WO2013045065A1 - Laser-scanning-mikroskop - Google Patents

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WO2013045065A1
WO2013045065A1 PCT/EP2012/003971 EP2012003971W WO2013045065A1 WO 2013045065 A1 WO2013045065 A1 WO 2013045065A1 EP 2012003971 W EP2012003971 W EP 2012003971W WO 2013045065 A1 WO2013045065 A1 WO 2013045065A1
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WO
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laser scanning
scanning microscope
microscope according
image
pinhole
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PCT/EP2012/003971
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Daniel Schwedt
Tiemo Anhut
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Carl Zeiss Microscopy Gmbh
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Publication date
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    • G02B21/008—Details of detection or image processing, including general computer control

Definitions

  • the invention relates to a laser scanning microscope (LSM) which simultaneously scans a sample with a plurality of spots and thus enables a shortened image acquisition time.
  • LSM laser scanning microscope
  • confocal filtering is a critical parameter, especially regarding the variability of pinhole sizes.
  • the Pinholeabstand is fixed, which in particular provides high adjustment and stability requirements for the respective beam paths or a variability of the examined scan field no longer permits. Furthermore, even with a desired switching of a multifocal mode of operation and the
  • the proposed inventive solution to the problem concerns a multifocal LSM whose foci are arranged on a line and their number (about 4 - 8) is not too large to keep the production costs in the frame.
  • the degree of parallelization the number of
  • Slit diaphragm implemented an optical arrangement, which is the geometric Orientation of the individual dot images with respect to the orientation of the overall image (dot image chain) rotates by 90 °.
  • the (possibly diffraction-limited) image takes place in a second pinhole plane, in which again a variable slit diaphragm
  • the segmented image rotating means must be in a position of
  • Beam path are arranged where each partial beam is individually treatable.
  • Fig.1a shows an arrangement of 4 by 45 ° rotated Dove prisms DP, bottom in front view and top plan view from above. These prisms are each mounted in a groove in a support body VB (hatched) to ensure their uniform orientation, to eliminate height misalignments and to arrange the prisms on impact can.
  • a dove prism is a truncated, right-angled prism. It is a kind of reflection prism in which incoming light undergoes a total internal reflection after passing through the first inclined surface; after that, it reflects along the longer lower surface and exits at the second inclined surface. The exit image is upside down but not laterally offset.
  • Dove prism shows the property that it rotates the figure by two times the prism rotation angle. Dove prisms are extremely useful as image rotators in areas such as astronomy, interferometry and pattern and pattern recognition.
  • each of the beam path is shown in dashed lines.
  • the arrow orientations indicate the change in orientation of the respective
  • the four individual beams and dot images undergo a rotation of 90 degrees each.
  • Catheter surface leaves the prism, wherein the image information of each beam was also rotated as in Fig. 1 a) by 90 °.
  • LSM laser scanning microscope
  • Partial beams per se are not the subject of the invention (see illustration of the prior art above).
  • the illumination 1 reaches scanning mirrors (4x, 4y), which scanned the laser spots over the sample (6) whose foci are generated by the microscope objective (5).
  • a scanner (x) moves the laser spots perpendicular to its connection axis over the sample, the other (y) shifts the spots along its longitudinal axis to realize another scan in the X direction.
  • Fluorescent light (2) emitted from these foci and further sample light is collimated by the objective (5) into corresponding sub-beams, which pass through the lens
  • Scan mirror (4x, 4y) scanned i. be directed to stationary beams.
  • the fluorescent light passes through the beam splitter (3) in transmission and is imaged by means of two Pinholeoptiken (7) in two intermediate images.
  • each one variably adjustable in its opening slit (8) is positioned.
  • the image orientations of the single point images are rotated by 90 ° relative to the orientation of the overall image by means of the arrangement (9) according to the invention.
  • the fluorescence (2) is electronically registered by means of a detector array (10).
  • variable slit apertures 8 can hereby be oriented parallel in their slit longitudinal extent if the individual dot images are rotated separately in their orientation, as shown in FIG. 1, but they can also be oriented perpendicular to one another when the row of dot images together in their orientation is rotated, as will be described in the other versions.
  • FIG. 3 shows a monolithically producible invention
  • Arrangement 9 wherein the image rotation of each sub-beam takes place individually due to three 90 ° reflections.
