WO2019038404A1 - Optische anordnung zum scannen von anregungsstrahlung und/oder manipulationsstrahlung in einem laser-scanning-mikroskop und laser-scanning-mikroskop - Google Patents

Optische anordnung zum scannen von anregungsstrahlung und/oder manipulationsstrahlung in einem laser-scanning-mikroskop und laser-scanning-mikroskop Download PDF

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scanner
pupil plane
radiation
beam deflection
manipulation
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Tiemo Anhut
Matthias Wald
Daniel Schwedt
Tobias Kaufhold
Beate BÖHME
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Carl Zeiss Microscopy Gmbh
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Definitions

  • the present invention relates in a first aspect to an optical arrangement for scanning excitation radiation and / or manipulation radiation in a laser scanning microscope according to the preamble of claim 1.
  • the invention relates to a laser scanning microscope according to the preamble of claim 22.
  • a generic optical arrangement for scanning excitation radiation and / or manipulation radiation in a laser scanning microscope is described, for example, in DE 10 2014 017 001 A1 and has the following components: a scanning optics as the first focusing device for providing a first pupil plane, a first beam deflecting device , which is formed by a first scanner arranged in the first pupil plane, for scanning the excitation radiation and / or manipulation radiation in a first coordinate direction, a second focusing device for generating a second pupil plane, which is optically conjugate to the first pupil plane, and a second beam deflection device for deflecting the excitation radiation and / or manipulation radiation, which is arranged in the second pupil plane.
  • a scanning optics as the first focusing device for providing a first pupil plane
  • a first beam deflecting device which is formed by a first scanner arranged in the first pupil plane, for scanning the excitation radiation and / or manipulation radiation in a first coordinate direction
  • a second focusing device for generating a second pupil plane, which is optically conjug
  • a generic laser scanning microscope also emerges from DE 10 2014 017 001 A1 and has the following components: at least one laser light source for emitting laser radiation for exciting and / or manipulating a sample, at least one main color divider for separating excitation radiation and / or manipulation radiation on the one hand, and wavelength-shifted detection light emanating from a sample, on the other hand, at least one microscope objective for directing excitation radiation and / or manipulation radiation onto a sample and for guiding detection light emanating from the sample, back towards the main color splitter, and with a detection module for detecting the detection light,
  • a general technical problem is to produce with the least possible effort, in the most compact possible space and with the lowest possible transmission losses, multiple optical pupils, which are each imaged each other.
  • the number of usable pupils should be greater than or equal to three. Between at least two of the provided pupils should be able to be switched.
  • EP 2 042 905 B1 shows a combination of two scanner pairs. Here, one pair of scanners or the other pair of scanners can be selected. However, individual axes can not be added very quickly because the masses to be moved are comparatively large.
  • DE 100 50 529 B4 shows the combination of a plurality of beam deflection units each consisting of two beam deflection modules.
  • imaging optics between the beam deflection devices are also described.
  • no means for influencing the wavefront are described.
  • a laser scanning microscope with additional pupil planes is to be created in which it is possible to switch back and forth as quickly as possible between the different pupil planes.
  • a third focusing means for generating a third pupil plane is present, which is optically conjugate to the first pupil plane that in the third pupil plane
  • a third Strahlumlenk arise for deflecting the excitation radiation and / or manipulation radiation is arranged that between the second focusing means and the second pupil plane on the one hand and the second pupil plane and the third focusing means on the other hand
  • a first Strahlumlenkstoff is present for deflecting the third focusing means coming excitation radiation and / or manipulation radiation, bypassing the second Strahlumlenk Vietnamese towards the second focusing means
  • a fourth focusing means for generating a fourth pupil plane is present, which is optically conjugate to the third pupil plane, and that in the fourth pupil plane a vari Ables second Strahlumlenkstoff is arranged for switching an optical beam path between a first beam path and a second beam path.
  • the laser scanning microscope of the type specified above is further developed according to the invention in that an optical arrangement according to the invention for scanning excitation radiation and / or manipulation radiation is present.
  • the first beam path can extend at least from the variable second beam deflection means via the third beam deflection device and the second beam deflection device to the first scanner.
  • the second beam path can particularly preferably run at least from the variable second beam deflection means via the third beam deflection device, bypassing the second beam deflection device, via the first beam deflection means to the first scanner.
  • an optical arrangement is an arrangement which has, in particular, beam-shaping components, such as lenses and concave mirrors, and beam-deflecting components, such as mirrors, which can in particular be movable.
  • scanning refers to the controlled guiding of a beam of the excitation radiation or of the manipulation radiation via a sample. This Scanning can take place in a regular pattern, for example line by line, but in particular along a trajectory to be specified.
  • excitation radiation is understood to be electromagnetic radiation, in particular visible light, but also infrared and ultraviolet radiation, which is generally used for imaging.
  • this excitation radiation is provided by lasers. Different contrast methods can be used.
  • radiation for exciting a fluorescence from dyes, with which a sample to be examined is prepared is measured using a laser scanning fluorescence microscope. In principle, however, it may also be illumination light for light microscopy.
  • manipulation radiation is electromagnetic radiation, in particular in the visible range, but also in the infrared and ultraviolet range, referred to, with a targeted change of a sample to be examined, in particular in a selectively selected space area or a selectively selected and presettable trajectory, can be accomplished.
  • excitation radiation and excitation light on the one hand and manipulation radiation and manipulation light on the other hand are used synonymously in this description.
  • detection light is understood to mean light which is emitted by the sample on the basis of the excitation and which is to be detected by means of the entire optical arrangement. Detection light may in particular be fluorescent light.
  • the pupil plane is understood to mean an optical plane which, in an operating state of the optical arrangement, is optically conjugated in a laser scanning microscope to a rear objective pupil of the respective microscope objective in use.
  • the first, the second, the third and the fourth pupil plane are optically conjugate to the posterior pupil of the microscope objective.
  • the Pupillary planes usually only for a lens exactly optically conjugate to the rear lens pupil.
  • the pupil planes are approximately optically conjugate to the posterior objective pupil.
  • the order of the pupil planes in the beam path is therefore basically arbitrary.
  • Advantageous variants of the optical arrangement according to the invention are characterized in that, based on the excitation radiation and the manipulation radiation, the second pupil plane is located upstream of the first pupil plane, the third pupil plane upstream of the second pupil plane, and the fourth pupil plane lies upstream of the third pupil plane.
  • any number of pupils can be generated with the arrangement according to the invention.
  • important applications already benefit from four consecutive pupils with manageable adjustment effort and low optical losses.
  • the scanning optics ie the first focusing device, usually consists of an arrangement of lenses, by means of which a first pupil plane equivalent to the rear objective pupil is generated.
  • the first coordinate direction may be the y-direction and the second coordinate direction may be the x-direction.
  • a coordinate system is chosen so that the optical axis of a system coincides with the z-axis.
  • arbitrary focusing components in particular also lenses or lens groups, can be used as the first, second, third and fourth focusing device for generating a pupil plane.
  • Concave mirrors in particular, are preferred as the second and / or third focusing device, in particular toric or spherical concave mirrors used.
  • the fourth focusing device may advantageously be a lens or a lens group.
  • the optical path via the first concave mirror is designed in such a way that an enlargement (
  • This is particularly advantageous when different scanners are to be combined.
  • resonant MEMS scanners can only reach certain diameters given resonant frequency and dynamic mirror deformation.
  • there is an optimal size for quasi-static galvanometer scanners that does not coincide with the size of the resonant MEMS scanner.
  • an adaptation of the pupil diameter over a magnification level can be very useful. Within certain limits, deviations from a 1: 1 image can be allowed here, with the option that scanners of different sizes can stand in the respective positions.
  • the second beam deflecting device in the second pupil plane is a second scanner for scanning the excitation radiation and / or the manipulation radiation in a second coordinate direction different from the first coordinate direction and / or the third beam deflecting device in the third
  • the pupil plane is a third scanner for scanning the excitation radiation and / or the manipulation radiation in a second coordinate direction different from the first coordinate direction.
  • the second beam deflection device in the second pupil plane and / or the third beam deflection device in the third pupil plane may also be a fixed mirror, a mirror whose surface can be actively curved, or another wavefront-changing element.
  • a mirror whose surface can be actively curved, by variation of the
  • Focusing scanning in the z direction can be done.
  • a mirror is usually initially flat and can then be deformed, for example, to a concave mirror.
  • the focusing along the optical axis for example in the z-direction, can be changed, and in this sense, a z-scan can be performed.
  • aberrations due to refractive index mismatches can be compensated for with increased depth of penetration in the sample.
  • first, second and third scanners in the context of the present description means are understood with which a beam can be changed in its direction at least in one coordinate direction.
  • a scanner pivotable mirrors are used.
  • the second scanner is a resonance scanner and the third scanner is a quasi-static scanner. It has a particularly advantageous effect here that the second scanner, that is to say the fast resonance scanner, is bypassed in the case of the second beam path, in other words is no longer effective. This means that the fast second scanner can be switched off very quickly.
  • the second and third scanners are interchangeable, i. it may also be useful if third scanner is a resonant scanner and the second scanner is a quasi-static scanner. Both variants can be advantageous in certain situations. Both variants allow very fast switching between an imaging mode using the fast scanner and an excitation mode using the slow quasi-static scanner.
  • a scanner As a quasi-static scanner, a scanner is called, which is not resonant but, relatively slowly, quasi-static, operated.
  • a drive curve can be impressed on a quasi-static scanner. This can be linearized, for example, so that each pixel has the same length of stay. can be shown.
  • Resonant scanners only allow sinus-like movements, but they can be significantly higher-frequency.
  • a resonant scanner or resonance scanner is operated, usually comparatively much faster than a quasi-static scanner, in a mechanical resonance. Both the quasi-static and the resonantly operated scanner can be realized by a galvanometric scanner or a MEMS scanner.
  • acousto-optical devices in particular acousto-optical scanners, can also be used for the beam deflection devices, in particular the scanners. Since it is generally sufficient for an imaging mode when a fast scanner is available for one coordinate direction, in a further advantageous variant the first scanner may also be a comparatively slow scanner and in particular a quasi-static scanner.
  • optical arrangement according to the invention also makes it possible to shift the region screened by the resonant scanner with the quasistatic galvo scanner in the sample plane (so-called “panning”).
  • ROI regions of interest
  • a two-dimensional scanner for example a two-dimensional MEMS scanner with a single pivot point
  • the first beam deflection means it is fundamentally important that it is positioned in the beam path such that the radiation coming from the third focusing device, in particular the second concave mirror, bypasses the second beam deflection device, in particular the second scanner, in the direction of the second focusing device , in particular the first concave mirror, is forwarded.
  • This can be achieved in a simple variant by a fixedly positioned mirror or several fixedly positioned mirror of suitable size.
  • the electromagnetic radiation is reflected or transmitted as a function of a variable parameter, in particular wavelength and / or polarization.
  • the first beam deflection means may also be a dielectric and / or dichroic mirror.
  • variable second beam deflection means is meant a component which allows some sort of adjustment or adjustment and which deflects incident light or incident radiation differently depending on this adjustment or adjustment. In particular, it is intended to variably adjustable mirror.
  • first and the second beam path are different, that is, there are parts of the first beam path, which are not part of the second beam path and vice versa.
  • the present invention is particularly suitable for confocal laser scanning fluorescence microscopy.
  • a microscope objective serves both for directing and focusing excitation radiation and / or manipulation radiation onto a sample or into a region of a sample and for guiding and collimating detection light originating from the region of the sample illuminated with excitation radiation and / or manipulation radiation, back towards the main paint divider.
  • detection module refers to that component with which the detection light emitted by an illuminated sample is ultimately detected.
  • a detection module has, in particular, at least one radiation detector and, depending on the intended use, can in particular have color filters and confocal diaphragms.
  • a further fundamental idea of a variant of the invention consists in using a variable beam deflection means to irradiate the beam of the excitation radiation and / or manipulation radiation either via a first beam path, the second beam deflection device, in particular the second scanner, and the third beam deflection device, in particular the third scanner. contains, or to pass over a second beam path, which contains the third beam deflection, but the second beam deflection bypasses.
  • the said first scanner for the particular coordinate direction and the second scanner for this coordinate direction are qualitatively different, in particular if the second scanner is a resonance scanner and the third scanner is a quasi-static scanner.
  • the fast scanner either, namely in the first beam path, switched on or, that is, switched off at the second beam path. Because such a switching of the beam path in principle extremely fast (in the
  • Magnitude of 1 ms and below can also be achieved see the two beam paths and thus be switched extremely fast between an imaging mode and a manipulation mode.
  • the inventive arrangement is extremely powerful and can be used to solve various problems.
  • the optical arrangement according to the invention is particularly suitable for use in a confocal laser scanning fluorescence microscope.
  • the laser scanning microscope according to the invention can therefore be particularly preferably a, in particular confocal, laser scanning fluorescence microscope.
  • optical arrangement according to the invention and the laser scanning microscope according to the invention can preferably be used for manipulating biological samples, in particular in three dimensions.
  • applications in material microscopy are also conceivable.
  • the arrangement according to the invention can also be used for optical manipulation, laser scanning microscopy, light-sheet microscopy and other methods in which a sample is scanned by means of a laser beam.
  • An essential advantage of the present invention is that it is possible on the one hand to image or perform optical manipulation in a laser scanning microscope with quasi-static galvanic scanners, which are also referred to as galvoscanners, and on the other hand to provide rapid imaging by means of resonant scanners perform.
  • the invention allows very fast switching between a manipulation mode and an imaging.
  • this should be possible without having to switch additional moving parts to Strahlwegumscaria in the beam path, because this often leads to instabilities and other technical problems see.
  • the switchover can take place in the range of a few milliseconds (ms).
  • a three-dimensional optical manipulation for example a targeted spatial bleaching (keywords: FRAP; uncageing) or an optogenetic switching of ion channels, etc., and a subsequent switching to an optionally very fast Jardinge- exercise possible.
  • FRAP targeted spatial bleaching
  • uncageing uncageing
  • optogenetic switching of ion channels, etc. and a subsequent switching to an optionally very fast Dolphin- exercise possible.
  • a possibility for influencing the three spatial degrees of freedom is required, in particular, three optical elements are required.
  • quasistatic galvo scanners are particularly advantageous since they expose defined spatial areas in a given time and thus can deposit the necessary amounts of light energy, which are also called light doses.
  • the third dimension can be addressed, for example, via a dynamic wavefront-curving mirror, which thus changes an axial focus position.
  • Such components are also referred to as defocusing or z-scanning mirrors. Due to their geometric dimension, these elements can complement each other very well with optical mirror scanners.
  • the movement of a focal volume in the direction of the z-coordinate thus takes place by influencing the wavefront at a given beam direction (z-direction) in the fundamental difference to lateral scanning movements, in which the beam direction is adjusted via deflectable mirrors. At this position, optical aberrations can be corrected simultaneously with certain mirrors. If one does this in order to compensate for influences of the sample on the optical quality of the imaging, then one can also speak of an adaptive correction.
  • the present invention can be used advantageously. 20 Only one port is occupied on the microscope stand.
  • 25 is characterized in that it can be realized in principle with a variety of wavelength combinations. In this case, between the scanners more moving elements that need to be switched on or off, or must be introduced into the beam path, not absolutely necessary.
  • the arrangement according to the invention can also be used in particular for the laser material
  • a sample is rastered with a laser beam.
  • arbitrary combinations of the wavelength of the manipulation radiation on the one hand and the excitation radiation on the other hand can be used.
  • xy / z-scanning systems are also very well suited for scanning arbitrary trajectories and planes in a three-dimensional sample. This is particularly advantageous if one wishes to quickly map defined structures within a volume, in particular with multiphoton excitation. For example, a neuron following an irregular course in a three-dimensional volume may be imaged. If this neuron is imaged very rapidly or the signal transduction, eg Ca (2 +) waves, is to be measured optically along this neuron, the optical arrangement according to the invention is able to follow this volume-forming structure.
  • the present invention can also be usefully employed in so-called light-sheet microscopy. This is an old technology that was developed by Zsigmondy and Siedentopf 1902/1903 at Carl Zeiss for colloid research. After being almost forgotten for a long time, the method was revived by new works by E. Stelzer. This was stimulated in particular by the great progress in the processing of digital data.
  • the optical arrangement according to the invention can also be used both for a linear fluorescence excitation and for a non-linear fluorescence excitation, for example for multiphoton microscopy. All common and known methods with the arrangement are possible (2-, 3- or multi-photon fluorescence, CARS, SRS, etc.).
  • Two-photon microscopy is today a standard method for studying living samples. Especially in so-called neuro-imaging three-dimensional manipulations of the sample play an essential role in the understanding of neurobiological processes in the brain of living animals.
