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Die Erfindung betrifft ein Laser-Scanning-Mikroskop, ausgebildet zur Abtastung eines Objektes mit Laserspots in verschiedenen Betriebsmodi zwecks Gewinnung von Objektabbildungen nach unterschiedlichen Kriterien.
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Bei der Anwendung der Laser-Scanning-Mikroskopie spielt die Lebendzellforschung eine immer größere Rolle, so beispielsweise hinsichtlich der Beobachtung metabolischer Prozesse in Zellen oder zur Analyse der Wirkung von Pharmaka. Neben der Detektion reflektierten Lichtes ist dabei die Fluoreszenzmikroskopie von besonderer Bedeutung, da sie eine subzellulare optische Beobachtung ermöglicht und nicht nur zur reinen Bildgebung, sondern auch zur Proben-Manipulation und Analyse verwendet werden kann, wobei Ein- oder auch Mehrphotonen-Prozesse genutzt werden. So können Proben z. B. mit einer Scangeschwindigkeit in definierter Weise manipuliert und mit einer zweiten, z. B. höheren Scangeschwindigkeit beobachtet werden.
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Für diese Zwecke der wissenschaftlichen Anwendung sind die Anforderungen an die Mikroskopsysteme zunehmend hoch. Zum einen muss die Datengewinnung sehr schnell erfolgen, um den zeitlichen Ablauf biologischer Prozesse verfolgen zu können, zum anderen sind Lichtverluste in den Strahlengängen möglichst zu vermeiden. Das kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass die Strahlengänge zwischen Lichtquelle und Detektor möglichst wenig optische Komponenten aufweisen und hinsichtlich Transmission und Auflösung, bezogen auf die unterschiedlichsten Anwendungen, maximiert sind.
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In dieses Sachgebiet ist die vorliegende Erfindung einzuordnen.
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Davon ausgehend besteht die Aufgabe der Erfindung darin, ein Laser-Scanning-Mikroskop anzugeben, das über verschiedene vorwählbare Betriebsmodalitäten verfügt, die es ermöglichen, das Mikroskop in einfacher Weise durch eine insbesondere schnelle Umschaltung bezüglich der jeweiligen experimentellen Erfordernisse optimal zu konfigurieren, so beispielsweise durch Entkopplung von Ablenkwinkel und Ablenkgeschwindigkeit der einzelnen Scanner-Achsen und sich daraus ergebenden Möglichkeit der gesonderten Steuerung.
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Diese Aufgabe wird mit einem Laser-Scanning-Mikroskop der eingangs genannten Art gelöst, welches umfasst:
- – eine Beleuchtungs- und Detektionseinheit (BDE), einen Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang, ein Mikroskopobjektiv, eine Scaneinrichtung mit einer Scanoptik und mehreren Scannern, wobei
- – im Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang Schaltspiegel mit jeweils zwei Schaltstellungen vorgesehen sind,
- – jede Schaltstellung einem von mehreren verschiedenen, optisch voneinander getrennten Strahlführungspfaden zugeordnet ist und jeder Strahlführungspfad einen gesonderten Betriebsmodus definiert, und
- – mindestens in einem der vorgesehenen Strahlführungspfade ein Hohlspiegel zur Abbildung eines ersten Scanners in mindestens einen weiteren Scanner und umgekehrt vorhanden ist.
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Davon ausgehend ist in einer ersten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung das Scanobjektiv zur Abbildung auf ein endliches, gewölbtes Zwischenbild ausgeführt, wobei
- – in einem ersten Strahlführungspfad eine sammelnde refraktive Linsenoptik zur Abbildung des ersten Scanners über den zweiten Schaltspiegel in eine zwischen dem zweiten Schaltspiegel und der Beleuchtungs- und Detektionseinheit liegende Pupillenebene bzw. umgekehrt vorgesehen ist, und
- – in dem zweiten Strahlführungspfad der Hohlspiegel zur Abbildung des ersten Scanners in den zweiten Scanner und nachfolgend eine Relayoptik zur Abbildung des zweiten Scanners über den zweiten Schaltspiegel in die zwischen dem zweiten Schaltspiegel und der Beleuchtungs- und Detektionseinheit liegende Pupillenebene bzw. umgekehrt vorgesehen ist.
