WO2014049127A1 - Konfokales auflicht-rastermikroskop zur multifleck-abtastung - Google Patents

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WO2014049127A1
WO2014049127A1 PCT/EP2013/070206 EP2013070206W WO2014049127A1 WO 2014049127 A1 WO2014049127 A1 WO 2014049127A1 EP 2013070206 W EP2013070206 W EP 2013070206W WO 2014049127 A1 WO2014049127 A1 WO 2014049127A1
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WO
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microscope
partial beams
beam path
manipulating
plane
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PCT/EP2013/070206
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Daniel Schwedt
Tiemo Anhut
Tobias Kaufhold
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Carl Zeiss Microscopy Gmbh
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Publication date
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    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0032—Optical details of illumination, e.g. light-sources, pinholes, beam splitters, slits, fibers
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    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
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    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J37/00—Discharge tubes with provision for introducing objects or material to be exposed to the discharge, e.g. for the purpose of examination or processing thereof
    • H01J37/26—Electron or ion microscopes; Electron or ion diffraction tubes
    • H01J37/28—Electron or ion microscopes; Electron or ion diffraction tubes with scanning beams

Definitions

  • the invention relates to a confocal scanning microscope, comprising an illumination beam path with a confocal
  • Multi-beam light source a detection beam path with confocal detectors, a beam splitter which couples the illumination beam path and the detection beam path to a common beam path, an adjustable deflection unit in the common beam path and a microscope objective for focusing the partial beams of the multi-beam light source
  • microscopes also include a scanning optics and a tube lens between the deflection unit and the microscope objective.
  • a detector is confocal if it itself or a diaphragm arranged in front of it is arranged in (or in the vicinity of) a confocal plane.
  • Confocal here means that in a sample-side focal plane of
  • a diaphragm for limiting the light absorption is arranged on a small "target volume" at the sample location.
  • a multi-beam light source is a means in which light a) is emitted simultaneously or at least overlapping in spatially separate regions of a spatial plane, or b) from a plurality of openings or optical elements such as lenses or
  • these areas of light emission or light emission, which define the spots resulting in the sample, are relatively fixed in position, but the openings may be
  • light is any radiation which can be manipulated by optical means, in particular also ultraviolet (UV) and infrared (IR) radiation.
  • UV ultraviolet
  • IR infrared
  • the light source one or more lasers are typically used.
  • the microscope is then referred to as a “multifocal laser scanning microscope.”
  • non-laser sources such as light-emitting diodes (LED), can be arranged correspondingly to several lasers.
  • the deflection unit comprises two deflection mirrors
  • the deflection unit thus makes it possible to scan the sample along a grid by tilting the common beam path, which leads to a simultaneous parallel displacement of the illuminated target volumes ("speckle pattern") on the sample, while being arranged in the detection beam path
  • the deflection unit may also comprise only a movable mirror which is movable about only one or two axes as in US 2007/127003 A1.
  • the area of the sample scanned by the deflection unit during a scan is referred to as the scan field, while the area scanned by a single one of the plurality of spots is referred to as the respective grid. Since an image can be composed from the detection values recorded in the scanning field, it is also referred to as an image field.
  • Properties of the image field can not be modified in the same way as in a single-spot scanning microscope by appropriate control of the deflection.
  • Rotation speeds of the deflecting mirrors are rotated.
  • a change in the relative scanning speeds leads to a change in the relative position of the spots among each other, in particular to different distances of adjacent spots.
  • the fixed distances of the spots in the sample plane set the multifocal scannable minimum
  • JP 8334698 A describes to arrange a Dove prism in the common beam path between the deflection unit and the objective.
  • US 2006/012875 A1 it is also known to arrange a Abbe-King prism in a pupil of the common beam path between main color splitter and sample in a confocal scanning microscope with linear illumination and detection for field rotation. In this way, in particular, a region of interest (ROI) can be rotated, and in the case of the detection of sample light, the rotation through the same prism is canceled.
  • ROI region of interest
  • the invention has for its object to improve microscopes of the type mentioned, so that at least one image field property can be variably adjusted.
  • the multi-beam light source may be a multi-aperture plate fixed relative to the main beam splitter, preceded by a single light source that simultaneously illuminates multiple (or all) of the apertures (apertures) of the disk.
  • the confocal multi-beam light source is imaged by the objective on the sample.
  • the light source typically serves for (multifocal) fluorescence excitation of a fluorescent dye contained in the sample in the illuminated spots, which then emit fluorescent light, which images from the objective onto the detectors associated with the spots. That along the
  • Lighting beam path to the sample led light is called illumination light, the light reflected from the sample, scattered and emitted light is referred to as sample light.
  • sample light the light reflected from the sample, scattered and emitted light.
  • the multi-beam light source generates illuminated spots on the sample through the N ⁇ M objective, at least N ⁇ M separate confocal detectors are required.
  • Openings may be arranged a respective detector.
  • a solution is provided for arranging means for manipulating a spatial position of the partial beams in the common beam path between the main beam splitter and the deflection unit.
  • the means for manipulating the spatial position of the partial beams determine the relative position of the
  • Partial beams to each other in particular laterally to the optical axis of the partial beams, wherein the relative distances of the resulting light spots to each other in an (all) image plane (s) are maintained.
  • the means for manipulating the sub-beams can be tilted relative to each other (relative
  • Angle change and / or the distances of the partial beams to each other can be changed.
  • control data for the scanning unit thus achieves a variable field rotation.
  • an adjustable image field rotating element in particular a rotatably mounted Abbe-King prism or a Dove Prism or a Schmidt-Pechan prism or a K-mirror.
  • the image field in a multi-spot scanning microscope by a variable orientation of the partial beams is rotatable to each other.
  • the line scan direction can be adjusted to the orientation of the elongated region such that the long dimension of the elongated region is oriented in the direction of the line scan.
  • An adapted number of the lines to be scanned is then based on the short
  • image field rotation may be advantageous when large
  • Movement velocities are to be examined in directed vesicle movements under high zoom. In this case, each individual passes
  • image artifacts due to fast movements may occur in the prior art.
  • the same vesicle can be seen twice in the image.
