das Objektiv 3 auf eine Probe 8, die im Halter 2 gehaltert ist, gerichtet werden kann. Die Probe 8 kann beispielsweise auf einem Probenträger bzw. Deckglas 9 angeordnet sein, das im Halter 2 gehaltert ist, wie insbesondere in der vergrößerten Detaildarstellung in 2 ersichtlich ist. Zwischen dem Objektiv 3 und dem Deckglas 9 kann ein Immersionsmedium 10 (wie z.B. Wasser, Öl oder Glyzerin) vorgesehen sein. Alternativ kann das Immersionsmedium 10 auch weggelassen werden. In diesem Fall befindet sich zwischen dem Objektiv 3 und dem Deckglas 9 beispielsweise Luft.
Die mit dem Licht der Lichtquelle 6 beleuchtete Probe 8 wird in bekannter Weise über das Objektiv 3 und die erste Teiloptik 4 auf die Kamera 5 vergrößert abgebildet. Um eine scharfe Abbildung zu realisieren, kann beispielsweise das Objektiv 3 entlang der z-Richtung bewegt werden, wie durch den Doppelpfeil P1 in 1 und 2 angedeutet ist. Dadurch kann die Fokuslage der in 2 schematisch dargestellten Fokusebene F des Objektives 3 bzw. der entsprechenden Abbildung auf die Kamera 5 so in z-Richtung verschoben werden, dass sie mit der abzubildenden Probe 8 zusammenfällt. Unter dem Vorliegen eines Zielzustandes wird hier insbesondere verstanden, dass die Fokusebene F so liegt, dass eine Grenzfläche des Deckglases 9 im Tiefenschärfebereich des Objektivs 3 liegt. Das kann die Immersionsgrenzfläche oder die Probengrenzfläche sein. Wird die von der Probe 8 entfernte Grenzfläche (Immersionsgrenzfläche) gefunden, kann über eine erneute Such nach der Probengrenzfläche diese gefunden werden. Alternativ kann mit der Kenntnis der Deckglasdicke die Differenz bestimmt werden, mit dem der Fokustrieb bewegt werden muss. In beiden Fällen wird die Probe 8, die sich an der Probenträgergrenzfläche befindet, in die Tiefenschärfe der Abbildungsoptik gebracht. Eine Abweichung wird als Versatz F oder Fokusabweichung F bezeichnet und ist in 2 relativ zur Grenzfläche Immersionsmedium 10 und Deckglas 9 eingezeichnet. Die Korrektur zum Erreichen des Zielzustandes wird als Fokusanpassung oder Fokuskorrektur bezeichnet. Die Richtung der Fokusabweichung F ist entlang der Bewegungsrichtung des Objektivs 3, die hier als z-Achse bezeichnet ist. Natürlich kann das Mikroskop 1 auch so ausgebildet sein, dass der Halter 2 zur Fokussierung in z-Richtung bewegt werden kann. Dies kann zusätzlich oder alternativ zur Bewegung des Objektivs 3 stattfinden.
Da sich das Objektiv 3 nach dem Einlegen des Deckglases 9 mit der Probe 8 in den Halter 2 in einem unbekannten Abstand zum Deckglas 9 und somit zur Probe 8 befindet, ist es wünschenswert, wenn eine Minimierung dieses Abstandes (insbesondere das Erreichen des gewünschten Zielzustandes) sicher und bevorzugt in automatisierter Weise möglich ist. In diesem Fall kann sich z.B. ein automatisierter Bildaufnahmeprozess (mit beispielsweise Fokussierung der Probe 8 und Aufnahme der Probe 8) anschließen, so dass nach dem Einlegen des Deckglases 9 mit der Probe 8 ein automatisiertes Aufnahmeverfahren realisieren lässt.
