DE102017119478A1

DE102017119478A1 - Optische Anordnung zum Scannen von Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung in einem Laser-Scanning-Mikroskop und Laser-Scanning-Mikroskop

Info

Publication number: DE102017119478A1
Application number: DE102017119478.9A
Authority: DE
Inventors: Tiemo Anhut; Matthias Wald; Daniel Schwedt; Tobias Kaufhold
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2017-08-25
Filing date: 2017-08-25
Publication date: 2019-02-28
Also published as: CN111095073A; US11703670B2; CN111095073B; WO2019038398A1; US20210157117A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine optische Anordnung zum Scannen von Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung in einem Laser-Scanning-Mikroskop und weist folgende Komponenten auf: eine Scanoptik zum Bereitstellen einer ersten Pupillenebene, eine erste Strahlumlenkeinrichtung, die durch einen in der ersten Pupillenebene angeordneten ersten Scanner gebildet ist, zum Scannen der Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung in einer ersten Koordinatenrichtung, eine erste fokussierende Einrichtung zum Erzeugen einer zweiten Pupillenebene, die zu der ersten Pupillenebene optisch konjugiert ist, und eine zweite Strahlumlenkeinrichtung zum Umlenken der Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung, die in der zweiten Pupillenebene angeordnet ist. Die erfindungsgemäße optische Anordnung ist dadurch weitergebildet, dass eine zweite fokussierende Einrichtung vorhanden ist zum Erzeugen einer dritten Pupillenebene, die zu der ersten Pupillenebene und der zweiten Pupillenebene optisch konjugiert ist, dass in der dritten Pupillenebene eine dritte Strahlumlenkeinrichtung angeordnet ist zum Umlenken der Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung, dass zwischen der ersten fokussierenden Einrichtung und der zweiten Pupillenebene einerseits und der zweiten Pupillenebene und der zweiten fokussierenden Einrichtung andererseits ein variables Strahlumlenkmittel vorhanden ist zum Umschalten eines optischen Strahlengangs zwischen einem ersten Strahlweg und einem zweiten Strahlweg. In einem weiteren Gesichtspunkt bezieht sich die Erfindung auf ein Laser-Scanning-Mikroskop.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft in einem ersten Gesichtspunkt eine optische Anordnung zum Scannen von Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung in einem Laser-Scanning-Mikroskop nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1. In einem weiteren Gesichtspunkt bezieht sich die Erfindung auf ein Laser-Scanning-Mikroskop nach dem Oberbegriff des Anspruchs 18.
Eine gattungsgemäße optische Anordnung zum Scannen von Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung in einem Laser-Scanning-Mikroskop ist beispielsweise beschrieben in DE 10 2014 017 001 A1 und weist folgende Komponenten auf: eine Scanoptik zum Bereitstellen einer ersten Pupillenebene, eine erste Strahlumlenkeinrichtung, die durch einen in der ersten Pupillenebene angeordneten ersten Scanner gebildet ist, zum Scannen der Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung in einer ersten Koordinatenrichtung, eine erste fokussierende Einrichtung zum Erzeugen einer zweiten Pupillenebene, die zu der ersten Pupillenebene optisch konjugiert ist, und eine zweite Strahlumlenkeinrichtung zum Umlenken der Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung, die in der zweiten Pupillenebene angeordnet ist.
Ein gattungsgemäßes Laser-Scanning-Mikroskop geht ebenfalls aus DE 10 2014 017 001 A1 hervor und weist folgende Komponenten auf: mindestens eine Laserlichtquelle zum Aussenden von Laserstrahlung zum Anregen und/oder Manipulieren einer Probe, mindestens einen Hauptfarbteiler zum Trennen von Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung einerseits und wellenlängenverschobenem Detektionslicht, welches von einer Probe ausgeht, andererseits und mindestens ein Mikroskopobjektiv zum Leiten von Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung auf eine Probe und zum Leiten von Detektionslicht, welches von der Probe ausgeht, zurück in Richtung des Hauptfarbteilers, und ein Detektionsmodul zum Nachweisen des Detektionslichts.
Die Laser-Scanning-Mikroskopie hat sich als unverzichtbares Werkzeug der biomedizinischen Forschung etabliert. Neben der reinen Bildgebung gewinnt die optische Manipulation von Proben immer mehr an Bedeutung.
Ein allgemeines technisches Problem besteht dabei darin, mit möglichst geringem Aufwand, in einem möglichst kompakten Bauraum und mit möglichst geringen Transmissionsverlusten, mehrere optische Pupillen zu erzeugen, welche jeweils aufeinander abgebildet werden. Die Anzahl der nutzbaren Pupillen soll dabei größer oder gleich drei sein. Zwischen mindestens zwei der zur Verfügung gestellten Pupillen soll geschaltet werden können.
Bekannte Lösungen basieren einerseits auf der Nutzung verschiedener Ports am Stativ. Dies ist nachteilig, da hierdurch das Mikroskopstativ kompliziert und teuer wird. Weiterhin ist es dann unter Umständen nicht möglich, weitere Verfahren, wie zum Beispiel die hochauflösende Mikroskopie am gleichen Stativ zu betreiben. Zudem sind häufig aufwändige Justagen durchzuführen, um die jeweiligen Bildfelder miteinander zur Deckung zu bringen.
Bekannte Lösungen für die Manipulation durch nur ein Scanobjektiv sind in der Regel mechanisch und somit oft relativ langsam. Es ist in der Regel kaum möglich, größere Massen, wie sie z.B. Spiegel darstellen, schneller als 10 ms zu schalten. Relativ kurze Schaltzeiten lassen sich mit galvanometrischen Scannern erzielen. Allerdings muss hierbei versucht werden, das Massenträgheitsmoment gering zu halten.
In US-7,715,078 ist eine Umschaltung zwischen mehreren Scannern gezeigt. Allerdings besteht hier keine Möglichkeit, in einer vierten Pupille einen z-scannenden Spiegel unterzubringen. Dieser wird aber insbesondere für eine dreidimensionale optische Manipulation benötigt.
EP 2 042 905 B1 zeigt eine Kombination von zwei Scannerpaaren. Hier kann jeweils das eine Scannerpaar oder das andere Scannerpaar ausgewählt werden. Allerdings können nicht einzelne Achsen sehr schnell hinzugeschaltet werden, weil die zu bewegenden Massen vergleichsweise groß sind.
Als eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung angesehen werden, eine optische Anordnung zu schaffen, mit der weitere Pupillenebenen bereitgestellt werden, wobei nur geringer zusätzlicher Bauraum beansprucht werden soll. Außerdem soll zwischen den Pupillenebenen möglichst schnell hin und her geschaltet werden können. Schließlich soll ein Laser-Scanning-Mikroskop mit zusätzlichen Pupillenebenen geschaffen werden, bei dem möglichst schnell zwischen den verschiedenen Pupillenebenen hin und her geschaltet werden kann.
Diese Aufgabe wird durch die optische Anordnung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Im Hinblick auf das Mikroskop wird die Aufgabe durch das Laser-Scanning-Mikroskop mit den Merkmalen des Anspruchs 18 gelöst.
Vorteilhafte Varianten der erfindungsgemäßen optischen Anordnung und des erfindungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskops sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche und werden außerdem im Folgenden, insbesondere im Zusammenhang mit den Figuren, beschrieben.
Die optische Anordnung der oben angegebenen Art ist erfindungsgemäß dadurch weitergebildet, dass eine zweite fokussierende Einrichtung vorhanden ist zum Erzeugen einer dritten Pupillenebene, die zu der ersten Pupillenebene und der zweiten Pupillenebene optisch konjugiert ist, dass in der dritten Pupillenebene eine dritte Strahlumlenkeinrichtung angeordnet ist zum Umlenken der Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung, dass zwischen der ersten fokussierenden Einrichtung und der zweiten Pupillenebene einerseits und der zweiten Pupillenebene und der zweiten fokussierenden Einrichtung andererseits ein variables Strahlumlenkmittel vorhanden ist zum Umschalten eines optischen Strahlengangs zwischen einem ersten Strahlweg und einem zweiten Strahlweg.
Das Laser-Scanning-Mikroskop der oben angegebenen Art ist erfindungsgemäß dadurch weitergebildet, dass eine erfindungsgemäße optische Anordnung zum Scannen von Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung vorhanden ist.
Als optische Anordnung wird im Rahmen der vorliegenden Beschreibung eine Anordnung bezeichnet, die insbesondere strahlformende Komponenten, wie Linsen und Hohlspiegel, und strahlumlenkende Komponenten, wie Spiegel, die insbesondere beweglich sein können, aufweist.
Unter dem Begriff des Scannens wird das gesteuerte Führen eines Strahls der Anregungsstrahlung oder der Manipulationsstrahlung über eine Probe verstanden. Dieses Scannen kann in einem regelmäßigen Muster, beispielsweise zeilenweise, aber insbesondere auch entlang einer vorzuggebenden Trajektorie erfolgen.
Unter Anregungsstrahlung wird für die Zwecke dieser Beschreibung elektromagnetische Strahlung, insbesondere sichtbares Licht, aber auch Infrarot- und Ultraviolettstrahlung verstanden, die allgemein zur Bildgebung dient. In aller Regel wird diese Anregungsstrahlung von Lasern bereitgestellt. Dabei können unterschiedliche Kontrastverfahren zum Einsatz kommen. Besonders bevorzugt handelt es sich um Strahlung zur Anregung einer Fluoreszenz aus Farbstoffen, mit denen eine zu untersuchende Probe präpariert ist. Zur Messung dieses Fluoreszenzlichts dient ein Laser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskop. Grundsätzlich kann es sich aber auch um Beleuchtungslicht für die Lichtmikroskopie handeln.
Unter dem Begriff des Detektionslichts wird Licht verstanden, das von der Probe aufgrund der Anregung emittiert wird und das mittels der gesamten optischen Anordnung detektiert werden soll. Detektionslicht kann insbesondere Fluoreszenzlicht sein.
Als Manipulationsstrahlung wird elektromagnetische Strahlung, insbesondere im sichtbaren Bereich, aber auch im Infrarot- und Ultraviolettbereich, bezeichnet, mit denen eine gezielte Veränderung einer zu untersuchenden Probe, insbesondere in einem gezielt ausgewählten Raumbereich oder einer gezielt ausgewählten und vorzugebenden Trajektorie, bewerkstelligt werden kann.