  • Such artifacts can be reduced according to the invention by placing the direction of the line scan in a given main direction of movement of the respective sample components.
  • Control data for the deflection unit can also be aligned such that the scanning the sample is made along a connecting line between two spots of the speckle pattern. This allows one line scan to take up to N times (or M times) the same line.
  • M 1 (one-dimensionally extended patch chain)
  • the time difference between the data acquisition of immediately adjacent light spots (n and n + 1) at the same sample location is minimal.
  • M> 1 that can be advantageous to rotate the image field such that the extension direction of the patch chain in the object field is orthogonal to its direction of extension in a plane of a confocal diaphragm.
  • Spotted pattern are rotated so that the dimension with the larger number of spots in the direction of the scan lines.
  • This can be used, for example, for evaluations of high-resolution microscopy such as SOFI (Dertinger et al .: “Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI)" in Proc. Nat. Acad. Sei. USA (2009) 106 (52 ): 22287-22292) are advantageously used, since in this case hardly any movement artifacts occur between the different lines.
  • Such artifacts which are indispensable in the art, have a negative effect on the high-resolution images, since they enter into the correlations that form the basis of these methods.
  • a microscope according to the invention therefore a
  • Control unit which controls the deflection unit in response to a setting of the field-rotating element.
  • the means for manipulating the spatial position of the partial beams comprise a variable zoom optics.
  • This allows a variable adaptation of the scannable image field size by modification of the spot spacings in the sample relative to each other.
  • a change of the spot distances relative to each other advantageously allows a variability of the minimum field of view and also a larger reduction of Abtastfeldieren, for example, by the method proposed in US 7,385,165 or deviating methods of stitching (English, "stitching").
  • a significant pupil lining is avoided, as this reduces the resolution of the microscope.
  • a leads (Minor) relining of the pupil but to the fact that a resting on one or between the Ablenkaptn pupil relative to the reference system is reduced in size in the lens pupil, whereby the relative angle of the partial beams are increased to each other.
  • Overfilling the objective pupil causes on the one hand a loss of illumination intensity, on the other hand, the hard fading of the excitation light at the pupil edge emphasizes the Airy rings more. Underfilling the pupil causes, as already mentioned, dissolution losses due to broadening of the PSF and, moreover, involves the risk of fluorescence losses
  • the underfilling or overfilling is therefore such that the loss of illumination intensity is at most 50%.
  • the means for manipulating the spatial position of the partial beams comprise a telescope optics for generating a
  • a main plane of an exit optics of the telescope optics outside of the telescope in particular in the matrix of
  • Reflection elements in particular such that all telescopically imaged sub-beams are mapped to different reflection elements. This enables partial beam-individual manipulation with high accuracy.
  • the means for manipulating the spatial position of the partial beams determine the relative position of the partial beams to a given point on an axle, especially on one
  • Axle beam in the media This allows the image to be optimized in the sample.
  • Partial beams in this embodiment a movably mounted, transparent, plane-parallel plate.
  • the partial beams can be moved laterally, for example, in order to set an optimal pupil filling can.
  • the common beam path between the main beam splitter and the deflection unit comprises means for manipulating a phase position of the sub-beams relative to each other.
  • Wavefront shaping, defocusing or correction of (for example, objectively dependent) aberrations, in particular spherical errors are examples of (for example, objectively dependent) aberrations, in particular spherical errors.
  • Partial beams a spatial light modulator. This allows the manipulation of the relative phases of the partial beams with high accuracy.
  • the means for manipulating a phase position of the partial beams comprise a membrane mirror.
  • a membrane mirror can the
  • phase fronts of the partial beams and thus correct, for example, aberrations of different orders (for example, sphere, coma, astigmatism).
  • the focal position in the object plane can vary within certain limits by means of a membrane mirror. You can be in confocal
  • scanning microscopes optimize the adjustment of the mirror surface based on the resulting image brightness.
  • the means for manipulation (at least approximately) in a pupil plane (the between the main beam splitter and the deflection unit) or at least be arranged in the vicinity of such.
  • the beam geometry initially predetermined by the multi-beam light source is modified on the way to the objective without the manipulation having to act on the entire scanning field.
  • manipulations of the spatial position of the sub-beams are also withdrawn for the sample light, so that the image remains invariable on the confocal shutter arrangements in the illumination and detection beam path.
  • the common beam path preferably comprises optics for generating the (additional) pupil plane.
  • the invention also includes embodiments in which the microscope objective images a plurality of spots from a real or virtual image plane of the multi-beam light source into the sample plane.
  • the invention facilitates, in particular, optical panning ("panning") and the rapid selection of predetermined ROI by appropriate control of the
  • Fig. 1 is a reflected light scanning microscope with a multi-beam light source.
  • FIG. 1 shows a multifocal LSM 1 with a multi-beam light source 2 into which a laser L is coupled.
  • the laser L is over, for example
  • the common beam C are also exemplifying optics. 3 arranged, which generate an additional pupil plane X between the main beam splitter 4 and the deflection unit 5 (with one or two deflection mirrors not shown) (can be omitted in other embodiments, in particular in other types of manipulation of the partial beams).
  • the main beam splitter 4 is for example a dichroic spectrally separating beam splitter and couples the
  • Exciting light passes through the deflection unit 5 in the direction of the sample.
  • the pupil plane X is arranged as a means 7 for ("descanned") manipulation of a spatial position of the partial beams B.
  • the common beam path C furthermore has scanning optics (not shown), a tube lens (not shown) and a microscope objective 8 for imaging a plurality of spots from an image plane the
  • the detection beam path D coupled by the main beam splitter 4 to the illumination beam path B contains a multi-aperture plate in the detection module F as confocal detection apertures 9 assigned to the illumination spots, a detector 10 being arranged behind each aperture.
  • the N ⁇ M pinholes of the multi-aperture plate are fixedly arranged in a plane to each other, they are all confocal imaged in the sample P.
  • Aperture diaphragms are adjustable in size, for example, in other embodiments (not shown) may have a (uniform) fixed size or different fixed sizes.
  • the size of the pinhole sets the
  • the means 7 for manipulating the position of the partial beams can be, for example, a field-rotating prism, a zoom lens, a telescope with a downstream switchable mirror array or a sequential combination of these elements or a subset thereof.