Das erfindungsgemäße Mikroskop 1 weist eine Detektionseinheit 11 auf. Die Detektionseinheit 11 umfasst ein Beleuchtungsmodul 12 mit einer zweiten Lichtquelle 13, einem Umlenkspiegel 14 und einem Lichtmodulator 15. Das Beleuchtungsmodul 12 ist so ausgebildet, dass die Beleuchtung des Deckglases 9 mit einem vorbestimmten Muster erfolgen kann. Es wird beispielsweise ein rechteckförmiges Beleuchtungsmuster M erzeugt, das schematisch in 3 gezeigt ist. Dazu kann der Lichtmodulator 15 z.B. als Blende ausgebildet sein. Das Beleuchtungsmuster M wird über einen teiltransparenten Spiegel 16, eine zweite Teiloptik 17 und einen Farbteiler 18 in den Abbildungsstrahlengang des Mikroskops 1 eingekoppelt, so dass das rechteckförmige Muster M über das Objektiv 3 auf das Deckglas 9 abgebildet werden kann. Die gewünschte Trennung zwischen dem Beleuchtungslicht der ersten Lichtquelle 6 und dem Licht zur Erzeugung des Musters M der Detektionseinheit 11 findet hier über die Wellenlänge statt. So kann die erste Lichtquelle 6 z.B. Licht im sichtbaren Wellenlängenbereich abgeben, wohingegen die zweite Lichtquelle 13 Licht im Infrarot-Bereich abgibt. Das von der Probe 8 und/oder dem Deckglas 9 zurückreflektierte Licht der Detektionseinheit 11 wird über das Objektiv 3, den Farbteiler 18, die zweite Teiloptik 17, den teiltransparenten Spiegel 16 und eine dritte Teiloptik 19 auf einen Detektor 20 des Beleuchtungsmoduls 12 abgebildet. Die dritte Teiloptik 19 ist optional und kann z.B. weggelassen werden, wenn die zweite Teiloptik 17 als Tubuslinse ausgebildet ist.
Der Detektor 20 kann als zweidimensionaler Detektor mit einer Vielzahl von einzeln auslesbaren Detektorpixeln 21, die z.B. in Zeilen und Spalten angeordnet sind, wie in 4 gezeigt ist, ausgebildet sein. Die einzelnen Pixel 21 des Detektors 20 sind schematisch als Quadrate eingezeichnet. Zur Verbesserung der Darstellbarkeit ist die Darstellung in 4 nicht maßstabsgetreu. Die Darstellung ist rein schematisch zu verstehen. Unter der Annahme, dass die Fokusebene F (2) mit einer Grenzfläche (Ober- oder Unterseite 22, 23) des Deckglases 9 zusammenfällt, liegt aufgrund der Reflexion des Musters M an dieser Grenzfläche 22, 23 eine scharfe Abbildung auf dem Detektor 20 vor. Diese fokussierte Abbildung führt dazu, dass das abgebildete rechteckige Beleuchtungsmuster die in 4 schraffierten Pixel 21 belegt. Diese Pixel 21 werden als Auswertebereich 24 festgelegt und nur die von den Pixeln 21 aus dem Auswertebereich 24 stammenden Signale werden, wie nachfolgend noch beschrieben wird, ausgewertet. Die Auswertung kann von einer Steuereinheit S (1) durchgeführt werden. Die Steuereinheit S kann Bestandteil des Mikroskops 1 und insbesondere der Detektionseinheit 11 sein und kann auch zur Steuerung des Mikroskops 1 dienen. Es ist jedoch auch möglich, dass die Auswertung in einer Auswerteeinheit (nicht gezeigt) durchgeführt wird, die nicht Bestandteil des Mikroskops 1 ist.
Wenn das Objektiv 3 so vom Probendeckglas 9 beabstandet ist, wie in 2 gezeigt ist, fällt die Fokusebene F nicht mit der Ober- oder Unterseite 22, 23 des Deckglases 3 zusammen, so dass die Reflexion des Beleuchtungsmusters M an der Ober- und/oder Unterseite 22, 23 zu einer unscharfen Abbildung des Beleuchtungsmusters M auf dem Detektor 20 führt. Dies ist schematisch in 5 dargestellt, wobei die aufgrund der unscharfen Abbildung des rechteckigen Beleuchtungsmusters belegten Pixel 21 wieder schraffiert dargestellt sind. Ein Vergleich mit 4 zeigt, dass auch Pixel außerhalb des Auswertebereiches 24 beleuchtet werden. Jedoch werden diese, wie bereits beschrieben, nicht bei der weiteren Auswertung berücksichtigt. Die Pixel 21 außerhalb des Auswertebereiches 24, die vom abgebildeten Muster belegt sind, sind senkrecht schraffiert, wohingegen die innerhalb des Auswertebereiches 24 belegten Pixel 21 schräg schraffiert sind. Nur die schräg schraffierten Pixel 21 werden ausgewertet. Durch die Festlegung des Auswertebereiches 24 wird eine Blendenfunktion über die Auslesung der Pixel des Detektors 20 emuliert. Der Auswertebereich 24 kann auch als region of interest (ROI) bezeichnet werden.