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Der erste Scanner ist zugleich als Schaltspiegel mit zwei Schaltstellungen ausgeführt. Diese beiden Schaltstellungen beeinflussen ausdrücklich die Richtung des Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengangs, nicht jedoch die scannende Ablenkung innerhalb des Strahlengangs, die getrennt gesteuert wird.
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In dem ersten Pfad bildet die refraktive Linsenoptik den ersten Scanner über den zweiten Schaltspiegel unmittelbar in die Pupillenebene und umgekehrt ab, wohingegen in dem zweiten Pfad der Hohlspiegel den ersten Scanner in den zweiten Scanner und die Relayoptik den zweiten Scanner über den zweiten Schaltspiegel in die Pupillenebene abbildet und umgekehrt.
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Diese Abbildung der Pupillenebenen in sämtlichen Betriebsmodi sichert auch für die multikonfokale Bildgebung eine gleichartige Wirkung von Pupillen-Manipulationen auf die einzelnen Spots. Da für Single-Spot-Anwendungen eine weniger genaue axiale Pupillenlage ausreicht, kann die refraktive Linsenoptik im ersten Betriebsmodus auch verschoben sein, und die Relayoptik im zweiten Betriebsmodus weggelassen sein.
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Während also im ersten Betriebsmodus die strahlensammelnde Wirkung mit der refraktiven Linsenoptik erzeugt wird, erfolgt dies im zweiten Betriebsmodus mit dem Hohlspiegel, wobei zwischen dem ersten Scanner und dem Hohlspiegel und zwischen dem ersten Scanner und der Sammeloptik eine Zwischenbildebene liegt.
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Der erste Scanner befindet sich an einer von der Position des Mikroskopobjektivs definierten Pupillenebene. Zwischen dem Hohlspiegel und dem zweiten Schaltspiegel können weitere Schaltspiegel vorhanden sein, um zusätzlich zu dem zweiten Scanner einen dritten Scanner mit gesonderter Drehachse in den Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang einzubeziehen, vorzugsweise zur Y-Ablenkung ähnlich dem zweiten Scanner.
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Optional kann die zwischen dem Mikroskopobjektiv und dem ersten Scanner positionierte Scanoptik axial verschiebbar oder in ihrer Brennweite variabel sein, um z. B. bei Verwendung unterschiedlicher Mikroskopobjektive die Pupillenebene auf dem ersten Scanner zu fixieren.
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In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung dagegen ist das Scanobjektiv zur Abbildung nach Unendlich ausgeführt, wobei
- – in einem ersten Strahlführungspfad der Beleuchtungsstrahlengang von der Beleuchtungs- und Detektionseinheit über den zweiten Schaltspiegel auf den ersten Scanner und nachfolgend in das Scanobjektiv gerichtet ist und umgekehrt der Detektionsstrahlengang vom Scanobjektiv zum ersten Scanner und dann über den Schaltspiegel in die Beleuchtungs- und Detektionseinheit, und
- – in dem zweiten Strahlführungspfad der Beleuchtungsstrahlengang von der Beleuchtungs- und Detektionseinheit über den Schaltspiegel, den zweiten Scanner und den Hohlspiegel auf den ersten Scanner gerichtet ist und umgekehrt der Detektionsstrahlengang vom ersten Scanner über den Hohlspiegel auf einen zweiten Scanner und nachfolgend über einen Kollimator und den Schaltspiegel in die Beleuchtungs- und Detektionseinheit.
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Hierbei ist zwischen dem Hohlspiegel und dem zweiten Scanner eine Zwischenbildebene ausgebildet. Optional kann in den Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang zwischen dem ersten Scanner und dem zweiten Schaltspiegel ein weiterer Scanner, vorzugsweise zur Y-Ablenkung, eingeordnet sein.