  • the means 7 comprise a sequential arrangement of all four said elements, with the zooming optics of the deflecting unit being closest, followed by the image-field-rotating prism with which the telescope is connected downstream Mirror matrix is adjusted. If the means 7 contain a telescope, then X denotes an intermediate image plane, while X 'is an (additional) pupil plane.
  • the manipulation means 7 After passing through the manipulation means 7 preferably meet all in a fixed angular relationship to each other standing partial beams B, in a common pupil (not in the telescope with an adjusted mirror matrix), in which a first deflecting mirror of the deflection unit 5 is arranged, the
  • the common pupil may lie (preferably in a patch of spots as a speckle pattern) on a surface of a deflecting mirror or, if there are two deflecting mirrors, between the two deflecting mirrors.
  • M 1 (patch chain)
  • the common pupil is preferably located on the deflection mirror which deflects the partial beams in the longitudinal direction of the patch chain.
  • one deflecting mirror can be imaged onto the other.
  • Fluorescence light generated in the sample is collimated by the microscope optics, in particular the objective 8, into separated partial beams with a fixed angular relationship to one another and guided by the deflection unit 5 onto stationary partial beams D 1.
  • the manipulation means 7, which has been passed backwards by the sample light performs an inverse manipulation, so that after transmission through the main beam splitter 4, an invariant imaging of the sample light onto the confocal matrix
  • Detectors 10 by a correspondingly executed optics 6 is possible.

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Abstract

Konfokale Multifleck-Rastermikroskope (1) mit einer Multistrahllichtquelle (2), konfokalen Detektoren (10), einem Strahlteiler (4) zum Koppeln des Beleuchtungsstrahlengangs (B) und des Detektionsstrahlengangs (D) zu einem gemeinsamen Strahlengang (C), einer einstellbaren Ablenkeinheit (5) und einem Mikroskopobjektiv (8) haben den Nachteil, dass die Eigenschaften des Bildfelds nicht auf dieselbe Weise wie bei einem Einzelfleck-Rastermikroskop durch entsprechende Ansteuerung der Ablenkeinheit modifiziert werden können, ohne dass sich die relative Lage der Flecken untereinanderändert. Zur Lösung ist vorgesehen, dass im gemeinsamen Strahlengang (C) zwischen dem Hauptstrahlteiler (4) und der Ablenkeinheit (5) Mittel (7) zur Manipulation einer räumlichen Lage der Teilstrahlen oder zur Manipulation einer Phasenlage der Teilstrahlen relativ zueinander angeordnet sind. Dadurch können Bildfeldeigenschaften variiert werden, ohne die relative Lage der Flecken untereinander zu ändern. Konfokale Mikroskopie.

Description

Konfokales Auflicht-Rastermikroskop zur Multifleck-Abtastung
Die Erfindung betrifft ein konfokales Rastermikroskop (engl,„scanning microscope"), aufweisend einen Beleuchtungsstrahlengang mit einer konfokalen
Multistrahllichtquelle (engl,„multi-beam light source"), einen Detektionsstrahlengang mit konfokalen Detektoren, einen Strahlteiler, der den Beleuchtungsstrahlengang und den Detektionsstrahlengang zu einem gemeinsamen Strahlengang koppelt, eine einstellbare Ablenkeinheit im gemeinsamen Strahlengang und ein Mikroskopobjektiv zur Fokussierung der Teilstrahlen der Multistrahllichtquelle in eine Probenebene, ebenfalls im gemeinsamen Strahlengang. Zweckmäßigerweise umfassen solche Mikroskope auch eine Abtastoptik (engl,„scan optics") und eine Tubuslinse zwischen der Ablenkeinheit und dem Mikroskopobjektiv.
Im Sinne der Erfindung ist ein Detektor konfokal, wenn er selbst oder eine ihm vorgeschaltete Blende in (oder in der Nähe) einer konfokalen Ebene angeordnet ist. Konfokal bedeutet hierbei, dass in einer zur probenseitigen Brennebene des
Objektivs optisch konjugierten Ebene des Detektionsstrahlengangs eine Blende zur Beschränkung der Lichtaufnahme auf ein kleines„Zielvolumen" am Probenort angeordnet ist. Entsprechendes gilt für eine konfokale Multistrahllichtquelle.
Eine Multistrahllichtquelle ist ein Mittel, in dem in räumlich separaten Bereichen einer Raumebene gleichzeitig oder zumindest zeitlich überlappend Licht a) emittiert wird oder b) aus mehreren Öffnungen oder optischen Elementen wie Linsen oder
Strahlteiler tritt. In jedem Fall sind diese Bereiche der Lichtemission beziehungsweise des Lichtaustritts, die die in der Probe resultierenden Beleuchtungsflecken (engl, „spots") definieren, relativ zueinander lagefest. Die Öffnungen können jedoch
(kontinuierlich oder diskret) größenveränderlich sein, wodurch sich jedoch ihre relative Lage zueinander nicht ändert.
Licht ist im Sinne der Erfindung jede mit optischen Mitteln manipulierbare Strahlung, insbesondere auch ultraviolette (UV) und infrarote (IR) Strahlung. Als Lichtquelle werden typischerweise ein oder mehrere Laser eingesetzt. Das Mikroskop wird dann als„multifokales Laser-Scanning-Mikroskop" bezeichnet. Anstelle eines oder mehrerer Laser können auch Nichtlaserquellen wie Leuchtdioden (engl,„light- emitting diodes"; LED) entsprechend angeordnet sein.
Typischerweise umfasst die Ablenkeinheit zwei Ablenkspiegel
(Galvanometerspiegel), die um zueinander orthogonale Achsen beweglich sind. Die Ablenkeinheit ermöglicht so das Abtasten (engl,„scanning") der Probe entlang eines Rasters durch Verkippen des gemeinsamen Strahlengangs, was zu einer simultanen Parallelverschiebung der beleuchteten Zielvolumina („Fleckenmuster") auf der Probe führt, währenddessen mittels der im Detektionsstrahlengang angeordneten
Detektoren konfokal Probenlicht von jedem der simultan beleuchteten Probenorte aufgenommen wird. Die Ablenkeinheit kann auch nur einen beweglichen Spiegel, der um nur eine oder um zwei Achsen beweglich ist wie in US 2007/127003 A1 , umfassen.