In 6 ist entlang der Ordinate die Lichtmenge der Pixel 21 aus dem Auswertebereich 24 auf 1 normiert in Abhängigkeit des Abstands des Objektivs 3 vom Deckglas 9 (entlang der Abszisse in µm) aufgetragen. Da nur die Pixel 21 aus dem Auswertebereich 24 ausgewertet werden (die Intensität der von diesen gemessenen Pixeln 21 wird addiert), gibt es ein Maximum M1 bei dem Zusammenfallen der Fokusebene F mit der Unterseite 23 des Deckglases 9 und ein Maximum M2 bei dem Zusammenfallen der Fokusebene F mit der Oberseite 22 des Deckglases 9. Bei anderen Fokuslagen wird das abgebildete Muster M unscharf und größer, so dass die Intensität aus dem Auswertebereich 24 sinkt, wie in 6 ersichtlich ist. Die Darstellung in 6 zeigt eine Messung an einem Deckglas 9 mit einer Dicke von 0,170 mm. Da der Brechungsindex des Deckglases etwa 1,5 beträgt, beträgt der Abstand der beiden Maxima M1 und M2 circa 114 µm.
Da man bei der Messung in einer Fokuslage vom Detektor 20 nur ein einzelnes Signal erhält (ein Wert der Lichtmenge für eine bestimmte z-Position), lässt sich daraus in der Regel weder auf die absolute z-Position noch auf die Richtung schließen, in der der Abstand zu ändern ist, um z.B. den Abstand zwischen dem Objektiv 3 und dem Deckglas 9 zu verringern.
Für die gewünschte Fokuskorrektur zum Erreichen des Zielzustandes können daher entlang der z-Achse die Signale der Pixel aus dem Auswertebereich 24 für verschiedene Fokuspositionen aufgezeichnet werden. In 7 sind schematisch vier Messpunkte x in einem Abstand von jeweils 10 µm eingezeichnet. Aus diesen Messpunkten x kann über einen linearen Fit die Steigung ermittelt werden (in 7 ist schematisch die entsprechende Fitgerade G eingezeichnet) und damit in diesem Fall eine Fokusanpassung in positiver z-Richtung.
Das Erreichen des Zielzustandes kann dadurch erfolgen, indem man schrittweise die z-Position nach oben oder unten, je nach ermittelten Intensitätsdaten und Steigungen anfährt, erneut die Richtung der Intensitätsänderung unter Berücksichtigung des neuen Messpunktes ermittelt und daraus die Position des nächsten Messpunktes bestimmt. Wenn man so entlang der z-Achse iteriert, findet man ein Maximum, das entweder zur Oberseite 22 oder Unterseite 23 gehört.
Die Schrittweite kann man anhand der zu erwartenden Steigung im Intensitätsverlauf und anhand der Objektivdaten, insbesondere der Vergrößerung, wählen. Kleine Vergrößerungen zeigen hierbei eine sehr schwache Steigung, hohe Vergrößerungen hingegen einen sehr steilen Verlauf. Zusätzlich lässt sich die Schrittweite dynamisch an die letzte gemessene Steigung anpassen. Bei geringen Steigungen ist zu erwarten, dass der Fokusfehler groß ist, so dass eine große Schrittweite möglich ist. Bei hohen Steigungen ist der Fokusfehler möglicherweise sehr klein und damit eine kleine Schrittweite sinnvoller. Diese dynamische Anpassung ermöglicht vor allem eine Reduzierung der Zeitdauer bis zum Erreichen des Zielzustandes, da weniger z-Positionen angefahren werden müssen. Grundsätzlich lassen sich mehrere Situationen unterscheiden, aus denen eine Entscheidung über eine Richtung der Fokuskorrektur erfolgt.
Wenn alle Werte eine eindeutige Steigung zeigen, ist eine eindeutige und damit fehlerfreie Richtungsbestimmung möglich. Dies ist dann der Fall, wenn die Intensitätswerte für nacheinander angefahrene z-Positionen entlang einer Richtung (entweder entlang oder gegen der z-Richtung) jeweils größer oder jeweils kleiner als der vorherige Wert sind.
Wenn die Steigung eindeutig und positiv ist, erfolgt eine Suche nach oben. Ist sie eindeutig und negativ, erfolgt eine Suche nach unten.
Ferner kann die ermittelte Steigung so klein sein, dass eine mögliche Fehlentscheidung nicht ausgeschlossen werden kann. Dies ist z.B. dann der Fall, wenn z-Positionen angefahren werden, bei denen die Fokuslage einen großen Abstand zur oberen oder unteren Grenzfläche 22, 23 des Deckglases 9 aufweist. Da sich nicht erkennen lässt, ob die Fokuslage oberhalb oder unterhalb des Deckglases 9 liegt, wird bevorzugt (z.B. aus Sicherheitsgründen) eine Suche nach unten durchgeführt. Wenn man nämlich fälschlicherweise nach oben sucht, riskiert man, dass das Objektiv 3 mit dem Deckglas 9 kollidiert. Sucht man hingegen fälschlicherweise nach unten, so rastet nur der z-Trieb (nicht gezeigt) des Objektivs 3 in den unteren Anschlag ein, was über die Softwaresteuerung zur Bewegung des Objektivs 3 erkennbar ist.