Die Begriffe Anregungsstrahlung und Anregungslicht einerseits und Manipulationsstrahlung und Manipulationslicht andererseits werden in dieser Beschreibung synonym verwendet.
Als Pupillenebene wird für die Zwecke dieser Beschreibung eine optische Ebene verstanden, die in einem Betriebszustand der optischen Anordnung in einem Laser-Scanning-Mikroskop optisch konjugiert ist zu einer hinteren Objektivpupille des jeweils im Einsatz befindlichen Mikroskopobjektivs. Beispielsweise sind in einem Betriebszustand der erfindungsgemäßen Anordnung zum Scannen die erste, die zweite, die dritte und die vierte Pupillenebene optisch konjugiert zur hinteren Pupille des Mikroskopobjektivs. Weil die Position der hinteren Objektivpupille variiert, sind die Pupillenebenen in der Regel nur für ein Objektiv exakt optisch konjugiert zur hinteren Objektivpupille. Für die anderen Objektive sind die Pupillenebenen näherungsweise optisch konjugiert zur hinteren Objektivpupille.
Grundsätzlich können mit der erfindungsgemäßen Anordnung beliebig viele Pupillen erzeugt werden. Wichtige Anwendungen profitieren aber bereits von vier aufeinander abgebildeten Pupillen bei überschaubarem Justageaufwand und geringen optischen Verlusten.
Die Scanoptik besteht in der Regel aus einer Anordnung von Linsen, durch die eine zur hinteren Objektivpupille äquivalente erste Pupillenebene generiert wird.
Als Scanner, beispielsweise erster, zweiter und dritter Scanner, werden im Rahmen der vorliegenden Beschreibung Einrichtungen verstanden, mit denen ein Strahl mindestens in einer Koordinatenrichtung in seiner Richtung verändert werden kann. Besonders bevorzugt kommen als Scanner schwenkbare Spiegel zum Einsatz.
Wenn im Rahmen der vorliegenden Beschreibung von Koordinatenrichtungen die Rede ist, ist dabei insbesondere an kartesische Koordinaten gedacht. Beispielsweise kann die erste Koordinatenrichtung die y-Richtung und die zweite Koordinatenrichtung kann die x-Richtung sein. Häufig wird ein Koordinatensystem so gewählt, dass die optische Achse eines Systems mit der z-Achse zusammenfällt.
Als erste und zweite fokussierende Einrichtung zum Generieren einer Pupillenebene können prinzipiell beliebige fokussierende Komponenten, insbesondere auch Linsen oder Linsengruppen, zum Einsatz kommen. Besonders bevorzugt werden als erste und/oder zweite fokussierende Einrichtung Hohlspiegel, insbesondere sphärische oder torische Hohlspiegel, verwendet.
Dabei kann es insbesondere von Vorteil sein, wenn der optische Weg über den ersten Hohlspiegel so ausgelegt wird, dass eine Vergrößerung (|V| > 1) oder eine Verkleinerung (|V| < 1) erzielt wird. Das ist insbesondere dann von Vorteil, wenn verschiedene Scanner miteinander kombiniert werden sollen. Beispielsweise ist bekannt, dass resonante MEMS-Scanner nur bestimmte Durchmesser erreichen können, wenn Resonanzfrequenz und dynamische Spiegeldeformation gegeben sind. Andererseits gibt es eine optimale Größe für quasistatische Galvanometerscanner, die nicht mit der Größe des resonanten MEMS-Scanners zusammenfällt. Für eine optimale optische Vereinigung beider Scannersysteme kann eine Anpassung der Pupillendurchmesser über eine Vergrößerungsstufe sehr sinnvoll sein. In gewissen Grenzen können hier Abweichungen von einer 1:1 Abbildung zugelassen werden, womit optional verschieden große Scanner in den jeweiligen Positionen stehen können.
Für die zweite und die dritte Strahlumlenkeinrichtung kommt es darauf an, dass die Strahlung definiert umgelenkt wird. Besonders bevorzugte Varianten zeichnen sich dadurch aus, dass die zweite Strahlumlenkeinrichtung in der zweiten Pupillenebene ein zweiter Scanner ist zum Scannen der Anregungsstrahlung und/oder der Manipulationsstrahlung, insbesondere in einer von der ersten Koordinatenrichtung verschiedenen zweiten Koordinatenrichtung, und/oder dass die dritte Strahlumlenkeinrichtung in der dritten Pupillenebene ein dritter Scanner ist zum Scannen der Anregungsstrahlung und/oder der Manipulationsstrahlung, insbesondere in einer von der ersten Koordinatenrichtung verschiedenen zweiten Koordinatenrichtung.
Die erfindungsgemäße optische Anordnung zeichnet sich durch eine große Flexibilität aus. Beispielsweise können die zweite Strahlumlenkeinrichtung und/oder die dritte Strahlumlenkeinrichtung auch ein feststehender Spiegel, ein Spiegel, dessen Oberfläche aktiv gekrümmt werden kann, oder ein weiteres wellenfrontveränderndes Element sein. Beispielsweise kann mit einem wellenfrontveränderndem Element die Fokussierung entlang der optischen Achse, beispielsweise in z-Richtung, verändert werden und diesem Sinn kann ein z-Scan durchgeführt werden.
Mit dem Begriff eines variablen Strahlumlenkmittels wird eine Komponente bezeichnet, die irgendeine Art von Verstellung oder Einstellung zulässt und somit abhängig von dieser Verstellung oder Einstellung einfallendes Licht oder einfallende Strahlung unterschiedlich umlenkt. Insbesondere ist dabei an variabel einstellbare Spiegel gedacht.
Mit dem Umschalten eines optischen Strahlengangs zwischen einem ersten Strahlweg und einem zweiten Strahlweg ist gemeint, dass je nach Schaltzustand das Licht oder die Strahlung entweder den ersten Strahlweg oder den zweiten Strahlweg durchläuft. Der erste und der zweite Strahlweg sind dabei verschieden, das heißt, es gibt Teile des ersten Strahlwegs, die nicht Teil des zweiten Strahlwegs sind und umgekehrt.
Der erste Strahlweg kann bevorzugt mindestens von der dritten Strahlumlenkeinrichtung über die zweite Strahlumlenkeinrichtung zu dem ersten Scanner verlaufen. Der zweite Strahlweg kann bevorzugt mindestens von der dritten Strahlumlenkeinrichtung unter Umgehung der zweiten Strahlumlenkeinrichtung über das variable Strahlumlenkmittel zu dem ersten Scanner verlaufen.
Bei einer besonders bevorzugten Variante der erfindungsgemäßen Anordnung verläuft der erste Strahlweg mindestens von der dritten Strahlumlenkeinrichtung über die zweite fokussierende Einrichtung, die zweite Strahlumlenkeinrichtung und die erste fokussierende Einrichtung zu dem ersten Scanner. Der zweite Strahlweg kann außerdem bevorzugt mindestens von der dritten Strahlumlenkeinrichtung über die zweite fokussierende Einrichtung unter Umgehung der zweiten Strahlumlenkeinrichtung über das variable Strahlumlenkmittel und die erste fokussierende Einrichtung zu dem ersten Scanner verlaufen.
Mit dem Merkmal, dass der zweite Scanner beim zweiten Strahlweg umgangen wird, soll zum Ausdruck gebracht werden, dass Anregungs- und/oder Manipulationsstrahlung, welche den zweiten Strahlweg nimmt, mit dem zweiten Scanner nicht in Kontakt kommt. Eine mögliche Bewegung dieses zweiten Scanners hat demnach keinen Einfluss auf das Anregungs- und/oder Manipulationsstrahlung.
Die vorliegende Erfindung eignet sich besonders für die konfokale Laser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskopie. Ein Mikroskopobjektiv dient dabei sowohl zum Leiten von Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung auf einer Probe oder in einen Bereich einer Probe als auch zum Leiten von Detektionslicht, welches von dem mit Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung beleuchteten Bereich der Probe stammt.
Mit dem Begriff des Detektionsmoduls wird im Rahmen der vorliegenden Beschreibung diejenige Komponente bezeichnet, mit welcher das von einer beleuchteten Probe abgestrahlte Detektionslicht letzten Endes nachgewiesen wird. Ein solches Detektionsmodul weist insbesondere mindestens einen Strahlungsdetektor auf und kann, je nach Einsatzzweck, insbesondere Farbfilter und konfokale Blenden aufweisen.
Als ein Kerngedanke der vorliegenden Erfindung kann angesehen werden, mit geeigneten fokussierenden Mitteln, insbesondere einem Hohlspiegel, eine weitere Pupillenebene zu schaffen, in der ein weiterer Scanner angeordnet werden kann. Ein weiterer grundlegender Gedanke einer Variante der Erfindung besteht sodann darin, mithilfe eines variablen Strahlumlenkmittels den Strahl der Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung entweder über einen ersten Strahlweg, der einen ersten Scanner (in der Nomenklatur der Ansprüche der zweite Scanner) für eine bestimmte Koordinatenrichtung enthält, oder über einen zweiten Strahlweg, der für die genannte Koordinatenrichtung einen zweiten Scanner (in der Nomenklatur der Ansprüche der dritte Scanner) beinhaltet, zu leiten. Besondere Vorteile können nun erzielt werden, wenn der genannte erste Scanner für die bestimmte Koordinatenrichtung und der zweite Scanner für diese Koordinatenrichtung qualitativ unterschiedlich sind, wenn insbesondere der erste Scanner ein quasistatischer Scanner ist und der zweite Scanner ein Resonanzscanner ist. Mithilfe des variablen Strahlumlenkmittels kann so zwischen dem schnellen und dem langsamen Scanner hin und her geschaltet werden. Weil solch ein Schalten des Strahlwegs prinzipiell äußerst schnell (in der Größenordnung von 1 ms und darunter) verwirklicht werden kann, kann auch zwischen den beiden Strahlwegen und damit zwischen einem bildgebenden Modus und einem Manipulationsmodus äußerst rasch geschaltet werden.
Die erfindungsgemäße Anordnung ist überaus mächtig und kann zur Lösung verschiedener Probleme eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäße optische Anordnung ist insbesondere geeignet für den Einsatz in einem konfokalen Laser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskop. Das erfindungsgemäße Laser-Scanning-Mikroskop kann also besonders bevorzugt ein, insbesondere konfokales, Laser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskop sein.