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Damit weist auch diese zweite Ausführungsform zwei unterschiedliche Pfade für die Strahlführung auf und kann demzufolge in zwei verschiedenen Betriebsmodi betrieben werden.
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Die Möglichkeit der Umschaltung des Schaltspiegels und des ersten Scanners dient in beiden Ausführungsformen zur Richtungsänderung der Beleuchtungs- und Detektionsstrahlung in Abhängigkeit von dem jeweils zu nutzenden Strahlführungspfad. Der Schaltspiegel und der Scanspiegel des ersten Scanners sind dabei um eine definierte Achse gegen die einfallende Strahlung verkippbar angeordnet. Im Rahmen der Erfindung liegt es auch, der Scanbewegung des ersten Scanners anstelle der Verkippung ein mit den Schaltstellungen des Schaltspiegels kommunizierendes Offset aufzuerlegen.
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In einer dritten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskops ist der Hohlspiegel zur Abbildung des ersten Scanners in einen zweiten Scanner oder in einen dritten Scanner und nachfolgend eine Relayoptik zur Abbildung der Scanner in eine Pupillenebene bzw. umgekehrt vorgesehen. Dabei sind zwischen dem Hohlspiegel und diesen beiden Scannern Schaltspiegel zur Umlenkung des Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengangs in zwei verschiedene Strahlführungspfade vorgesehen, wobei in einem dieser Strahlführungspfade der zweite Scanner und in dem anderen der dritte Scanner positioniert. ist Mit den Schaltspiegeln sind geringe Umschaltzeit bei der Änderung der Strahlführung und damit im Hinblick auf eine wechselnde Nutzung dieser beiden Scanner erzielbar, was insbesondere bei Anwendung des sogenannten FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) von Vorteil ist, wobei mit einem Scannerpaar in der Probe optisch manipuliert wird und dann innerhalb von wenigen Millisekunden, z. B. mittels Resonanzscanner, auf die Beobachtung umgeschaltet werden muss.
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Im Rahmen der Erfindung liegt es, in Abhängigkeit von der jeweils gewählten Ausführungsform den erste Scanner als MEMS-Scanspiegel zur zweidimensionalen X, Y-Ablenkung und die weiteren Scanner zur eindimensionalen, z. B. besonders schnellen, resonanten Y-Ablenkung des Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengangs auszuführen. Grundsätzlich können erster und zweiter Scanner zur Ablenkung in orthogonalen Raumrichtungen X oder Y vorgesehen sein. Alternativ kann der erste Scanner auch als eindimensionaler, z. B. Galvo-Scanner für die x-Richtung ausgebildet und durch einen nachgeschalteten, dicht benachbarten y-Galvo-Scanner ergänzt sein, so dass in Kombination beider Scanner wiederum eine zweidimensionale x, y-Ablenkung am Scanobjektiv erfolgt.
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Das erfindungsgemäße Laser-Scanning-Mikroskop ist mit einer Ansteuerschaltung ausgestattet, die verbunden ist
- – mit den Schaltspiegeln zwecks Änderung der Ein- und Ausfallswinkel der Beleuchtungs- und Detektionsstrahlung,
- – mit den Scannern zwecks Vorgabe einer Laserspotfolge bei der Objektabtastung,
- – mit einer Befehlseingabeeinrichtung zur Vorwahl eines der Betriebsmodi, und
- – optional mit der Scanoptik zur Justage der Pupillenlage auf den ersten Scanner.
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Weiterhin kann in den Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang eine optische Baugruppe mit einem adaptiven optischen Element eingekoppelt sein, die zur Beeinflussung der Z-Position der Laserspots, zur Korrektur von system- oder objektbedingten Bildfehlern und/oder zur Nutzung spezieller Bildgebungsmodalitäten ausgestaltet und zu diesem Zweck ebenfalls mit der Ansteuerschaltung verbunden ist.