Mit der Suche nach unten kann somit der Fall eintreten, dass man eine Grenzfläche 22, 23 ermitteln kann. In diesem Fall lag die Fokuslage oberhalb der Ober- oder Unterseite 22, 23 des Deckglases 9.
Wenn die Fokuslage jedoch unterhalb der unteren Grenzfläche 23 lag, wird der z-Trieb des Objektivs 3 nach einer gewissen Zeit in den unteren Anschlag laufen. In diesem Fall kann eine Suche nach oben durchgeführt werden, da man nun sicher weiß, dass man sich unterhalb des Deckglases 9 befindet.
Man kann auch bewusst das Objektiv 3 in die unterste z-Position verfahren und dann eine Suche nach oben durchführen.
Ferner ist es möglich, dass die Steigung nicht eindeutig nach oben oder unten weist, dafür aber einen eindeutigen parabolischen Verlauf aufweist. Dies tritt dann auf, wenn die Fokuslage zwischen der Oberseite 22 und der Unterseite 23 des Deckglases 9 liegt. Dies ist schematisch in 8 dargestellt. Wenn die Parabel P eine Öffnung nach oben aufweist und sich das Minimum der Parabel P innerhalb der zur Bestimmung herangezogenen Messpunkte befindet, wurde ein Minimum in dem Intensitätsverlauf erkannt. Damit ist eine Suche in beiden Richtungen möglich.
Mit diesen Entscheidungskriterien zur iterativen Annäherung an den Zielzustand ist dieser zuverlässig zu finden. Erfindungsgemäß ist es somit möglich, in den Arbeitsbereich oder Tiefenschärfebereich des Objektivs 3 zu gelangen. Man kann nun zusätzlich ein weiteres Autofokusprinzip einsetzen, um eine präzise Fokusbestimmung und/oder Fokusstabilisierung durchzuführen.
Die Belichtungszeit auf dem Detektor 20 als auch die Intensität der zweiten Lichtquelle 13 des Beleuchtungsmoduls 12 haben natürlich eine obere und eine untere Grenze. Bei dem hier beschriebenen Vorgehen ist es von Vorteil, die zweite Lichtquelle 13 mit maximaler Intensität zu betreiben, um möglichst kurze Belichtungszeiten zu realisieren. Sollte man dabei feststellen, dass der Detektor 20 überbelichtet ist, sollte die Lichtintensität der zweiten Lichtquelle 13 verringert und/oder die Belichtungszeit des Detektors 20 verringert werden. Damit ändert sich aber unabhängig von der z-Position die gemessene Intensität auf dem Detektor 20. Daher sollte die Intensität des Detektors (I_Kamera) mit der Belichtungszeit (t_Kamera) und der Intensität der zweiten Lichtquelle (I_Lampe) skaliert werden, um die Intensität ISignal der Pixel 21 aus dem Auswertebereich 24 zu erhalten.
Bei anderen Arten von Detektoren (z.B. bei der Verwendung von Fotodioden) sind gegebenenfalls analoge Korrekturen durchzuführen.
Wie bereits angegeben, werden die z-Positionen zur Korrektur der Fokuslage und Bestimmung der Korrektur-Richtung schrittweise angefahren. Die Weglänge bzw. Schrittweite lässt sich an die zu erwartende Steigung aufgrund der Objektivkenndaten (Vergrößerung) anpassen. So kann z.B. eine höhere Schrittweite für geringe Vergrößerungen wie eine 10- oder 20-fache Vergrößerung, eine mittlere Schrittweite für den Bereich einer 40-fachen Vergrößerung und sehr kleine Schrittweiten für Bereiche mit höheren Vergrößerungen gewählt werden.
Zur Reduzierung der Gesamtschritte bis zur optimalen Fokuslage kann man die Schrittweite dynamisch an die zuletzt gemessen Steigung anpassen. So kann man bei geringen Steigungen größere Distanzen zwischen zwei Messpunkten entlang der z-Achse abfahren und bei sehr hohen Steigungen kleinere Schrittweiten nutzen, um präziser beim Erreichen des Zielzustandes zu werden. Zusätzlich kann man bei einer Suche nach unten die Schrittweite erhöhen, wenn die Steigung als sehr gering erkannt wurde, da die Gefahr einer Kollision mit dem Deckglas 9 nicht gegeben ist.