  • the necessary micromirror MS1 -3 are milled into a glass block G, etched or introduced by laser ablation.
  • a Highly reflective coating is not necessary, as the angle of incidence of 45 ° on the micro mirror surfaces is already sufficient in BK7 for total reflection.
  • Fig. 3a shows the arrangement with four image-rotating segments in a glass block G in plan view with a partially enlarged single element.
  • Fig. 3b is an arrangement of three schematically and not to scale
  • Micromirrors as shown in Fig. 3a, shown in detail.
  • micromirrors MS1 -3 are each arranged at a 45-degree angle to the incidence normal, but differently oriented in their position relative to one another.
  • the incident beam Se is deflected upward at MS1, undergoes a lateral deflection at MS2, and is parallel to MS3 at outgoing beam Sa.
  • FIG. 3c shows the beam path starting from the slit diaphragm plane through a image-rotating segment MS1-3 for the axis beam and the two marginal beams which are just propagating through the segment.
  • the scale ratios correspond to a positioning of the segmented
  • the beam path illustrates the image-rotating effect of the arrangement on a single partial beam.
  • the marginal rays are adjacent to each other in the paper plane and are superimposed by the first two reflections.
  • the third reflection no longer changes the relative orientation of the partial beams within a spot bundle, but rearranges the spot bundles next to each other on a line.
  • the optical axes of the spot bundle become about half a centimeter
  • the element 9 according to FIG. 3 could be replaced by another prefabricated one with a smaller spacing between the individual elements MS1 -3. 4:
  • FIG. 4 shows schematically the beam path through the entire arrangement for confocal filtering of the emitted from the sample
  • Fluorescent light (2) This is first imaged by the first lens of Pinholeoptik (7a) on the first slit (8a).
  • the second lens (7b) forms the two slit diaphragms (8a) and (8b) from each other, but the.
  • the lens (7b) can be implemented, for example, as a system of two Fourier lenses which first (the first lens) still produce a collimated beam path and then image (the second lens) on (8b). In Fig. 4, however, a single lens 7b is shown schematically. The third lens (7c) again collimates the fluorescent light, which is then passed on in the direction of the detector and possibly detection optics.
  • FIG. 5 shows in outline the principle of rearranging the spots within a linear spot array, as it can be advantageously achieved for example by the arrangement of several periscopic mirror levels.
  • a linear spot array as it can be advantageously achieved for example by the arrangement of several periscopic mirror levels.
  • the image orientation is indicated by the arrow direction.
  • the repositioning is done by means of a 90 ° rotation of the orientation axis of the spot array.
  • the slit diaphragms 8a, 8b would be oriented 90 degrees to each other.
  • each on dark drawn reflective surfaces run two 90 ° deflections and thus introduce a periscopic beam offset in each beam path.
  • Periscope prism level P1, P4, P6 deflected into the new vertical target planes.
  • S1, S3 and S4 are offset laterally, S2 retains its position, but it is also conceivable, without restriction, to move S1 -S4 sideways.
  • the second Periskopprismenviation P2, P3 P4, P5, P6 rearranges the spots by each lateral offset in a plane perpendicular to the output plane E1 oriented plane E2.
  • S2 is only offset laterally.
  • a partial beam matrix or a partial beam array can also be realized,

Abstract

Laser-Scanning-Mikroskop (LSM) bestehend aus mindestens einer Lichtquelle, von der ein Beleuchtungsstrahlengang in Richtung einer Probe ausgeht, mindestens einem Detektionsstrahlengang zur Übertragung von Probenlicht vorzugsweise Fluoreszenzlicht, auf eine Detektoranordnung aus mindestens einem Detektor, einem ersten Pinhole zur konfokalen Filterung vor der Detektoranordnung einem Scanner zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen dem Beleuchtungslicht und der Probe in mindestens einer Richtung, einem Mikroskopobjektiv, wobei zur Probenbeleuchtung mindestens zwei Beleuchtungsstrahlen im Beleuchtungsstrahlengang erzeugt sind, die als Beleuchtungspunkte vom Mikroskopobjektiv in einer Probenebene fokussiert sind dadurch gekennzeichnet, dass und neben dem ersten Pinhole, das vorzugsweise verstellbar, spaltförmig ausgebildet ist, ein zweites vorzugsweise verstellbares, spaltförmiges Pinhole optisch konjugiert zum ersten Pinhole diesem im Detektionsstrahlengang nachgeordnet ist und zwischen erstem und zweitem Pinhole eine Einrichtung zur Drehung der Orientierung der Beleuchtungsstrahlen angeordnet ist.