Die erfindungsgemäße optische Anordnung und das erfindungsgemäße Laser-Scanning-Mikroskop können bevorzugt für eine Manipulation biologischer Proben, insbesondere in drei Dimensionen, genutzt werden. Allerdings sind auch Anwendungen in der Materialmikroskopie denkbar.
Die erfindungsgemäße Anordnung ist auch für die optische Manipulation, die Laser-Scanning-Mikroskopie, die Lichtblattmikroskopie sowie für andere Verfahren einsetzbar sein, bei welcher eine Probe mittels eines Laserstrahls gerastert wird.
Ein wesentlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass es möglich wird, in einem Laser-Scanning-Mikroskop einerseits eine Bildgebung oder eine optische Manipulation mit einem quasistatischen Scanner und andererseits eine schnelle Bildgebung mit einem resonanten Scanner durchzuführen.
Als quasistatischer Scanner wird ein Scanner bezeichnet, der nicht resonant sondern, vergleichsweise langsam, quasistatisch, betrieben wird. Insbesondere kann einem quasistatischen Scanner eine Ansteuerkurve aufgeprägt werden. Diese kann beispielsweise linearisiert sein, so dass jedem Pixel die gleiche Aufenthaltsdauer zugewiesen werden kann. Resonante Scanner erlauben nur Sinus-artige Bewegungen, die aber deutlich hochfrequenter sein können. Ein resonanter Scanner oder Resonanzscanner wird, in der Regel vergleichsweise viel schneller als ein quasistatischer Scanner, in einer mechanischen Resonanz betrieben. Sowohl der quasistatische als auch der resonant betriebene Scanner können verwirklicht sein durch einen galvanometrischen Scanner oder einen MEMS-Scanner.
Prinzipiell können für die Strahlablenkungseinrichtungen, insbesondere die Scanner, auch akustooptische Einrichtungen, insbesondere akustooptische Scanner, zum Einsatz kommen.
Insbesondere ermöglicht die Erfindung, dass sehr schnell zwischen einem Manipulationsmodus und einer Bildgebung geschaltet werden kann. Sehr schnell heißt hierbei, dass die Umschaltung schneller als ca. 1 Millisekunde (ms) erfolgen kann. Weiterhin ist auch eine dreidimensionale optische Manipulation, beispielsweise ein gezieltes räumliches Ausbleichen (Stichworte: FRAP; uncageing) oder ein optogenetisches Schalten von lonenkanälen usw. und ein anschließendes Umschalten auf eine gegebenenfalls sehr schnelle Bildgebung möglich. Für eine dreidimensionale optische Manipulation werden drei optische Elemente benötigt. Für das Scannen in der Ebene sind quasistatische Galvoscanner besonders vorteilhaft, da diese definiert räumliche Bereiche in einer gegebenen Zeit belichten und damit die notwendigen Lichtenergiemengen, die auch als Lichtdosen bezeichnet werden, deponieren können. Die dritte Dimension kann zum Beispiel über einen z-scannenden Spiegel adressiert werden. Diese Elemente können sich aufgrund ihrer geometrischen Dimension sehr gut mit optischen Spiegelscannern ergänzen.
Auch unter der Randbedingung, dass Bildgebung und Manipulation durch dieselbe Scanlinse erfolgen soll, lässt sich die vorliegende Erfindung vorteilhaft einsetzen. Dabei wird am Mikroskopstativ nur ein Port belegt.
Besondere Herausforderungen ergeben sich für die oben beschriebenen Aufgaben, wenn die Wellenlängen für die Manipulation und die Bildgebung identisch sein sollen. Für den Fall, der auch praktische Relevanz hat, dass beide Wellenlängen unterschiedlich sind, können Farbteiler verwendet werden.
xy/z-scannende Systeme sind neben der optischen Manipulation auch sehr gut dazu geeignet, beliebige Trajektorien und Ebenen in einer dreidimensionalen Probe bildgebend abzuscannen. Das ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn man definierte Strukturen innerhalb eines Volumens schnell abbilden möchte. Beispielsweise kann ein Neuron, welches einem irregulären Verlauf in einem dreidimensionalen Volumen folgt, abgebildet werden. Wenn dieses Neuron sehr schnell abgebildet, oder die Signaltransduktion, z.B. Ca(2+)-Wellen, entlang dieses Neurons optisch vermessen werden soll, ist erfindungsgemäße optische Anordnung in der Lage, dieses im Volumen verlaufende Gebilde zu verfolgen.
Die vorliegende Erfindung kann auch nutzbringend bei der sogenannten Lichtblattmikroskopie zum Einsatz kommen. Dabei handelt es sich um eine alte Technologie, die von Zsigmondy und Siedentopf 1902/1903 bei Carl Zeiss für die Kolloidforschung entwickelt wurde. Nachdem die Methode lange Zeit nahezu in Vergessenheit geraten war, erlebte sie durch neue Arbeiten von E. Stelzer eine Renaissance. Dies wurde insbesondere durch den großen Fortschritt in der Verarbeitung digitaler Daten stimuliert.
In der Lichtblattmikroskopie besteht, zumindest in der Ausführungsform, die nicht auf einer Beleuchtung mit einer Zylinderlinse beruht, ebenfalls die Aufgabe, eine Probe mit einem Laserstrahl abzuscannen. Auch hier sind mehrere Pupillen besonders vorteilhaft, weil neben dem Scannen des Strahls in zwei Dimensionen noch dynamische Strahlformungen durchgeführt werden sollen, siehe zum Beispiel Dean et al.: Deconvolution-free subcellular imaging with axially swept light sheet microscopy, Biophysic. J., Vol. 108, 2807-2815 (2015)). Die erfindungsgemäße optische Anordnung und das erfindungsgemäße Laser-Scanning-Mikroskop können auch hier sehr vorteilhaft eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäße optische Anordnung kann außerdem sowohl für eine lineare Fluoreszenzanregung als auch für eine nichtlineare Fluoreszenzanregung, beispielsweise zur Mehrphotonenmikroskopie, genutzt werden. Es sind alle gängigen und bekannten Verfahren mit der Anordnung möglich (2-, 3- oder Mehrphotonenfluoreszenz; CARS, SRS usw.). Insbesondere die Zweiphotonenmikroskopie ist heute eine Standardmethode zur Untersuchung lebender Proben. Insbesondere im sogenannten Neuro-Imaging spielen dreidimensionale Manipulationen der Probe eine wesentliche Rolle beim Verständnis neurobiologischer Vorgänge im Hirn lebender Tiere.
Grundsätzlich kommt es für die verwendeten Scanner nur darauf an, dass eine Strahlablenkung in der jeweiligen Koordinatenrichtung mit der gewünschten Geschwindigkeit und Genauigkeit durchgeführt wird. Besonders bevorzugt ist der zweite Scanner ein Resonanzscanner und der dritte Scanner ein quasistatischer Scanner. Besonders vorteilhaft wirkt sich dabei aus, dass der zweite Scanner, also der schnelle Resonanzscanner, im Fall des zweiten Strahlwegs umgangen wird, mit anderen Worten also nicht mehr wirksam ist. Das bedeutet, dass der schnelle zweite Scanner sehr rasch weggeschaltet werden kann. Grundsätzlich sind der zweite und der dritte Scanner austauschbar, d.h. es kann auch zweckmäßig sein, wenn dritte Scanner ein Resonanzscanner und der zweite Scanner ein quasistatischer Scanner ist. Beide Varianten können in bestimmten Situationen vorteilhaft sein.
Beide Varianten ermöglichen, dass sehr rasch zwischen einem bildgebenden Modus, bei dem der schnelle Scanner zum Einsatz kommt, und einem Anregungsmodus, der mithilfe des langsamen quasistatischen Scanners durchgeführt wird, hin und her geschaltet werden kann.
Da es für einen bildgebenden Modus im allgemeinen ausreicht, wenn für eine Koordinatenrichtung ein schneller Scanner zur Verfügung steht, kann bei einer weiteren vorteilhaften Variante der erste Scanner ebenfalls ein vergleichsweise langsamer Scanner und insbesondere ein galvanometrischer Scanner sein.
Es ist aber auch möglich, in jeder der Pupillen einen resonanten Scanner zu platzieren, wobei die Schwingungsachsen so gebildet sind, dass die gerasterten Linien in der Probe vorteilhaft, aber nicht zwingend, einen Winkel von 90° bilden. Somit kann zwar das Bildfeld nicht kontinuierlich gedreht werden. Aber es ist in gewissen Grenzen eine Anpassung an eine Probengeometrie möglich. Allerdings erfordert dieser Modus, dass die Optiken, insbesondere die Hohlspiegel, ein genügend großes Feld übertragen.
Schließlich erlaubt die erfindungsgemäße optische Anordnung auch, den durch den resonanten Scanner gerasterten Bereich mit dem quasistatischen Scanner in der Probenebene zu verschieben (sogenanntes „panning“). Somit ist es möglich, zwischen verschiedenen „regions of interest“ (ROI) zu springen.
In der ersten Pupillenebene, die der Scanoptik räumlich am Nächsten liegt, kann grundsätzlich auch ein zweidimensionaler Scanner, z.B. ein zweidimensionaler MEMS-Scanner mit einem einzigen Schwenkpunkt, angeordnet werden.
Für das variable Strahlumlenkmittel, das zum Umschalten zwischen dem ersten Strahlweg und dem zweiten Strahlweg dient, kommt es prinzipiell nur darauf an, dass das gewünschte Umschalten hinreichend rasch möglich ist. Bei besonders bevorzugten Varianten weist das variable Strahlumlenkmittel einen variabel positionierbaren Spiegel auf. Besonders zweckmäßig werden dabei sehr leichte Spiegel verwendet, um die zu bewegenden Massen und damit die auftretenden und notwendigen Kräfte klein zu halten.
Die variable Positionierbarkeit des Spiegels erlaubt grundsätzlich vielfältige technische Ausgestaltungen. Bei vergleichsweise unaufwändig zu realisierenden Ausführungen sind Mittel vorhanden zum Herein- und Herausschieben des Spiegels oder zum Herein- und Herausschwenken des Spiegels in den beziehungsweise aus dem Strahlengang.
Bei weiteren vergleichsweise unaufwändige Varianten, die sich außerdem durch mechanisch günstige Eigenschaften auszeichnen, ist der Spiegel ein Drehspiegel mit einer Dreheinrichtung, der in einer ersten Drehposition, in welcher der erste Strahlweg ausgewählt ist, nicht Teil des optischen Strahlengangs ist und der in einer von der ersten Drehposition verschiedenen zweiten Drehposition, in welcher der zweite Strahlweg ausgewählt ist, Teil des optischen Strahlengangs ist.