Wie in den 6 bis 8 ersichtlich ist, liegt ein sehr steiler Kurvenverlauf in die Nähe des Zielzustandes (Maxima M1 und M2) vor. Mit größer werdendem Abstand zum Zielzustand nimmt die Eindeutigkeit des Signals ab. Dies lässt sich z.B. dadurch kompensieren, dass der Detektor 20 schräggestellt wird. Bei dem bisherigen Ausführungsbeispiel traf die Abbildung senkrecht auf die durch die Pixel des Detektors aufgespannte Fläche. Es lag somit ein Winkel des Detektors 20 relativ zur Abbildung von 0° vor. Wenn man nun durch Schrägstellung einen größeren Winkel einstellt, wie z.B. einen Winkel von 50°, entspricht dies einer Mittelwertbildung der Intensitätswerte über z. Eine solche Ausbildung des erfindungsgemäßen Mikroskops 1 ist in 9 schematisch dargestellt, wobei der schräggestellte Detektor mit dem Bezugszeichen 26 bezeichnet ist. In 10 ist in gleicher Weise wie in 6 bis 8 der Intensitätsverlauf aus dem Auswertebereich 24 in Abhängigkeit der Fokuslage (z-Position) aufgetragen, wobei der Verlauf für den schräggestellten Detektor 26 mit einem Winkel von 50° mit durchgezogener Linie eingezeichnet ist und der Verlauf mit senkrecht gestelltem Detektor 20 (Winkel von 0°) gemäß 6 bis 8 gestrichelt eingezeichnet ist.
Es ist deutlich zu erkennen, dass aus den Messsignalen des schräggestellten Detektors 26 für große Entfernungen wie z.B. 500 µm bis 1000 µm eine eindeutige Steigung und damit die Richtung der Positionskorrektur ermittelt werden kann, wohingegen das Signal des Detektors 20 bei Positionierung mit 0° bei diesen z-Werten im wesentlichen nur Rauschen enthält. Der beispielhaft angeführte Winkel der Schrägstellung von 50° soll nicht einschränkend zu verstehen sein. Andere Winkelwerte sind ebenfalls möglich. Wenn der Winkel größer wird, wird der Effekt größer, während bei kleineren Winkeln der Effekt geringer wird.
Durch die geringere Steilheit an der Fokusposition selbst oder das Verwaschen des zweiten Fokus beim schräggestellten Detektor 26, wie in 10 zu sehen ist, ist für eine zuverlässige Ermittlung des Zielzustandes eine zweite Methode notwendig. Das kann z.B. durch zwei Detektoren 20, 26 in der Detektionseinheit 11 verwirklicht werden, wie in 11 schematisch dargestellt ist. Es wird in der Detektionseinheit 11 dazu nach der dritten Teiloptik 19 ein Strahlteiler 25 angeordnet, so dass gleichzeitig unter 0° (Detektor 20) und unter 50° (Detektor 26) gemessen werden kann. Man kann dann die Signale der beiden Detektoren 20 und 26 in vorteilhafterweise so auswerten, dass das Signal des Detektors 26 für die Richtungsbestimmung bei großem Abstand zum Deckglas 9 und das Signal des Detektors 20 für die Richtungsbestimmung bei geringem bzw. geringerem Abstand zum Deckglas 9 ausgewertet wird. Natürlich ist es auch möglich, nur einen einzelnen Detektor 20 vorzusehen, und diesen beispielsweise zu verkippen. Zur Bestimmung der Richtung bei großem Abstand zum Deckglas 9 wird der Detektor schräg gestellt und zur Bestimmung der Richtung bei geringem bzw. geringerem Abstand wird er dann in die 0°-Lage gebracht.
Man kann die Detektionseinheit 11 auch so weiterbilden, dass mittels des schräggestellten Detektors die Richtung bestimmt wird und mit einem anderen bekannten Verfahren zur Fokusbestimmung die präzise Position der Fokuslage ermittelt wird.
Durch die Messung nur einer einzelnen Intensität an einer z-Position ist es notwendig, mehrere z-Positionen anzufahren, um eine Richtung zur Positionskorrektur zu ermitteln. Es ist bei dem erfindungsgemäßen Mikroskop 1 jedoch möglich, mehrere z-Positionen gleichzeitig zu ermitteln, um so aus einer einzigen Messung direkt auf die Richtung zur Positionskorrektur schließen zu können.
So kann die Detektionseinheit 11 z.B. so ausgebildet sein, dass sie zumindest zwei Detektoren 20, 26 enthält, auf die die Abbildung über einen Strahlteiler 25 erfolgt. Die beiden Detektoren 20 und 26 weisen dabei jedoch einen unterschiedlichen Abstand entlang der Abbildungsrichtung auf, wie in 12 schematisch angedeutet ist, so dass mit den beiden Detektoren 20 und 26 Intensitätswerte gleichzeitig an zwei unterschiedlichen z-Werte gemessen werden. Nachdem Messwerte für zwei unterschiedliche z-Positionen vorliegen, die mit einer einzelnen Messung erfasst werden, lässt sich die Richtung auch aus einer einzigen Messung ermitteln. Natürlich können auch mehr als zwei Detektoren 20, 26 vorgesehen sein. Mit weiteren Strahlteilern können weitere Detektoren für unterschiedliche z-Werte positioniert werden.