Der mittels der Ablenkeinheit während eines Abtastvorgangs abgerasterte Bereich der Probe wird als Abtastfeld bezeichnet, während das durch einen einzelnen der mehreren Fleck abgerasterte Gebiet als jeweiliges Rasterfeld bezeichnet wird. Da aus den im Abtastfeld aufgenommenen Detektionswerten ein Bild zusammengesetzt werden kann, wird es auch als Bildfeld bezeichnet.
Die bekannten Multifleck-Rastermikroskope haben den Nachteil, dass die
Eigenschaften des Bildfelds nicht auf dieselbe Weise wie bei einem Einzelfleck- Rastermikroskop durch entsprechende Ansteuerung der Ablenkeinheit modifiziert werden können. So kann das Bildfeld beispielsweise bei einem Einzelfleck- Rastermikroskop durch unterschiedliche relative Einstellung der
Abtastgeschwindigkeiten entlang der Abtastachsen, also unterschiedliche
Drehgeschwindigkeiten der Ablenkspiegel, gedreht werden. Bei einem Multifleck- Rastermikroskop führt eine Änderung der relativen Abtastgeschwindigkeiten jedoch zu einer Änderung der relativen Lage der Flecken untereinander, insbesondere zu unterschiedlichen Abständen benachbarter Flecken. Darüber hinaus legen die festen Abstände der Flecken in der Probenebene die multifokal abtastbare minimale
Bildfeldgröße fest, während sie bei einem Einzelfleck-Rastermikroskop durch unterschiedliche Einstellung der Auslenkungsweite (Amplitude) der Ablenkspiegel variabel ist. Zur Beeinflussung der Abtastrichtung in einem Einzelfleck-Rastermikroskop beschreibt beispielsweise JP 8334698 A, im gemeinsamen Strahlengang zwischen der Ablenkeinheit und dem Objektiv ein Dove-Prisma anzuordnen. Aus
US 2006/012875 A1 ist es zudem bekannt, in einem konfokalen Rastermikroskop mit linienförmiger Beleuchtung und Detektion zur Bildfelddrehung ein Abbe-König-Prisma in einer Pupille des gemeinsamen Strahlenganges zwischen Hauptfarbteiler und Probe anzuordnen. Auf diese Weise kann insbesondere ein ausgewählter Bereich (engl,„region of interest", ROI) gedreht werden. Bei der Detektion von Probenlicht wird die Drehung durch dasselbe Prisma wieder aufgehoben.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, auch Mikroskope der eingangs genannten Art zu verbessern, so dass mindestens eine Bildfeldeigenschaft variabel eingestellt werden kann.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Mikroskop, welches die in Anspruch 1 oder 1 1 angegebenen Merkmale aufweist.
Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
Beispielsweise kann es sich bei der Multistrahllichtquelle wie in US 6,028,306 um eine relativ zum Hauptstrahlteiler feststehende Multiaperturenplatte handeln, der eine einzelne Lichtquelle vorgeschaltet ist, welche mehrere (oder alle) der Öffnungen (Aperturen) der Platte simultan beleuchtet. Der Offenbarungsgehalt von
US 6,028,306 bezüglich der Ausgestaltung von Rastermikroskopen mit lagefester Multistrahllichtquelle wird hier in vollem Umfang einbezogen. Weiterhin ist es auch möglich mit besagter Lichtquelle eine Matrix aus Mikrolinsen zu beleuchten, wie beispielsweise gezeigt von Bewersdorf et al. in„Handbook of Biological Confocal Microscopy" (James B. Pawley), dritte Auflage, S. 550 (2006). Alternativ zu einer Multiaperturenplatte oder einer Mikrolinsenmatrix kann es sich bei der
Multistrahllichtquelle beispielsweise um eine Matrix (engl,„array") aus beanstandeten Lichtquellen, beispielsweise räumlich getrennte Laserdioden oder VCSEL, handeln. Des weiteren ist es auch möglich, wie beispielsweise in US 6,219,179 B1 aus einer einzelnen in das System eingekoppelten Laserlichtquelle durch Strahlteilungsmechanismen eine Vielzahl annähernd gleich intensiver Strahlen zu erzeugen. Der Multistrahllichtquelle kann eine Kollinnationsoptik nachgeschaltet sein.
Die konfokale Multistrahllichtquelle wird von dem Objektiv auf die Probe abgebildet. Die Lichtquelle dient dabei typischerweise zur (multifokalen) Fluoreszenzanregung eines in der Probe enthaltenen Fluoreszenzfarbstoffs in den beleuchteten Flecken, die daraufhin Fluoreszenzlicht emittieren, welches von dem Objektiv auf die den Flecken zugeordneten Detektoren abbildet. Das längs des
Beleuchtungsstrahlengangs zur Probe geleitete Licht wird als Beleuchtungslicht, das von der Probe reflektierte, gestreute und emittierte Licht wird als Probenlicht bezeichnet. Erzeugt die Multistrahllichtquelle durch das Objektiv N x M beleuchtete Flecken auf der Probe, so werden mindestens N x M separate konfokale Detektoren benötigt. Beispielsweise können zu diesem Zweck im Detektionsstrahlengang eine identische Multiaperturenplatte wie in der Multistrahllichtquelle und hinter den
Öffnungen ein jeweiliger Detektor angeordnet sein.
Erfindungsgemäß ist zur Lösung der Aufgabe vorgesehen, dass im gemeinsamen Strahlengang zwischen dem Hauptstrahlteiler und der Ablenkeinheit Mittel zur Manipulation einer räumlichen Lage der Teilstrahlen angeordnet sind. Dadurch können vorteilhafterweise Bildfeldeigenschaften variierbar gestaltet werden.