Für den Spiegel an sich kommt es grundsätzlich nur darauf an, dass die Anregungs- und/oder Manipulationsstrahlung hinreichend effektiv reflektiert wird. Wenn für unterschiedliche Wellenlängen unterschiedliche Eigenschaften erzielt werden sollen, kann es von Vorteil sein, wenn das variable Strahlumlenkmittel einen dielektrischen und/oder dichroitischen Spiegel aufweist.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsvariante der erfindungsgemäßen optischen. Anordnung zeichnet sich dadurch aus, dass das variable Strahlumlenkmittel einen wellenlängenabhängigen und polarisationsabhängigen dielektrischen und/oder dichroitischen Spiegel aufweist, wobei dieser Spiegel Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung mit einer ersten Wellenläge und einem ersten Polarisationszustand transmittiert, Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung mit der ersten Wellenläge und einem zweiten Polarisationszustand, der von dem ersten Polarisationszustand verschieden ist, reflektiert und von einer Probe ausgesandtes Fluoreszenzlicht mit einer rotverschobenen Wellenlänge unabhängig von dessen Polarisationszustand transmittiert.
Beispielsweise kann dabei der erste Polarisationszustand bezogen auf den dielektrischen und/oder dichroitischen Spiegel s-Polarisation und der zweite Polarisationszustand bezogen auf den dielektrischen und/oder dichroitischen Spiegel p-Polarisation sein.
Die Anordnung eines solchen dielektrischen und/oder dichroitischen Spiegel im Strahlengang ermöglicht in vorteilhafter Weise das Umschalten zwischen dem ersten Strahlweg und dem zweiten Strahlweg der Anregungsstrahlung und/oder der Manipulationsstrahlung durch Umschalten zwischen s- und p-Polarisation. Hierzu können bei dem erfindungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskop geeignete Umschaltmittel zum Umschalten der Polarisation, beispielsweise eine Lambda-Halbe-Platte, vorhanden sein.
Grundsätzlich kommt es beim Umschalten der Strahlwege nur darauf an, dass die zweite Strahlumlenkeinrichtung, insbesondere der zweite Scanner umgangen wird. Dies kann platzsparend und in geringem Bauraum verwirklicht werden bei Ausführungsvarianten, bei denen in dem zweiten Strahlweg eine vierte Pupillenebene gebildet ist, die zu der ersten Pupillenebene und der dritten Pupillenebene optisch konjugiert ist und in der eine weitere strahlumlenkende und/oder strahlformende Komponente angeordnet ist.
Diese weitere strahlumlenkende und/oder strahlformende Komponente kann beispielsweise ein, insbesondere feststehender, Spiegel sein.
Eine weitere Pupillenebene ermöglicht aber auch Eingriffe in die Wellenfront des Anregungsstrahlung und/oder der Manipulationsstrahlung. Unter diesen Gesichtspunkt kann es von Vorteil sein, wenn die weitere strahlumlenkende Komponente ein Spiegel ist, dessen Oberfläche aktiv gekrümmt werden kann, oder ein segmentierter Spiegel oder eine sonstige Einrichtung zum Manipulieren der Wellenfront ist.
Beispielsweise kann die Wellenfront mit Elementen der in J. Biomed. Opt. 21(12), 121507, Oct 12, 2016, siehe dort insbesondere , beschriebenen Art so manipuliert werden, dass eine Umfokussierung in der Probe mit hoher Geschwindigkeit erreicht wird.
Wellenfrontverändernde Elemente dieser Art werden in der Regel über vergleichsweise aufwändige Relayoptiken in den Strahlengang eingebracht. Insbesondere für Systeme, in denen auch konfokal gemessen werden soll, führen diese Relayoptiken zu einem erheblichen und oftmals nicht akzeptablen Lichtverlust und sind darüber hinaus teuer und schwer zu justieren. Abgesehen davon ist eine schnelle Umschaltung des Strahlwegs zwischen Manipulation und Bildgebung in der oben beschriebenen Art mit Relayoptiken kaum möglich.
Auch in dieser Hinsicht bringt die erfindungsgemäße optische Anordnung erhebliche Verbesserungen. Ein weiterer Modus, der insbesondere dreidimensionale Manipulationen, wie sie zum Beispiel in der Optogenetik eingesetzt werden, unterstützt, kann durch die erfindungsgemäße Anordnung zur Verfügung gestellt werden, indem man insbesondere in der vierten Pupillenebene ein schnelles wellenfrontformendes Element einbringt. Solche Elemente werden zum Beispiel von der Firma Revibro Optics (Bozeman, MT 59717) angeboten. Natürlich sind hier auch alternative Bauteile möglich, die eine gewünschte Funktion zur Verfügung stellen, hierfür aber eine optische Pupille benötigen. Mit dem schnell verstellbaren z-scan-Element kann in Kombination mit den quasistatischen Scannern eine optische Manipulation in einem dreidimensionalen Volumen erfolgen.
Darüber hinaus kann auch eine Steuer- und Auswerteeinheit vorhanden sein, welche die Komponenten der erfindungsgemäßen optischen Anordnung ansteuert, beispielsweise die variable strahlumlenkende Einrichtung, eine Einrichtung zum Umschalten der Polarisation und/oder eine Einrichtung zum Manipulieren der Wellenfront, wie einen segmentierten Spiegel oder einen Spiegel, dessen Oberfläche aktiv gekrümmt werden kann. Bei solch einer Steuer- und Auswerteeinheit kann es sich beispielsweise um einen PC handeln.
Bei besonders vorteilhaften Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskops ist eine Einrichtung zur Multipunktbeleuchtung mit einer Mehrzahl von Beleuchtungskanälen vorhanden.
Beispielsweise kann die Einrichtung zur Multipunktbeleuchtung zur Steuerung der einzelnen Beleuchtungskanäle einen mehrkanaligen AOTF aufweisen. Damit können die einzelnen Beleuchtungskanäle grundsätzlich beliebig im Hinblick auf Wellenlänge und Intensität der Strahlung eingestellt werden.
Bei einer besonders bevorzugten Variante wird einer der Beleuchtungskanäle zur Anregung und/oder zur Manipulation einer Probe verwendet und die weiteren Beleuchtungskanäle werden zur Bildgebung verwendet.
Hierzu sind Varianten des erfindungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskops besonders bevorzugt, bei denen für mindestens einen der Beleuchtungskanäle eine Einrichtung zur Manipulation der Polarisation, insbesondere ein Lambda-Halbe-Plättchen, vorhanden ist. Mit dieser Einrichtung zur Manipulation, also zum Umschalten, der Polarisation kann der Strahlengang für mindestens einen Beleuchtungskanal zwischen dem ersten Strahlweg und dem zweiten Strahlweg hin und her geschaltet werden.
Ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist außerdem, dass sie grundsätzlich bei verschiedenen Mikroskoptechniken zum Einsatz kommen kann.
Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Laser-Scanning-Mikroskop zur Kontrastgebung auf Grundlage mindestens eines nichtlinearen Kontrastprinzips eingerichtet sein. Insbesondere kann es sich bei dem nichtlinearen Kontrastprinzip um eine Mehrphotonenfluoreszenz, beispielsweise 2- oder 3-Photonen-Fluoreszenz, um CARS (kohärente Anti-Stokes Raman Streuung) oder um SRS (stimulierte Raman Streuung) handeln. Besonders bevorzugt ist das erfindungsgemäße Mikroskop ein Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop.
Besonders bevorzugt kann das erfindungsgemäße Mikroskop auch ein konfokales Mikroskop, insbesondere ein konfokales Laser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskop, sein. Als konfokal wird ein Mikroskop bezeichnet, wenn in einer zur Bildebene konjugierten Ebene ein Pinhole vorhanden ist.
Wegen der Konzentration des Anregungsvolumens durch die Nichtlinearität der Mehr-Photonen-Fluoreszenz ist bei einem Mehr-Photonen-Scanning-Mikroskop oder Mehr-Photonen-Fluoreszenz-Scanning-Mikroskop eine solche konfokale Blende nicht unbedingt notwendig.
Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung werden im Folgenden unter Bezug auf die schematischen Figuren erläutert. Hierin zeigen:

1: ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen optischen Anordnung;
2: ein zweites Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen optischen Anordnung;
3: ein Detail eines dritten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen optischen Anordnung;
4: ein Diagramm, in dem für einen bestimmten dielektrischen und/oder dichroitischen Spiegel der Reflexionskoeffizient über die Wellenlänge in Abhängigkeit der Polarisation aufgetragen ist;
5: eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskops.

Gleiche und gleichwirkende Komponenten sind in allen Figuren in der Regel mit denselben Bezugszeichen gekennzeichnet.
Beispielhaft wird im Folgenden der Fall betrachtet, dass mittels quasistatischer Scanner eine räumlich gezielte Manipulation in einer Probe vorgenommen wird. Danach soll sehr schnell auf eine Bildgebung umgeschaltet werden. Hier wird zugrunde gelegt, dass man Bilder mit einer sogenannten Videorate aufnehmen möchte. Bei Laser-Scanning-Mikroskopen ist dies zum Beispiel mit sogenannten Resonanzscannern möglich. Für das nachfolgende Beispiel aus 1 wird weiterhin angenommen, dass sowohl die optische Manipulation als auch die Anregung der Fluoreszenz für die Bildgebung mit einer Laserlinie bei 488 nm realisiert wird, da dies ein häufig auftretender Anwendungsfall ist.
Das Problem wird durch eine erfindungsgemäße optische Anordnung SM zum Scannen von Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung in einem Laser-Scanning-Mikroskop, insbesondere einem Laser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskop, gelöst, wie sie in 1 dargestellt ist. Hierbei werden drei Scanner S1, S2 und S3 in einer Reihe hintereinander angeordnet, wobei durch eine Abbildung aller Scanner aufeinander erreicht wird, dass alle Scanner in einer optischen Pupille stehen. Dies ist ein wesentlicher Punkt, da hierdurch garantiert wird, dass die Pupille stationär bleibt und ein Bildfeld homogen aufgenommen wird.