  • the invention is in principle realized when it is possible to switch over between a first beam path and a second beam path and the first beam path extends from the variable second beam deflection means via the third beam deflection device and the second beam deflection device to the first scanner and the second beam path at least from the variable second beam deflection means via the third beam deflecting device, bypassing the second beam deflecting device, via the first beam deflecting means to the first scanner.
  • Concrete variants of the optical arrangement according to the invention are characterized in that the first beam path extends at least from the variable second beam deflection means via the fourth focusing device, the third beam deflection device, the third focusing device, the second beam deflection device and the second focusing device to the first scanner and that the second beam path extends at least from the variable second beam deflection means via the fourth focusing means, the third beam deflection means, the third focusing means bypassing the second beam deflection means via the first beam deflection means and the second focusing means to the first scanner.
  • variable beam deflection means has a variably positionable mirror. It is particularly expedient to use very light mirrors to move the masses to be moved and thus the occurring and necessary forces to keep small.
  • the variable positioning of the mirror basically allows a variety of technical configurations.
  • the mirror is a rotating mirror with a, in particular galvanometric, rotating device.
  • This rotating mirror in a first rotational position in which the first beam path is selected, reflects incident radiation differently than in a second rotational position different from the first rotational position, in which the second beam path is selected.
  • the rotating device is a galvanometric rotating device.
  • the first beam deflection means and / or the variable second beam deflection means may comprise a dielectric mirror.
  • variable second Strahlumsch has a wavelength-dependent and polarization-dependent dielectric and / or dichroic mirror, said mirror transmits excitation radiation and / or manipulation radiation with a first Wellenläge and a first polarization state, excitation radiation and / or manipulation radiation with the first Wellenläge and a second polarization state, which is different from the first polarization state, reflected and transmitted from a specimen fluorescence light with a red-shifted wavelength, regardless of its polarization state transmitted or reflected.
  • the first polarization state relative to the dielectric and / or dichroic mirror can be s-polarization and the second polarization state related to the dielectric and / or dichroic mirror can be p-polarization.
  • the reverse assignment is possible.
  • the first polarization onsSullivan referred to the mirror p-polarization and the second polarization state relative to the mirror s-polarization.
  • the arrangement of such a dielectric and / or dichroic mirror in the beam path advantageously allows the switching between the first beam path and the second beam path of the excitation radiation and / or the manipulation radiation by switching between s and p polarization.
  • suitable switching means for switching the polarization for example a lambda half plate and / or an electro-optical manipulator, may be present in the laser scanning microscope according to the invention.
  • the third focusing device in particular the second concave mirror, redirects incoming excitation radiation or manipulation radiation in the direction of the second focusing device, in particular to the first concave mirror.
  • Particularly advantageous variants of the optical arrangement according to the invention are characterized in that the first beam deflection means has at least one fixedly positioned mirror, in particular exactly two fixedly positioned mirrors.
  • the second beam deflection device in particular the second scanner, is bypassed.
  • This can be realized in a space-saving and in a small space in embodiments in which an alternative second pupil plane is formed in the second beam path, which is optically conjugate to the first pupil plane and in which a further beam deflecting and / or beam-forming component which is part of the first Strahlumlenkstoffs , is arranged.
  • This further beam-deflecting and / or beam-shaping component may, for example, be a, in particular fixed, mirror.
  • the further pupil plane namely the alternative second pupil plane, however, also makes it possible to intervene in the wavefront of the excitation radiation and / or the manipulation radiation. From this point of view, it can be an advantage if the The beam-deflecting component is a mirror whose surface can be actively curved, or a segmented mirror or other device for manipulating the wavefront, for example a spatial light modulator.
  • the wavefront may be filled with elements described in J. Biomed. Opt. 21 (12), 121507, Oct. 12, 2016, see there in particular Figure 2, described type are manipulated so that a refocusing in the sample is achieved at high speed.
  • Wavefront-changing elements of this type are usually introduced into the beam path via comparatively complex relay optics.
  • these relay optics result in significant and often unacceptable loss of light and, moreover, are expensive and difficult to adjust.
  • rapid switching of the beam path between manipulation and imaging in the manner described above with relay optics is hardly possible.
  • the optical arrangement according to the invention brings significant improvements.
  • Another mode which particularly supports three-dimensional manipulations, as used for example in optogenetics can be provided by the arrangement according to the invention by introducing a fast wavefront-forming element, in particular in the alternative second pupil plane.
  • Such elements are offered, for example, by the company Revibro Optics (Bozeman, MT 59717).
  • a control unit is provided for the coordinated activation of the first scanner, the second beam deflection device, the third beam deflection device and / or the variable second beam deflection device. means of.
  • This control unit may particularly preferably be a PC, but in principle also other, in particular programmable, components such as microcontrollers.
  • control unit can be set up to control the first scanner, the second beam deflecting device, the third beam deflecting device and / or the variable second beam deflecting device in such a way that, regardless of whether the first or the second beam path is traversed, the same sample locations with excitation radiation or manipulation radiation are applied.
  • the first scanner is tracked so that regardless of whether the first beam path or the second beam path is traversed, the same location on the sample is exposed to excitation light or manipulation light becomes.
  • control unit can serve to control further components of the optical arrangement according to the invention, for example a device for switching or rotating the polarization and / or a device for manipulating the wavefront, such as a segmented mirror or a mirror whose surface is actively curved can.
  • the device for multipoint illumination for controlling the individual illumination channels can have a multi-channel AOTF.
  • the individual illumination channels can thus be set arbitrarily with regard to wavelength and intensity of the radiation.
  • one of the illumination channels is used to excite and / or manipulate a sample and the further illumination channels are used for imaging.
  • variants of the laser scanning microscope according to the invention are particularly preferred in which for at least one of the illumination channels, a device for manipulation, in particular switching and / or rotating, the polarization, in particular a lambda half-plate and / or an electro-optical manipulator pulator , is available. With this device for manipulation, ie for switching, the polarization of the beam path for at least one illumination channel between the first beam path and the second beam path can be switched back and forth.
  • a particular advantage of the present invention is that it can in principle be used in various microscope techniques.
  • the laser scanning microscope according to the invention can be set up for contrasting on the basis of at least one non-linear contrast principle.
  • the nonlinear contrast principle may be multi-photon fluorescence, for example 2- or 3-photon fluorescence, CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering) or SRS (Stimulated Raman Scattering).
  • the microscope according to the invention is particularly preferably a two-photon laser scanning microscope.
  • the microscope according to the invention may also be a confocal microscope, in particular a confocal laser scanning fluorescence microscope.
  • a confocal microscope is when a pinhole is present in a plane conjugate to the image plane.
  • Figure 1 a first embodiment of an optical inventive
  • Figure 2 a detail of the embodiment of Figure 1;
  • Figure 3 the detail of Figure 2 in an alternative operating position
  • FIG. 4 shows a schematic representation of a laser scanning microscope according to the invention. Identical and equivalent components are generally identified by the same reference numerals in all figures.
  • an inventive optical arrangement SM for scanning excitation radiation and / or manipulation radiation in a laser scanning microscope, in particular a laser scanning fluorescence microscope, as shown in FIG.
  • a laser scanning microscope in particular a laser scanning fluorescence microscope
  • three scanners S1, S2 and S3 arranged in a row one behind the other, which is achieved by an image of all scanners on each other, that all the scanners are in an optical pupil.
  • the optical arrangement SM has, as an essential component, first as a first focusing device, a scanning optics SO for providing a first pupil plane P1.
  • This first pupil plane P1 is in an operating state, that is to say in a state in which the optical arrangement SM interacts with a laser scanning microscope or is installed in this microscope, to a rear one Lens pupil P of the microscope objective (MO) optically conjugate (see Figure 4).
  • a first scanner S1 is arranged as the first beam deflection means, which serves for scanning excitation radiation and / or manipulation radiation 10 in a first coordinate direction y.
  • the scanner S1 may, for example, be a quasi-static, in particular a galvanometric, scanner.
  • the scanner mirror S1 shown schematically is pivoted back and forth about an axis which is vertical in FIG. 1, that is to say parallel to the x-axis.
  • a second focusing device which in the example shown is a first concave mirror H1.
  • This first concave mirror H1 serves to provide a second pupil plane P2, which is optically conjugate to the first pupil plane P1.
  • a second scanner S2 which serves to scan the excitation radiation and / or manipulation radiation in a second coordinate direction x different from the first coordinate direction y, is arranged as the second beam deflection device.
  • the xyz coordinate system shown schematically in FIG. 1 is a Cartesian coordinate system, ie the first coordinate direction y is perpendicular to the second coordinate direction x.
  • the direction of the optical axis 12 extends in the region between an intermediate image plane ZB and the scanning optics SO parallel to the z-axis.
  • the second scanner S2 may be, for example, a resonance scanner.
  • the scanner mirror S2 shown schematically in FIG. 1 is pivoted back and forth in operation about an axis oriented parallel to the z-direction. This orientation of the axis of rotation is by no means absolutely necessary. The orientation generally depends on the angle at which the first scanner S1 is operated.
  • the axes of rotation of the scanners S2 and S3 lie in a plane which contains the optical axis of the scanning objective and whose surface normal is parallel to the axis of rotation of the scanner S1.
  • the axis of the scanner S2 may, for example, be parallel to the optical axis of the scanning objective.
  • a third focusing device is present, which in the example shown is a second concave mirror H2.
  • the second concave mirror H2 is used to generate a third pupil plane P3, which is optically conjugate to the first pupil plane P1 and the second pupil plane P2.
  • a third scanner S3, which likewise serves to scan the excitation radiation and / or manipulation radiation 10 in the second coordinate direction x, is arranged as the third beam deflection device.
  • the third scanner S3, like the first scanner S1, can be a quasi-static, in particular a galvanometric, scanner.
  • a first beam deflection means 30 is present between the second focusing device, ie the first concave mirror H1, and the second pupil plane P2 on the one hand and the second pupil plane P2 and the third focusing device, ie the second concave mirror H2, for deflecting the latter second concave mirror H2 coming excitation radiation 16 and / or manipulation radiation 10, bypassing the second beam deflection S2 in the direction of the first concave mirror H1.
  • a fourth focusing device which is shown schematically in the embodiment shown in Figure 1 as a lens L4.
  • this can also be a further concave mirror, a lens group or a combination of these components.
  • the fourth focusing device L4 serves to generate a fourth pupil plane P4, which is optically conjugate to the third pupil plane P3 and thus also to the preceding pupil planes P1 and P2.
  • a variable second beam deflection means 20 is then arranged for switching an optical beam path between a first beam path and a second beam path.
  • the variable second Strahlumsch 20 is a rotating mirror 22 having a rotating device, not shown.
  • the rotating device can be realized for example by a galvanometric scanner. This is advantageous because the mass moment of inertia can be kept relatively small.
  • the direction of the incoming excitation radiation 16 or manipulation radiation 10 as shown schematically in FIG. be adjusted between two different directions.
  • a switchover between a first beam path and a second beam path is ultimately achieved.
  • a collimated beam incident on the rotating mirror 22 is guided on the lens L4 in different directions depending on the rotational position of the rotating mirror 22.
  • the lens L4 focuses these different beams, as indicated schematically in Figure 1, in spaced apart (illustrated in Figure 1 by the double arrow 13) points B.
  • the position of the points B in the beam downstream from the third Strahlumsch listening S3 is shown in Figure 1 by a Arrow indicated.
  • the first beam path extends at least from the variable second beam deflection means, that is to say the rotary mirror 22, via the third scanner S3 and the second scanner S2 to the first scanner S1.
  • the second beam path extends at least from the rotating mirror 22 via the third scanner S3, bypassing the second beam deflection device, ie the second scanner S2, via the first beam deflection means 30 to the first scanner S1.
  • the second scanner S2 is a resonance scanner, that is to say a component which moves very rapidly. It is essential that the beam path via the second scanner S2 and thus the action of this second scanner S2 is deactivated or switched off by actuation of the variable beam deflection means 20. It is therefore switched between the two-dimensional scans with and without resonant scanner.
  • the first scanner S1 in particular automatically by a control unit, can make a switching of the deflection angle. The first scanner S1 thus ensures in addition to the screening of the sample to the image structure and a switching of the beam path.
  • the laser scanning microscope 100 schematically illustrated therein has as essential components a laser module LM, a main color splitter HFT, an optical arrangement SM according to the invention for scanning Excitation and manipulation light 10, a microscope objective MO and a detection module DM.
  • the laser module LM serves as a radiation source for excitation light 16 and manipulation light 10.
  • the excitation light 16 or manipulation light 10 emitted by the laser module LM strikes a multipoint module 40, which divides the incoming light beam into a plurality of Discontinuous radiation bundles, which are finally focused in different focal volumes on or in a sample S.
  • the spectral composition and the intensity can be set separately for the individual partial beams, for example with a multi-channel AOTF.
  • the laser module LM, the multipoint module 40, the inventive optical arrangement for scanning SM, a lens revolver, not shown, and the detection module DM are connected via connecting lines 71 to 75 with a control and evaluation PC, which is a commercially available computer can.
  • the excitation light 16 or manipulation light 10 After passing through the multipoint module 40, the excitation light 16 or manipulation light 10 passes via the main color splitter HFT to the inventive optical arrangement SM for scanning the excitation light 16 and / or manipulation light 10.
  • the scanning optics SO of the optical arrangement SM focuses the excitation light 16 or manipulation light 10 in FIG an intermediate level ZB.
  • the excitation light 16 or the manipulation light 10 reaches the microscope objective MO via a rear objective pupil P, which transmits the light into a plurality of focal volumes on or in the sample S, which is located in a sample plane SP, focused.
  • the number of separate focal volumes corresponds to the number of separate beams generated in the multipoint module 40. If one omits the multipoint module 40, the excitation or manipulation light would turn into a
  • the focal volumes of the excitation or manipulation light 10 are scanned in the intermediate image plane ZB and thus in the sample plane SP optically conjugate to the intermediate image plane ZB.
  • the microscope shown schematically in FIG. 4 can in particular be confocal
  • the second beam path is the beam path on which manipulation radiation 10 is directed in the direction of the sample S
  • the first beam path is correspondingly the beam path on which excitation radiation 16 is directed onto the sample S.
  • the second beam path ie the beam path for manipulation radiation or manipulation light 10
  • a defined manipulation for example a defined bleaching
  • the optical arrangement SM according to the invention can be switched quickly and the sample can be observed in an imaging mode with the aid of excitation radiation 16.
  • the manipulation radiation 10 arrives, coming from the laser module LM, first via the rotating mirror 22, ie via the second variable beam deflection means 20 in the fourth pupil plane P4, to the third scanner S3 in the third pupil plane P3.
  • the third scanner S3 is a quasi-static, in particular galvanometric, scanner which scans the manipulation radiation 10 comparatively slowly in the x-direction.
  • the manipulation radiation 10 for scanning SM according to the invention takes the second beam path, that is to say the manipulation radiation 10 does not come into contact with the second scanner S2 in the second pupil plane P2.
  • the manipulation radiation 10 coming from the third scanner S3 passes via the second concave mirror H2 onto a fixedly arranged mirror 31 which is part of the first beam deflection means 30. From this fixedly arranged mirror 31, the manipulation radiation 10 is reflected a first time and then encounters another beam deflecting component 32.
  • This further beam deflecting component 32 is shown in the example shown in Figure 2 another fixed mirror 32, which together with the fixed ange - arranged mirror 31 forms the first beam deflection means 30.
  • an alternative second pupil plane P2a is formed in the second beam path, which is in particular optically conjugate to the first pupil plane P1 and to the third pupil plane P3, and the further beam deflecting component 32 is arranged in this alternative second pupil plane P2a.
  • the manipulation radiation 10 After reflection on the further fixed mirror 32, the manipulation radiation 10 strikes the fixed mirror a second time and is then reflected by it in the direction of the first concave mirror H1.
  • the manipulation radiation 10 finally reaches the sample S from the first concave mirror H1 via the first scanner S1 in the first pupil plane P1, the scanning optics SO and the microscope objective MO.
  • the first scanner S1 is likewise a quasi-static, in particular galvanometric, scanner the manipulation light 10 scans comparatively slowly in the y-direction.
  • the impact point of the focal volume or the impact points of the focal volumes of the manipulation radiation 10 can accordingly be set in a targeted manner by setting the first scanner S1 in the first pupil plane P1 and the third scanner S3 in the third pupil plane P3.
  • the alternative second pupil plane P2a instead of the fixed mirror 31, also an optical element for fast refocusing, as e.g. commercially available from Revibro Optics (Bozeman, MT 59717) or mirrors whose surface can be actively curved.
  • the focus can be varied in the z-direction.
  • three-dimensional trajectories or freely selected volumes in the sample S can also be manipulated by the manipulation radiation 10.
  • a 2-dimensional or 3-dimensional manipulation of the sample can be performed.