Gemäß einer ersten, besonders bevorzugten Ausführungsform bestimmen die Mittel zur Manipulation der räumlichen Lage der Teilstrahlen die relative Lage der
Teilstrahlen zueinander, insbesondere lateral zur optischen Achse der Teilstrahlen, wobei die relativen Abstände der resultierenden Lichtflecken zueinander in einer (allen) Bildebene(n) erhalten bleiben. Beispielsweise können durch die Mittel zur Manipulation die Teilstrahlen relativ zu einander verkippt werden (relative
Winkeländerung) und/oder es können die Abstände der Teilstrahlen zueinander verändert werden. In Verbindung mit einer entsprechend angepassten Steuerdaten für die Abtasteinheit gelingt so eine variable Bildfelddrehung.
In einer vorteilhaften ersten Ausgestaltungsvariante umfassen die Mittel zur
Manipulation der räumlichen Lage der Teilstrahlen ein einstellbar bildfelddrehendes Element, insbesondere ein drehbar gelagertes Abbe-König-Prisma oder ein Dove- Prisma oder ein Schmidt-Pechan-Prisma oder ein K-Spiegel. Auf diese Weise ist das Bildfeld in einem Multifleck-Rastermikroskop durch eine veränderliche Ausrichtung der Teilstrahlen zueinander rotierbar.
Das ist besonders vorteilhaft, wenn beispielsweise in elongierten Regionen der Probe schnelle Prozesse zu untersuchen sind. Liegen diese elongierten Regionen entlang der Zeilenabtastrichtung (höhere Abtastgeschwindigkeit als in Spaltenabtastrichtung), so lässt sich das Bildformat zugunsten einer erhöhten Framerate variieren,
beispielsweise durch eine Reduktion der Zeilenanzahl. Zu diesem Zweck kann durch eine erfindungsgemäße Drehung des Fleckenmusters kann die Zeilenabtastrichtung an die Orientierung der elongierten Region so angepasst werden, dass die lange Dimension der elongierten Region in Richtung des Zeilenabtastung orientiert ist. Eine angepasste Anzahl der abzutastenden Zeilen wird dann anhand der kurzen
Dimension der elongierten Region ermittelt. Auf diese Weise werden rechteckige Bilder abgetastet, deren Zeilenanzahl geringer als deren Spaltenanzahl ist. Dadurch ist der Zeitaufwand zur Erfassung der Information gegenüber dem nicht rotierten Abtastfeld aufgrund der reduzierten Zeilenanzahl geringer.
Des weiteren kann eine Bildfelddrehung vorteilhaft sein, wenn große
Bewegungsgeschwindigkeiten bei gerichteten Vesikelbewegungen unter großem Zoom zu untersuchen sind. In diesem Fall überstreicht jeder einzelne
Beleuchtungsfleck eine große Anzahl von Abtastzeilen, bevor die Teilbilder der individuellen Flecken aneinanderstoßen, wobei ein harter Sprung der Aufnahmezeit zwischen Ende des einen Teilbildes und dem Anschluss des darauffolgenden besteht. Dadurch können im Stand der Technik Bildartefakte aufgrund von schnellen Bewegungen auftreten. Beispielsweise kann dasselbe Vesikel zweimal im Bild Sichtbar werden. Solche Artefakte können erfindungsgemäß reduziert werden, indem die Richtung der Zeilenabtastung in eine vorgegebene Hauptbewegungsrichtung der betreffenden Probenbestandteile gelegt wird.
Ein weiterer vorteilhafter Aspekt der optischen Bildfelddrehung in einem Multifleck- Rastermikroskop liegt darin, dass das Fleckenmuster (in Verbindung mit einer Anpassung der Drehgeschwindigkeiten der Scanner mittels entsprechender
Steuerdaten für die Ablenkeinheit) auch derart ausrichtbar ist, dass das Abrastern der Probe längs einer Verbindungsgeraden zwischen zwei Flecken des Fleckenmusters erfolgt. Dadurch kann man mit einer Zeilenabtastung bis zu N-mal (oder M-mal) die gleiche Zeile aufnehmen. Insbesondere kann es für den Fall M=1 (eindimensional erstreckte Fleckenkette) von Vorteil sein, das Bildfeld so zu drehen, dass die Erstreckungsrichtung der Fleckenkette im Objektfeld orthogonal zur ihrer Erstreckungsrichtung in einer Ebene einer konfokalen Blende ist. In diesem Fall ist der zeitunterschied zwischen der Datenaufnahme von unmittelbar benachbarten Lichtflecken (n und n+1 ) am selben Probenort minimal. Für M>1 kann das
Fleckenmuster so gedreht werden, daß die Dimension mit der größeren Fleckanzahl in Richtung der Abtastzeilen liegt. Das kann beispielsweise für Auswertungen zur hochauflösenden Mikroskopie wie SOFI (Dertinger et al.: "Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI)" in Proc. Nat. Acad. Sei. USA (2009) 106(52):22287-22292) vorteilhaft eingesetzt werden, da in diesem Fall kaum Bewegungsartefakte zwischen den verschiedenen Zeilen auftreten. Solche im Stand der Technik unumgehbaren Artefakte wirken sich negativ auf die hochaufgelösten Bilder aus, da sie in die Korrelationen eingehen, die die Grundlage dieser Methoden darstellen.
Zweckmäßigerweise kann ein erfindungsgemäßes Mikroskop daher eine
Steuereinheit umfassen, die die Ablenkeinheit in Abhängigkeit einer Einstellung des bildfelddrehenden Elements steuert.
In einer vorteilhaften zweiten Ausgestaltungsvariante, die auch mit der ersten kombiniert werden kann, umfassen die Mittel zur Manipulation der räumlichen Lage der Teilstrahlen eine variable Zoomoptik. Das ermöglicht eine variable Anpassung der abtastbaren Bildfeldgröße durch Modifikation der Fleckabstände in der Probe relativ zueinander. Eine Veränderung der Fleckabstände relativ zueinander ermöglicht in vorteilhafter Weise eine Variabilität des minimalen Bildfeldes und zudem eine größere Untersetzung von Abtastfeldgrößen, die sich beispielsweise mittels der in US 7,385,165 vorgeschlagenen Methode oder davon abweichenden Methoden des Zusammensetzens (engl,„stitching") erschließen lassen.