Ferner ist es möglich, wenn der Detektor 26 in der Detektionseinheit 11 schräggestellt ist (wie in 9 gezeigt ist), den Auswertebereich 24 in zwei Auswertebereiche 24 ₁, 24 ₂ aufzuteilen und separat auszuwerten, wie in 13 angedeutet ist. Da man aufgrund der Schrägstellung des Detektors 26 Informationen aus mehreren z-Positionen gleichzeitig erhält, sieht der Auswertebereich 24 ₁ eine andere Fokuslage als der Auswertebereich 24 ₂. Somit hat man Messwerte aus zwei verschiedenen z-Bereichen und kann aus diesen auf die Richtung rückschließen.
Des Weiteren ist es möglich, ein Beleuchtungsmuster bereitzustellen, das z.B. zwei lateral voneinander beabstandete Punkte (oder Teilmuster) aufweist, die jeweils in anderen z-Positionen in der Objektebene fokussiert sind. Auch der Detektor weist dann zwei Auswertebereiche 24 ₁ und 24 ₂ auf, wie in 14 angedeutet ist, die lateral (also in der Ebene des Detektors 20) voneinander beabstandet sind. Diese beiden Auswertebereiche 24 ₁ und 24 ₂ sind unterschiedlichen z-Positionen zugeordnet. Das bedeutet, wenn eine Fokussierung im Auswertebereich 241 vorliegt, ist der Auswertebereich 24 ₂ defokussiert abgebildet. Man erhält somit simultan mehrere Intensitätswerte von verschiedenen z-Positionen, aus denen auf die Richtung zur Positionskorrektur geschlossen werden kann. Eine Möglichkeit zur Realisierung einer solchen Beleuchtung besteht in der Verwendung einer diffraktiven Phasenmaske kombiniert mit einer Amplitudenmodulation. Die Amplitudenmodulation ist nicht zwingend notwendig und kann auch weggelassen werden. Solche Phasenmasken sind in der öffentlich zugänglichen Dissertation „Strahlformung in der Femtosekundenlaser-Mikrostrukturierung“ an der Fakultät für Mathematik und Physik der Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover von Herrn Matthias Pospiech (http://edok01.tib.uni-hannover.de/edoks/e01dh11/664502180.pdf) beschrieben. Es kann insbesondere auf Seiten 50 bis 58 verwiesen werden.
Mit einem solchen Vorgehen kann ein einzelnes Muster durch die diffraktive Phasenmaske in Kombination mit der Amplitudenmodulation vervielfältigt und in den Bereich des Deckglases 9 abgebildet werden, so dass dort die beiden Teilmuster mit unterschiedlichen Fokuslagen vorliegen.
Wie bereits ausgeführt wurde, lässt sich grundsätzlich aus einem Intensitätswert nicht direkt auf eine Fokuslage oder die Änderung der Richtung der Fokuslage zurückschließen. Wenn eine oder mehrere Annahmen erfüllt sind, kann man jedoch auch aus einer einzelnen Messung direkt auf die Fokuslage zurückschließen. Wenn z.B. bekannt ist, ob die aktuelle Fokuslage oberhalb oder unterhalb der Lage des Zielzustandes liegt, und für den Verlauf von oberhalb oder unterhalb der Lage des Zielzustandes für jede z-Position für die Kombination aus Objektiv 3 und Deckglas 9 ein eindeutiger Intensitätswert vorliegt, der bekannt ist, kann in diesem Fall aus einem einzigen Wert auf die Korrektur zurückgeschlossen werden. Damit ist aus einer einzelnen Messung und einer einmaligen Fokuskorrektur das Erreichen des Zielzustandes möglich.
Selbst wenn nicht bekannt sein sollte, ob die aktuelle Fokuslage oberhalb oder unterhalb der Lage des Zielzustandes liegt, kann man aus einer Messung an zwei verschiedenen z-Positionen (z.B. mittels einer der bereits beschriebenen Möglichkeiten) ermitteln, ob die aktuelle Fokuslage oberhalb oder unterhalb der Lage des Zielzustandes liegt. Man kann dies z.B. aus einer Differenz der Messwerte ableiten. Zusammen mit dem Messwert einer dieser Messungen oder einer weiteren Messung kann dann die notwendige Korrektur bestimmt werden.