  • the rotating mirror 22 is rotated in the fourth pupil plane P4 in such a way that the excitation radiation 16 coming from the direction of the laser module LM strikes the lens L4 in another direction and thus exits the lens L4 at another location.
  • This idea of the rotating mirror 22 means that the stimulus tion radiation 16 does not take the same path as the manipulation radiation 10 through the components of the optical arrangement SM according to the invention, ie not the second beam path, but the first beam path.
  • the directional change brought about by the rotating mirror 22 and the size and the spatial position of the fixed mirror 31 are matched to one another such that in the exemplary embodiment shown in FIGS. 1 and 2 the excitation radiation 16 does not interfere with the first beam deflection means 30, 31 on the first beam path , 32 comes into contact.
  • the third scanner S3 is a quasi-static, in particular galvanometric, scanner which scans the excitation radiation 16 comparatively slowly in the x-direction.
  • the excitation radiation 16 coming from the third scanner S3 reaches the second scanner S2 in the second pupil plane P2 via the second concave mirror H2.
  • This second scanner S2 is a resonance scanner, which is much faster in comparison to the third scanner S3 and also scans the excitation radiation 16 in the x-direction.
  • the third scanner S3 is a quasi-static scanner, it can, in principle, be brought to a standstill very quickly, or the scanning of the excitation light 16 in the x-direction is combined by both the third scanner S3 and the second scanner S2. For example, especially with a limited stroke of the second scanner S2, with the quasi-static scanners S1 and S3, the location of a certain field of view can be set and the rapid scanning is then carried out with the second scanner S2. In this mode, the scan field can be activated by operating the third scanner S3 in x-
  • the third scanner S3 can stand still. From the second scanner S2, the excitation radiation 16 is reflected in the direction of the first concave mirror H1 and, coming from the concave mirror H1, finally hits the first scanner S1 in the first pupil plane P1. From the first scanner S1, the excitation light 16 finally reaches the sample S via the scanning optics SO and the microscope objective MO.
  • the alternative second pupil plane P2a accordingly plays no role for the first beam path.
  • the first beam path of the Impact point of the focal volume or the impact points of the focal volumes of the excitation radiation 16 can be set by adjusting the first scanner S1 in the first pupil plane P1, the second scanner S2 in the second pupil plane and the third scanner S3 in the third pupil plane P3 targeted.
  • the second pupil plane P2 and the alternative second pupil plane P2a can be equipped with different optically active or passive elements. In the simplest case, this is a mirror as soon as there is an active element in the other pupil, which should be bypassed.
  • this is a mirror as soon as there is an active element in the other pupil, which should be bypassed.
  • there may be a resonant scanner. If this is not needed, no light should be passed over this, in order to avoid disturbances of the beam by residual movements.
  • a resonant scanner has a certain transient response. If you want to realize a very fast circuit between a manipulation mode and a fast imaging mode by means of a resonant scanner, the scanner must vibrate continuously and you turn on at the appropriate moment optically to this movement.
  • Figure 3 shows a situation in which the first scanner S1 is tracked when switching from the first to the second beam path such that the first beam path and the second beam path downstream of the first scanner S1 again coincide. This means that, irrespective of whether the first or the second beam path is selected, the excitation radiation 16 on the one hand and the manipulation radiation 10 on the other hand are conducted to the same location on a sample S.
  • This tracking of the first scanner S1 or alternatively or additionally also the second scanner S2 and / or the third scanner S3 in response to a positioning of the switching device 20, in the example shown, the rotary mirror 22, can be performed for example by means of a suitably programmed control unit.
  • the optical arrangement according to the invention achieves this because the fast second scanner S2 and the quasi-static third te Scanner S3 can be used simultaneously. With the arrangement of DE 10 2014 017 001 A1, this is not possible.
  • the angle between incoming and outgoing beam is preferably equal to the corresponding angle at the first concave mirror H1 and the axes of rotation of the second scanner S2 and the third scanner S3 are preferably parallel to one another. This ensures that, regardless of whether the second scanner S2 or the third scanner S3 or both is scanned, no asymmetrical scan distortions occur during the scanning in the sample plane (see DE 10 2014 017 001 A1).
  • a variable-sized mirror as shown in FIG. 2, can be present in the beam path as a variable beam deflection means 30. This element does not have to be configured. It can basically remain in the beam path even with normal imaging.
  • Switching occurs by generating an angle between the beam incident on the first scanner S1 and the axis of rotation of the mirror, which is then different from 90 °.
  • the beam paths of the two modes of operation leave the third scanner S3 in the direction of the main color splitter and a confocal pinhole at different angles.
  • a further angle circuit in a descanned pupil plane in particular fourth pupil plane P4 can be made with a further galvanometric mirror (not shown in the figure) (in particular second variable beam deflecting device 20).
  • This arrangement is suitable both for single-point scanning laser scanning microscopy and for multipoint methods which require that all scanners can be arranged in well-defined optical pupils.
  • the sample S After excitation of the sample S by the excitation light 10, the sample S emits in a basically known manner detection light 14, which runs essentially the same optical beam path back to the main color splitter HFT.
  • the detection light 14 is typically fluorescent light whose wavelength is red-shifted compared to the wavelength of the excitation light 10 due to Stokes shift. This redshift makes it possible to separate the detection light 14 in the main color splitter HFT, and the detection light 14, if appropriate via further components, not shown, such as mirrors or filters, arrives at the detection module DM and is quantitatively detected there.
  • the measurement data of the detection module DM are supplied to the control and evaluation unit PC.
  • a significant advantage of the optical arrangement according to the invention is that it can be switched very quickly between a so-called manipulation mode using manipulation radiation 10 and a fast imaging mode in which excitation radiation 16 is used. This can be done in different ways.
  • the optical arrangement according to the invention as shown in FIGS. 1 and 2, can be profitably extended in various respects.
  • the pupil P2 now has a resonant scanner, for example.
  • the alternative pupil plane P2a may, for example, be occupied by a fixed mirror. If the beam path is chosen such that P2a is addressed, manipulation or imaging by means of the quasi-static scanner can take place, with the resonant scanner being bypassed.
  • the switching mechanism of the optical arrangement according to the invention is combined with an active multi-point illumination, as described, for example, in US Pat
  • one of the multiple beams may have a polarization rotated by 90 °. This is then the manipulation beam, which generally also has a higher intensity. All remaining rays are used for imaging.
  • a switching by means of the acousto-optic filter (AOTF) now leads to the desired switching of the lighting tion beam paths for the manipulation of the pupil P4 or the detection via the scanner S2 in the pupil P2.
  • manipulation radiation manipulation light 12 optical axis

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine optische Anordnung zum Scannen von Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung in einem Laser-Scanning-Mikroskop. Die erfindungsgemäße optische Anordnung ist dadurch gekennzeichnet, dass, zusätzlich zu einer ersten und einer zweiten fokussierenden Einrichtung eine dritte fokussierende Einrichtung vorhanden ist zum Erzeugen einer dritten Pupillenebene, die zu einer ersten Pupillenebene optisch konjugiert ist, dass in der dritten Pupillenebene eine dritte Strahlumlenkeinrichtung angeordnet ist zum Umlenken der Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung, dass zwischen der zweiten fokussierenden Einrichtung und der zweiten Pupillenebene einerseits und der zweiten Pupillenebene und der dritten fokussierenden Einrichtung andererseits ein erstes Strahlumlenkmittel vorhanden ist zum Umlenken der von der dritten fokussierenden Einrichtung kommenden Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung unter Umgehung der zweiten Strahlumlenkeinrichtung in Richtung der zweiten fokussierenden Einrichtung, dass eine vierte fokussierende Einrichtung zum Erzeugen einer vierten Pupillenebene vorhanden ist, die zur dritten Pupillenebene optisch konjugiert ist, dass in der vierten Pupillenebene ein variables zweites Strahlumlenkmittel angeordnet ist zum Umschalten eines optischen Strahlengangs zwischen einem ersten Strahlweg und einem zweiten Strahlweg. Die Erfindung betrifft außerdem ein Laser-Scanning-Mikroskop.

Description

Optische Anordnung zum Scannen von Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung in einem Laser-Scanning-Mikroskop und Laser-Scanning-Mikroskop
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem ersten Gesichtspunkt eine optische An- Ordnung zum Scannen von Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung in einem Laser-Scanning-Mikroskop nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 . In einem weiteren Gesichtspunkt bezieht sich die Erfindung auf ein Laser-Scanning-Mikroskop nach dem Oberbegriff des Anspruchs 22.
Eine gattungsgemäße optische Anordnung zum Scannen von Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung in einem Laser-Scanning-Mikroskop ist beispielsweise beschrieben in DE 10 2014 017 001 A1 und weist folgende Komponenten auf: eine Scanoptik als erste fokussierende Einrichtung zum Bereitstellen einer ersten Pupillenebene, eine erste Strahlumlenkeinrichtung, die durch einen in der ersten Pupillenebene angeordneten ersten Scanner gebildet ist, zum Scannen der Anregungs- Strahlung und/oder Manipulationsstrahlung in einer ersten Koordinatenrichtung, eine zweite fokussierende Einrichtung zum Erzeugen einer zweiten Pupillenebene, die zu der ersten Pupillenebene optisch konjugiert ist, und eine zweite Strahlumlenkeinrichtung zum Umlenken der Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung, die in der zweiten Pupillenebene angeordnet ist. Ein gattungsgemäßes Laser-Scanning-Mikroskop geht ebenfalls aus DE 10 2014 017 001 A1 hervor und weist folgende Komponenten auf: mindestens eine Laserlichtquelle zum Aussenden von Laserstrahlung zum Anregen und/oder Manipulieren einer Probe, mindestens einen Hauptfarbteiler zum Trennen von Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung einerseits und wellenlängenverschobenem Detekti- onslicht, welches von einer Probe ausgeht, andererseits, mindestens ein Mikroskopobjektiv zum Leiten von Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung auf eine Probe und zum Leiten von Detektionslicht, welches von der Probe ausgeht, zurück in Richtung des Hauptfarbteilers, und mit einem Detektionsmodul zum Nachweisen des Detektionslichts,
Die Laser-Scanning-Mikroskopie hat sich als unverzichtbares Werkzeug der biomedizinischen Forschung etabliert. Neben der reinen Bildgebung gewinnt die optische Manipulation von Proben immer mehr an Bedeutung.
Ein allgemeines technisches Problem besteht dabei darin, mit möglichst geringem Aufwand, in einem möglichst kompakten Bauraum und mit möglichst geringen Transmissionsverlusten, mehrere optische Pupillen zu erzeugen, welche jeweils aufeinander abgebildet werden. Die Anzahl der nutzbaren Pupillen soll dabei größer oder gleich drei sein. Zwischen mindestens zwei der zur Verfügung gestellten Pupillen soll geschaltet werden können.
Bekannte Lösungen basieren einerseits auf der Nutzung verschiedener Ports am Stativ. Dies ist nachteilig, da hierdurch das Mikroskopstativ kompliziert und teuer wird. Weiterhin ist es dann unter Umständen nicht möglich, weitere Verfahren, wie zum Beispiel die hochauflösende Mikroskopie am gleichen Stativ zu betreiben. Zudem sind häufig aufwändige Justagen durchzuführen, um die jeweiligen Bildfelder miteinander zur Deckung zu bringen.
Bekannte Lösungen für die Manipulation durch nur ein Scanobjektiv sind in der Regel mechanisch und somit oft relativ langsam. Es ist in der Regel kaum möglich, größere Massen, wie sie z.B. Spiegel darstellen, schneller als 10 ms zu schalten. Relativ kurze Schaltzeiten lassen sich dagegen mit galvanometrischen Scannern erzielen. Allerdings muss hierbei versucht werden, das Massenträgheitsmoment gering zu halten.
In US-7, 715,078 ist eine Umschaltung zwischen mehreren Scannern gezeigt. Hier werden, neben den für das eigentliche Scannen benötigten Scannern, mindestens zwei weitere Scanner gebraucht, die die Strahlwege schalten. Zudem zeigen die Ausführungen in dieser Anmeldung eine weitere Abbildung über eine refraktive Optik, die als einfache Linsen dargestellt sind. Allerdings besteht hier keine Möglichkeit, in einer vierten Pupille einen z-scannenden Spiegel unterzubringen. Dieser wird aber insbesondere für eine dreidimensionale optische Manipulation benötigt. Die optischen Elemente weisen dabei den Komplexitätsgrad eines Scanobjektivs auf, das aufwändig und weniger lichteffizient ist.
EP 2 042 905 B1 zeigt eine Kombination von zwei Scannerpaaren. Hier kann jeweils das eine Scannerpaar oder das andere Scannerpaar ausgewählt werden. Allerdings können nicht einzelne Achsen sehr schnell hinzugeschaltet werden, weil die zu bewegenden Massen vergleichsweise groß sind.
In DE 100 50 529 B4 ist die Kombination von mehreren Strahlablenkungseinheiten gezeigt, die jeweils aus zwei Strahlablenkungsmodulen bestehen. In den Ausfüh- rungsbeispielen sind auch Abbildungsoptiken zwischen den Strahlablenkung Einrichtungen beschrieben. Es bestehen jedoch keine Möglichkeiten zur Umschaltung zwischen verschiedenen Scanmodi. Ebenso sind keine Mittel zur Wellenfrontbeeinflus- sung beschrieben.
Als eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung kann angesehen werden, eine optische Anordnung zu schaffen, mit der weitere Pupillenebenen bereitgestellt werden, wobei nur geringer zusätzlicher Bauraum beansprucht werden soll. Außerdem soll zwischen den Pupillenebenen möglichst schnell hin und her geschaltet werden können. Schließlich soll ein Laser-Scanning-Mikroskop mit zusätzlichen Pupillenebenen geschaffen werden, bei dem möglichst schnell zwischen den verschiedenen Pupillen- ebenen hin und her geschaltet werden kann.
Diese Aufgabe wird durch die optische Anordnung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Im Hinblick auf das Mikroskop wird die Aufgabe durch das Laser- Scanning-Mikroskop mit den Merkmalen des Anspruchs 22 gelöst.
Vorteilhafte Varianten der erfindungsgemäßen optischen Anordnung und des erfin- dungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskops sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche und werden außerdem im Folgenden, insbesondere im Zusammenhang mit den Figuren, beschrieben.
Die optische Anordnung zum Scannen von Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung in einem Laser-Scanning-Mikroskop der oben angegebenen Art ist erfindungsgemäß dadurch weitergebildet, dass eine dritte fokussierende Einrichtung zum Erzeugen einer dritten Pupillenebene vorhanden ist, die zu der ersten Pupillenebene optisch konjugiert ist, dass in der dritten Pupillenebene eine dritte Strahlumlenkeinrichtung zum Umlenken der Anregungsstrahlung und/oder Manipulations- Strahlung angeordnet ist, dass zwischen der zweiten fokussierenden Einrichtung und der zweiten Pupillenebene einerseits und der zweiten Pupillenebene und der dritten fokussierenden Einrichtung andererseits ein erstes Strahlumlenkmittel vorhanden ist zum Umlenken der von der dritten fokussierenden Einrichtung kommenden Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung unter Umgehung der zweiten Strahlumlenkeinrichtung in Richtung der zweiten fokussierenden Einrichtung, dass eine vierte fokussierende Einrichtung zum Erzeugen einer vierten Pupillenebene vorhanden ist, die zur dritten Pupillenebene optisch konjugiert ist, und dass in der vierten Pupillenebene ein variables zweites Strahlumlenkmittel angeordnet ist zum Umschalten eines optischen Strahlengangs zwischen einem ersten Strahlweg und ei- nem zweiten Strahlweg.
Das Laser-Scanning-Mikroskop der oben angegebenen Art ist erfindungsgemäß dadurch weitergebildet, dass eine erfindungsgemäße optische Anordnung zum Scannen von Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung vorhanden ist.
Besonders bevorzugt kann der erste Strahlweg mindestens von dem variablen zwei- ten Strahlumlenkmittel über die dritte Strahlumlenkeinrichtung und die zweite Strahlumlenkeinrichtung zu dem ersten Scanner verlaufen. Der zweite Strahlweg kann besonders bevorzugt mindestens von dem variablen zweiten Strahlumlenkmittel über die dritte Strahlumlenkeinrichtung unter Umgehung der zweiten Strahlumlenkeinrichtung über das erste Strahlumlenkmittel zu dem ersten Scanner verlaufen. Als optische Anordnung wird im Rahmen der vorliegenden Beschreibung eine Anordnung bezeichnet, die insbesondere strahlformende Komponenten, wie Linsen und Hohlspiegel, und strahlumlenkende Komponenten, wie Spiegel, die insbesondere beweglich sein können, aufweist.