Dabei ist zu beachten, dass eine deutliche Pupillenunterfütterung vermieden wird, da hierdurch die Auflösung des Mikroskops herabgesetzt wird. Günstigerweise führt eine (geringfügige) Unterfütterung der Pupille aber dazu, dass eine auf einem oder zwischen den Ablenkspiegeln ruhende Pupille gegenüber dem Referenzsystem verkleinert in die Objektivpupille abgebildet wird, wodurch die Relativwinkel der Teilstrahlen zueinander vergrößert werden. Daraus folgt wiederum, dass das minimale Bildfeld durch eine Pupillenunterfütterung vergrößert wird (Herauszoomen). Umgekehrt ist ein Hineinzoomen durch eine Vergrößerung der Ablenkspiegelpupille in die Objektivpupille genauso möglich. Randbedingungen an den Grad der Überbeziehungsweise Unterfüllung der Objektivpupille stellen sich über Lichtverluste, Auflösung und Kontraste. Ein Überfüllen der Objektivpupille bewirkt einerseits einen Verlust an Beleuchtungsintensität, andererseits werden durch das harte Abblenden des Anregungslichtes am Pupillenrand die Airy-Ringe stärker betont. Ein Unterfüllen der Pupille bewirkt wie schon erwähnt Auflösungsverluste durch eine Verbreiterung der PSF und birgt des weiteren die Gefahr von Fluoreszenzverlusten an
Aperturbegrenzungen im System, da die Objektivpupille vergrößert auf/zwischen die Ablenkspiegel abgebildet und die Objektivpupille durch die Fluoreszenz vollständig gefüllt wird. Vorzugsweise erfolgt die Unter- oder Überfüllung daher derart, dass der Verlust an Beleuchtungsintensität maximal 50% beträgt.
In einer vorteilhaften dritten Ausgestaltungsvariante, die auch mit der ersten und/oder der zweiten kombiniert werden kann, umfassen die Mittel zur Manipulation der räumlichen Lage der Teilstrahlen eine Teleskopoptik zur Erzeugung eines
Zwischenbilds und eine Matrix aus kontinuierlich in ihrer Reflexionsrichtung verstellbaren Reflexionselementen. Auf diese Weise können die resultierenden Flecklagen in der Objektebene relativ zueinander modifiziert werden, ohne die Punktübertragungsfunktion (engl,„point-spread function"; PSF) zu beeinflussen.
Vorzugsweise liegt in dieser Ausführungsform eine Hauptebene einer Austrittsoptik der Teleskopoptik außerhalb des Teleskops, insbesondere in der Matrix der
Reflexionselemente, insbesondere derart, dass alle teleskopisch abgebildeten Teilstrahlen auf unterschiedliche Reflexionselemente abgebildet werden. Das ermöglicht eine teilstrahlenindividuelle Manipulation mit hoher Genauigkeit.
Gemäß einer zweiten bevorzugten Ausführungsform bestimmen die Mittel zur Manipulation der räumlichen Lage der Teilstrahlen die relative Lage der Teilstrahlen zu einem vorgegebenen Punkt auf einem Achsstrahl, insbesondere auf einem
Achsstrahl in den Mitteln. Dadurch kann die Abbildung in die Probe optimiert eingestellt werden.
Vorzugsweise umfassen die Mittel zur Manipulation der räumlichen Lage der
Teilstrahlen in dieser Ausführungsform eine beweglich gelagerte, transparente, planparallele Platte. Auf diese Weise können die Teilstrahlen lateral verschoben werden, beispielsweise, um eine optimale Pupillenfüllung einstellen zu können.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung ist vorgesehen, dass der gemeinsame Strahlengang zwischen dem Hauptstrahlteiler und der Ablenkeinheit Mittel zur Manipulation einer Phasenlage der Teilstrahlen relativ zueinander umfasst. Das ermöglicht es, in einem konfokalen Mikroskop, welches aufgrund von
Mehrfachstrahlengängen nur ein begrenztes Bildfeld überträgt, Bildfeldeigenschaften zu manipulieren. Durch solche Mittel können beispielsweise Gangunterschiede zwischen den Teilstrahlen erzeugt werden, beispielsweise zum Zweck einer
Wellenfrontformung, einer Defokussierung oder zur Korrektur von (beispielsweise objektivabhängigen) Aberrationen, insbesondere sphärischen Fehlern.
Vorzugsweise umfassen die Mittel zur Manipulation einer Phasenlage der
Teilstrahlen einen räumlichen Lichtmodulator. Das ermöglicht die Manipulation der relativen Phasen der Teilstrahlen mit hoher Genauigkeit.
Vorteilhaft ist es auch, wenn die Mittel zur Manipulation einer Phasenlage der Teilstrahlen einen Membranspiegel umfassen. Ein Membranspiegel kann die
Phasenfronten der Teilstrahlen verändern und damit beispielsweise Abbildungsfehler unterschiedlicher Ordnungen (beispielsweise Sphäre, Coma, Astigmatismus) korrigieren. Daneben kann mittels eines Membranspiegels die Fokuslage in der Objektebene in gewissen Grenzen variieren. Man kann in konfokalen
Rastermikroskopen beispielsweise die Einstellung der Spiegelfläche anhand der resultierenden Bildhelligkeit optimieren.
Vorteilhafterweise können in allen Ausführungsformen und Ausgestaltungsvarianten die Mittel zur Manipulation (zumindest näherungsweise) in einer Pupillenebene (die zwischen dem Hauptstrahlteiler und der Ablenkeinheit liegt) oder zumindest in der Nähe einer solchen angeordnet sein. Dadurch wird die durch die Multistrahllichtquelle zunächst fest vorgegebene Strahlgeometrie auf dem Weg zum Objektiv modifiziert, ohne dass die Manipulation auf das gesamte Abtastfeld wirken muss. Des weiteren werden aufgrund der Umkehrbarkeit des Lichtweges im gemeinsamen Strahlengang Manipulationen der räumlichen Lage der Teilstrahlen auch für das Probenlicht wieder zurückgenommen, so dass die Abbildung auf die konfokalen Blendenanordnungen im Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang invariant bleibt.
Vorzugsweise umfasst der gemeinsame Strahlengang zu diesem Zweck Optiken zur Erzeugung der (zusätzlichen) Pupillenebene.