Da bei dem erfindungsgemäßen Mikroskop 1 der Detektor 20 ein separater Detektor ist und nicht die Kamera 5 des Mikroskops 1, können die Aufnahmen unabhängig von dem Auffinden des Zielzustandes mittels der Detektionseinheit 11 durchgeführt werden. Dies führt zu einem Geschwindigkeitsgewinn in der Verarbeitung und Bildgewinnung, da eine Parallelverarbeitung möglich ist.
Der Detektor 20 kann, wie beschrieben, als Flächendetektor mit mehreren einzelauslesbaren Pixeln 21 ausgebildet sein. Insbesondere kann er beispielsweise als CCD-Detektor ausgebildet sein. Es ist jedoch auch möglich, eine oder mehrere Lichtdioden als Detektor 20 vorzusehen. In diesem Fall kann die Ausdehnung der einen oder der mehreren Lichtdioden selbst die gewünschte Blendenwirkung bzw. Maskierung realisieren. Es ist ferner möglich, eine entsprechende mechanische Blende vor der Lichtdiode oder vor den Lichtdioden anzuordnen.
Bei den bisher beschriebenen Ausführungsformen wurde davon ausgegangen, dass das Muster M rechteckförmig ist. Es ist jedoch jede andere Form eines Musters möglich. So kann das Muster beispielsweise in Form eines Plus-Zeichens (15) vorliegen oder kreisförmig (16) sein.
Der Lichtmodulator 15 des Beleuchtungsmoduls 12 kann beispielsweise als LCD-Modul ausgebildet sein, das eine Mehrzahl von selektiv schaltbaren Pixeln aufweist, so dass somit Licht aus nur solchen Bereichen durchgelassen wird, die die Form des gewünschten Musters bilden. Auch andere räumliche Lichtmodulatoren, wie z.B. eine Kippspiegelmatrix, können als Lichtmodulator 15 eingesetzt werden.
Das erfindungsgemäße Mikroskop kann als Weitfeldmikroskop, als konfokales Mikroskop, als Laser-Scanning-Mikroskop, als Fluoreszenzmikroskop oder als sonstiges Mikroskop ausgebildet sein. Insbesondere ist das erfindungsgemäße Mikroskop als automatisiertes Mikroskop ausgebildet, das nach Einlegen der Probe 8 automatisch eine gewünschte mikroskopische Untersuchung durchführt. Auch ist es möglich, dass eine Zuführeinheit vorgesehen ist, die mehrere in der Zuführeinheit vorgesehene Proben 8 nacheinander zur mikroskopischen Untersuchung in den Halter 2 platziert.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Nicht-Patentliteratur

http://edok01.tib.uni-hannover.de/edoks/e01dh11/664502180.pdf [0078]

Claims

Mikroskop mit einem Halter (2) zum Haltern eines Probenträgers (9), einer Abbildungseinheit, die einen ersten Detektor (5) und eine erste Abbildungsoptik (3) zum Abbilden zumindest eines Teils einer vom Probenträger (9) gehalterten Probe (8) entlang einer ersten optischen Achse auf den ersten Detektor (5) aufweist, einer Steuereinheit (S) und einer Detektionseinheit (11), die ein Beleuchtungsmodul (12), einen zweiten Detektor (20) und eine zweite Abbildungsoptik aufweist, wobei das Beleuchtungsmodul (12) einen Probenträger (9), der vom Halter (2) gehaltert ist, mit einem vorbestimmten Muster (M) beleuchtet, das mittels der zweiten Abbildungsoptik (3) auf den zweiten Detektor (20) abgebildet wird, wobei der zweite Detektor (20) so maskiert ist, dass ein Detektionsbereich des zweiten Detektors (20), den das Muster (M) bei fokussierter Abbildung belegt, oder ein Teil des Detektionsbereiches als Auswertebereich (24; 24 ₁, 24 ₂) festgelegt ist, und wobei die Steuereinheit (S) vom zweiten Detektor (20) nur die aus dem Auswertebereich (24; 24 ₁, 24 ₂) stammenden Messwerte auswertet, um die Richtung der Änderung der Lage des Fokus der ersten Abbildungsoptik (3) entlang der ersten optischen Achse mit dem Ziel zu bestimmen, die zur Probenseite gerichtete Grenzfläche des Probenträgers (9) im Tiefenschärfebereich der ersten Abbildungsoptik (3) zu positionieren.