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Das erfindungsgemäße Laser-Scanning-Mikroskop ist vorzugsweise ausgebildet zur Fluoreszenzmikroskopie mit dem Beleuchtungslicht als Anregungsstrahlung und der davon verursachten Fluoreszenz als Detektionsstrahlung.
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Ein Laser-Scanning-Mikroskop, das sich durch die erfindungsgemäßen Merkmale auszeichnet, ermöglicht durch Umschaltung auf die einzelnen Betriebsmodi die optimale Nutzung im Hinblick auf unterschiedliche Anforderungen bei der Objektabbildung, insbesondere durch Entkopplung von Ablenkwinkel und Ablenkgeschwindigkeit der einzelnen Scanner-Achsen.
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Nachfolgend wird die Erfindung beispielhaft anhand von Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
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1 die Strahlführungspfade für den Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengangs in einer ersten Ausführungsform der Erfindung, ausgestattet mit einer ins Endliche auf eine Zwischenbildebene abbildenden Scanoptik,
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2 die Ausführungsform nach 1, wobei jedoch ein adaptives optisches Element in den Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengangs eingeordnet ist,
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3 die Strahlführungspfade des Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengangs in einer zweiten Ausführungsform der Erfindung, ausgestattet mit einer ins Unendliche abbildenden Scanoptik,
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4 die Ausführungsform nach 3, jedoch mit einem zusätzlichen Scanner.
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Aus 1 geht der grundsätzliche Aufbau des erfindungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskops hervor, beispielsweise ausgebildet zur Fluoreszenzmikroskopie.
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Das in einer Beleuchtungs- und Detektionseinheit BDE erzeugte Anregungslicht ist auf einen Schaltspiegel SP1 gerichtet, der in zwei Schaltstellungen gegen die einfallende Strahlung kippbar angeordnet ist. Hierbei kann die Beleuchtungseinheit einen einzelnen Strahl zur konfokalen Abtastung der Probe mit einem einzelnen Spot erzeugen und detektieren, oder mehrere Strahlen für eine multikonfokale Abtastung der Probe liefern und detektieren. Diesbezüglich sind in 1 beispielhaft mehrere Strahlenbündel dargestellt, die in den Zwischenbildern ZB1, ZB2 und in der Probe drei Spots zur multikonfokalen Abtastung erzeugen und die Pupille P in unterschiedlichen Winkeln treffen.
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In einer ersten Kippstellung, die einem ersten Betriebsmodus zugeordnet ist, ist das vom Schaltspiegel SP1 reflektierte Anregungslicht über einen ersten Beleuchtungs- und Detektionspfad auf einen Scanner S1 gerichtet. Dabei wird die Pupille P über den Schaltspiegel SP1 mittels einer sammelnden refraktiven Linsenoptik T1 auf den Scanner S1 abgebildet. Vom Scanner S1 ist das Anregungslicht über eine Scanoptik SO, die von einem um S1 konzentrischen Zwischenbild ZB2 in ein Zwischenbild ZB1 abbildet, eine Tubusoptik T2 und ein Mikroskopobjektiv MO in ein zu untersuchendes Objekt bzw. eine Objektebene OE gerichtet.
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In der zweiten Kippstellung, die einem zweiten Betriebsmodus zugeordnet ist, wird das vom Schaltspiegel SP1 reflektierte Anregungslicht über einen alternativen Beleuchtungs- und Detektionspfad mittels einer Relayoptik L/T3, einem Scanner S2 und einem Hohlspiegel HSP auf den Scanner S1 abgebildet. Dabei ist zwischen dem Hohlspiegel HSP und dem Scanner S1 eine Zwischenbildebene ZB2 ausgebildet.