Description

Titel: Laser-Scanning-Mikroskop
Stand der Technik und dessen Nachteile
Die Erfindung betrifft ein Laser-Scanning-Mikroskop (LSM), das mit mehreren Spots gleichzeitig eine Probe abrastert und so eine verkürzte Bildaufnahmezeit ermöglicht.
Ein derartiges Mikroskop ist beispielsweise in US 6028306 beschrieben.
Eine Einrichtung zur Mehrstahlerzeugung wurde beispielsweise in DE19904592 A1 beschrieben.
Zum allgemeinen Aufbau konfokaler LSM wird zusätzlich auf J. Pawley,„Handbook of biological confocal microscopy", Springer (2006) verwiesen. In einem LSM werden vor allem fluoreszierende Proben durch mindestens einen Laserspot oder eine Linie zum Leuchten angeregt, wobei der Spot oder die Linie über die Probe gerastert wird. Die von der Probe stammende Fluoreszenz wird auf eine konfokale Blende
abgebildet, welche Licht aus nicht fokalen Ebenen der Probe effektiv ausblendet. Durch die Blende transmittiertes Licht wird mit einem Photodetektor registriert und per Computer mittels der Ortsinformation aus der Laserpositionierung zu einem kontrastreichen Fluoreszenzbild der jeweiligen Fokalebene zusammengesetzt.
Durch Änderung der Fokalebene können dreidimensionale Bildstapel erzeugt werden.
Dem Scanvorgang inhärent ist eine relativ große Dauer bzgl. der Bildaufnahme. Der aus US 6028306 bekannte Ansatz, die konfokale Bildaufnahmerate zu
beschleunigen, ist das simultane Rastern der Probe mit mehreren Anregungsstrahlen in kleinen Regionen.
In diesem Fall ist die konfokale Filterung ein kritischer Parameter, insbesondere bezüglich der Variabilität der Pinholegrößen.
Viele vorgeschlagene Lösungen geben einfach feste Pinholegrößen vor, was jedoch nachteilig ist, wenn durch die Applikation, d. h. kundenseitig, eine große Anzahl von möglichen Objektiven verlangt wird, da die Größe des Fluoreszenzspots in der Pinholeebene von der Größe der Objektivpupille abhängt.
Zudem liegt dann der Pinholeabstand fest, was insbesondere hohe Justier- und Stabilitätsanforderungen an die jeweiligen Strahlengänge stellt oder eine Variabilität des betrachteten Scanfeldes gar nicht mehr zulässt. Weiterhin ist auch bei einem gewünschten Umschalten von einer multifokalen Arbeitsweise und dem
konventionellen LSM-Betrieb die maximale Größe eines Pinholes immer durch den Abstand, in diesem Fall schaltbarer, Pinholes begrenzt.
Problemstellung
In einem konfokalen Laserscanningmikroskop (LSM) mit multifokaler Anregung der Probe soll vollständige Konfokalität hergestellt werden, wobei Justierungstoleranzen der individuellen Strahlengänge bzw. der Relativpositionen der Konfokalblenden zueinander nicht in deutlichen Helligkeitsunterschieden resultieren sollen.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der unabhängigen Patentansprüche gelöst. Bevorzugte Weiterbildungen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
Problemlösung
Die hier vorgeschlagene erfinderische Lösung der Problemstellung betrifft ein multifokales LSM dessen Foki auf einer Linie angeordnet sind und deren Anzahl (ca. 4 - 8) nicht allzu groß ist, um den Fertigungsaufwand im Rahmen zu halten. Vom Aufwand abgesehen ist dem Grad der Parallelisierung (der Anzahl der
Anregungsstrahlen) aber kein prinzipielles Limit gesetzt. Die vorgeschlagene Lösung des Problems nutzt vorteilhaft aus, dass die Fluoreszenzspots in der Pinholeebene ortsfest liegen und linear angeordnet sind. Es werden erfindungsgemäß nun zwei Pinholeebenen erzeugt, die also zueinander optisch konjugiert sind, in denen jeweils eine veränderliche Blende, vorzugsweise eine Spaltblende angeordnet wird. Diese beiden Spaltblenden sind in ihrer Ausrichtung parallel zueinander oder auch senkrecht zueinander, wenn ein Periskop zur Aufrechterhaltung der Orientierung zwischen ihnen angeordnet ist. Eine einfache Drehung der Spotreihe, wie sie zum Beispiel in einem einfachen Periskop mit zwei Spiegeln realisiert wird, würde jedoch darin resultieren, dass beide Spalten auf die jeweils gleiche Raumrichtung einwirken und die Konfokalität in dieser Richtung quasi doppelt bestimmen.