Unter dem Begriff des Scannens wird das gesteuerte Führen eines Strahls der Anre- gungsstrahlung oder der Manipulationsstrahlung über eine Probe verstanden. Dieses Scannen kann in einem regelmäßigen Muster, beispielsweise zeilenweise, aber insbesondere auch entlang einer vorzugebenden Trajektorie erfolgen.
Unter Anregungsstrahlung wird für die Zwecke dieser Beschreibung elektromagnetische Strahlung, insbesondere sichtbares Licht, aber auch Infrarot- und Ultraviolett- Strahlung verstanden, die allgemein zur Bildgebung dient. In aller Regel wird diese Anregungsstrahlung von Lasern bereitgestellt. Dabei können unterschiedliche Kontrastverfahren zum Einsatz kommen. Besonders bevorzugt handelt es sich um Strahlung zur Anregung einer Fluoreszenz aus Farbstoffen, mit denen eine zu untersuchende Probe präpariert ist. Zur Messung dieses Fluoreszenzlichts dient ein Laser- Scanning-Fluoreszenz-Mikroskop. Grundsätzlich kann es sich aber auch um Beleuchtungslicht für die Lichtmikroskopie handeln.
Als Manipulationsstrahlung wird elektromagnetische Strahlung, insbesondere im sichtbaren Bereich, aber auch im Infrarot- und Ultraviolettbereich, bezeichnet, mit der eine gezielte Veränderung einer zu untersuchenden Probe, insbesondere in einem gezielt ausgewählten Raumbereich oder einer gezielt ausgewählten und vorzugebenden Trajektorie, bewerkstelligt werden kann.
Die Begriffe Anregungsstrahlung und Anregungslicht einerseits und Manipulationsstrahlung und Manipulationslicht andererseits werden in dieser Beschreibung synonym verwendet. Unter dem Begriff des Detektionslichts wird Licht verstanden, das von der Probe aufgrund der Anregung emittiert wird und das mittels der gesamten optischen Anordnung detektiert werden soll. Detektionslicht kann insbesondere Fluoreszenzlicht sein.
Als Pupillenebene wird für die Zwecke dieser Beschreibung eine optische Ebene verstanden, die in einem Betriebszustand der optischen Anordnung in einem Laser- Scanning-Mikroskop optisch konjugiert ist zu einer hinteren Objektivpupille des jeweils im Einsatz befindlichen Mikroskopobjektivs. Beispielsweise sind in einem Betriebszustand der erfindungsgemäßen Anordnung zum Scannen die erste, die zweite, die dritte und die vierte Pupillenebene optisch konjugiert zur hinteren Pupille des Mikroskopobjektivs. Weil die Position der hinteren Objektivpupille variiert, sind die Pupillenebenen in der Regel nur für ein Objektiv exakt optisch konjugiert zur hinteren Objektivpupille. Für die anderen Objektive sind die Pupillenebenen näherungsweise optisch konjugiert zur hinteren Objektivpupille.
Für die Verwirklichung der Erfindung kommt es im Hinblick auf die relative Lage der einzelnen Pupillenebene zueinander grundsätzlich nur darauf an, dass diese Pupillenebenen jeweils ineinander abgebildet werden und demgemäß zueinander optisch konjugiert sind. Die Reihenfolge der Pupillenebenen im Strahlengang ist deshalb grundsätzlich beliebig. Vorteilhafte Varianten der erfindungsgemäßen optischen Anordnung sind dadurch gekennzeichnet, dass, bezogen auf die Anregungsstrahlung und die Manipulationsstrahlung, die zweite Pupillenebene strahlaufwärts von der ersten Pupillenebene, die dritte Pupillenebene strahlaufwärts von der zweiten Pupillenebene, und die vierte Pupillenebene strahlaufwärts von der dritten Pupillenebene liegt.
Grundsätzlich können mit der erfindungsgemäßen Anordnung beliebig viele Pupillen erzeugt werden. Wichtige Anwendungen profitieren aber bereits von vier aufeinander abgebildeten Pupillen bei überschaubarem Justageaufwand und geringen optischen Verlusten.
Die Scanoptik, also die erste fokussierende Einrichtung, besteht in der Regel aus einer Anordnung von Linsen, durch die eine zur hinteren Objektivpupille äquivalente erste Pupillenebene generiert wird.
Wenn im Rahmen der vorliegenden Beschreibung von Koordinatenrichtungen die Rede ist, ist dabei insbesondere an kartesische Koordinaten gedacht. Beispielsweise kann die erste Koordinatenrichtung die y-Richtung und die zweite Koordinatenrichtung kann die x-Richtung sein. Häufig wird ein Koordinatensystem so gewählt, dass die optische Achse eines Systems mit der z-Achse zusammenfällt.
Als erste, zweite, dritte und vierte fokussierende Einrichtung zum Generieren einer Pupillenebene können prinzipiell beliebige fokussierende Komponenten, insbesondere auch Linsen oder Linsengruppen, zum Einsatz kommen. Besonders bevorzugt werden als zweite und/oder dritte fokussierende Einrichtung Hohlspiegel, insbeson- dere torische oder sphärische Hohlspiegel, verwendet. Die vierte fokussierende Einrichtung kann vorteilhaft eine Linse oder eine Linsengruppe sein.
Dabei kann es insbesondere von Vorteil sein, wenn der optische Weg über den ersten Hohlspiegel so ausgelegt wird, dass eine Vergrößerung (|V| > 1 ) oder eine Ver- kleinerung (|V| < 1 ) erzielt wird. Das ist insbesondere dann von Vorteil, wenn verschiedene Scanner miteinander kombiniert werden sollen. Beispielsweise ist bekannt, dass resonante MEMS-Scanner nur bestimmte Durchmesser erreichen können, wenn Resonanzfrequenz und dynamische Spiegeldeformation gegeben sind. Andererseits gibt es eine optimale Größe für quasistatische Galvanometerscanner, die nicht mit der Größe des resonanten MEMS-Scanners zusammenfällt. Für eine optimale optische Vereinigung beider Scannersysteme kann eine Anpassung der Pupillendurchmesser über eine Vergrößerungsstufe sehr sinnvoll sein. In gewissen Grenzen können hier Abweichungen von einer 1 :1 Abbildung zugelassen werden, womit optional verschieden große Scanner in den jeweiligen Positionen stehen kön- nen.
Für die zweite und die dritte Strahlumlenkeinrichtung kommt es darauf an, dass die Strahlung definiert umgelenkt wird. Besonders bevorzugte Varianten zeichnen sich dadurch aus, dass die zweite Strahlumlenkeinrichtung in der zweiten Pupillenebene ein zweiter Scanner ist zum Scannen der Anregungsstrahlung und/oder der Manipu- lationsstrahlung in einer von der ersten Koordinatenrichtung verschiedenen zweiten Koordinatenrichtung und/oder dass die dritte Strahlumlenkeinrichtung in der dritten Pupillenebene ein dritter Scanner ist zum Scannen der Anregungsstrahlung und/oder der Manipulationsstrahlung in einer von der ersten Koordinatenrichtung verschiedenen zweiten Koordinatenrichtung. Die erfindungsgemäße optische Anordnung zeichnet sich durch eine große Flexibilität aus. Beispielsweise können die zweite Strahlumlenkeinrichtung in der zweiten Pupillenebene und/oder die dritte Strahlumlenkeinrichtung in der dritten Pupillenebene auch ein feststehender Spiegel, ein Spiegel, dessen Oberfläche aktiv gekrümmt werden kann, oder ein anderes wellenfrontveränderndes Element sein. Mit einem Spiegel, dessen Oberfläche aktiv gekrümmt werden kann, kann durch Variation der
Fokussierung ein Scannen in z-Richtung durchgeführt werden. Solch ein Spiegel ist in der Regel zunächst flach und kann dann, beispielsweise zu einem Hohlspiegel, deformiert werden.
Beispielsweise kann mit einem wellenfrontveränderndem Element die Fokussierung entlang der optischen Achse, beispielsweise in z-Richtung, verändert werden und in diesem Sinn kann ein z-Scan durchgeführt werden. Darüber hinaus können mit einem solchen Element Aberrationen aufgrund von Brechungsindexfehlanpassungen bei erhöhter Eindringtiefe in der Probe kompensiert werden.
Als Scanner, beispielsweise erster, zweiter und dritter Scanner, werden im Rahmen der vorliegenden Beschreibung Einrichtungen verstanden, mit denen ein Strahl min- destens in einer Koordinatenrichtung in seiner Richtung verändert werden kann. Besonders bevorzugt kommen als Scanner schwenkbare Spiegel zum Einsatz.
Grundsätzlich kommt es für die verwendeten Scanner nur darauf an, dass eine Strahlablenkung in der jeweiligen Koordinatenrichtung mit der gewünschten Geschwindigkeit und Genauigkeit durchgeführt wird. Besonders bevorzugt ist der zweite Scanner ein Resonanzscanner und der dritte Scanner ein quasistatischer Scanner. Besonders vorteilhaft wirkt sich dabei aus, dass der zweite Scanner, also der schnelle Resonanzscanner, im Fall des zweiten Strahlwegs umgangen wird, mit anderen Worten also nicht mehr wirksam ist. Das bedeutet, dass der schnelle zweite Scanner sehr rasch weggeschaltet werden kann. Grundsätzlich sind der zweite und der dritte Scanner austauschbar, d.h. es kann auch zweckmäßig sein, wenn dritte Scanner ein Resonanzscanner und der zweite Scanner ein quasistatischer Scanner ist. Beide Varianten können in bestimmten Situationen vorteilhaft sein. Beide Varianten ermöglichen, dass sehr rasch zwischen einem bildgebenden Modus, bei dem der schnelle Scanner zum Einsatz kommt, und einem Anregungsmodus, der mithilfe des langsa- men quasistatischen Scanners durchgeführt wird, hin und her geschaltet werden kann.
Als quasistatischer Scanner wird ein Scanner bezeichnet, der nicht resonant sondern, vergleichsweise langsam, quasistatisch, betrieben wird. Insbesondere kann einem quasistatischen Scanner eine Ansteuerkurve aufgeprägt werden. Diese kann beispielsweise linearisiert sein, so dass jedem Pixel die gleiche Aufenthaltsdauer zu- gewiesen werden kann. Resonante Scanner erlauben nur Sinus-artige Bewegungen, die aber deutlich hochfrequenter sein können. Ein resonanter Scanner oder Resonanzscanner wird, in der Regel vergleichsweise viel schneller als ein quasistatischer Scanner, in einer mechanischen Resonanz betrieben. Sowohl der quasistatische als auch der resonant betriebene Scanner können verwirklicht sein durch einen galvanometrischen Scanner oder einen MEMS-Scanner.
Prinzipiell können für die Strahlablenkungseinrichtungen, insbesondere die Scanner, auch akustooptische Einrichtungen, insbesondere akustooptische Scanner, zum Einsatz kommen. Da es für einen bildgebenden Modus im allgemeinen ausreicht, wenn für eine Koordinatenrichtung ein schneller Scanner zur Verfügung steht, kann bei einer weiteren vorteilhaften Variante der erste Scanner ebenfalls ein vergleichsweise langsamer Scanner und insbesondere ein quasistatischer Scanner sein.
Es ist aber auch möglich, in jeder der Pupillen einen resonanten Scanner zu platzie- ren, wobei die Schwingungsachsen so gebildet sind, dass die gerasterten Linien in der Probe vorteilhaft, aber nicht zwingend, einen Winkel von 90° bilden. Somit kann zwar das Bildfeld nicht kontinuierlich gedreht werden. Aber es ist in gewissen Grenzen eine Anpassung an eine Probengeometrie möglich. Allerdings erfordert dieser Modus, dass die Optiken, insbesondere die Hohlspiegel, ein genügend großes Feld übertragen.
Schließlich erlaubt die erfindungsgemäße optische Anordnung auch, den durch den resonanten Scanner gerasterten Bereich mit dem quasistatischen Galvoscanner in der Probenebene zu verschieben (sogenanntes "panning"). Somit ist es möglich, verschiedene interessierende Bereiche ("regions of interest", ROI) abbildende zu er- fassen und zwischen diesen verschiedenen "regions of interest" zu springen.
In der ersten Pupillenebene, die der Scanoptik räumlich am Nächsten liegt, kann grundsätzlich auch ein zweidimensionaler Scanner, z.B. ein zweidimensionaler MEMS-Scanner mit einem einzigen Schwenkpunkt, angeordnet werden. Bei dem ersten Strahlumlenkmittel kommt es grundsätzlich darauf an, dass dieses so im Strahlengang positioniert ist, dass die von der dritten fokussierenden Einrichtung, insbesondere dem zweiten Hohlspiegel, kommende Strahlung unter Umgehung der zweiten Strahlumlenkeinrichtung, insbesondere des zweiten Scanners, in Richtung der zweiten fokussierenden Einrichtung, insbesondere dem ersten Hohlspiegel, weitergeleitet wird. Dieses kann bei einer einfachen Variante durch einen fest positionierten Spiegel oder mehrere fest positionierte Spiegel geeigneter Größe erreicht werden.
Grundsätzlich ist aber auch möglich, dass die elektromagnetische Strahlung in Ab- hängigkeit eines variierbaren Parameters, insbesondere Wellenlänge und/oder Polarisation, reflektiert oder transmittiert wird. Unter diesem Gesichtspunkt kann das erste Strahlumlenkmittel auch ein dielektrischer und/oder dichroitischer Spiegel sein.
Mit dem Begriff eines variablen zweiten Strahlumlenkmittels wird eine Komponente bezeichnet, die irgendeine Art von Verstellung oder Einstellung zulässt und abhängig von dieser Verstellung oder Einstellung einfallendes Licht oder einfallende Strahlung unterschiedlich umlenkt. Insbesondere ist dabei an variabel einstellbare Spiegel gedacht.
Mit dem Umschalten eines optischen Strahlengangs zwischen einem ersten Strahlweg und einem zweiten Strahlweg ist gemeint, dass je nach Schaltzustand das Licht oder die Strahlung entweder den ersten Strahlweg oder den zweiten Strahlweg durchläuft. Der erste und der zweite Strahlweg sind dabei verschieden, das heißt, es gibt Teile des ersten Strahlwegs, die nicht Teil des zweiten Strahlwegs sind und umgekehrt.
Mit dem Merkmal, dass die zweite Strahlumlenkeinrichtung, insbesondere also der zweite Scanner, beim zweiten Strahlweg umgangen wird, soll zum Ausdruck gebracht werden, dass Anregungs- und/oder Manipulationsstrahlung, welche den zweiten Strahlweg nimmt, mit der zweiten Strahlumlenkeinrichtung, beispielsweise mit dem zweiten Scanner, nicht in Kontakt kommt. Eine mögliche Bewegung dieses zweiten Scanners hat demnach keinen Einfluss auf die Anregungs- und/oder Mani- pulationsstrahlung. Die vorliegende Erfindung eignet sich besonders für die konfokale Laser-Scanning- Fluoreszenz-Mikroskopie. Ein Mikroskopobjektiv dient dabei sowohl zum Leiten und Fokussieren von Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung auf eine Probe oder in einen Bereich einer Probe als auch zum Leiten und Kollimieren von Detek- tionslicht, welches von dem mit Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung beleuchteten Bereich der Probe stammt, zurück in Richtung des Hauptfarbteilers.
Mit dem Begriff des Detektionsmoduls wird im Rahmen der vorliegenden Beschreibung diejenige Komponente bezeichnet, mit welcher das von einer beleuchteten Probe abgestrahltes Detektionslicht letzten Endes nachgewiesen wird. Ein solches Detektionsmodul weist insbesondere mindestens einen Strahlungsdetektor auf und kann, je nach Einsatzzweck, insbesondere Farbfilter und konfokale Blenden aufweisen.
Als ein Kerngedanke der vorliegenden Erfindung kann angesehen werden, mit ge- eigneten fokussierenden Mitteln, insbesondere einem Hohlspiegel, eine weitere Pupillenebene zu schaffen, in der insbesondere ein weiterer, nämlich ein dritter, Scanner angeordnet werden kann. Ein weiterer grundlegender Gedanke einer Variante der Erfindung besteht sodann darin, mithilfe eines variablen Strahlumlenkmittels den Strahl der Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung entweder über einen ersten Strahlweg, der die zweite Strahlumlenkeinrichtung, insbesondere den zweiten Scanner, und die dritte Strahlumlenkeinrichtung, insbesondere den dritten Scanner, enthält, oder über einen zweiten Strahlweg zu leiten, der die dritte Strahlumlenkeinrichtung, enthält, die zweite Strahlumlenkeinrichtung aber umgeht. Besondere Vorteile können nun erzielt werden, wenn der genannte erste Scanner für die bestimmte Koordinatenrichtung und der zweite Scanner für diese Koordinatenrichtung qualitativ unterschiedlich sind, wenn insbesondere der zweite Scanner ein Resonanzscanner ist und der dritte Scanner ein quasistatischer Scanner ist. Mithilfe des variablen Strahlumlenkmittels kann so der schnelle Scanner entweder, nämlich bei dem ersten Strahlweg, zugeschaltet oder, nämlich bei dem zweiten Strahlweg, weggeschaltet werden. Weil solch ein Schalten des Strahlwegs prinzipiell äußerst schnell (in der
Größenordnung von 1 ms und darunter) verwirklicht werden kann, kann auch zwi- sehen den beiden Strahlwegen und damit zwischen einem bildgebenden Modus und einem Manipulationsmodus äußerst rasch geschaltet werden.