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Der Scanspiegel des Scanners S1 schwenkt um eine senkrecht zur Zeichenebene der 1 ausgerichtete Achse, der des Scanners S2 dagegen um eine in der Zeichenebene liegende Achse. Dabei entspricht die geometrische Form und Abmessung des Hohlspiegel HSP in der Zeichenebene dem Winkelbereich, der im Multi- oder Singlespot-Verfahren jeweils von der Beleuchtungs- und Detektionseinheit BDE benötigt wird. Senkrecht zur Zeichenebene entspricht die geometrische Form und Abmessung des Hohlspiegel HSP dem Ablenkbereich des Scanners S2.
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Der Scanner S1 kann als MEMS-Scanspiegel ausgeführt und zur eindimensionalen Ablenkung in der X- oder Y-Koordinate oder zur zweidimensionalen X, Y-Ablenkung vorgesehen sein, während der Scanner S2 als schneller eindimensionaler Scanspiegel zur eindimensionalen Ablenkung in der Y-Koordinate ausgelegt ist, der den Laserspot entlang der Y-Achse über die längere Seite des Hohlspiegels HSP bewegt. Die Kippachse des Scanners S2 liegt senkrecht oder näherungsweise senkrecht zur Umschaltachse des Schaltspiegels SP1.
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Im Rahmen der Erfindung liegt es auch, wenn die Scanner S1 und S2 jeweils als eindimensionale Resonanz- oder Galvano-Scanner ausgebildet sind und mittels Hohlspiegel aufeinander abgebildet werden, wobei beide in konjugierten Pupillenebenen stehen. Optional kann zur Ergänzung des Scanners S1 ein weiterer Galvo-Scanner vorgesehen sein, der zwischen S1 und der refraktiven Linsenoptik T1 liegt.
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Im Unterschied zum ersten Betriebsmodus übernimmt im zweiten Betriebsmodus der Hohlspiegel HSP die strahlensammelnde Wirkung anstelle der sammelnden refraktiven Linsenoptik T1, die diese Funktion im ersten Betriebsmodus erfüllt.
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Vom Scanner S1 gelangt das Anregungslicht wiederum wie oben beschrieben über die Scanoptik SO, die Tubusoptik T2 und das Mikroskopobjektiv MO in das Objekt bzw. in die Objektebene OE.
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Der Scanner S1 ist in einer zur Pupille des Mikroskopobjektivs MO konjugierten Pupillenebene positioniert. Die Schaltstellungen von Scanner S1 und Schaltspiegel SP1 kommunizieren so miteinander, dass das Anregungslicht entweder im ersten Betriebsmodus über den ersten Beleuchtungs- und Detektionspfad oder im zweiten Betriebsmodus über den zweiten Beleuchtungs- und Detektionspfad in die Scanoptik SO gelangt.
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Diese Konformität wird entweder erreicht, indem der Scanspiegel des Scanners S1 ebenfalls wie der Schaltspiegel SP1 in zwei Schaltstellungen kippbar ist, oder indem der Scanbewegung des Scanners S1 ein Offset auferlegt wird.
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Die in 1 mit unterbrochenen Linien dargestellten beiden Schaltspiegel SP2, SP3 sind optional in einer bereits erwähnten Ausführungsform der Erfindung zur Strahlablenkung – hier beispielsweise aus der Zeichenebene heraus – vorgesehen, um die Strahlung über unterschiedliche Pfade entweder über den Scanner 2 oder den Scanner 3 zu lenken. Dabei wird sowohl der ortsfeste, zum Scanner S2 laufende Strahl als auch der vom Scanner S2 reflektierte, bewegte Strahl vom jeweils zugeordneten Schaltspiegel SP2, SP3 umgelenkt.
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Auf diese Weise sind Pupillenabbildung und Schaltvorgänge gleichzeitig bei minimalem technischem Aufwand möglich, da mit den Schaltspiegeln SP2, SP3 geringe Umschaltzeit im Hinblick auf eine wechselnde Nutzung der beiden Scanner S2 und S3 erzielbar sind, was insbesondere bei Anwendung des FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) von Vorteil ist.