Die optische Anordnung SM weist als wesentliche Komponente zunächst eine Scanoptik SO zum Bereitstellen einer ersten Pupillenebene P1 auf. Diese erste Pupillenebene P1 ist in einem Betriebszustand, also in einem Zustand, in dem die optische Anordnung SM mit einem Laser-Scanning-Mikroskop zusammenwirkt oder in dieses Mikroskop eingebaut ist, zu einer hinteren Objektivpupille des Mikroskopobjektivs optisch konjugiert. In dieser ersten Pupillenebene P1 ist ein erster Scanner S1 als erste Strahlumlenkeinrichtung angeordnet, der zum Scannen von Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung 10 in einer ersten Koordinatenrichtung y dient. Bei dem Scanner S1 kann es sich beispielsweise um einen quasistatischen galvanometrischen Scanner handeln. Der schematisch gezeigte Scannerspiegel S1 wird im Betrieb dabei um eine in 1 vertikal liegende Achse hin und her geschwenkt.
Sodann ist eine erste fokussierende Einrichtung vorhanden, bei der es sich im gezeigten Beispiel um einen ersten Hohlspiegel H1 handelt. Dieser erste Hohlspiegel H1 dient zum Bereitstellen einer zweiten Pupillenebene P2, die zu der ersten Pupillenebene P1 optisch konjugiert ist. In der zweiten Pupillenebene P2 ist als zweite Strahlumlenkeinrichtung ein zweiter Scanner S2 angeordnet, der zum Scannen der Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung in einer von der ersten Koordinatenrichtung y verschiedenen zweiten Koordinatenrichtung x dient. Das in 1 schematisch dargestellte xyz-Koordinatensystem ist ein kartesisches Koordinatensystem, d.h. die erste Koordinatenrichtung y ist senkrecht zu der zweiten Koordinatenrichtung x. Die Richtung der optischen Achse 12 verläuft im Bereich zwischen der Zwischenbildebene ZB und der Scanoptik SO parallel zur z-Achse. Der zweite Scanner S2 kann beispielsweise ein Resonanz-Scanner sein. Der in 1 schematisch gezeigte Scannerspiegel S2 wird im Betrieb um eine parallel zur z-Richtung orientierte Achse hin und her geschwenkt.
Weiterhin ist eine zweite fokussierende Einrichtung vorhanden, bei der es sich im gezeigten Beispiel um einen zweiten Hohlspiegel H2 handelt. Der zweite Hohlspiegel H2 dient zum Erzeugen einer dritten Pupillenebene P3, die zu der ersten Pupillenebene P1 und der zweiten Pupillenebene P2 optisch konjugiert ist. In dieser dritten Pupillenebene P3 ist als dritte Strahlumlenkeinrichtung ein dritter Scanner S3 angeordnet, der zum Scannen der Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung 10 in der zweiten Koordinatenrichtung x dient. Der dritte Scanner S3 kann, wie der erste Scanner S1, ein quasistatischer galvanometrischer Scanner sein.
Erfindungsgemäß ist zum Umschalten des optischen Strahlengangs zwischen einem ersten Strahlweg und einem zweiten Strahlweg zwischen dem ersten Hohlspiegel H1 und der zweiten Pupillenebene P2 einerseits und der zweiten Pupillenebene P2 und dem zweiten Hohlspiegel H2 andererseits ein variables Strahlumlenkmittel 20 vorhanden. Bei dem in 1 dargestellten Beispiel ist das variable Strahlumlenkmittel 20 ein Spiegel 21, der in den Strahlengang hinein- oder aus diesem herausgeschoben werden kann. Dazu sind geeignete mechanische Mittel vorhanden, die in 1 nicht im Detail dargestellt sind.
Erfindungsgemäß verläuft dabei der erste Strahlweg von dem dritten Scanner S3 über den zweiten Hohlspiegel H2, den zweiten Scanner S2 und den ersten Hohlspiegel H1 zu dem ersten Scanner S1. Der zweite Strahlweg verläuft erfindungsgemäß von dem dritten Scanner S3 über den zweiten Hohlspiegel H2 unter Umgehung des zweiten Scanners S2 über den Spiegel 21, durch den das variable Strahlumlenkmittel 20 verwirklicht ist und der sich, wenn der zweite Strahlweg ausgewählt ist, im Strahlengang befindet, und den ersten Hohlspiegel H1 bis zu dem ersten Scanner S1. Die zweite Pupillenebene P2, in der sich der zweite Scanner S2 befindet, wird durch den in den Strahlengang hineingeschobenen Spiegel 21 auf eine vierte Pupillenebene P4 abgebildet. In dieser vierten Pupillenebene P4 ist eine weitere strahlumlenkende Einrichtung 30 positioniert, bei der es sich in dem in 1 gezeigten Beispiel um einen feststehenden Spiegel 31 handelt.
Grundsätzlich kann in der vierten Pupilleneben P4 anstelle des feststehenden Spiegels 31 auch ein optisches Element zur schnellen Umfokussierung, wie es z.B. kommerziell von der Firma Revibro Optics (Bozeman, MT 59717) angeboten wird, angeordnet sein.
Wesentlich ist, dass der Strahlweg über den zweiten Scanner S2 und damit die Wirkung dieses zweiten Scanners S2 durch Betätigung des variablen Strahlumlenkmittels, also durch Hineinschieben des Spiegels 21 in den Strahlengang, deaktiviert oder abgeschaltet wird. Es wird also geschaltet zwischen den zweidimensionalen Scans mit und ohne resonanten Scanner.
Der Aufbau eines erfindungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskops wird mit Bezug auf 5 erläutert. Das dort schematisch dargestellte Laser-Scanning-Mikroskop 100 weist als wesentliche Komponenten ein Lasermodul LM, einen Hauptfarbteiler HFT, eine erfindungsgemäße optische Anordnung SM zum Scannen von Anregungs- und Manipulationslicht 10, ein Mikroskopobjektiv MO und ein Detektionsmodul DM auf. Das Lasermodul LM dient als Strahlungsquelle für Anregungslicht 16 und Manipulationslicht 10. In dem in 5 schematisch dargestellten Beispiel trifft das von dem Lasermodul LM ausgesandte Anregungslicht 16 oder Manipulationslicht 10 auf ein Multipunkt-Modul 40, welches den einkommenden Lichtstrahl in eine Mehrzahl von Strahlenbündeln auftrennt, die schließlich in unterschiedliche Fokalvolumina auf oder in einer Probe S fokussiert werden. Die spektrale Zusammensetzung und die Intensität kann für die einzelnen Teilstrahlen, beispielsweise mit einem mehrkanaligen AOTF, separat eingestellt werden. Das Lasermodul LM, das Multipunkt-Modul 40, die erfindungsgemäße optische Anordnung zum Scannen SM, eine nicht gezeigter Objektivrevolver und das Detektionsmodul DM sind über Verbindungsleitungen 71 bis 75 mit einer Steuer- und Auswerteeinheit PC verbunden, bei der es sich um einen handelsüblichen Rechner handeln kann.
Nach Durchlaufen des Multipunkt-Moduls 40 gelangt das Anregungslicht 16 oder Manipulationslicht 10 über den Hauptfarbteiler HFT zu der erfindungsgemäßen optischen Anordnung SM zum Scannen des Anregungslichts 16 und/oder Manipulationslichts 10. Die Scanoptik SO der optischen Anordnung SM fokussiert das Anregungslicht 16 oder Manipulationslicht 10 in eine Zwischenbildebene ZB. Über weitere Komponenten, beispielsweise Spiegel, die in 5 nicht dargestellt sind, gelangt das Anregungslicht 16 oder Manipulationslicht 10 über eine hintere Objektivpupille P in das Mikroskopobjektiv MO, welches das Licht in mehrere Fokalvolumina auf oder in der Probe S, die sich in einer Probenebene SP befindet, fokussiert. Die Anzahl der separaten Fokalvolumina entspricht der Anzahl der in dem Multipunkt-Modul 40 generierten separaten Strahlbündel. Wenn man das Multipunkt-Modul 40 weglassen würde, würde das Anregungs- oder Manipulationslicht in einen Fokalpunkt fokussiert. Mit der erfindungsgemäßen optischen Anordnung SM zum Scannen werden die Fokalvolumina des Anregungs- oder Manipulationslichts 10 in der Zwischenbildebene ZB und damit in der zur Zwischenbildebene ZB optisch konjugierten Probenebene SP gescannt.
Zunächst wird nun der Strahlverlauf für Manipulationslicht 10 erläutert, mit welchem beispielsweise in einer Probe eine definierte Manipulation, zum Beispiel ein definiertes Ausbleichen entlang einer bestimmten Trajektorie bewerkstelligt wird. Ist dieses Ausbleichen durchgeführt, kann, wie im Folgenden erläutert wird, die erfindungsgemäße optische Anordnung SM rasch umgeschaltet und die Probe in einem bildgebenden Modus mithilfe von Anregungslicht 16 beobachtet werden. Das Manipulationslicht 10 gelangt zunächst auf den dritten Scanner S3 in der dritten Pupillenebene P3. In dem in 1 dargestellten Ausführungsbeispiel ist der dritte Scanner S3 ein quasistatischer galvanometrischer Scanner, der das Manipulationslicht 10 vergleichsweise langsam in x-Richtung scannt. Für das Manipulationslicht 10 wird bei der erfindungsgemäßen optischen Anordnung zum Scannen SM der zweite Strahlweg aktiviert, das heißt der Spiegel 21 als variables strahlumlenkendes Mittel 20 befindet sich im Strahlengang und der zweite Scanner S2 in der zweiten Pupille P2 ist deaktiviert. Vom dritten Scanner S3 gelangt das Manipulationslicht 10 demgemäß über den zweiten Hohlspiegel H2, den variablen Spiegel 21, den feststehenden Spiegel 31 in der vierten Pupillenebene P4 und den ersten Hohlspiegel H1 auf den ersten Scanner S1 in der ersten Pupillenebene P1. Der erste Scanner S1 ist ebenfalls ein quasistatischer galvanometrischer Scanner, der das Manipulationslicht 10 vergleichsweise langsam in y-Richtung scannt. Durch geeignete Ansteuerung des ersten Scanners S2 und des dritten Scanners S3 kann die gewünschte Manipulation in der Probe, beispielsweise das Ausbleichen entlang einer bestimmten Trajektorie bewerkstelligt werden. Anstelle des feststehenden Spiegels 31 in der vierten Pupille P4 kann dort auch beispielsweise ein Spiegel, dessen Oberfläche aktiv gekrümmt werden kann, positioniert werden, mit dem durch Variation der Fokussierung ein Scannen in z-Richtung durchgeführt werden kann. Solch ein Spiegel ist in der Regel zunächst flach und kann dann, beispielsweise zu einem Hohlspiegel, deformiert werden. So können im Prinzip auch dreidimensionale Trajektorien oder frei gewählte Volumina in einer Probe durch das Manipulationslicht 10 manipuliert werden.