Aus diesem Grund wird erfindungsgemäß in Detektionsrichtung hinter der ersten
Spaltblende eine optische Anordnung implementiert, welche die geometrische Orientierung der individuellen Punktbilder in Bezug auf die Orientierung des Gesamtbildes (Punktbildkette) um 90° dreht.
Dies kann auf zwei verschiedene Arten erfolgen:
1. Individuelle Drehung der Punktbilder mittels eines Arrays von vorzugsweise miniaturisierten bildfelddrehenden Prismen.
2. Umordnung der Punktbilder der gesamten Spotreihe mittels periskopischer
Spiegelanordnungen, ohne die Bildorientierung zu modifizieren.
Nach der Bildumordnung erfolgt die (möglichst beugungsbegrenzte) Abbildung in eine zweite Pinholeebene, in der wiederum eine veränderliche Spaltblende
angeordnet ist.
Auf diese Weise erfolgt in zwei orthogonalen Bildrichtungen eine vollständig konfokale Filterung, wobei auch Pinholefertigungs-toleranzen keine Auswirkungen auf die Bildqualität haben. Zudem ist in geringen Grenzen eine Modifikation der Spotabstände ohne Verringerung der konfokalen Filterung zulässig und damit eine geringe Variabilität der Scanfeldgröße möglich, indem beispielsweise der Abstand der drehenden Prismen mit verändert wird.
Das segmentierte bilddrehende Mittel muss dabei in einer Position des
Strahlenganges angeordnet werden, wo jeder Teilstrahl individuell behandelbar ist.
Beschreibung der Abbildungen
Fig. 1 :
Die Abbildung in Fig.1a zeigt eine Anordnung aus 4 um 45° gedrehten Dove-Prismen DP, unten in Frontansicht und oben Draufsicht von oben. Diese Prismen sind jeweils in eine Nut in einem Auflagekörper VB (schraffiert) gelagert, um ihre gleichmäßige Orientierung zu gewährleisten, Höhenversätze auszuschließen und die Prismen auf Stoß anordnen zu können.
Ein Dove-Prisma ist ein gestutztes, rechtwinkliges Prisma. Es handelt sich um eine Art Reflexionsprisma, bei dem eintretendes Licht nach dem Durchlaufen der ersten geneigten Fläche eine totale interne Reflexion erfährt; danach reflektiert es entlang der längeren Unterfläche und tritt an der zweiten geneigten Fläche wieder aus. Das Austrittsbild steht auf dem Kopf, ist aber nicht lateral versetzt.
Ein Dove-Prisma zeigt die Eigenschaft, dass es, die Abbildung um den zweifachen Prismendrehungswinkels rotiert. Dove-Prismen sind äußerst nützlich als Bildrotatoren in Bereichen wie der Astronomie, der Interferometrie und zur Struktur- und Bildmustererkennung.
Im oberen Teil in Fig.1 ist jeweils der Strahlengang gestrichelt dargestellt.
Die Pfeilorientierungen deuten die Orientierungsänderung des betreffenden
Punktbildes beispielhaft an.
Durch die Dove-Prismen und ihre 45 Grad Lagerung erfahren die vier Einzelstrahlen und Punktbilder eine Drehung um jeweils 90 Grad.
Diese Anordnung würde somit in der oben beschriebenen Weise die konfokale Filterung in einem 4-fach Multifokal-LSM in den zwei Spaltblendenebenen (siehe die weiteren Abbildungen) ermöglichen.
Anstelle der Dove-Prismen sind ebenso Abbe-König-Prismen oder andere
bildfelddrehende (prismatische oder nichtprismatische) Elemente verwendbar.
Jedoch verlangen Dove-Prismen nach dem geringsten Bauraum und sind
monolithisch fertigbar.