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Der Schaltspiegel SP1 und der Scanner S1 sind mit einer Ansteuerschaltung verbunden (zeichnerisch nicht dargestellt), welche die Kippstellungen in Abhängigkeit vom jeweils gewählten Betriebsmodus vorgibt. Die Ansteuerschaltung ihrerseits ist mit einer Befehlseingabeeinrichtung zur manuellen Vorwahl des gewünschten Betriebsmodus gekoppelt.
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Im Rahmen der Erfindung liegt es jedoch auch, wenn die Vorwahl selbsttätig erfolgt, beispielsweise in Abhängigkeit von bestimmten Ergebnissen der Auswertung der Objektabbildung.
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Die vom Objekt ausgehende Detektionsstrahlung gelangt entgegengesetzt zum Anregungslicht je nach Betriebsmodus entweder über den ersten oder den zweiten Beleuchtungs- und Detektionspfad und die übrigen Strahlengänge in die Beleuchtungs- und Detektionseinheit BDE und dient in üblicher Weise zur Bildgewinnung mit nachgeordneter visueller oder elektronischer Bildauswertung.
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Vorzugsweise ist im ersten Betriebsmodus der erfindungsgemäßen Anordnung, bei dem die Objektabtastung und Bildgewinnung über den ersten Beleuchtungs- und Detektionspfad erfolgt, eine zweidimensionale Strahlablenkung durch den Scanner S1 vorgesehen. Damit gelangt die bei Abtastung des Objektes in den Koordinaten X, Y senkrecht zur optischen Achse des Mikroskopobjektivs MO generierte Detektionsstrahlung vom Scanner S1 über die Linsenoptik T1 und den Schaltspiegel SP1 in die Pupille P und in die Beleuchtungs- und Detektionseinheit BDE.
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Im zweiten Betriebsmodus, bei dem die Objektabtastung und Bildgewinnung über den alternativen Beleuchtungs- und Detektionspfad erfolgt, ist vorzugsweise eine eindimensionale Strahlablenkung durch den Scanner S1 vorgesehen, so dass hierdurch beispielsweise die Abtastung des Objektes in der Koordinate X (in 1 in der Zeichenebene liegend) erfolgt, und ebenfalls der Scanner S2 zur eindimensionalen Abtastung dient, jedoch in der Koordinatenrichtung Y (senkrecht zur Zeichenebene der 1). Vorteilhaft kann so einer der beiden Scanner S1, S2, vorzugsweise der Scanner S2, schneller als der andere ablenken.
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Wird die erfindungsgemäße Anordnung im ersten Betriebsmodus genutzt, erzeugt die Linsenoptik T1 ein virtuelles Zwischenbild ZB2 des Beleuchtungslichtes, so dass der Scanner S1 mit einem divergenten Bündel beleuchtet wird.
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Bei der Nutzung des zweiten Betriebsmodus dagegen wird Scanner S2 über die Relayoptik L/T3 kollimiert beleuchtet, so dass nun der Hohlspiegel HSP das virtuelle Zwischenbild ZB2 vor dem Scanner S1 erzeugt, dessen Krümmungsradius dem Abstand zum Scanner S1 entspricht.
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Somit verfügt das erfindungsgemäße Laser-Scanning-Mikroskop über eine Scaneinrichtung, die technisch wenig aufwendig ist, bei der die Pupillenabbildung in einfacher Weise mit einem vorzugsweise torischen Hohlspiegel HSP erzeugt wird. Die Anpassung der Pupillenlage kann bei einem Objektivwechsel erforderlichenfalls durch Axialverschiebung der Scanoptik SO korrigiert werden. Diesbezüglich kann zwar auch eine afokale Relayoptik genutzt werden, wobei dies aber die gleichzeitige Axialbewegung der vor- und nachgeordneten optischen Baugruppen erfordert.
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Im Rahmen der Erfindung liegt es ausdrücklich auch, anstelle des torischen Hohlspiegels HSP einen sphärischen Spiegel in Kombination mit einer Zylinderlinse im ungescannten Strahl zu verwenden.