Nach Abschluss der Manipulation kann es erwünscht sein, die optische Anordnung SM möglichst rasch in einen Bildgebungsmodus umzuschalten. Zu diesem Zweck wird der verschiebbare Spiegel 21 aus dem Strahlengang entfernt, in dem in 1 gezeigten Beispiel also nach oben herausgezogen. Das Anregungslicht 16 trifft nun ebenfalls, vom Hauptfarbteiler HFT kommend, zunächst auf den dritten Scanner S3 in der dritten Pupillenebene P3. Vom dritten Scanner S3 gelangt das Anregungslicht 16 aber nun über den zweiten Hohlspiegel H2 auf den zweiten Scanner S2 in der zweiten Pupillenebene P2, der das Anregungslicht 16 in x-Richtung scannt. In dem in 1 gezeigten Beispiel handelt es sich bei dem zweiten Scanner S2 um einen Resonanzscanner, also um einen Scanner, der im Vergleich zum ersten Scanner S1 und dritten Scanner S3 viel schneller ist. Weil der dritte Scanner S3 ein quasistatischer Scanner ist, kann er prinzipiell sehr rasch zum Stillstand gebracht werden oder das Scannen des Anregungslichts 16 in x-Richtung erfolgt kombiniert sowohl durch den dritten Scanner S3 als auch durch den zweiten Scanner S2. Beispielsweise kann mit den quasistatischen Scannern S1 und S3 der Ort eines bestimmten Sichtfelds eingestellt werden und das rasche Scannen erfolgt dann mit dem zweiten Scanner S2. Von dem zweiten Scanner S2 gelangt das Anregungslicht 16 sodann auf den ersten Hohlspiegel H1 und von diesem auf den ersten Scanner S1. Ab dem ersten Hohlspiegel H1 ist der Strahlverlauf dann gleich wie derjenige für das Manipulationslicht 10, der oben beschrieben wurde.
Die Pupillen P2 und P4 können mit verschiedenen optisch aktiven oder passiven Elementen bestückt sein. Im einfachsten Fall ist das jeweils ein Spiegel, sobald in der je anderen Pupille ein aktives Element steht, welches umgangen werden soll. Zum Beispiel kann in P2, wie beschrieben, ein resonanter Scanner stehen. Wenn dieser nicht gebraucht wird, sollte auch kein Licht über diesen geführt werden, um Störungen des Strahls durch Restbewegungen zu vermeiden. Zudem hat ein resonanter Scanner ein gewisses Einschwingverhalten. Will man eine sehr schnelle Schaltung zwischen einem Manipulationsmodus und einem schnellen Bildgebungsmodus mittels eines resonanten Scanners realisieren, so muss der Scanner durchgehend schwingen und man schaltet sich im entsprechenden Moment optisch auf diese Bewegung auf.
Es gibt wichtige Anwendungen der schnellen Bildgebung mit resonanten Scannern, die es erfordern, dass das Scanfeld des resonanten Scanners lateral über die Probe bewegt werden soll (sogenanntes „panning“). Die erfindungsgemäße optische Anordnung leistet dies, weil der schnelle zweite Scanner S2 und der quasistatische dritte Scanner S3 gleichzeitig verwendet werden können. Mit der Anordnung aus DE 10 2014 017 001 A1 ist das so nicht möglich.
Am zweiten Hohlspiegel H2 ist der Winkel zwischen ein- und ausfallendem Strahl bevorzugt gleich dem entsprechenden Winkel am ersten Hohlspiegel H1 und die Drehachsen des zweiten Scanners S2 und des dritten Scanners S3 liegen bevorzugt parallel zueinander. Dadurch wird erreicht, dass, unabhängig davon, ob mit dem zweiten Scanner S2 oder dem dritten Scanner S3 oder beiden gescannt wird, keine unsymmetrischen Scanverzeichnungen bei der Abtastung in der Probenebene auftreten (siehe dazu DE 10 2014 017 001 A1 ).
Nach Anregung der Probe S durch das Anregungslicht 10 sendet die Probe S in grundsätzlich bekannter Art Detektionslicht 14 aus, welches im Wesentlichen denselben optischen Strahlengang zurück bis zum Hauptfarbteiler HFT läuft. Der Spiegel 21 muss hierzu aus dem Strahlengang herausgezogen bleiben. Bei dem Detektionslicht 14 handelt es sich typischerweise um Fluoreszenzlicht, dessen Wellenlänge im Vergleich zur Wellenlänge des Anregungslichts 10 aufgrund Stokes-Verschiebung rotverschoben ist. Diese Rotverschiebung ermöglicht das Abtrennen des Detektionslichts 14 in dem Hauptfarbteiler HFT und das Detektionslicht 14 gelangt, gegebenenfalls über weitere nicht dargestellte Komponenten wie Spiegel oder Filter, zum Detektionsmodul DM und wird dort quantitativ nachgewiesen. Die Messdaten des Detektionsmoduls DM werden der Steuer- und Auswerteeinheit PC zugeführt.
Die erfindungsgemäße optische Anordnung, wie sie in 1 dargestellt ist, kann in verschiedener Hinsicht gewinnbringend erweitert werden.
Dass in 2 dargestellte Ausführungsbeispiel entspricht weitgehend demjenigen aus 1. Die Unterschiede bestehen bei dem variablen Strahlumlenkmittel 20. Bei dem in 2 gezeigten Ausführungsbeispiel handelt es sich bei diesem variablen Strahlumlenkmittel 20 um einen Drehspiegel 22 mit einer in 2 nicht dargestellten mechanischen Dreheinrichtung. Die Dreheinrichtung kann z.B. durch einen galvanometrischen Scanner verwirklicht sein. Dies ist vorteilhaft, da das Massenträgheitsmoment relativ klein gehalten werden kann.
Der Drehspiegel 22 in 2 kann zwischen einer ersten Position, die weitgehend dem in den Strahlengang hineingeschobenem Spiegel 21 aus 1 entspricht, und einer zweiten Position, in welcher der Drehspiegel 22 im Wesentlichen senkrecht zur Schwenkachse des zweiten Scanners S2 ausgerichtet ist, hin und her gedreht werden. Wesentlich ist, dass der Drehspiegel 22 in der zweiten Position nicht in den Strahlengang eingreift, dass also vom Hohlspiegel H2 einkommendes Anregungslicht 16, ungehindert durch den Drehspiegel 22, zu dem zweiten Scanner S2 und von diesem zu dem ersten Hohlspiegel H1 gelangen kann. Dasselbe gilt für Detektionslicht 14, welches den Strahlengang in der umgekehrten Richtung durchläuft.
Ein weiterer wesentlicher Vorteil der erfindungsgemäßen optischen Anordnung ist also, dass sehr schnell zwischen einem sogenannten Manipulationsmodus und einem schnellen Bildgebungsmodus geschaltet werden kann. Das kann auf verschiedene Art und Weise erfolgen.
Wenn das Anregungslicht und das Manipulationslicht spektral unterschiedlich ist, kann zunächst ein Farbfilter, z.B. ein dichroitischer Spiegel, an der Position des verschiebbaren Spiegels 21 in 1 eingebracht werden. Dieser Spiegel ist ein variables Strahlumlenkmittel insoweit als seine Reflexions- und Transmissionseigenschaften von der Wellenlänge der Strahlung abhängen. Zu beachten ist dabei, dass die Eigenschaften eines dichroitischen Spiegels abhängig sind vom Winkel der darauf einfallenden Strahlung, was unter Umständen zu Einschränkungen des Sehfelds führen kann.
Bei gleicher Wellenlänge der Manipulations- und der Fluoreszenzanregungsstrahlung wird im einfachsten Fall, wie in 1 gezeigt, ein reflektierendes Element (verschiebbarer Spiegel 21) in den Strahl eingeschwenkt oder eingeschoben. Allerdings muss hierbei ein Spiegel mit einer gewissen Masse bewegt werden. Es ist im Allgemeinen schwierig, mit einer solchen Anordnung schneller als 10 ms oder, noch besser, schneller als 1 ms zu werden. Besser in dieser Hinsicht ist, aufgrund seiner relativ geringen Massenträgheit, ein drehbarer Spiegel 22, wie er in 2 gezeigt ist. Eine Umschaltung, die nicht aus mechanischen Schaltelementen beruht, ist aber wünschenswert.
Es kann mit der optischen Anordnung, wie sie in 1 gezeigt ist, auch eine nichtmechanische Umschaltung zwischen den Pupillen erfolgen. Dieses Prinzip wird im Zusammenhang mit 3 erläutert.
Mit der Anordnung aus 3, die auch als Strahlweiche bezeichnet wird, kann zwischen den Pupillen P2 und P4 geschaltet werden. In der Pupille P2 steht jetzt zum Beispiel ein resonanter Scanner. Pupille P4 kann zum Beispiel mit einem festen Spiegel belegt sein. Wird der Strahlweg derart gewählt, dass P4 adressiert wird, kann eine Manipulation oder Bildgebung mittels der quasistatischen Scanner erfolgen, wobei der resonante Scanner umgangen wird. Alternativ ist es auch vorteilhaft, in P4 optisch aktive Elemente zu platzieren. Zum Beispiel kann dort ein wellenfrontmodulierendes Element platziert werden, welches sehr schnell einen Defokus einstellen kann.
In 3 ist solch eine optische Strahlweiche dargestellt. Diese dient dazu, zwischen den Pupillen P2 und P4 zu schalten. Für diese Schaltung können verschiedene optische Elemente Anwendung finden. Einerseits kann, wie erwähnt, ein Schaltspiegel innerhalb weniger Millisekunden zwischen P2 und P4 schalten. Werden noch schnellere Schaltzeiten benötigt, müssen alternative Schaltmechanismen genutzt werden. Soll die gleiche Wellenlänge bei beiden Pupillen für Manipulation und schnelle Bildgebung genutzt werden, so kann ein polarisationsabhängiges Element Anwendung finden.
Das Element weist eine wellenlängenabhängige Reflexion derart auf, dass bei kürzeren Wellenlängen eine polarisationsabhängige Aufspaltung erfolgt, während beide Polarisationskomponenten der Emission sehr gut transmittiert werden.