Mikroskop nach Anspruch 1, bei dem die Steuereinheit (S) das Beleuchtungsmodul (12) und den Halter (2) so ansteuert, dass das vorbestimmte Muster (M) bei zwei verschiedenen Fokuslagen der zweiten Abbildungsoptik (3) auf den zweiten Detektor (20) abgebildet wird, wobei die Steuereinheit (S) anhand der Messwerte ermittelt, in welche Richtung die Fokuslage zu verschieben ist, um die zur Probenseite gerichtete Grenzfläche des Probenträgers (9) im Tiefenschärfebereich der ersten Abbildungsoptik (3) zu positionieren.
Mikroskop nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Detektionseinheit (11) zumindest zwei zweite Detektoren (20, 26) aufweist, deren Abstand in Abbildungsrichtung zum Halter (2) unterschiedlich ist, so dass gleichzeitig das vorbestimmte Muster (M) in unterschiedlichen Fokuslagen aufgenommen werden kann.
Mikroskop nach Anspruch 2 oder 3, bei dem die Änderungen der Fokuslage der ersten Abbildungsoptik (3) zur Aufnahme des vorbestimmten Musters (M) mit der Detektionseinheit (11) mit geringer werdendem Abstand zur Grenzfläche des Probenträgers (9) kleiner gewählt wird.
Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, bei dem das Beleuchtungsmodul (12) so ausgebildet ist, dass das vorbestimmte Muster (M), mit dem der Probenträger (9) beleuchtet ist, zwei lateral voneinander beabstandete Teilmuster in unterschiedlichen Fokuslagen aufweist.
Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, bei dem der zweite Detektor (20, 26) als flächiger Detektor oder als Zeilendetektor ausgebildet ist, der parallel zu einer Ebene, in die das vorbestimmte Muster abgebildet wird, ausgerichtet ist.
Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, bei dem der zweite Detektor (26) als flächiger Detektor oder als Zeilendetektor ausgebildet ist, der gegenüber einer Ebene, in die das vorbestimmte Muster (M) abgebildet wird, geneigt angeordnet ist.
Mikroskop nach Anspruch 7, bei dem der Auswertebereich (24) in einen ersten und einen zweiten Teilbereich (24 ₁, 24 ₂) aufgeteilt wird, um Messwerte aus unterschiedlichen Fokuslagen zu erhalten.
Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, bei dem das Beleuchtungsmodul zwei zweite Detektoren aufweist, wobei ein erster der zweiten Detektoren (26) gegenüber einer Ebene, in die das vorbestimmte Muster abgebildet wird, geneigt ist, und ein zweiter der zweiten Detektoren (20) parallel zu der Ebene, in die das vorbestimmte Muster abgebildet wird, angeordnet ist.
Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, bei dem die Steuereinheit (S) aus den Messwerten bei zwei verschiedenen Fokuslagen ermittelt, ob die aktuelle Fokuslage oberhalb oder unterhalb einer Grenzfläche des Probenträgers (9) liegt, und anhand dieser Information in Verbindung mit einem bekannten Intensitätsverlauf für oberhalb und unterhalb Grenzfläche des Probenträgers (9) die notwendige Korrektur entlang der ersten optischen Achse bestimmt, um die zur Probenseite gerichtete Grenzfläche des Probenträgers (9) im Tiefenschärfebereich der ersten Abbildungsoptik zu positionieren.
Mikroskopierverfahren für ein Mikroskop mit einem Halter (2) zum Haltern eines Probenträgers (9), einer Abbildungseinheit, die einen ersten Detektor (5) und eine erste Abbildungsoptik (3) zum Abbilden zumindest eines Teils einer vom Probenträger (9) gehalterten Probe (8) entlang einer ersten optischen Achse auf den ersten Detektor (5) aufweist, und einer Detektionseinheit (11), die ein Beleuchtungsmodul (12), einen zweiten Detektor (20) und eine zweiter Abbildungsoptik aufweist, wobei mittels des Beleuchtungsmoduls (12) Probenträger (9), der vom Halter (2) gehaltert ist, mit einem vorbestimmten Muster (M) beleuchtet wird, das mittels der zweiten Abbildungsoptik (3) auf den zweiten Detektor (20) abgebildet wird, wobei der zweite Detektor (20) so maskiert ist, dass ein Detektionsbereich des zweiten Detektors (20), den das Muster (M) bei fokussierter Abbildung belegt, oder ein Teil des Detektionsbereiches als Auswertebereich (24; 24 ₁, 24 ₂) festgelegt wird, und wobei vom zweiten Detektor (20) nur die aus dem Auswertebereich (24; 24 ₁, 24 ₂) stammenden Messwerte ausgewertet werden, um die Richtung der Änderung der Lage des Fokus der ersten Abbildungsoptik (3) entlang der ersten optischen Achse mit dem Ziel zu bestimmten, die zur Probenseite gerichtete Grenzfläche des Probenträgers (9) im Tiefenschärfebereich der ersten Abbildungsoptik (3) zu positionieren.