Die Erfindung umfasst auch Ausführungsformen, in denen das Mikroskopobjektiv mehrere Flecken aus einer reellen oder virtuellen Bildebene der Multistrahllichtquelle in die Probenebene abbildet.
Die Erfindung erleichtert insbesondere optisches Schwenken (engl,„panning") und die schnelle Auswahl vorgegebener ROI durch entsprechende Steuerung der
Ablenkeinheit.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. In den Zeichnungen zeigt:
Fig. 1 ein Auflicht-Rastermikroskop mit einer Multistrahllichtquelle.
In Fig. 1 ist ein multifokales LSM 1 mit einer Multistrahllichtquelle 2, in die mit einem Laser L eingekoppelt wird, dargestellt. Der Laser L ist beispielsweise über
Lichtwellenleiter an Koppelstellen lösbar mit dem Abtastmodul S des Mikroskops 1 verbunden, so dass er in den Beleuchtungsstrahlengang B eingekoppelt ist und an der Multistrahllichtquelle 2 eine Anzahl N x M von (näherungsweise gleich intensiven) Teilstrahlen B, erzeugt (beispielgebend sind drei dargestellt), die am Ausgang der Multistrahllichtquelle 2 eine feste räumliche Winkelbeziehung zueinander aufweisen. Im gemeinsamen Strahlengang C sind darüber hinaus beispielgebend Optiken 3 angeordnet, die eine zusätzliche Pupillenebene X zwischen dem Hauptstrahlteiler 4 und der Ablenkeinheit 5 (mit einem oder zwei nicht abgebildeten Ablenkspiegel) erzeugen (können in anderen Ausführungsformen, insbesondere bei anderen Arten der Manipulation der Teilstrahlen, entfallen). Der Hauptstrahlteiler 4 ist beispielsweise ein dichroitischer spektral separierender Strahlteiler und koppelt das
Beleuchtungslicht in den gemeinsamen Strahlengang C ein, so dass das
Anregungslicht über die Ablenkeinheit 5 in Richtung Probe gelangt. In der
Pupillenebene X ist als Mittel 7 zur („descannten") Manipulation einer räumlichen Lage der Teilstrahlen B, angeordnet. Der gemeinsame Strahlengang C weist darüber hinaus eine Abtastoptik (nicht abgebildet), eine Tubuslinse (nicht abgebildet) und ein Mikroskopobjektiv 8 zur Abbildung mehrerer Flecken aus einer Bildebene der
Multistrahllichtquelle 2 in eine Probenebene P auf. Der durch den Hauptstrahlteiler 4 mit dem Beleuchtungsstrahlengang B gekoppelte Detektionsstrahlengang D enthält im Detektionsmodul F eine Multiaperturenplatte als den Beleuchtungsflecken zugeordnete konfokale Detektionsblenden 9, wobei hinter jeder Blendenöffnung ein Detektor 10 angeordnet ist.
Da die N x M Lochblenden der Multiaperturenplatte fest zueinander in einer Ebene angeordnet sind, werden sie alle konfokal in die Probe P abgebildet. Die
Lochblenden sind hier beispielsweise einstellbar größenveränderlich, in anderen Ausführungsformen (nicht abgebildet) können sie eine (einheitliche) feste Größe oder unterschiedliche feste Größen aufweisen. Die Größe der Lochblenden legt die
Geometrie der Teilstrahlengänge B,, D, fest. Dies gilt für Anregungs- und
Detektionsstrahlen gleichermaßen, da diese im gemeinsamen Strahlengang C koaxial in entgegengesetzter Richtung verlaufen
Die Mittel 7 zur Manipulation der Lage der Teilstrahlen können beispielsweise ein bildfelddrehendes Prisma, eine Zoomoptik, ein Teleskop mit nachgeschaltetem schaltbaren Spiegelarray oder eine sequentielle Kombination dieser Elemente oder einer Untermenge derselben sein. In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Mittel 7 eine sequentiellen Anordnung aus allen vier genannten Elementen, wobei sich die Zoomoptik der Ablenkeinheit am nächsten befindet, gefolgt von dem bildfelddrehenden Prisma, welchem das Teleskop mit nachgeschalteter Spiegelmatrix nachgestellt ist. Enthalten die Mittel 7 ein Teleskop, so bezeichnet X eine Zwischenbildebene, während X' eine (zusätzliche) Pupillenebene ist.
Nach dem Passieren des Manipulationsmittels 7 treffen sich vorzugsweise alle in fester Winkelbeziehung zueinander stehenden Teilstrahlen B, in einer gemeinsamen Pupille (nicht bei dem Teleskop mit nachgestellter Spiegelmatrix), in welcher ein erster Ablenkspiegel der Ablenkeinheit 5 angeordnet ist, die die durch das
Mikroskopobjektiv 8 abgebildeten separaten Beleuchtungsflecken über die Probe rastern. Die gemeinsame Pupille kann (vorzugsweise bei einer Fleckenkette als Fleckenmuster) auf einer Oberfläche eines Ablenkspiegels oder, sofern zwei Ablenkspiegel vorhanden sind, zwischen den beiden Ablenkspiegeln liegen. Im Fall M=1 (Fleckenkette) liegt die gemeinsame Pupille vorzugsweise auf demjenigen Ablenkspiegel, der die Teilstrahlen in Längsrichtung der Fleckenkette ablenkt.
Insbesondere kann bei zwei Ablenkspiegeln der eine Ablenkspiegel auf den anderen abgebildet werden.
In der Probe erzeugtes Fluoreszenzlicht wird durch die Mikroskopoptik, insbesondere das Objektiv 8, in separierte Teilstrahlen mit fester Winkelbeziehung zueinander kollinniert und durch die Ablenkeinheit 5 auf ortsfeste Teilstrahlen D, gelenkt. Danach nimmt das vom Probenlicht rückwärts durchlaufene Manipulationsmittel 7 eine inverse Manipulation vor, so dass nach Transmission durch den Hauptstrahlteiler 4 eine invariante Abbildung des Probenlichtes auf die Matrix aus konfokalen
Detektoren 10 durch eine entsprechend ausgeführte Optik 6 möglich ist.