Eine Vereinfachung in Bezug auf die Fertigung dieser Struktur ergibt sich auch, wenn anstatt der Dove-Prismen entsprechend dimensionierte 90°-Prismen verwendet werden wie in Fig. 1 b dargestellt.
Diese können dann auf einer der beiden Hypotenusenkanten um 45° geneigt werden und an den Dreiecksflächen (Stirnseiten) miteinander verkittet werden. Die Prismen werden dann von den Kathetenflächen her beleuchtet, brechen das Licht zur
Hypotenuse hin, wo es reflektiert wird und an der gegenüberliegenden
Kathetenfläche das Prisma verlässt, wobei die Bildinformation jedes einzelnen Strahlbündels ebenfalls wie in Fig. 1 a) um 90° gedreht wurde.
Fig. 2:
Die Abbildung in Fig. 2 zeigt die Anordnung der vorgeschlagenen
erfindungsgemäßen Komponente im Strahlengang eines Laser-Scanning- Mikroskops (LSM). Von einer nicht dargestellten Beleuchtungsquelle, vorzugsweise einem Laser emittiertes Licht (1) wird mittels eines Strahlteilers (3) auf einen Strahlengang zur Fluoreszenzanregung durch Reflektion an 3 aufgefädelt, wobei hier zu Gunsten der Übersichtlichkeit nur der Achsstrahl gezeigt ist, da die Erzeugung mehrerer
Teilstrahlen an sich nicht Gegenstand der Erfindung ist (Siehe Darstellung des Standes der Technik oben).
Die Beleuchtung 1 gelangt auf Scanspiegel (4x, 4y), die die Laserspots über die Probe (6) rastern, deren Fokusse durch das Mikroskopobjektiv (5) erzeugt werden. Ein Scanner (x) bewegt die Laserspots senkrecht zu ihrer Verbindungsachse über die Probe, der andere (y) verschiebt die Spots entlang ihrer Längsachse um eine weitere Abtastung in X Richtung zu realisieren.
Aus diesen Foki emittiertes Fluoreszenzlicht (2) und weiteres Probenlicht wird durch das Objektiv (5) in entsprechende Teilstrahlen kollimiert, welche durch die
Scanspiegel (4x, 4y) gescannt, d.h. auf ortsfeste Strahlen gelenkt werden.
Das Fluoreszenzlicht durchläuft den Strahlteiler (3) in Transmission und wird mittels zweier Pinholeoptiken (7) in zwei Zwischenbilder abgebildet. In diesen
Zwischenbildern ist jeweils eine variabel in ihrer Öffnung verstellbare Spaltblende (8) positioniert.
In einem Teilabschnitt des Strahlenganges, in dem auf alle Teilstrahlen individuell zugegriffen werden kann, werden mittels der erfindungsgemäßen Anordnung (9) die Bildorientierungen der Einzelpunktbilder relativ zu der Orientierung des Gesamtbildes um 90° gedreht. Schließlich wird die Fluoreszenz (2) mittels eines Detektorarrays (10) elektronisch registriert.
Die veränderlichen Spaltblenden 8 können hierbei in ihrer Spaltlängsausdehnung parallel orientiert sein, wenn die einzelnen Punktbilder separat in ihrer Orientierung gedreht werden, wie in Fig. 1 dargestellt, sie können aber auch zueinander senkrecht orientiert angeordnet sein, wenn die Reihe der Punktbilder zusammen in ihrer Orientierung gedreht wird, wie in den weiteren Ausführungen noch beschrieben wird.
Fig. 3a, b:
Die Abbildung in Fig.3 zeigt eine monolithisch erzeugbare erfindungsgemäße
Anordnung 9 wobei die Bilddrehung jedes einzelnen Teilstrahls einzeln aufgrund von drei 90° Reflexionen erfolgt. Die dazu notwendigen Mikrospiegel MS1 -3 werden dazu in einen Glasblock G gefräst, geätzt oder per Laserablation eingebracht. Eine hochverspiegelnde Beschichtung ist nicht von nöten, da der Einfallswinkel von 45° auf die MikroSpiegelflächen bereits in BK7 für Totalreflexion ausreichend ist. Fig. 3a zeigt dabei die Anordnung mit vier bilddrehenden Segmenten in einem Glasblock G in Draufsicht mit einem ausschnittsweise vergrößerten Einzelelement.