Im Zusammenhang mit den 3 und 4 wird das genauer erläutert. 3 zeigt schematisch einige wesentliche Details einer erfindungsgemäßen optischen Anordnung zum Scannen von Anregungslicht 16 und Manipulationslicht 10. Bei dieser Ausführungsvariante erfolgt das Umschalten zwischen dem ersten Strahlweg und dem zweiten Strahlweg durch Verändern der Polarisation des Anregungslichts 16 oder des Manipulationslichts 10. Anstelle der variabel im Strahlengang zu positionierenden Spiegel 21, 22 in den Ausführungsbeispielen der 1 und 2 befindet sich bei dem Ausführungsbeispiel der 3 ein dielektrischer Spiegel 24 im Strahlengang zwischen dem zweiten Scanner S2 in der zweiten Pupillenebene P2 einerseits und dem ersten Hohlspiegel H1 und dem zweiten Hohlspiegel H2 andererseits. Schematisch dargestellt ist außerdem strahlaufwärts von dem dritten Scanner S3 in der dritten Pupillenebene P3 eine Polarisationsdreheinrichtung 50. Dabei kann es sich um eine einen elektrooptischen Polarisator oder beispielsweise auch um eine Lambda-Halbe-Platte handeln, die mechanisch in den Strahlengang hinein- und aus diesem heraus bewegt werden kann. Der dielektrische Spiegel 24 ist im Hinblick auf die verwendeten Wellenlängen des Anregungslichts 16, des Manipulationslichts 10 und des typischerweise zu erwartenden Detektionslichts 14 gezielt konstruiert und hat folgende dichroitischen Eigenschaften, die in Zusammenschau mit 4 erläutert werden.
4 zeigt ein Diagramm, in dem der Reflexionskoeffizient des dielektrischen Spiegel 24 gegen die Wellenlänge des auftreffenden Lichts aufgetragen ist. Die Daten beziehen sich auf einen Auftreffwinkel des Lichts auf den Spiegel 24 von 45°. Die gestrichelte Kurve bezieht sich auf s-Polarisation und die durchgezogene Kurve bezieht sich auf p-Polarisation. Wie aus 4 ersichtlich, ist bei einem mit dem Bezugszeichen 61 gekennzeichneten Wert der Wellenlänge, der Reflexionskoeffizient bei s-Polarisation nahezu 1 und gleichzeitig der Reflexionskoeffizient bei p-Polarisation nahezu 0.
Die Lage innerhalb des spektralen Reflexionsverlaufes stellt sicher, dass bei der Manipulations-/Anregungswellenlänge entweder eine hohe Reflexion (s-polarisierte Komponente) oder eine hohe Transmission (p-polarisierte Komponente) erreicht wird.
Bei dieser Wellenlänge 61 wird s-polarisiertes Licht also nahezu vollständig reflektiert und p-polarisiertes Licht wird nahezu vollständig transmittiert. Das bedeutet, dass durch Umschalten der Polarisation zwischen Reflexion und Transmission umgeschaltet werden kann.
Die Fluoreszenzemission ist beispielhaft durch den Bereich 62 kenntlich gemacht. Hier werden beide Polarisationskomponenten hocheffizient transmittiert.
Diese Eigenschaften werden bei dem Ausführungsbeispiel der 3 ausgenutzt.
Mithilfe der Polarisationsdreheinrichtung 50 kann für das auf den dritten Scanner S3 einlaufende Licht die Polarisation zwischen zwei zueinander senkrechten Werten verstellt werden. Die Polarisationsdreheinrichtung 50 ist dabei so eingestellt, dass bezogen auf den dielektrischen Spiegel 24 entweder s-Polarisation oder p-Polarisation eingestellt werden kann.
Für den Fall, dass in einem Manipulationsmodus gearbeitet werden soll, dass die Probe also mit Manipulationslicht 10 beaufschlagt werden soll, wird mit der Polarisationsdreheinrichtung 50 zweckmäßig s-Polarisation eingestellt. Das Manipulationslicht 10 gelangt dann über den dritten Scanner S3 und den zweiten Hohlspiegel H2 auf den dielektrischen Spiegel 24. Wegen der eingestellten s-Polarisation wird das Manipulationslicht 10 am Auftreffpunkt 26 an dem dielektrischen Spiegel 24 reflektiert und in Richtung der weiteren strahlumlenkenden Komponente 30 in der vierten Pupillenebene P4 geleitet. Bei der weiteren strahlumlenkenden Komponente 30 handelt es sich im gezeigten Beispiel um einen feststehenden Spiegel 31. Grundsätzlich kann in der vierten Pupillenebene P4 auch ein Spiegel, dessen Oberfläche aktiv gekrümmt werden kann, oder eine wellenfrontmodulierende Komponente angeordnet werden. Das von dem feststehenden Spiegel 31 reflektierte Manipulationslicht 10 wird am Auftreffpunkt 27 erneut an dem dielektrischen Spiegel 24 reflektiert und in Richtung des Hohlspiegels H1 und von dort aus grundsätzlich so wie in 1 und 2 an den ersten Scanner S1 weitergeleitet. Der zweite schnelle Scanner S2 ist dabei deaktiviert.
Handelt es sich bei dem eingestrahlten Licht um Anregungslicht 16, wird mithilfe der Polarisationsdreheinrichtung 50 die Polarisation des Anregungslichts 16 auf p-Polarisation gestellt. Das führt dazu, dass das p-polarisierte Anregungslicht 16 durch den dielektrischen Spiegel 24 am Punkt 26 hindurchtritt und auf den zweiten schnellen Scanner S2 in der zweiten Pupillenebene P2 gelangt. Entsprechend tritt das von dem zweiten Scanner S2 reflektierte Anregungslicht 16 am Punkt 27 durch den dielektrischen Spiegel 24 hindurch und gelangt dann auf den ersten Hohlspiegel H1 und zum ersten Scanner S1, der in 3 nicht dargestellt ist. Ein Bereich, in welchem sich die Durchstoßpunkte des Strahls des Anregungslichts 16 bewegen ist in 3 schematisch dargestellt und mit dem Bezugszeichen 25 gekennzeichnet.
Für Detektionslicht 14, welches von der Probe S abgestrahlt wird und den optischen Strahlengang in umgekehrter Richtung durchläuft, gilt die obige Betrachtung wegen der rotverschobenen Wellenlänge nicht. Aus 4 ist ersichtlich, dass in einem mit dem Bezugszeichen 62 gekennzeichneten Wellenlängenintervall der Reflexionskoeffizient sowohl für s- als auch für p-Polarisation sehr gering ist. Das bedeutet, dass Licht in diesem Wellenlängenbereich 62 unabhängig von seiner Polarisation sehr gut von dem dielektrischen Spiegel 24 transmittiert wird. Der dielektrische Spiegel 24 ist gezielt so gefertigt, dass typische Wellenlängen des Detektionslichts 14 gerade in dem Intervall 62 liegen. Fazit des in 3 gezeigten Ausführungsbeispiels ist also, dass dort zwischen dem ersten Strahlweg, der über den zweiten Scanner S2 verläuft, und dem zweiten Strahlweg, der unter Umgehung des zweiten Scanners S2 über den feststehenden Spiegel 31 verläuft, durch geeignetes Einstellen der Polarisation des Anregungslichts 16 beziehungsweise des Manipulationslichts 10 hin und her geschaltet werden kann.
Eine Drehung der Polarisation ist mit sehr hoher Geschwindigkeit möglich. Elektrooptische Modulatoren erlauben eine Polarisationsdrehung bis in den MHz-Bereich. Umschaltungen zwischen den Pupillen erreicht man also im Bereich von Mikrosekunden. Das emittierte Fluoreszenzlicht, welches von der Probe kommt, weist eine charakteristische Stokes-Verschiebung auf, welche vom betrachteten Fluorophor abhängt. Damit ist diese Strahlung längerwellig, was bei der betrachteten spektralen Reflexionscharakteristik dazu führt, dass das Element in diesem Bereich beide Polarisationskomponenten mit hoher Effizienz transmittiert. Ein technisches Problem hierbei ist, dass das Verhalten dieser Schichten stark winkelabhängig ist. Für eine Winkelvariation von etwa 10° kann man eine solche Schicht allerdings herstellen. Aus dem Grund ist in 3 die Schicht mit der spektralen Reflexionseigenschaft wie in 4 nur als schmaler Streifen 29 ausgeführt. Alternativ können mehrere Streifen mit einer jeweils für einen gewissen Winkelbereich angepassten Charakteristik oder sogar verlaufsfilterartige Elemente hergestellt und integriert werden.
Sehr vorteilhaft wird dieser Schaltmechanismus mit einer aktiven Multipunktbeleuchtung kombiniert, wie sie zum Beispiel in DE 10 2016 102 286.1 beschrieben ist. Hier kann zum Beispiel einer der Mehrfachstrahlen eine um 90° gedrehte Polarisation aufweisen. Dies ist dann der Manipulationsstrahl, der im Allgemeinen auch eine höhere Intensität aufweist. Alle verbleibenden Strahlen werden zur Bildgebung genutzt. Eine Schaltung mittels des Akusto-optischen Filters (AOTF) führt jetzt zu der gewünschten Umschaltung der Beleuchtungsstrahlwege für die Manipulation über die Pupille P4 oder die Detektion über den Scanner S2 in der Pupille P2.