Bezugszeichenliste
1 Rastermikroskop
2 Multistrahllichtquelle
3 Pupillenerzeugungsoptik
4 Hauptstrahlteiler
5 Ablenkeinheit
6 Detektionsoptik
7 Mittel zur Manipulation einer räumlichen Lage der Teilstrahlen
8 Mikroskopobjektiv
9 Konfokale Detektionsblenden
10 Detektor
L Laser
S Abtastmodul
M Mikroskopmodul
F Detektionsmodul
B Beleuchtungsstrahlengang
D Detektionsstrahlengang
C Gemeinsamer Strahlengang
X Zusätzliche Pupillenebene (Zwischenbildebene im Falle eines Teleskops)
X' Zusätzliche Pupillenebene im Falle eines Teleskops
P Probenebene

Claims

Patentansprüche
1 . Konfokales Rastermikroskop (1 ), aufweisend einen
Beleuchtungsstrahlengang (B) mit einer Multistrahllichtquelle (2) zur Erzeugung eines jeweiligen Teilstrahls für unterschiedliche Flecken, einen
Detektionsstrahlengang (D) mit konfokalen Detektoren (10), einen
Strahlteiler (4), der den Beleuchtungsstrahlengangs (B) und den
Detektionsstrahlengang (D) zu einem gemeinsamen Strahlengang (C) koppelt, sowie im gemeinsamen Strahlengang (C) eine einstellbare Ablenkeinheit (5) und ein Mikroskopobjektiv (8) zur Fokussierung der Teilstrahlen der
Multistrahllichtquelle (2) in eine Probenebene (P), dadurch gekennzeichnet, dass im gemeinsamen Strahlengang (C) zwischen dem Hauptstrahlteiler (4) und der Ablenkeinheit (5) Mittel (7) zur Manipulation einer räumlichen Lage der Teilstrahlen angeordnet sind.
2. Mikroskop (1 ) nach Anspruch 1 , wobei die Mittel (7) zur Manipulation der
räumlichen Lage der Teilstrahlen die relative Lage der Teilstrahlen zueinander bestimmen, insbesondere lateral zur optischen Achse der Teilstrahlen, wobei die relativen Abstände der resultierenden Lichtflecken zueinander in einer Bildebene erhalten bleiben.
3. Mikroskop (1 ) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Mittel (7) zur Manipulation der räumlichen Lage der Teilstrahlen ein einstellbar
bildfelddrehendes Element umfassen.
4. Mikroskop (1 ) nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei das bildfelddrehende Element ein drehbar gelagertes Abbe-König-Prisma oder ein Dove-Prisma ist.
5. Mikroskop (1 ) nach Anspruch 3 oder 4, umfassend eine Steuereinheit, die die Ablenkeinheit in Abhängigkeit einer Einstellung des bildfelddrehenden Elements steuert.
6. Mikroskop (1 ) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Mittel (7) zur Manipulation der räumlichen Lage der Teilstrahlen eine variable Zoomoptik umfassen.
7. Mikroskop (1 ) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Mittel (7) zur Manipulation der räumlichen Lage der Teilstrahlen eine Teleskopoptik zur Erzeugung eines Zwischenbilds und eine Matrix aus kontinuierlich in ihrer
Reflexionsrichtung verstellbaren Reflexionselementen umfassen.
8. Mikroskop (1 ) nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei eine Hauptebene
einer Austrittsoptik der Teleskopoptik außerhalb des Teleskops liegt,
insbesondere in der Matrix der Reflexionselemente, insbesondere derart, dass alle teleskopisch abgebildeten Teilstrahlen auf unterschiedliche
Reflexionselemente abgebildet werden.
9. Mikroskop (1 ) nach Anspruch 1 , wobei die Mittel (7) zur Manipulation der
räumlichen Lage der Teilstrahlen die relative Lage der Teilstrahlen zu einem vorgegebenen Punkt auf einem Achsstrahl, insbesondere auf einem Achsstrahl in den Mitteln (7), bestimmen.
10. Mikroskop (1 ) nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei die Mittel (7) zur
Manipulation der räumlichen Lage der Teilstrahlen eine beweglich gelagerte, transparente, planparallele Platte umfassen.
1 1 . Konfokales Rastermikroskop (1 ), aufweisend einen Beleuchtungsstrahlengang (B) mit einer Multistrahllichtquelle (2) und einer dieser nachgeschalteten
Kollimationsoptik zur Erzeugung eines jeweiligen Teilstrahls für unterschiedliche Flecken, einen Detektionsstrahlengang (D) mit konfokalen Detektoren (10), einen Strahlteiler (4), der den Beleuchtungsstrahlengangs (B) und den
Detektionsstrahlengangs (D) zu einem gemeinsamen Strahlengang (C) koppelt, sowie im gemeinsamen Strahlengang (C) eine einstellbare Ablenkeinheit (5) und ein Mikroskopobjektiv (8) zur Fokussierung der Teilstrahlen der
Multistrahllichtquelle (2) in eine Probenebene (P), dadurch gekennzeichnet, dass der gemeinsame Strahlengang (C) zwischen dem Hauptstrahlteiler (4) und der Ablenkeinheit (5) Mittel (7) zur Manipulation einer Phasenlage der Teilstrahlen relativ zueinander umfasst.
12. Mikroskop (1 ) nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei die Mittel (7) zur
Manipulation einer Phasenlage der Teilstrahlen ein räumlichen Lichtmodulator umfassen.
13. Mikroskop (1 ) nach Anspruch 1 1 oder 12, wobei die Mittel (7) zur Manipulation einer Phasenlage der Teilstrahlen einen Membranspiegel umfassen.
14. Mikroskop (1 ) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Mittel (7) zur Manipulation in einer Pupillenebene angeordnet sind.
15. Mikroskop (1 ) nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei der gemeinsame
Strahlengang (C) Optiken zur Erzeugung der Pupillenebene umfasst.
16. Mikroskop (1 ) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das
Mikroskopobjektiv mehrere Flecken aus einer reellen oder virtuellen Bildebene der Multistrahllichtquelle (2) in die Probenebene (P) abbildet.
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