In Fig. 3b ist schematisch und nicht maßstabsgetreu eine Anordnung aus drei
Mikrospiegeln, wie in Fig. 3a enthalten, im Detail dargestellt.
Die Mikrospiegel MS1 -3 sind jeweils in einen 45 Grad Winkel zur Einfallsnormale angeordnet, aber unterschiedlich in ihrer Lage zueinander orientiert.
Der einfallende Strahl Se wird an MS1 nach obenabgelenkt, erfährt an MS 2 eine seitliche Ablenkung und wird an MS3 als ausgehender Strahl Sa parallel zur
Einfallsrichtung von S3 abgelenkt.
Die Abbildung in 3c zeigt den Strahlengang von der Spaltblendenebene ausgehend durch ein bilddrehendes Segment MS1-3 hindurch für den Achsstrahl und die beiden Randstrahlen, die gerade noch durch das Segment hindurch propagieren. Die Maßstabverhältnisse entsprächen einer Positionierung des segmentierten
Bilddrehers 2 mm hinter der ersten Spaltblende mit einer für LSM typischen numerischen Apertur der Pinholeoptik und einer Begrenzung des
korrespondierenden Pinholedurchmessers auf 200 m. Das entspricht einer hinreichend weiten Öffnung und stellt sicher, dass alle Teilstrahlen separat manipulierbar sind. Des Weiteren illustriert der Strahlengang die bilddrehende Wirkung der Anordnung auf einen einzelnen Teilstrahl. Auf der einlaufenden Seite der Anordnung liegen die Randstrahlen nebeneinander in der Papierebene und werden durch die ersten beiden Reflexionen übereinander gelegt. Die dritte Reflexion ändert an der relativen Orientierung der Teilstrahlen innerhalb eines Spotbündels nichts mehr, ordnet die Spotbündel aber wieder nebeneinander auf einer Linie an. Dabei werden die optischen Achsen der Spotbündel um etwa einen halben
Spotabstand gegeneinander versetzt. Der Spotabstand bleibt aber erhalten da jedes der Spotbündel, von denen nur eines dargestellt ist, um den gleichen Betrag versetzt ist.
Bei einer Änderung des Spotabstandes könnte beispielsweise das Element 9 nach Fig. 3 durch ein anderes vorgefertigtes mit geringerem Abstand zwischen den Einzelelementen MS1 -3 ersetzt werden. Fig. 4:
Die Abbildung in Fig. 4 zeigt schematisch den Strahlengang durch die gesamte Anordnung zur konfokalen Filterung des von der Probe ausgesandten
Fluoreszenzlichtes (2). Dieses wird zunächst durch die erste Linse der Pinholeoptik (7a) auf die erste Spaltblende (8a) abgebildet. Die zweite Linse (7b) bildet die beiden Spaltblenden (8a) und (8b) aufeinander ab, wobei aber die durch die
erfindungsgemäße Anordnung (9) erzeugten Strahlversätze und zusätzlichen
Glaswege in fachmännisch bekannter Weise berücksichtigt werden. Die Linse (7b) ist beispielsweise als ein System aus zwei Fourierlinsen implementierbar, welche zunächst (die erste Linse) noch einen kollimierten Strahlengang erzeugen und dann (die zweite Linse) auf (8b) abbilden. In Fig. 4 ist jedoch schematisch eine Einzellinse 7b dargestellt. Die dritte Linse (7c) kollimiert das Fluoreszenzlicht wieder, welches danach in Richtung Detektor und ggf. Detektionsoptik weiter geleitet wird.
Fig. 5:
Die Abbildung Fig. 5 zeigt skizziert das Prinzip der Umordnung der Spots innerhalb eines linearen Spotarrays, wie sie vorteilhaft beispielsweise durch die Anordnung mehrerer periskopischer Spiegelstufen erreicht werden kann. Hier erfolgt eine
Neupositionierung der Spots, ohne dass deren Bildorientierung verändert wird. Die Bildorientierung wird durch die Pfeilrichtung angezeigt. Die Neupositionierung erfolgt mittels einer 90°-Drehung der Orientierungsachse des Spotarrays. In diesem Fall würden die Spaltblenden 8a, 8b zueinander um 90 Grad orientiert stehen.