Die erfindungsgemäße Anordnung ist überaus mächtig und kann zur Lösung verschiedener Probleme eingesetzt werden. Die erfindungsgemäße optische Anordnung ist insbesondere geeignet für den Einsatz in einem konfokalen Laser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskop. Das erfindungsgemäße Laser-Scanning-Mikroskop kann also besonders bevorzugt ein, insbesondere konfokales, Laser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskop sein.
Die erfindungsgemäße optische Anordnung und das erfindungsgemäße Laser- Scanning-Mikroskop können bevorzugt für eine Manipulation biologischer Proben, insbesondere in drei Dimensionen, genutzt werden. Allerdings sind auch Anwendungen in der Materialmikroskopie denkbar.
Die erfindungsgemäße Anordnung ist auch für die optische Manipulation, die Laser- Scanning-Mikroskopie, die Lichtblattmikroskopie sowie für andere Verfahren einsetz- bar, bei welcher eine Probe mittels eines Laserstrahls gerastert wird.
Ein wesentlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass es möglich wird, in einem Laser-Scanning-Mikroskop einerseits eine Bildgebung oder eine optische Manipulation mit quasistatischen galvanischen Scannern, die auch als Gal- voscanner bezeichnet werden, und andererseits eine schnelle Bildgebung mittels resonanter Scanner durchzuführen.
Insbesondere ermöglicht die Erfindung, dass sehr schnell zwischen einem Manipulationsmodus und einer Bildgebung geschaltet werden kann. Insbesondere soll dieses möglich sein, ohne zusätzlich bewegte Teile zu Strahlwegumschaltung in den Strahlengang schalten zu müssen, weil das häufig zu Instabilitäten und weiteren techni- sehen Problemen führt. Sehr schnell heißt hierbei, dass die Umschaltung im Bereich weniger Millisekunden (ms) erfolgen kann. Weiterhin ist auch eine dreidimensionale optische Manipulation, beispielsweise ein gezieltes räumliches Ausbleichen (Stichworte: FRAP; uncageing) oder ein optogenetisches Schalten von lonenkanälen usw. und ein anschließendes Umschalten auf eine gegebenenfalls sehr schnelle Bildge- bung möglich. Für eine dreidimensionale optische Manipulation wird eine Möglichkeit für die Beeinflussung der drei räumlichen Freiheitsgrade benötigt, insbesondere werden drei optische Elemente benötigt. Für das Scannen in der Ebene sind quasistatische Galvoscanner besonders vorteilhaft, da diese definiert räumliche Bereiche in 5 einer gegebenen Zeit belichten und damit die notwendigen Lichtenergiemengen, die auch als Lichtdosen bezeichnet werden, deponieren können. Die dritte Dimension kann zum Beispiel über einen dynamischen wellenfrontkrümmenden und damit eine axiale Fokuslage ändernden Spiegel adressiert werden. Solche Komponenten werden auch als defokussierende oder z-scannende Spiegel bezeichnet. Diese Elemen- 10 te können sich aufgrund ihrer geometrischen Dimension sehr gut mit optischen Spiegelscannern ergänzen. Die Bewegung eines Fokalvolumens in Richtung der z- Koordinate erfolgt also durch Beeinflussung der Wellenfront bei gegebener Strahlrichtung (z-Richtung) im grundlegenden Unterschied zu lateralen Scanbewegungen, bei denen die Strahlrichtung über auslenkbare Spiegel verstellt wird. Bei dieser Verl s Stellung können mit bestimmten Spiegeln gleichzeitig optische Aberrationen korrigiert werden. Tut man dies, um Einflüsse der Probe auf die optische Qualität der Bildgebung zu kompensieren, so kann man auch von einer adaptiven Korrektur sprechen.
Auch unter der Randbedingung, dass Bildgebung und Manipulation durch dieselbe Scanlinse erfolgen soll, lässt sich die vorliegende Erfindung vorteilhaft einsetzen. 20 Dabei wird am Mikroskopstativ nur ein Port belegt.
Besondere Herausforderungen ergeben sich für die oben beschriebenen Aufgaben, wenn die Wellenlängen für die Manipulation und die Bildgebung identisch sein sollen. Für den Fall, der auch praktische Relevanz hat, dass beide Wellenlängen unterschiedlich sind, können Farbteiler verwendet werden. Die vorliegende Erfindung
25 zeichnet sich dadurch aus, dass sie grundsätzlich mit einer Vielzahl von Wellenlängenkombinationen verwirklicht werden kann. Dabei sind zwischen den Scannern weitere bewegliche Elemente, die ein- oder ausgeschaltet werden müssen, oder in den Strahlengang eingebracht werden müssen, nicht unbedingt notwendig.
Die erfindungsgemäße Anordnung kann insbesondere auch für die Lasermaterialbe-
30 arbeitung eingesetzt werden, bei welcher eine Probe mit einem Laserstrahl gerastert wird. Insbesondere ist dabei eine schnelle Umschaltung zwischen verschiedenen Modi und insbesondere zwischen optische Manipulation und Bildgebung über Laser- Scanning-Mikroskopie möglich. Dabei können grundsätzlich beliebige Kombinationen der Wellenlänge der Manipulationsstrahlung einerseits und der Anregungsstrahlung andererseits zum Einsatz kommen. xy/z-scannende Systeme sind neben der optischen Manipulation auch sehr gut dazu geeignet, beliebige Trajektorien und Ebenen in einer dreidimensionalen Probe bildgebend abzuscannen. Das ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn man definierte Strukturen innerhalb eines Volumens, insbesondere mit Mehrphotonenanregung, schnell abbilden möchte. Beispielsweise kann ein Neuron, welches einem irregulären Verlauf in einem dreidimensionalen Volumen folgt, abgebildet werden. Wenn dieses Neuron sehr schnell abgebildet oder die Signaltransduktion, z.B. Ca(2+)-Wellen, entlang dieses Neurons optisch vermessen werden soll, ist die erfindungsgemäße optische Anordnung in der Lage, dieses im Volumen verlaufende Gebilde zu verfolgen.
Die vorliegende Erfindung kann auch nutzbringend bei der sogenannten Lichtblatt- mikroskopie zum Einsatz kommen. Dabei handelt es sich um eine alte Technologie, die von Zsigmondy und Siedentopf 1902/1903 bei Carl Zeiss für die Kolloidforschung entwickelt wurde. Nachdem die Methode lange Zeit nahezu in Vergessenheit geraten war, erlebte sie durch neue Arbeiten von E. Stelzer eine Renaissance. Dies wurde insbesondere durch den großen Fortschritt in der Verarbeitung digitaler Daten stimu- liert.
In der Lichtblattmikroskopie besteht, zumindest in der Ausführungsform, die nicht auf einer Beleuchtung mit einer Zylinderlinse beruht, ebenfalls die Aufgabe, eine Probe mit einem Laserstrahl abzuscannen. Auch hier sind mehrere Pupillen besonders vorteilhaft, weil neben dem Scannen des Strahls in zwei Dimensionen noch dynamische Strahlformungen durchgeführt werden sollen, siehe zum Beispiel Dean et al.: Decon- volution-free subcellular imaging with axially swept light sheet microscopy, Biophysic. J., Vol. 108, 2807-2815 (2015)). Die erfindungsgemäße optische Anordnung und das erfindungsgemäße Laser-Scanning-Mikroskop können auch hier sehr vorteilhaft eingesetzt werden. Die erfindungsgemäße optische Anordnung kann außerdem sowohl für eine lineare Fluoreszenzanregung als auch für eine nichtlineare Fluoreszenzanregung, beispielsweise zur Mehrphotonenmikroskopie, genutzt werden. Es sind alle gängigen und bekannten Verfahren mit der Anordnung möglich (2-, 3- oder Mehrphotonenfluo- reszenz; CARS, SRS usw.). Die Zweiphotonenmikroskopie ist heute eine Standardmethode zur Untersuchung lebender Proben. Insbesondere im sogenannten Neuro- Imaging spielen dreidimensionale Manipulationen der Probe eine wesentliche Rolle beim Verständnis neurobiologischer Vorgänge im Hirn lebender Tiere.
Die Erfindung wird grundsätzlich verwirklicht, wenn zwischen einem ersten Strahlweg und einem zweiten Strahlweg umgeschaltet werden kann und der erste Strahlweg von dem variablen zweiten Strahlumlenkmittel über die dritte Strahlumlenkeinrichtung und die zweite Strahlumlenkeinrichtung zu dem ersten Scanner verläuft und der zweite Strahlweg mindestens von dem variablen zweiten Strahlumlenkmittel über die dritte Strahlumlenkeinrichtung unter Umgehung der zweiten Strahlumlenkeinrichtung über das erste Strahlumlenkmittel zu dem ersten Scanner verläuft. Konkrete Varianten der erfindungsgemäßen optischen Anordnung sind dadurch gekennzeichnet, dass der erste Strahlweg mindestens von dem variablen zweiten Strahlumlenkmittel über die vierte fokussierende Einrichtung, die dritte Strahlumlenkeinrichtung, die dritte fokussierende Einrichtung, die zweite Strahlumlenkeinrichtung und die zweite fo- kussierende Einrichtung zu dem ersten Scanner verläuft und dass der zweite Strahlweg mindestens von dem variablen zweiten Strahlumlenkmittel über die vierte fokussierende Einrichtung, die dritte Strahlumlenkeinrichtung, die dritte fokussierende Einrichtung unter Umgehung der zweiten Strahlumlenkeinrichtung über das erste Strahlumlenkmittel und die zweite fokussierende Einrichtung zu dem ersten Scanner verläuft.
Für das variable zweite Strahlumlenkmittel, das zum Umschalten zwischen dem ersten Strahlweg und dem zweiten Strahlweg dient, kommt es prinzipiell nur darauf an, dass das gewünschte Umschalten hinreichend rasch möglich ist. Bei besonders bevorzugten Varianten weist das variable Strahlumlenkmittel einen variabel positionier- baren Spiegel auf. Besonders zweckmäßig werden dabei sehr leichte Spiegel verwendet, um die zu bewegenden Massen und damit die auftretenden und notwendi- gen Kräfte klein zu halten. Die variable Positionierbarkeit des Spiegels erlaubt grundsätzlich vielfältige technische Ausgestaltungen.
Bei vergleichsweise unaufwändige Varianten, die sich außerdem durch mechanisch günstige Eigenschaften auszeichnen, ist der Spiegel ein Drehspiegel mit einer, ins- besondere galvanometrischen, Dreheinrichtung. Dieser Drehspiegel reflektiert in einer ersten Drehposition, in welcher der erste Strahlweg ausgewählt ist, einfallende Strahlung anders als in einer von der ersten Drehposition verschiedenen zweiten Drehposition, in welcher der zweite Strahlweg ausgewählt ist. Besonders vorteilhaft ist die Dreheinrichtung eine galvanometrische Dreheinrichtung. Diese können mit vergleichsweise geringen Massenträgheitsmomenten verwirklicht werden.
Für den Spiegel an sich kommt es grundsätzlich nur darauf an, dass die Anregungsund/oder Manipulationsstrahlung hinreichend effektiv reflektiert wird. Wenn für unterschiedliche Wellenlängen unterschiedliche Eigenschaften erzielt werden sollen, kann es von Vorteil sein, wenn das erste Strahlumlenkmittel und/oder das variable zweite Strahlumlenkmittel einen dielektrischen Spiegel aufweist.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsvariante der erfindungsgemäßen optischen Anordnung zeichnet sich dadurch aus, dass das variable zweite Strahlumlenkmittel einen wellenlängenabhängigen und polarisationsabhängigen dielektrischen und/oder dichroitischen Spiegel aufweist, wobei dieser Spiegel Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung mit einer ersten Wellenläge und einem ersten Polarisationszustand transmittiert, Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung mit der ersten Wellenläge und einem zweiten Polarisationszustand, der von dem ersten Polarisationszustand verschieden ist, reflektiert und von einer Probe ausgesandtes Fluoreszenzlicht mit einer rotverschobenen Wellenlänge unabhängig von dessen Polari- sationszustand transmittiert oder reflektiert.
Beispielsweise kann dabei der erste Polarisationszustand bezogen auf den dielektrischen und/oder dichroitischen Spiegel s-Polarisation und der zweite Polarisationszustand bezogen auf den dielektrischen und/oder dichroitischen Spiegel p-Polarisation sein. Auch die umgekehrte Zuordnung ist möglich. Dabei wäre der erste Polarisati- onszustand bezogen auf den Spiegel p-Polarisation und der zweite Polarisationszustand bezogen auf den Spiegel s-Polarisation.
Die Anordnung eines solchen dielektrischen und/oder dichroitischen Spiegel im Strahlengang ermöglicht in vorteilhafter Weise das Umschalten zwischen dem ersten Strahlweg und dem zweiten Strahlweg der Anregungsstrahlung und/oder der Manipulationsstrahlung durch Umschalten zwischen s- und p-Polarisation. Hierzu können bei dem erfindungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskop geeignete Umschaltmittel zum Umschalten der Polarisation, beispielsweise eine Lambda-Halbe-Platte und/oder ein elektrooptischer Manipulator, vorhanden sein. Für das erste Strahlumlenkmittel kommt es im Grundsatz darauf an, dass, wie anspruchsgemäß gefordert, von der dritten fokussierenden Einrichtung, insbesondere von dem zweiten Hohlspiegel, kommende Anregungsstrahlung oder Manipulationsstrahlung in Richtung der zweiten fokussierenden Einrichtung, insbesondere zu dem ersten Hohlspiegel, umgeleitet wird. Besonders vorteilhafte Varianten der erfin- dungsgemäßen optischen Anordnung sind dadurch gekennzeichnet, dass das erste Strahlumlenkmittel mindestens einen fest positionierten Spiegel, insbesondere genau zwei fest positionierte Spiegel aufweist.
Grundsätzlich kommt es beim Umschalten der Strahlwege nur darauf an, dass die zweite Strahlumlenkeinrichtung, insbesondere der zweite Scanner, umgangen wird. Dies kann platzsparend und in geringem Bauraum verwirklicht werden bei Ausführungsvarianten, bei denen in dem zweiten Strahlweg eine alternative zweite Pupillenebene gebildet ist, die zu der ersten Pupillenebene optisch konjugiert und in der eine weitere strahlumlenkende und/oder strahlformende Komponente, die Teil des ersten Strahlumlenkmittels ist, angeordnet ist. Diese weitere strahlumlenkende und/oder strahlformende Komponente kann beispielsweise ein, insbesondere feststehender, Spiegel sein.
Die weitere Pupillenebene, nämlich die alternative zweite Pupillenebene, ermöglicht aber auch Eingriffe in die Wellenfront der Anregungsstrahlung und/oder der Manipulationsstrahlung. Unter diesen Gesichtspunkt kann es von Vorteil sein, wenn die wei- tere strahlumlenkende Komponente ein Spiegel, dessen Oberfläche aktiv gekrümmt werden kann, oder ein segmentierter Spiegel oder eine sonstige Einrichtung zum Manipulieren der Wellenfront, beispielsweise ein räumlicher Lichtmodulator, ist.
Beispielsweise kann die Wellenfront mit Elementen der in J. Biomed. Opt. 21 (12), 121507, Oct 12, 2016, siehe dort insbesondere Abbildung 2, beschriebenen Art so manipuliert werden, dass eine Umfokussierung in der Probe mit hoher Geschwindigkeit erreicht wird.
Wellenfrontverändernde Elemente dieser Art werden in der Regel über vergleichsweise aufwändige Relayoptiken in den Strahlengang eingebracht. Insbesondere für Systeme, in denen auch konfokal gemessen werden soll, führen diese Relayoptiken zu einem erheblichen und oftmals nicht akzeptablen Lichtverlust und sind darüber hinaus teuer und schwer zu justieren. Abgesehen davon ist eine schnelle Umschal- tung des Strahlwegs zwischen Manipulation und Bildgebung in der oben beschriebenen Art mit Relayoptiken kaum möglich. Auch in dieser Hinsicht bringt die erfindungsgemäße optische Anordnung erhebliche Verbesserungen. Ein weiterer Modus, der insbesondere dreidimensionale Manipulationen, wie sie zum Beispiel in der Optogenetik eingesetzt werden, unterstützt, kann durch die erfindungsgemäße Anordnung zur Verfügung gestellt werden, indem man insbesondere in der alternativen zweiten Pupillenebene ein schnelles wellenfrontfor- mendes Element einbringt. Solche Elemente werden zum Beispiel von der Firma Re- vibro Optics (Bozeman, MT 59717) angeboten. Natürlich sind hier auch alternative Bauteile möglich, die eine gewünschte Funktion zur Verfügung stellen, hierfür aber eine optische Pupillenebene benötigen. Mit dem schnell verstellbaren z-scan- Element, das auch als adaptiv defokussierendes Element bezeichnet werden kann, kann in Kombination mit den quasistatischen Scannern eine optische Manipulation oder eine Bildgebung in einem dreidimensionalen Volumen erfolgen.