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2 zeigt die Ausführungsform nach 1, wobei sich jedoch im Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang BS, DS eine optische Baugruppe mit einem reflektiven adaptiven optischen Element AO befindet.
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Das adaptive optische Element AO dient zur Z-Positionierung der Laserspots zusätzlich zu der X, Y-Scanbewegung und ist zu diesem Zweck ebenfalls mit der bereits erwähnten Ansteuerschaltung verbunden. Außerdem kann das adaptive optische Element AO zur Kompensation von Aberrationen genutzt werden, die durch das optische System und/oder das Objekt selbst verursacht sind. Es ist bekannt, dass die Punktbildfunktion des Laserspots von der lateralen Position im Objektvolumen bzw. im Bildfeld abhängig ist und dadurch mit zunehmendem Abstand des Laserspots von der optischen Achse des Objektivs Aberrationen auftreten.
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Die genannte optische Baugruppe ist an der Position der Pupillenebene P in den Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang BS, DS eingekoppelt. Sie weist zwei Strahlumlenkelemente U1, U2 auf, die im Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang BS, DS symmetrisch zur Pupillenebene P angeordnet sind.
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Dabei wird der Beleuchtungsstrahlengang BS mittels eines ersten Strahlumlenkelementes U1 über eine erste und eine zweite Linsenoptik L1, L2 auf das adaptive optische Element AO und von dort über die zweite und eine dritte Linsenoptik L2, L3 auf das zweite Strahlumlenkelement U2 und von dort auf den Schaltspiegel SP1 gerichtet.
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In entgegengesetzter Richtung ist der Detektionsstrahlengang DS, vom Schaltspiegel SP1 kommend, mittels des zweiten Strahlumlenkelementes U2 über die dritte und zweite Linsenoptik L2, L3 auf das adaptive optische Element AO und von dort über die zweite und erste Linsenoptik L1, L2 auf das erste Strahlumlenkelement U1 gerichtet und gelangt erst dann in die Beleuchtungs- und Detektionseinheit BDE.
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Zwischen der zweiten Linsenoptik L2 einerseits und der ersten und dritten Linsenoptik L1, L3 andererseits ist eine Zwischenbildebene ZB3 ausgebildet, und zwischen dem ersten Strahlumlenkelement U1 und der ersten Linsenoptik L1 und zwischen dem zweiten Strahlumlenkelement U2 und der dritten Linsenoptik L3 sind weitere Pupillenebenen P1, P2 ausgebildet, wobei die Pupillenebenen P, P1, P2 zueinander konjugiert sind.
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Die dargestellte optische Baugruppe oder zumindest das Prisma mit den Strahlumlenkelementen U1, U2 ist mit einer nicht dargestellten Schwenkeinrichtung verbunden, mit der bedarfsweise das Einschwenken in die hier gezeigte Position relativ zu der Pupilleneben P bzw. das Ausschwenken aus dieser Position vorgenommen werden kann. Aufgrund dieser Option ist das Laser-Scanning-Mikroskop wahlweise mit der anhand 1 oder 2 beschriebenen Konfiguration nutzbar.
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In 3 sind die Strahlführungspfade des Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengangs in einer zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskops dargestellt, bei der – abweichend von den Beispielen nach 1 und 2 – die Scanoptik SO ins Unendliche abbildet. Im Unterschied zu 1 und 2 ist hier nur ein Strahl zur konfokalen Abtastung der Probe mit einem Einzel-Spot dargestellt.
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Über einen ersten Strahlführungspfad, der einem ersten Betriebsmodus dieser Ausführungsform zugeordnet ist, gelangt das Anregungslicht von der Beleuchtungs- und Detektionseinheit BDE kommend über den Schaltspiegel SP1 direkt auf den Scanner S1, nachfolgend in das Scanobjektiv SO und von dort, wie bereits weiter oben beschrieben, mittels des Mikroskopobjektivs MO und in die abzubildende Objektebene OE.