Bezugszeichenliste

x: zweite Koordinatenrichtung
y: erste Koordinatenrichtung
z: Richtung der optischen Achse
DM: Detektionsmodul
HFT: Hauptfarbteiler
H1: erste fokussierende Einrichtung, erster Hohlspiegel
H2: zweite fokussierende Einrichtung, zweiter Hohlspiegel
LM: Lasermodul/Lichtquelle
MO: Mikroskopobjektiv
P: Pupillenebene des Mikroskopobjektivs MO
PC: Steuer- und Auswerteeinheit
P1: erste Pupillenebene
P2: zweite Pupillenebene
P3: dritte Pupillenebene
P4: vierte Pupillenebene
S: Probe
SM: Scanmodul, erfindungsgemäße optische Anordnung
SO: Scanoptik
SP: Probenebene
S1: erster Scanner
S2: zweiter Scanner
S3: dritter Scanner
ZB: Zwischenbildebene
10: Manipulationsstrahlung, Manipulationslicht
12: optische Achse
14: Detektionslicht
16: Anregungsstrahlung, Anregungslicht
20: variables Strahlumlenkmittel
21: verschiebbarer Spiegel
22: Drehspiegel
24: dielektrischer Spiegel
25: Bereich, in dem sich die Durchstoßpunkte des Strahls beim Scannen bewegen
26: Auftreffpunkt, Durchstoßpunkt
27: Auftreffpunkt, Durchstoßpunkt
30: weitere strahlumlenkende und/oder strahlformende Komponente
31: feststehender Spiegel
40: Multipunkt-Modul
50: Polarisationsdreheinrichtung
61: Wellenlänge, bei der Reflexionskoeffizient maximal von Polarisation abhängt
62: Wellenlängenbereich, in dem Reflexionskoeffizient nahezu polarisationsunabhängig ist
71-75: Leitungen von Mikroskopkomponenten zu PC
100: Laser-Scanning-Mikroskop

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

DE 102014017001 A1 [0002, 0003, 0096, 0097]
US 7715078 [0008]
EP 2042905 B1 [0009]
DE 102016102286 [0120]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Dean et al.: Deconvolution-free subcellular imaging with axially swept light sheet microscopy, Biophysic. J., Vol. 108, 2807-2815 (2015) [0050]

Claims

Optische Anordnung zum Scannen von Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung in einem Laser-Scanning-Mikroskop, insbesondere einem Laser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskop, mit einer Scanoptik (SO) zum Bereitstellen einer ersten Pupillenebene (P1), mit einer ersten Strahlumlenkeinrichtung, die durch einen in der ersten Pupillenebene (P1) angeordneten ersten Scanner (S1) gebildet ist, zum Scannen der Anregungsstrahlung (16) und/oder Manipulationsstrahlung (10) in einer ersten Koordinatenrichtung (y), mit einer ersten fokussierenden Einrichtung (H1) zum Erzeugen einer zweiten Pupillenebene (P2), die zu der ersten Pupillenebene (P1) optisch konjugiert ist, mit einer zweiten Strahlumlenkeinrichtung (S2) zum Umlenken der Anregungsstrahlung (16) und/oder Manipulationsstrahlung (10), die in der zweiten Pupillenebene (P2) angeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, dass eine zweite fokussierende Einrichtung (H2) vorhanden ist zum Erzeugen einer dritten Pupillenebene (P3), die zu der ersten Pupillenebene (P1) und der zweiten Pupillenebene (P2) optisch konjugiert ist, dass in der dritten Pupillenebene (P3) eine dritte Strahlumlenkeinrichtung (S3) angeordnet ist zum Umlenken der Anregungsstrahlung (16) und/oder Manipulationsstrahlung (10), und dass zwischen der ersten fokussierenden Einrichtung (H1) und der zweiten Pupillenebene (P2) einerseits und der zweiten Pupillenebene (P2) und der zweiten fokussierenden Einrichtung (H2) andererseits ein variables Strahlumlenkmittel (20) vorhanden ist zum Umschalten eines optischen Strahlengangs zwischen einem ersten Strahlweg und einem zweiten Strahlweg.
Optische Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Strahlweg mindestens von der dritten Strahlumlenkeinrichtung (S3) über die zweite Strahlumlenkeinrichtung (S2) zu dem ersten Scanner (S1) verläuft und wobei der zweite Strahlweg mindestens von der dritten Strahlumlenkeinrichtung (S3) unter Umgehung der zweiten Strahlumlenkeinrichtung (S2) über das variable Strahlumlenkmittel (20) zu dem ersten Scanner (S1) verläuft.
Optische Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Strahlweg mindestens von der dritten Strahlumlenkeinrichtung (S3) über die zweite fokussierende Einrichtung (H2), die zweite Strahlumlenkeinrichtung (S2) und die erste fokussierende Einrichtung (H1) zu dem ersten Scanner (S1) verläuft und wobei der zweite Strahlweg mindestens von der dritten Strahlumlenkeinrichtung (S3) über die zweite fokussierende Einrichtung (H2) unter Umgehung der zweiten Strahlumlenkeinrichtung (S2) über das variable Strahlumlenkmittel (20) und die erste fokussierende Einrichtung (H1) zu dem ersten Scanner (S1) verläuft.
Optische Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die erste fokussierende Einrichtung (H1) und/oder die zweite fokussierende Einrichtung (H2) ein Hohlspiegel, insbesondere ein torischer oder ein sphärischer Hohlspiegel, ist.
Optische Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Strahlumlenkeinrichtung in der zweiten Pupillenebene (P2) ein zweiter Scanner (S2) ist zum Scannen der Anregungsstrahlung (16) und/oder der Manipulationsstrahlung (10) in einer von der ersten Koordinatenrichtung (y) verschiedenen zweiten Koordinatenrichtung (x) und/oder dass die dritte Strahlumlenkeinrichtung in der dritten Pupillenebene (P3) ein dritter Scanner (S3) ist zum Scannen der Anregungsstrahlung (16) und/oder der Manipulationsstrahlung (10) in einer von der ersten Koordinatenrichtung (y) verschiedenen zweiten Koordinatenrichtung (x).
Optische Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Strahlumlenkeinrichtung und/oder die dritte Strahlumlenkeinrichtung ein feststehender Spiegel, ein Spiegel, dessen Oberfläche aktiv gekrümmt werden kann, oder ein anderes wellenfrontveränderndes Element ist.
Optische Anordnung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Scanner (S2) ein Resonanzscanner ist und der dritte Scanner (S3) ein quasistatischer Scanner ist oder dass der dritte Scanner (S3) ein Resonanzscanner ist und der zweite Scanner (S2) ein quasistatischer Scanner ist.
Optische Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Scanner (S1) ein galvanometrischer Scanner ist.
Optische Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das variable Strahlumlenkmittel (20) einen variabel positionierbaren Spiegel (21, 22) aufweist.
Optische Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel vorhanden sind zum Herein- und Herausschieben des Spiegels (21) oder zum Herein- und Herausschwenken des Spiegels in den beziehungsweise aus dem Strahlengang.
Optische Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Spiegel ein Drehspiegel (22) mit einer Dreheinrichtung ist, der in einer ersten Drehposition, in welcher der erste Strahlweg ausgewählt ist, nicht Teil des optischen Strahlengangs ist und der in einer von der ersten Drehposition verschiedenen zweiten Drehposition, in welcher der zweite Strahlweg ausgewählt ist, Teil des optischen Strahlengangs ist.
Optische Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das variable Strahlumlenkmittel (20) einen dielektrischen Spiegel (23) aufweist.
Optische Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das variable Strahlumlenkmittel (20) einen wellenlängenabhängigen und polarisationsabhängigen dichroitischen Spiegel (24) aufweist, wobei dieser dichroitische Spiegel (24) • Anregungsstrahlung (16) und/oder Manipulationsstrahlung (10) mit einer ersten Wellenläge (61) und einem ersten Polarisationszustand (p) transmittiert, • Anregungsstrahlung (16) und/oder Manipulationsstrahlung (10) mit der ersten Wellenläge (61) und einem zweiten Polarisationszustand (s), der von dem ersten Polarisationszustand verschieden ist, reflektiert und • von einer Probe (S) ausgesandtes Fluoreszenzlicht (14) mit einer rotverschobenen Wellenlänge (62) unabhängig von dessen Polarisationszustand transmittiert.
Optische Anordnung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Polarisationszustand bezogen auf den dichroitischen Spiegel s-Polarisation ist und dass der zweite Polarisationszustand bezogen auf den dielektrischen Spiegel p-Polarisation ist.
Optische Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass in dem zweiten Strahlweg eine vierte Pupillenebene (P4) gebildet ist, die zu der ersten Pupillenebene (P1) und der dritten Pupillenebene (P3) optisch konjugiert ist und in der eine weitere strahlumlenkende und/oder strahlformende Komponente (30) angeordnet ist.
Optische Anordnung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere strahlumlenkende und/oder strahlformende Komponente (30) ein, insbesondere feststehender, Spiegel (31) ist.
Optische Anordnung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere strahlumlenkende Komponente (30) ein Spiegel ist, dessen Oberfläche aktiv gekrümmt werden kann, ein segmentierter Spiegel oder eine Einrichtung zum Manipulieren der Wellenfront ist.
Laser-Scanning-Mikroskop, mit mindestens einer Laserlichtquelle (LM) zum Aussenden von Laserstrahlung (10, 16) zum Anregen und/oder Manipulieren einer Probe (P), mit mindestens einem Hauptfarbteiler zum Trennen von Anregungsstrahlung (16) und/oder Manipulationsstrahlung (10) einerseits und wellenlängenverschobenem Detektionslicht (14), welches von einer Probe (S) ausgeht, andererseits und mit mindestens einem Mikroskopobjektiv (MO) zum Leiten von Anregungsstrahlung (16) und/oder Manipulationsstrahlung (10) auf eine Probe (S) und zum Leiten von Detektionslicht (14), welches von der Probe (S) ausgeht, zurück in Richtung des Hauptfarbteilers (HFT), und mit einem Detektionsmodul (DM) zum Nachweisen des Detektionslichts (14), dadurch gekennzeichnet, dass eine optische Anordnung zum Scannen von Anregungsstrahlung (16) und/oder Manipulationsstrahlung nach einem der Ansprüche 1 bis 17 vorhanden ist.
Laser-Scanning-Mikroskop nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass eine Einrichtung zur Multipunktbeleuchtung (40) mit einer Mehrzahl von Beleuchtungskanälen vorhanden ist.
Laser-Scanning-Mikroskop nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung zur Multipunktbeleuchtung (40) zur Steuerung der einzelnen Beleuchtungskanäle einen mehrkanaligen AOTF aufweist.
Laser-Scanning-Mikroskop nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass für mindestens einen der Beleuchtungskanäle eine Einrichtung zur Manipulation der Polarisation, insbesondere ein Lambda-Halbe-Plättchen, vorhanden ist.
Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der Ansprüche 18 bis 21, welches eingerichtet ist zur Kontrastgebung auf Grundlage mindestens eines nichtlinearen Kontrastprinzips, insbesondere Mehrphotonenfluoreszenz, beispielsweise Zwei- oder Drei-Photonen-Fluoreszenz, CARS oder SRS, und welches insbesondere ein Zwei-Photonen-Laser-Scan-Mikroskop ist.
Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der Ansprüche 18 bis 22, welches ein konfokales Mikroskop, insbesondere ein konfokales Laser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskop, ist.