Bei einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsvariante der erfindungsgemäßen optischen Anordnung ist eine Steuereinheit vorhanden zum aufeinander abgestimmten Ansteuern des ersten Scanners, der zweiten Strahlumlenkeinrichtung, der dritten Strahlumlenkeinrichtung und/oder des variablen zweiten Strahlumlenkmit- tels. Bei dieser Steuereinheit kann es sich besonders bevorzugt um einen PC, grundsätzlich aber auch um andere, insbesondere programmierbare, Komponenten wie MikroController handeln.
Besonders vorteilhaft kann die Steuereinheit dazu eingerichtet sein, den ersten Scanner, die zweite Strahlumlenkeinrichtung, die dritte Strahlumlenkeinrichtung und/oder das variable zweite Strahlumlenkmittel dergestalt aufeinander abgestimmt anzusteuern, dass unabhängig davon, ob der erste oder der zweite Strahlweg durchlaufen wird, dieselben Probenorte mit Anregungsstrahlung oder Manipulationsstrahlung beaufschlagt werden. Insbesondere ist eine Ausführungsvariante bevorzugt, bei der in Abhängigkeit einer Stellung des variablen zweiten Strahlumlenkmittels der erste Scanner so nachgeführt wird, dass unabhängig davon, ob der erste Strahlweg o- der der zweite Strahlweg durchlaufen wird, derselbe Ort auf der Probe mit Anregungslicht oder Manipulationslicht beaufschlagt wird.
Darüber hinaus kann die Steuereinheit dazu dienen, weitere Komponenten der erfin- dungsgemäßen optischen Anordnung anzusteuern, beispielsweise eine Einrichtung zum Umschalten oder Drehen der Polarisation und/oder eine Einrichtung zum Manipulieren der Wellenfront, wie einen segmentierten Spiegel oder einen Spiegel, dessen Oberfläche aktiv gekrümmt werden kann.
Bei besonders vorteilhaften Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Laser- Scanning-Mikroskops ist eine Einrichtung zur Multipunktbeleuchtung mit einer Mehrzahl von Beleuchtungskanälen vorhanden.
Beispielsweise kann die Einrichtung zur Multipunktbeleuchtung zur Steuerung der einzelnen Beleuchtungskanäle einen mehrkanaligen AOTF aufweisen. Damit können die einzelnen Beleuchtungskanäle grundsätzlich beliebig im Hinblick auf Wellenlänge und Intensität der Strahlung eingestellt werden.
Bei einer besonders bevorzugten Variante wird einer der Beleuchtungskanäle zur Anregung und/oder zur Manipulation einer Probe verwendet und die weiteren Beleuchtungskanäle werden zur Bildgebung verwendet. Hierzu sind Varianten des erfindungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskops besonders bevorzugt, bei denen für mindestens einen der Beleuchtungskanäle eine Einrichtung zur Manipulation, insbesondere Umschalten und/oder Drehen, der Polarisation, insbesondere ein Lambda-Halbe-Plättchen und/oder ein elektrooptischer Mani- pulator, vorhanden ist. Mit dieser Einrichtung zur Manipulation, also zum Umschalten, der Polarisation kann der Strahlengang für mindestens einen Beleuchtungskanal zwischen dem ersten Strahlweg und dem zweiten Strahlweg hin und her geschaltet werden.
Ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist außerdem, dass sie grundsätz- lieh bei verschiedenen Mikroskoptechniken zum Einsatz kommen kann.
Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Laser-Scanning-Mikroskop zur Kon- trastgebung auf Grundlage mindestens eines nichtlinearen Kontrastprinzips eingerichtet sein. Insbesondere kann es sich bei dem nichtlinearen Kontrastprinzip um eine Mehr-photonenfluoreszenz, beispielsweise 2- oder 3-Photonen-Fluoreszenz, um CARS (ko-härente Anti-Stokes Raman Streuung) oder um SRS (stimulierte Raman Streuung) handeln. Besonders bevorzugt ist das erfindungsgemäße Mikroskop ein Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop.
Besonders bevorzugt kann das erfindungsgemäße Mikroskop auch ein konfokales Mikroskop, insbesondere ein konfokales Laser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskop, sein. Als konfokal wird ein Mikroskop bezeichnet, wenn in einer zur Bildebene konjugierten Ebene ein Pinhole vorhanden ist.
Wegen der Konzentration des Anregungsvolumens durch die Nichtlinearität der Mehr-Photonen-Fluoreszenz ist bei einem Mehr-Photonen-Scanning-Mikroskop oder Mehr-Photonen-Fluoreszenz-Scanning-Mikroskop eine solche konfokale Blende nicht unbedingt notwendig.
Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung werden im Folgenden unter Bezug auf die schematischen Figuren erläutert. Hierin zeigen:
Figur 1 : ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen optischen
Anordnung; Figur 2: ein Detail des Ausführungsbeispiels aus Figur 1 ;
Figur 3: das Detail aus Figur 2 in einer alternativen Betriebsstellung und
Figur 4: eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Laser- Scanning-Mikroskops. Gleiche und gleichwirkende Komponenten sind in allen Figuren in der Regel mit denselben Bezugszeichen gekennzeichnet.
Beispielhaft wird im Folgenden der Fall betrachtet, dass mittels quasistatischer Scanner eine räumlich gezielte Manipulation in einer Probe vorgenommen wird. Danach soll sehr schnell auf eine Bildgebung umgeschaltet werden. Hier wird zugrunde gelegt, dass man Bilder einer bestimmten Größe mit einer sogenannten Videorate aufnehmen möchte. Bei Laser-Scanning-Mikroskopen ist dies zum Beispiel mit sogenannten Resonanzscannern möglich. Für das nachfolgende Beispiel aus Figur 1 wird weiterhin angenommen, dass sowohl die optische Manipulation als auch die Anregung der Fluoreszenz für die Bildgebung mit einer Laserlinie bei 488 nm realisiert wird, da dies ein häufig auftretender Anwendungsfall ist.
Das Problem wird durch eine erfindungsgemäße optische Anordnung SM zum Scannen von Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung in einem Laser- Scanning-Mikroskop, insbesondere einem Laser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskop, gelöst, wie sie in Figur 1 dargestellt ist. Hierbei sind drei Scanner S1 , S2 und S3 in einer Reihe hintereinander angeordnet, wobei durch eine Abbildung aller Scanner aufeinander erreicht wird, dass alle Scanner in einer optischen Pupille stehen. Dies ist ein wesentlicher Punkt, da hierdurch garantiert wird, dass die Pupille stationär bleibt und ein Bildfeld homogen, d.h. mit einem sehr geringen sogenannten Randlichtabfall, aufgenommen wird. Die optische Anordnung SM weist als wesentliche Komponente zunächst als erste fokussierende Einrichtung eine Scanoptik SO zum Bereitstellen einer ersten Pupillenebene P1 auf. Diese erste Pupillenebene P1 ist in einem Betriebszustand, also in einem Zustand, in dem die optische Anordnung SM mit einem Laser-Scanning- Mikroskop zusammenwirkt oder in dieses Mikroskop eingebaut ist, zu einer hinteren Objektivpupille P des Mikroskopobjektivs (MO) optisch konjugiert (siehe Figur 4). In dieser ersten Pupillenebene P1 ist ein erster Scanner S1 als erste Strahlumlenkeinnchtung angeordnet, der zum Scannen von Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung 10 in einer ersten Koordinatenrichtung y dient. Bei dem Scanner S1 kann es sich beispielsweise um einen quasistatischen, insbesondere um einen galvanometrischen, Scanner handeln. Der schematisch gezeigte Scannerspiegel S1 wird im Betrieb dabei um eine in Figur 1 vertikal, das heißt parallel zur x-Achse liegende Achse hin und her geschwenkt.
Sodann ist eine zweite fokussierende Einrichtung vorhanden, bei der es sich im ge- zeigten Beispiel um einen ersten Hohlspiegel H1 handelt. Dieser erste Hohlspiegel H1 dient zum Bereitstellen einer zweiten Pupillenebene P2, die zu der ersten Pupillenebene P1 optisch konjugiert ist. In der zweiten Pupillenebene P2 ist als zweite Strahlumlenkeinrichtung ein zweiter Scanner S2 angeordnet, der zum Scannen der Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung in einer von der ersten Koordi- natenrichtung y verschiedenen zweiten Koordinatenrichtung x dient. Das in Figur 1 schematisch dargestellte xyz-Koordinatensystem ist ein kartesisches Koordinatensystem, d.h. die erste Koordinatenrichtung y ist senkrecht zu der zweiten Koordinatenrichtung x. Die Richtung der optischen Achse 12 verläuft im Bereich zwischen einer Zwischenbildebene ZB und der Scanoptik SO parallel zur z-Achse. Der zweite Scanner S2 kann beispielsweise einen Resonanz-Scanner sein. Der in Figur 1 schematisch gezeigte Scannerspiegel S2 wird im Betrieb um eine parallel zur z- Richtung orientierte Achse hin und her geschwenkt. Diese Orientierung der Rotationsachse ist aber keinesfalls unbedingt notwendig. Die Orientierung hängt generell davon ab, unter welchem Winkel der erste Scanner S1 betrieben wird. Besonders bevorzugt liegen die Drehachsen der Scanner S2 und S3 in einer Ebene, welche die optische Achse des Scanobjektivs enthält und deren Flächennormale parallel zur Drehachse des Scanners S1 ist. Hierbei kann die Achse des Scanners S2 zum Beispiel parallel zur optischen Achse des Scanobjektivs sein. Abweichungen von diesen Geometrien sind aber grundsätzlich möglich und stellen ebenso Ausfüh- rungsvarianten der hier beschriebenen Erfindung dar. Weiterhin ist eine dritte fokussierende Einrichtung vorhanden, bei der es sich im gezeigten Beispiel um einen zweiten Hohlspiegel H2 handelt. Der zweite Hohlspiegel H2 dient zum Erzeugen einer dritten Pupillenebene P3, die zu der ersten Pupillenebene P1 und der zweiten Pupillenebene P2 optisch konjugiert ist. In dieser drit- ten Pupillenebene P3 ist als dritte Strahlumlenkeinrichtung ein dritter Scanner S3 angeordnet, der zum Scannen der Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung 10 ebenfalls in der zweiten Koordinatenrichtung x dient. Der dritte Scanner S3 kann, wie der erste Scanner S1 , ein quasistatischer, insbesondere ein galvanometrischer, Scanner sein. Erfindungsgemäß ist zwischen der zweiten fokussierenden Ein- richtung, also dem ersten Hohlspiegel H1 , und der zweiten Pupillenebene P2 einerseits und der zweiten Pupillenebene P2 und der dritten fokussierenden Einrichtung, also dem zweiten Hohlspiegel H2, andererseits ein erstes Strahlumlenkmittel 30 vorhanden zum Umlenken der von dem zweiten Hohlspiegel H2 kommenden Anregungsstrahlung 16 und/oder Manipulationsstrahlung 10 unter Umgehung der zweiten Strahlumlenkeinrichtung S2 in Richtung des ersten Hohlspiegels H1 .
Außerdem ist erfindungsgemäß eine vierte fokussierende Einrichtung vorhanden, die in dem in Figur 1 dargestellten Ausführungsbeispiel schematisch als Linse L4 gezeigt ist. Prinzipiell kann es sich dabei auch um einen weiteren Hohlspiegel, um eine Linsengruppe oder um eine Kombination dieser Komponenten handeln. Die vierte fo- kussierende Einrichtung L4 dient zum Erzeugen einer vierten Pupillenebene P4, die zur dritten Pupillenebene P3 und damit auch zu den vorhergehenden Pupillenebenen P1 und P2 optisch konjugiert ist. In der vierten Pupillenebene P4 ist sodann ein variables zweites Strahlumlenkmittel 20 angeordnet zum Umschalten eines optischen Strahlengangs zwischen einem ersten Strahlweg und einem zweiten Strahl- weg. Bei dem in Figur 1 dargestellten Ausführungsbeispiel ist das variable zweite Strahlumlenkmittel 20 ein Drehspiegel 22, der eine nicht dargestellte Dreheinrichtung aufweist. Die Dreheinrichtung kann z.B. durch einen galvanometrischen Scanner verwirklicht sein. Dies ist vorteilhaft, da das Massenträgheitsmoment relativ klein gehalten werden kann. Mithilfe des Drehspiegels 22 kann die Richtung der einkommenden Anregungsstrahlung 16 oder Manipulationsstrahlung 10, wie in Figur 1 schematisch gezeigt, mindes- tens zwischen zwei unterschiedlichen Richtungen verstellt werden. Durch dieses Verstellen der Richtung, mit der auf den Drehspiegel 22 einfallende Anregungsstrahlung 16 oder Manipulationsstrahlung 10 weitergeleitet wird, wird letzten Endes ein Umschalten zwischen einem ersten Strahlweg und einem zweiten Strahlweg erreicht. Im Einzelnen wird ein kollimiertes Strahlenbündel, welches auf den Drehspiegel 22 einfällt, abhängig von der Drehposition des Drehspiegels 22 in unterschiedlichen Richtungen auf die Linse L4 geleitet. Die Linse L4 fokussiert diese unterschiedlichen Strahlenbündel, wie schematisch in Figur 1 angedeutet, in voneinander beanstandete (in Figur 1 veranschaulicht durch den Doppelpfeil 13) Punkte B. Die Position der Punkte B im Strahlengang strahlabwärts von der dritten Strahlumlenkeinrichtung S3 ist in Figur 1 durch einen Pfeil angedeutet. Der erste Strahlweg verläuft dabei erfindungsgemäß mindestens von dem variablen zweiten Strahlumlenkmittel, also dem Drehspiegel 22, über den dritten Scanner S3 und den zweiten Scanner S2 zu dem ersten Scanner S1 . Der zweite Strahlweg verläuft erfindungsgemäß mindestens von dem Drehspiegel 22 über den dritten Scanner S3 unter Umgehung der zweiten Strahlumlenkeinrichtung, also des zweiten Scanners S2 über das erste Strahlumlenkmittel 30 zu dem ersten Scanner S1 . Bei dem zweiten Scanner S2 handelt es sich im gezeigten Ausführungsbeispiel um einen Resonanzscanner, also um eine sich sehr rasch bewegende Komponente. Wesentlich ist, dass der Strahlweg über den zweiten Scanner S2 und damit die Wirkung dieses zweiten Scanners S2 durch Betätigung des variablen Strahlumlenkmittels 20 deaktiviert oder abgeschaltet wird. Es wird also geschaltet zwischen den zweidimensionalen Scans mit und ohne resonanten Scanner. Um zu erreichen, dass in beiden Strahlwegen derselbe Bildpunkt adressiert werden kann, kann auch der erste Scanner S1 , insbesondere automatisiert durch eine Steuereinheit, eine Schaltung des Ablenkwinkels vornehmen. Der erste Scanner S1 gewährleistet so neben der Rasterung der Probe zum Bildaufbau auch eine Umschaltung des Strahlwegs.
Der Aufbau eines erfindungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskops wird mit Bezug auf Figur 4 erläutert. Das dort schematisch dargestellte Laser-Scanning- Mikroskop 100 weist als wesentliche Komponenten ein Lasermodul LM, einen Hauptfarbteiler HFT, eine erfindungsgemäße optische Anordnung SM zum Scannen von Anregungs- und Manipulationslicht 10, ein Mikroskopobjektiv MO und ein Detekti- onsmodul DM auf. Das Lasermodul LM dient als Strahlungsquelle für Anregungslicht 16 und Manipulationslicht 10. In dem in Figur 4 schematisch dargestellten Beispiel trifft das von dem Lasermodul LM ausgesandte Anregungslicht 16 oder Manipu- lationslicht 10 auf ein Multipunkt-Modul 40, welches den einkommenden Lichtstrahl in eine Mehrzahl von Strahlenbündeln auftrennt, die schließlich in unterschiedliche Fokalvolumina auf oder in einer Probe S fokussiert werden. Die spektrale Zusammensetzung und die Intensität kann für die einzelnen Teilstrahlen, beispielsweise mit einem mehrkanaligen AOTF, separat eingestellt werden. Das Lasermodul LM, das Multipunkt-Modul 40, die erfindungsgemäße optische Anordnung zum Scannen SM, ein nicht gezeigter Objektivrevolver und das Detektionsmodul DM sind über Verbindungsleitungen 71 bis 75 mit einer Steuer- und Auswerteeinheit PC verbunden, bei der es sich um einen handelsüblichen Rechner handeln kann.