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Das vom Mikroskopobjektiv MO erfasste und durch das Scanobjektiv SO parallelisierte Detektionslicht trifft auf den ersten Scanner S1 und ist von diesem über den Schaltspiegel SP1 in die Beleuchtungs- und Detektionseinheit BDE gerichtet.
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Über einen zweiten Strahlführungspfad, der einem zweiten Betriebsmodus zugeordnet ist, wird das Anregungslicht von der Beleuchtungs- und Detektionseinheit BDE kommend über den Schaltspiegel SP1, den Scanner S2 und den Scanner S1 in das Scanobjektiv SO gelenkt und gelangt von dort in das Mikroskopobjektiv MO und die abzubildende Objektebene OE.
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Das durch das Scanobjektiv SO parallelisierte Detektionslicht wird vom ersten Scanner S1 auf den Hohlspiegel HSP gerichtet, der das nun in X-Richtung descannte Licht in sein vom Scanobjektiv SO weggekrümmtes Zwischenbild ZB4 fokussiert. Im Krümmungsmittelpunkt des Zwischenbildes ZB4 ist der zweite Scanner S2 angeordnet, der divergent mit dem Detektionslicht beleuchtet wird. Dem Scanner S2 ist ein Kollimator K nachgeordnet, von dem das nun parallelisierte Detektionslicht über den Schaltspiegel SP1 zur Beleuchtungs- und Detektionseinheit BDE gelangt.
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Auf diese Weise können je nach Wunsch Scanner S1, S2 mit oder ohne abbildende Elemente in den Verlauf des Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengangs BS, DS permanent vorgesehen oder vom Nutzer zuschaltbar sein.
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Wie in 1 kann auch hier der Scanner S1 als MEMS-Scanspiegel ausgeführt sein und wahlweise zur eindimensionalen Ablenkung in der X- oder Y-Koordinate oder zur zweidimensionalen X, Y-Ablenkung dienen, während der Scanner S2 als schneller eindimensionaler Scanspiegel zur eindimensionalen Ablenkung in der Y-Koordinate ausgelegt ist.
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4 zeigt die Ausführungsform nach 3, wobei hier jedoch ein zusätzlicher Scanner S4 vorgesehen ist, der die y-Ablenkung in der ersten Schaltstellung übernimmt, so dass die Scanner S1 und S4 als eindimensionale Galvo-Scanner ausgebildet sein können, und gemeinsam eine x-y-Ablenkung des Strahles bewirken. In der zweiten Schaltstellung, die den Hohlspiegel HSP enthält, liegt der Scanner S4 dann nicht im Strahlengang, stattdessen wird die y-Ablenkung durch den Scanner S2 übernommen, der insbesondere als schneller resonanter Scanner ausgebildet sein kann.
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Hierbei können die Scanner S4 und S2 auch in ihrer Grundstellung aus der Zeichenebene ablenken, so dass eine dreidimensionale Anordnung entsteht, deren Projektion in 4 dargestellt ist.
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Ähnlich, wie in den 1 und 2 dargestellt, kann auch hier eine multikonfokale Nutzung vorgesehen und es können weitere refraktive Optiken zur Pupillenabbildung vorhanden sein.
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Bezugszeichenliste
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- AO
- adaptives optisches Element
- BS
- Beleuchtungsstrahlengang
- BDE
- Beleuchtungs- und Detektionseinheit
- DS
- Detektionsstrahlengang
- SP1, SP2, SP3
- Schaltspiegel
- HSP
- Hohlspiegel
- K
- Kollimator
- L/T3
- Relayoptik
- L1, L2, L3
- Linsenoptik
- MO
- Mikroskopobjektiv
- OE
- Objektebene
- P, P1, P2
- Pupillenebene
- S1, S2, S3, S4
- Scanner
- SO
- Scanoptik
- T1, T2
- Linsenoptik
- ZB1, ZS2, ZB3, ZB4
- Zwischenbildebene