Nach Durchlaufen des Multipunkt-Moduls 40 gelangt das Anregungslicht 16 oder Manipulationslicht 10 über den Hauptfarbteiler HFT zu der erfindungsgemäßen optischen Anordnung SM zum Scannen des Anregungslichts 16 und/oder Manipulationslichts 10. Die Scanoptik SO der optischen Anordnung SM fokussiert das Anregungslicht 16 oder Manipulationslicht 10 in eine Zwischenebene ZB. Über weitere Komponenten, beispielsweise Linsen und/oder Spiegel, die in Figur 4 nicht dargestellt sind, gelangt das Anregungslicht 16 oder das Manipulationslicht 10 über eine hintere Objektivpupille P in das Mikroskopobjektiv MO, welches das Licht in mehrere Fokalvolumina auf oder in der Probe S, die sich in einer Probenebene SP befindet, fokussiert. Die Anzahl der separaten Fokalvolumina entspricht der Anzahl der in dem Multipunkt-Modul 40 generierten separaten Strahlbündel. Wenn man das Multipunkt- Modul 40 weglassen würde, würde das Anregungs- oder Manipulationslicht in einen
Fokalpunkt fokussiert. Mit der erfindungsgemäßen optischen Anordnung SM zum Scannen werden die Fokalvolumina des Anregungs- oder Manipulationslichts 10 in der Zwischenbildebene ZB und damit in der zur Zwischenbildebene ZB optisch konjugierten Probenebene SP gescannt. Das in Fig. 4 schematisch dargestellte Mikroskop kann insbesondere ein konfokales
Mikroskop sein. Grundsätzlich kann es sich aber auch um ein Mikroskop handeln, welches mindestens ein nichtlineares Kontrastprinzip nutzt. Bei einem nichtlinearen Betrieb kann das Detektionslicht so wie in Fig. 4 gezeichnet detektiert werden, es kann grundsätzlich aber auch vor dem Scanmodul SM gemessen werden.
Im Einzelnen werden der erste und der zweite Strahlweg mit Bezug auf Figur 2 erläu- tert. Ohne Beschränkung der Allgemeinheit ist bei dem in Figur 2 gezeigten Beispiel der zweite Strahlweg derjenige Strahlweg, auf welchem Manipulationsstrahlung 10 in Richtung der Probe S geleitet wird, und der erste Strahlweg ist entsprechend derjenige Strahlweg, auf welchem Anregungsstrahlung 16 auf die Probe S geleitet wird.
Zunächst wird nun im Zusammenhang mit den Figuren 1 und 2 der zweite Strahlweg, also der Strahlverlauf für Manipulationsstrahlung oder Manipulationslicht 10, erläutert, mit welchem in einer Probe S eine definierte Manipulation, zum Beispiel ein definiertes Ausbleichen entlang einer bestimmten Trajektorie bewerkstelligt wird. Ist dieses Ausbleichen durchgeführt, kann, wie im Folgenden erläutert wird, die erfindungsgemäße optische Anordnung SM rasch umgeschaltet und die Probe in einem bildgebenden Modus mithilfe von Anregungsstrahlung 16 beobachtet werden.
Die Manipulationsstrahlung 10 gelangt, von dem Lasermodul LM kommend, zunächst über den Drehspiegel 22, also über das zweite variable Strahlumlenkmittel 20 in der vierten Pupillenebene P4, auf den dritten Scanner S3 in der dritten Pupillenebene P3. In dem in den Figuren 1 und 2 schematisch dargestellten Ausführungsbei- spiel ist der dritte Scanner S3 ein quasistatischer, insbesondere galvanometrischer, Scanner, der die Manipulationsstrahlung 10 vergleichsweise langsam in x-Richtung scannt. Die Manipulationsstrahlung 10 nimmt bei dem gezeigten Beispiel der erfindungsgemäßen optischen Anordnung zum Scannen SM den zweiten Strahlweg, das heißt die Manipulationsstrahlung 10 kommt mit dem zweiten Scanner S2 in der zwei- ten Pupillenebene P2 nicht in Kontakt. Vielmehr gelangt die vom dritten Scanner S3 kommende Manipulationsstrahlung 10 über den zweiten Hohlspiegel H2 auf einen fest angeordneten Spiegel 31 , der Teil des ersten Strahlumlenkmittels 30 ist. Von diesem fest angeordneten Spiegel 31 wird die Manipulationsstrahlung 10 ein erstes Mal reflektiert und trifft dann auf eine weitere strahlumlenkende Komponente 32. Diese weitere strahlumlenkende Komponente 32 ist in dem in Figur 2 gezeigten Beispiel ein weiterer fest angeordneter Spiegel 32, der zusammen mit dem fest ange- ordneten Spiegel 31 das erste Strahlumlenkmittel 30 bildet. Besonders zweckmäßig ist in dem zweiten Strahlweg eine alternative zweite Pupillenebene P2a gebildet, die insbesondere zur ersten Pupillenebene P1 und zur dritten Pupillenebene P3 optisch konjugiert ist, und die weitere strahlumlenkende Komponente 32 ist in dieser alterna- tiven zweiten Pupillenebene P2a angeordnet. Nach Reflexion an dem weiteren fest angeordneten Spiegel 32 trifft die Manipulationsstrahlung 10 ein zweites Mal auf den fest angeordneten Spiegel 31 und wird von diesem dann in Richtung des ersten Hohlspiegels H1 reflektiert. Von dem ersten Hohlspiegel H1 gelangt die Manipulationsstrahlung 10 schließlich über den ersten Scanner S1 in der ersten Pupillenebe- ne P1 , die Scanoptik SO und das Mikroskopobjektiv MO auf die Probe S. Der erste Scanner S1 ist ebenfalls ein quasistatischer, insbesondere galvanometrischer, Scanner, der das Manipulationslicht 10 vergleichsweise langsam in y-Richtung scannt. Der Auftreffpunkt des Fokalvolumens oder die Auftreffpunkte der Fokalvolumina der Manipulationsstrahlung 10 können demgemäß durch Einstellen des ersten Scan- ners S1 in der ersten Pupillenebene P1 und des dritten Scanners S3 in der dritten Pupillenebene P3 zielgerichtet eingestellt werden.
Grundsätzlich kann in der alternativen zweiten Pupillenebene P2a anstelle des feststehenden Spiegels 31 auch ein optisches Element zur schnellen Umfokussierung, wie es z.B. kommerziell von der Firma Revibro Optics (Bozeman, MT 59717) ange- boten wird, oder Spiegel, dessen Oberfläche aktiv gekrümmt werden kann, angeordnet sein. Mit solchen variablen Komponenten kann die Fokussierung in z-Richtung variiert werden. So können im Prinzip auch dreidimensionale Trajektorien oder frei gewählte Volumina in der Probe S durch die Manipulationsstrahlung 10 manipuliert werden. Wahlweise kann also eine 2-dimensionale oder 3-dimensionale Manipulation der Probe durchgeführt werden.
Nach Abschluss der Manipulation kann es erwünscht sein, die optische Anordnung SM möglichst rasch in einen Bildgebungsmodus umzuschalten. Zu diesem Zweck wird der Drehspiegel 22 in der vierten Pupillenebene P4 dergestalt verdreht, dass die aus der Richtung des Lasermoduls LM kommende Anregungsstrahlung 16 in einer anderen Richtung auf die Linse L4 trifft und damit an einem anderen Ort aus der Linse L4 austritt. Diese Vorstellung des Drehspiegels 22 führt dazu, dass die Anre- gungsstrahlung 16 nicht denselben Weg wie die Manipulationsstrahlung 10 durch die Komponenten der erfindungsgemäßen optischen Anordnung SM, also nicht den zweiten Strahlweg, sondern den ersten Strahlweg nimmt. Die durch den Drehspiegel 22 bewirkte Richtungsänderung und die Größe und die Raumposition des fest angeordneten Spiegels 31 sind dabei so aufeinander abgestimmt, dass bei dem in den Figuren 1 und 2 gezeigten Ausführungsbeispiel die Anregungsstrahlung 16 auf dem ersten Strahlweg nicht mit dem ersten Strahlumlenkmittel 30, 31 , 32 in Kontakt kommt.
Im Einzelnen: Die Anregungsstrahlung 16 gelangt, von dem Lasermodul LM kom- mend, zunächst über den Drehspiegel 22, also über das zweite variable Strahlumlenkmittel 20 in der vierten Pupillenebene P4, auf den dritten Scanner S3 in der dritten Pupillenebene P3. Der dritte Scanner S3 ist ein quasistatischer, insbesondere galvanometrischer, Scanner, der die Anregungsstrahlung 16 vergleichsweise langsam in x-Richtung scannt. Die vom dritten Scanner S3 kommende Anregungsstrah- lung 16 gelangt über den zweiten Hohlspiegel H2 auf den zweiten Scanner S2 in der zweiten Pupillenebene P2. Bei diesem zweiten Scanner S2 handelt es sich um einen Resonanzscanner, der im Vergleich zum dritten Scanner S3 viel schneller ist und die Anregungsstrahlung 16 ebenfalls in x-Richtung scannt. Weil der dritte Scanner S3 ein quasistatischer Scanner ist, kann er prinzipiell sehr rasch zum Stillstand gebracht werden oder das Scannen des Anregungslichts 16 in x-Richtung erfolgt kombiniert sowohl durch den dritten Scanner S3 als auch durch den zweiten Scanner S2. Beispielsweise kann, insbesondere bei begrenztem Hub des zweiten Scanners S2, mit den quasistatischen Scannern S1 und S3 der Ort eines bestimmten Sichtfelds eingestellt werden und das rasche Scannen erfolgt dann mit dem zweiten Scanner S2. Bei diesem Modus kann das Scanfeld durch Betätigen des dritten Scanners S3 in x-
Richtung verschoben werden. Prinzipiell kann der dritte Scanner S3 aber stillstehen. Von dem zweiten Scanner S2 wird die Anregungsstrahlung 16 in Richtung des ersten Hohlspiegels H1 reflektiert und trifft, vom Hohlspiegel H1 kommend, schließlich auf den ersten Scanner S1 in der ersten Pupillenebene P1 . Vom ersten Scanner S1 ge- langt das Anregungslicht 16 schließlich über die Scanoptik SO und das Mikroskopobjektiv MO auf die Probe S. Die alternative zweite Pupillenebene P2a spielt für den ersten Strahlweg demgemäß keine Rolle. Im Fall des ersten Strahlwegs kann der Auftreffpunkt des Fokalvolumens oder können die Auftreffpunkte der Fokalvolumina der Anregungsstrahlung 16 durch Einstellen des ersten Scanners S1 in der ersten Pupillenebene P1 , des zweiten Scanners S2 in der zweiten Pupillenebene und des dritten Scanners S3 in der dritten Pupillenebene P3 zielgerichtet eingestellt werden. Die zweite Pupillenebene P2 und die alternative zweite Pupillenebene P2a können mit verschiedenen optisch aktiven oder passiven Elementen bestückt sein. Im einfachsten Fall ist das jeweils ein Spiegel, sobald in der je anderen Pupille ein aktives Element steht, welches umgangen werden soll. Zum Beispiel kann in P2, wie beschrieben, ein resonanter Scanner stehen. Wenn dieser nicht gebraucht wird, sollte auch kein Licht über diesen geführt werden, um Störungen des Strahls durch Restbewegungen zu vermeiden. Zudem hat ein resonanter Scanner ein gewisses Einschwingverhalten. Will man eine sehr schnelle Schaltung zwischen einem Manipulationsmodus und einem schnellen Bildgebungsmodus mittels eines resonanten Scanners realisieren, so muss der Scanner durchgehend schwingen und man schaltet sich im entsprechenden Moment optisch auf diese Bewegung auf.
Figur 3 zeigt eine Situation, bei der der erste Scanner S1 beim Umschalten vom ersten auf den zweiten Strahlweg dergestalt nachgeführt wird, dass der erste Strahlweg und der zweite Strahlweg strahlabwärts von dem ersten Scanner S1 wieder zusammenfallen. Das bedeutet, dass unabhängig davon, ob der erste oder der zweite Strahlweg gewählt wird, die Anregungsstrahlung 16 einerseits und die Manipulationsstrahlung 10 andererseits auf denselben Ort auf einer Probe S geleitet werden.
Dieses Nachführen des ersten Scanners S1 oder alternativ oder ergänzend auch des zweiten Scanners S2 und/oder des dritten Scanners S3 in Abhängigkeit einer Positionierung der Umschalteinrichtung 20, im gezeigten Beispiel also des Drehspie- gels 22, kann beispielsweise mithilfe einer geeignet programmierten Steuereinheit durchgeführt werden.
Es gibt wichtige Anwendungen der schnellen Bildgebung mit resonanten Scannern, die es erfordern, dass das Scanfeld des resonanten Scanners lateral über die Probe bewegt werden soll (sogenanntes "panning"). Die erfindungsgemäße optische An- Ordnung leistet dies, weil der schnelle zweite Scanner S2 und der quasistatische drit- te Scanner S3 gleichzeitig verwendet werden können. Mit der Anordnung aus DE 10 2014 017 001 A1 ist das so nicht möglich.
Am zweiten Hohlspiegel H2 ist der Winkel zwischen ein- und ausfallendem Strahl bevorzugt gleich dem entsprechenden Winkel am ersten Hohlspiegel H1 und die Drehachsen des zweiten Scanners S2 und des dritten Scanners S3 liegen bevorzugt parallel zueinander. Dadurch wird erreicht, dass, unabhängig davon, ob mit dem zweiten Scanner S2 oder dem dritten Scanner S3 oder beiden gescannt wird, keine unsymmetrischen Scanverzeichnungen bei der Abtastung in der Probenebene auftreten (siehe dazu DE 10 2014 017 001 A1 ). Bei gleicher Wellenlänge der Manipulationsstrahlung und der Anregungsstrahlung kann als variables Strahlumlenkmittel 30 ein größenmäßig geeignet dimensionierter Spiegel, wie in Figur 2 gezeigt, im Strahlengang vorhanden sein. Dieses Element muss nicht zwingend konfiguriert werden. Es kann grundsätzlich auch bei normaler Bildgebung im Strahlengang verbleiben. Somit muss hier keine komplizierte mecha- nische Verstellung vorgesehen sein. Die Umschaltung erfolgt durch Erzeugen eines Winkels zwischen dem auf den ersten Scanner S1 einfallenden Strahl und der Drehachse des Spiegels, der dann verschieden ist von 90°. Daraufhin verlassen die Strahlengänge der beiden Betriebsmodi (Modulationsmodus: Betrieb mit Modulationsstrahlung; Anregungsmodus oder Bildgebungsmodus: Betrieb mit Anregungs- Strahlung) den dritten Scanner S3 in Richtung des Hauptfarbteilers und eines konfokalen Pinholes unter verschiedenen Winkeln. Um eine Fehlablage am Pinhole zu vermeiden, kann zeitgleich eine weitere Winkelschaltung in einer descannten Pupillenebene (insbesondere vierte Pupillenebene P4) mit einem weiteren in der Abbildung nicht gezeigten galvanometrischer Spiegel (insbesondere zweite variable Strahlumlenkeinrichtung 20) vorgenommen werden. Diese Anordnung ist sowohl für die einzelpunktscannende Laser-Scanning-Mikroskopie als auch für Multipunktver- fahren geeignet, welche erfordern, dass alle Scanner in gut definierten optischen Pupillen angeordnet werden können.
Nach Anregung der Probe S durch das Anregungslicht 10 sendet die Probe S in grundsätzlich bekannter Art Detektionslicht 14 aus, welches im Wesentlichen denselben optischen Strahlengang zurück bis zum Hauptfarbteiler HFT läuft. Der Dreh- Spiegel 22 muss hierzu in der zum ersten Strahlweg gehörenden Position bleiben. Bei dem Detektionslicht 14 handelt es sich typischerweise um Fluoreszenzlicht, dessen Wellenlänge im Vergleich zur Wellenlänge des Anregungslichts 10 aufgrund von Stokes-Verschiebung rotverschoben ist. Diese Rotverschiebung ermöglicht das Ab- trennen des Detektionslichts 14 in dem Hauptfarbteiler HFT und das Detektionslicht 14 gelangt, gegebenenfalls über weitere nicht dargestellte Komponenten wie Spiegel oder Filter, zum Detektionsmodul DM und wird dort quantitativ nachgewiesen. Die Messdaten des Detektionsmoduls DM werden der Steuer- und Auswerteeinheit PC zugeführt. Ein wesentlicher Vorteil der erfindungsgemäßen optischen Anordnung ist, dass sehr schnell zwischen einem sogenannten Manipulationsmodus unter Verwendung von Manipulationsstrahlung 10 und einem schnellen Bildgebungsmodus, bei dem Anregungsstrahlung 16 verwendet wird, geschaltet werden kann. Das kann auf verschiedene Art und Weise erfolgen. Die erfindungsgemäße optische Anordnung, wie sie in den Figuren 1 und 2 dargestellt ist, kann in verschiedener Hinsicht gewinnbringend erweitert werden.
In der Pupille P2 steht jetzt zum Beispiel ein resonanter Scanner. Die alternative Pupillenebene P2a kann zum Beispiel mit einem festen Spiegel belegt sein. Wird der Strahlweg derart gewählt, dass P2a adressiert wird, kann eine Manipulation oder Bildgebung mittels der quasistatischen Scanner erfolgen, wobei der resonante Scanner umgangen wird. Alternativ ist es auch vorteilhaft, in P2a optisch aktive Elemente zu platzieren. Zum Beispiel kann dort ein wellenfrontmodulierendes Element platziert werden, welches sehr schnell einen Defokus einstellen kann.
Sehr vorteilhaft wird der Schaltmechanismus der erfindungsgemäßen optischen An- Ordnung mit einer aktiven Multipunktbeleuchtung kombiniert, wie sie zum Beispiel in
DE 10 2016 102 286.1 beschrieben ist. Hier kann zum Beispiel einer der Mehrfachstrahlen eine um 90° gedrehte Polarisation aufweisen. Dies ist dann der Manipulationsstrahl, der im Allgemeinen auch eine höhere Intensität aufweist. Alle verbleibenden Strahlen werden zur Bildgebung genutzt. Eine Schaltung mittels des Akusto- optischen Filters (AOTF) führt jetzt zu der gewünschten Umschaltung der Beleuch- tungsstrahlwege für die Manipulation über die Pupille P4 oder die Detektion über den Scanner S2 in der Pupille P2.
Bezugszeichenliste x zweite Koordinatenrichtung
y erste Koordinatenrichtung
z Richtung der optischen Achse
B Fokalpunkt
DM Detektionsmodul
HFT Hauptfarbteiler
H1 zweite fokussierende Einrichtung, erster Hohlspiegel
H2 dritte fokussierende Einrichtung, zweiter Hohlspiegel
L4 vierte fokussierende Einrichtung, Linse oder Linsengruppe
LM Lasermodul/Lichtquelle
MO Mikroskopobjektiv
P Pupillenebene des Mikroskopobjektivs MO
PC Steuer- und Auswerteeinheit
P1 erste Pupillenebene
P2 zweite Pupillenebene
P2a alternative zweite Pupillenebene
P3 dritte Pupillenebene
P4 vierte Pupillenebene
S Probe
SM Scanmodul, erfindungsgemäße optische Anordnung
50 Scanoptik, erste fokussierende Einrichtung
SP Probenebene
51 erster Scanner, erste Strahlumlenkeinrichtung
52 zweiter Scanner, zweite Strahlumlenkeinrichtung
53 dritter Scanner, dritte Strahlumlenkeinrichtung
ZB Zwischenbildebene
10 Manipulationsstrahlung, Manipulationslicht 12 optische Achse
13 Doppelpfeil
14 Detektionslicht
16 Anregungsstrahlung, Anregungslicht
20 zweites (variables) Strahlumlenkmittel
22 Drehspiegel
30 erstes Strahlumlenkmittel
31 feststehender Spiegel
32 weitere strahlumlenkende und/oder strahlformende Komponente 40 Multipunkt-Modul
71 -75 Leitungen von Mikroskopkomponenten zu PC
100 Laser-Scanning-Mikroskop

Claims

Patentansprüche
1 . Optische Anordnung zum Scannen von Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung in einem Laser-Scanning-Mikroskop, insbesondere einem La- ser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskop,
mit einer Scanoptik (SO) als erster fokussierender Einrichtung zum Bereitstellen einer ersten Pupillenebene (P1 ),
mit einer ersten Strahlumlenkeinrichtung, die durch einen in der ersten Pupillenebene (P1 ) angeordneten ersten Scanner (S1 ) gebildet ist, zum Scannen der Anregungsstrahlung (16) und/oder Manipulationsstrahlung (10) in einer ersten Koordinatenrichtung (y),
mit einer zweiten fokussierenden Einrichtung (H1 ) zum Erzeugen einer zweiten Pupillenebene (P2), die zu der ersten Pupillenebene (P1 ) optisch konjugiert ist,
mit einer zweiten Strahlumlenkeinrichtung (S2) zum Umlenken der Anregungsstrahlung (16) und/oder Manipulationsstrahlung (10), die in der zweiten Pupillenebene (P2) angeordnet ist,
dadurch gekennzeichnet,
dass eine dritte fokussierende Einrichtung (H2) vorhanden ist zum Erzeugen einer dritten Pupillenebene (P3), die zu der ersten Pupillenebene (P1 ) optisch konjugiert ist,
dass in der dritten Pupillenebene (P3) eine dritte Strahlumlenkeinrichtung (S3) angeordnet ist zum Umlenken der Anregungsstrahlung (16) und/oder Manipulationsstrahlung (10),
dass zwischen der zweiten fokussierenden Einrichtung (H1 ) und der zweiten Pupillenebene (P2) einerseits und der zweiten Pupillenebene (P2) und der dritten fokussierenden Einrichtung (H2) andererseits ein erstes Strahlumlenkmittel (30) vorhanden ist zum Umlenken der von der dritten fokussierenden Einrichtung (H2) kommenden Anregungsstrahlung (16) und/oder Manipulati- onsstrahlung (10) unter Umgehung der zweiten Strahlumlenkeinrichtung (S2) in Richtung der zweiten fokussierenden Einrichtung (H1 ),
dass eine vierte fokussierende Einrichtung (L4) zum Erzeugen einer vierten Pupillenebene (P4) vorhanden ist, die zur dritten Pupillenebene (P3) optisch konjugiert ist, und
dass in der vierten Pupillenebene (P4) ein variables zweites Strahlumlenkmittel (20) angeordnet ist zum Umschalten eines optischen Strahlengangs zwischen einem ersten Strahlweg und einem zweiten Strahlweg.
Optische Anordnung nach Anspruch 1 ,
dadurch gekennzeichnet,
dass der erste Strahlweg mindestens von dem variablen zweiten Strahlumlenkmittel (20) über die dritte Strahlumlenkeinrichtung (S3) und die zweite Strahlumlenkeinrichtung (S2) zu dem ersten Scanner (S1 ) verläuft und/oder dass der zweite Strahlweg mindestens von dem variablen zweiten Strahlumlenkmittel (20) über die dritte Strahlumlenkeinrichtung (S3) unter Umgehung der zweiten Strahlumlenkeinrichtung (S2) über das erste Strahlumlenkmittel (30) zu dem ersten Scanner (S1 ) verläuft.
Optische Anordnung nach Anspruch 1 ,
dadurch gekennzeichnet,
dass der erste Strahlweg mindestens von dem variablen zweiten Strahlumlenkmittel (20) über die vierte fokussierende Einrichtung (L4), die dritte
Strahlumlenkeinrichtung (S3), die dritte fokussierende Einrichtung (H2), die zweite Strahlumlenkeinrichtung (S2), die zweite fokussierende Einrichtung (H1 ) zu dem ersten Scanner (S1 ) verläuft und
dass der zweite Strahlweg mindestens von dem variablen zweiten Strahlumlenkmittel (20) über die vierte fokussierende Einrichtung (L4), die dritte
Strahlumlenkeinrichtung (S3), die dritte fokussierende Einrichtung (H2) unter Umgehung der zweiten Strahlumlenkeinrichtung (S2) über das erste Strahlumlenkmittel (30) und die zweite fokussierende Einrichtung (H1 ) zu dem ersten Scanner (S1 ) verläuft. Optische Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet,
dass, bezogen auf die Anregungsstrahlung (16) und die Manipulationsstrahlung (10), die zweite Pupillenebene (P2) strahlaufwärts von der ersten Pupillenebene (P1 ), die dritte Pupillenebene (P3) strahlaufwärts von der zweiten Pupillenebene (P2), und die vierte Pupillenebene (P4) strahlaufwärts von der dritten Pupillenebene (P3) liegt.
Optische Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet,
dass die zweite fokussierende Einrichtung (H1 ) und/oder die dritte fokussierende Einrichtung (H2) ein Hohlspiegel, insbesondere ein torischer oder sphärischer Hohlspiegel, ist.
Optische Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet,
dass die vierte fokussierende Einrichtung eine Linse (L4) oder eine Linsengruppe ist.
Optische Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet,
dass die zweite Strahlumlenkeinrichtung in der zweiten Pupillenebene (P2) ein zweiter Scanner (S2) ist zum Scannen der Anregungsstrahlung (16) und/oder der Manipulationsstrahlung (10) in einer von der ersten Koordinatenrichtung (y) verschiedenen zweiten Koordinatenrichtung (x) und/oder
dass die dritte Strahlumlenkeinrichtung in der dritten Pupillenebene (P3) ein dritter Scanner (S3) ist zum Scannen der Anregungsstrahlung (16) und/oder der Manipulationsstrahlung (10) in einer von der ersten Koordinatenrichtung (y) verschiedenen zweiten Koordinatenrichtung (x).
8. Optische Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 7,
dadurch gekennzeichnet,
dass die zweite Strahlumlenkeinnchtung in der zweiten Pupillenebene (P2) und/oder die dritte Strahlumlenkeinrichtung in der dritten Pupillenebene (P3) ein feststehender Spiegel, ein Spiegel, dessen Oberfläche aktiv gekrümmt werden kann, oder ein sonstiges wellenfrontveränderndes Element ist.
9. Optische Anordnung nach Anspruch 7 oder 8,
dadurch gekennzeichnet,
dass der zweite Scanner (S2) ein Resonanzscanner ist und der dritte Scanner (S3) ein quasistatischer Scanner ist oder
dass der dritte Scanner (S3) ein Resonanzscanner ist und der zweite Scanner (S2) ein quasistatischer Scanner ist.
10. Optische Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 9,
dadurch gekennzeichnet,
dass der erste Scanner (S1 ) ein quasistatischer Scanner ist.
1 1 . Optische Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 10,
dadurch gekennzeichnet,
dass das erste Strahlumlenkmittel (30) mindestens einen fest positionierten Spiegel, insbesondere genau zwei fest positionierte Spiegel (31 , 32) aufweist.
12. Optische Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 ,
dadurch gekennzeichnet,
dass das zweite variable Strahlumlenkmittel (20) einen variabel positionierbaren Spiegel (21 , 22) aufweist. Optische Anordnung nach Anspruch 12,
dadurch gekennzeichnet,
dass der variabel positionierbare Spiegel ein Drehspiegel (22) mit einer Dreheinrichtung ist.
Optische Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 13,
dadurch gekennzeichnet,
dass das erste Strahlumlenkmittel (30) und/oder das variable zweite Strahlumlenkmittel (20) einen dielektrischen und/oder dichroitischen Spiegel (23) aufweist.
Optische Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 14,
dadurch gekennzeichnet,
dass das variable zweite Strahlumlenkmittel (20) einen wellenlängenabhängigen und polarisationsabhängigen dielektrischen und/oder dichroitischen Spiegel (24) aufweist, wobei dieser Spiegel (24)
• Anregungsstrahlung (16) und/oder Manipulationsstrahlung (10) mit einer ersten Wellenläge (61 ) und einem ersten Polarisationszustand (p) transmittiert,
• Anregungsstrahlung (16) und/oder Manipulationsstrahlung (10) mit der ersten Wellenläge (61 ) und einem zweiten Polarisationszustand (s), der von dem ersten Polarisationszustand verschieden ist, reflektiert und
• von einer Probe (S) ausgesandtes Fluoreszenzlicht (14) mit einer rotverschobenen Wellenlänge (62) unabhängig von dessen Polarisationszustand transmittiert oder reflektiert.
Optische Anordnung nach Anspruch 15,
dadurch gekennzeichnet,
dass der erste Polarisationszustand bezogen auf den dielektrischen und/oder dichroitischen Spiegel s-Polarisation ist und dass der zweite Polarisationszustand bezogen auf den dielektrischen und/oder dichroitischen Spiegel p- Polarisation ist.
17. Optische Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 16,
dadurch gekennzeichnet,
dass in dem zweiten Strahlweg eine alternative zweite Pupillenebene (P2a) gebildet ist, die zu der ersten Pupillenebene (P1 ) optisch konjugiert ist und in der eine weitere strahlumlenkende und/oder strahlformende Komponente (32), die Teil des ersten Strahlumlenkmittels (30) ist, angeordnet ist.
18. Optische Anordnung nach Anspruch 17,
dadurch gekennzeichnet,
dass die weitere strahlumlenkende und/oder strahlformende Komponente (32) ein, insbesondere feststehender, Spiegel (31 ) ist.
19. Optische Anordnung nach Anspruch 18,
dadurch gekennzeichnet,
dass die weitere strahlumlenkende Komponente (32) ein Spiegel, dessen Oberfläche aktiv gekrümmt werden kann, ein segmentierter Spiegel oder eine sonstige Einrichtung zum Manipulieren der Wellenfront, beispielsweise ein räumlicher Lichtmodulator, ist.
20. Optische Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 19,
dadurch gekennzeichnet,
dass eine Steuereinheit vorhanden ist zum aufeinander abgestimmten Ansteuern des ersten Scanners (S1 ), der zweiten Strahlumlenkeinrichtung (S2), der dritten Strahlumlenkeinrichtung (S3) und/oder des variablen zweiten Strahlumlenkmittels (20).
21 . Optische Anordnung nach Anspruch 20,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Steuereinheit dazu eingerichtet ist, den ersten Scanner (S1 ), die zweite Strahlumlenkeinrichtung (S2), die dritte Strahlumlenkeinrichtung (S3) und/oder das variable zweite Strahlumlenkmittel (20) dergestalt aufeinander abgestimmt anzusteuern, dass unabhängig davon, ob der erste oder der zweite Strahlweg durchlaufen wird, dieselben Probenorte mit Anregungsstrahlung oder Manipulationsstrahlung beaufschlagt werden.
22. Laser-Scanning-Mikroskop
mit mindestens einer Laserlichtquelle (LM) zum Aussenden von Laserstrahlung (10, 16) zum Anregen und/oder Manipulieren einer Probe (P),
mit mindestens einem Hauptfarbteiler zum Trennen von Anregungsstrahlung (16) und/oder Manipulationsstrahlung (10) einerseits und wellenlängenverschobenem Detektionslicht (14), welches von einer Probe (S) ausgeht, andererseits,
mit mindestens einem Mikroskopobjektiv (MO) zum Leiten und Fokussieren von Anregungsstrahlung (16) und/oder Manipulationsstrahlung (10) auf eine Probe (S) und zum Leiten und Kollimieren von Detektionslicht (14), welches von der Probe (S) ausgeht, zurück in Richtung des Hauptfarbteilers (HFT), und
mit einem Detektionsmodul (DM) zum Nachweisen des Detektionslichts (14), dadurch gekennzeichnet,
dass eine optische Anordnung zum Scannen von Anregungsstrahlung (16) und/oder Manipulationsstrahlung nach einem der Ansprüche 1 bis 21 vorhanden ist.
23. Laser-Scanning-Mikroskop nach Anspruch 22,
dadurch gekennzeichnet,
dass eine Einrichtung zur Multipunktbeleuchtung (40) mit einer Mehrzahl von Beleuchtungskanälen vorhanden ist.
24. Laser-Scanning-Mikroskop nach Anspruch 23,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Einrichtung zur Multipunktbeleuchtung (40) zur Steuerung der einzelnen Beleuchtungskanäle einen mehrkanaligen AOTF aufweist.
25. Laser-Scanning-Mikroskop nach Anspruch 23 oder 24,
dadurch gekennzeichnet,
dass für mindestens einen der Beleuchtungskanäle eine Einrichtung zur Manipulation, insbesondere zum Drehen, der Polarisation, insbesondere ein Lamb- da-Halbe-Plättchen, vorhanden ist.
26. Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der Ansprüche 22 bis 25,
welches eingerichtet ist zur Kontrastgebung auf Grundlage mindestens eines nichtlinearen Kontrastprinzips, insbesondere Mehrphotonenfluoreszenz, beispielsweise Zwei- oder Drei-Photonen-Fluoreszenz, CARS oder SRS, und welches insbesondere ein Zwei-Photonen-Laser-Scan-Mikroskop ist.
27. Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der Ansprüche 22 bis 26,
welches ein konfokales Mikroskop, insbesondere ein konfokales Laser- Scanning-Fluoreszenz-Mikroskop, ist.
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