Fig. 6:
Diese Abbildung zeigt erfindungsgemäße Anordnungen P1 -7 mit rhomboiden
Prismen,
die jeweils an dunkel gezeichneten reflektierenden Flächen zwei 90°-Umlenkungen ausführen und so einen periskopischen Strahlversatz in jeden Teilstrahlengang einführen.
Im dargestellten Ausführungsbeispiel werden zunächst die Teilstrahlen aus der ursprünglichen Ebene, schematisch als E1 dargestellt, die durch Strahlrichtung und Orientierungsrichtung des Spotarrays definiert ist, mittels einer ersten
Periskopprismenstufe P1 , P4, P6 in die neuen vertikalen Zielebenen abgelenkt. Wie hier dargestellt werden nur S1 , S3 und S4 seitlich versetzt, S2 behält seine Lage, es ist jedoch ohne Einschränkung auch denkbar, S1 -S4 seitlich zu versetzen. Die zweite Periskopprismenstufe P2, P3 P4, P5, P6 ordnet die Spots durch jeweils seitliche Versetzung in einer senkrecht zur Ausgangsebene E1 orientierten Ebene E2 neu übereinander an. Hierbei wird S2 nur seitlich versetzt.
Die Erfindung ist nicht an die dargestellten Ausführungsformen gebunden.
Insbesondere kann neben der dargestellten Teilstrahlenanordnung in einer Ebene auch eine Teilstrahlenmatrix oder ein Teilstrahlenarray realisiert werden,
beispielsweise durch mehrere Anordnungen wie in Fig. 1 dargestellt übereinander und ein entsprechend angeordnetes Blendenarray (Pinholearray) in den beiden beschriebenen Raumrichtungen.

Claims

Patentansprüche
1.
Laser-Scanning-Mikroskop (LSM)
bestehend aus
mindestens einer Lichtquelle, von der ein Beleuchtungsstrahlengang in Richtung einer Probe ausgeht,
mindestens einem Detektionsstrahlengang zur Übertragung von Probenlicht vorzugsweise Fluoreszenzlicht, auf eine Detektoranordnung aus mindestens einem Detektor,
einem ersten Pinhole zur konfokalen Filterung vor der Detektoranordnung
einem Scanner zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen dem
Beleuchtungslicht und der Probe in mindestens einer Richtung,
einem Mikroskopobjektiv,
wobei zur Probenbeleuchtung mindestens zwei Beleuchtungsstrahlen im
Beleuchtungsstrahlengang erzeugt sind, die als Beleuchtungspunkte vom
Mikroskopobjektiv in einer Probenebene fokussiert sind
dadurch gekennzeichnet, dass
und neben dem ersten Pinhole ,das vorzugsweise verstellbar, spaltförmig
ausgebildet ist ein zweites, vorzugsweise verstellbares, spaltförmiges Pinhole optisch konjugiert zum ersten Pinhole diesem im Detektionsstrahlengang
nachgeordnet ist
und zwischen erstem und zweitem Pinhole eine Einrichtung zur Drehung der
Orientierung der Beleuchtungsstrahlen angeordnet ist.
2.
Laser-Scanning-Mikroskop nach Anspruch 1 mit einer Erzeugung zweier
Zwischenbildebenen im Detektionsstrahlengang zur konfokalen Filterung in denen erstes und zweites Pinhole angeordnet sind.
3.
Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche mit einer Positionierung je einer variablen Spaltblende in jeder Zwischenbildebene.
4.
Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Spaltblenden zueinander parallel ausgerichtet sind oder dieselbe Längsorientierung aufweisen.
5.
Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Spaltblenden zueinander senkrecht ausgerichtet sind oder eine zueinander senkrechte Längsorientierung aufweisen.
6.
Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche mit einer Positionierung einer bilddrehenden Einrichtung in einer Position zwischen den Zwischenbildebenen.
7.
Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Linsenoptik zur Erzeugung des zweiten Zwischenbildes ein 4f-Linsensystem ist.
8.
Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Linsenoptik zur Erzeugung des zweiten Zwischenbildes eine Einzellinse ist und wobei vorzugsweise das erste Zwischenbild in der doppelten Brennweite dieser Linse liegt.
9.
Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Einrichtung zur Drehung der Orientierung aus Bildfelddrehern besteht, vorzugsweise aus linear aufgereihten und um vorzugsweise 45° gedrehten bilddrehenden Prismen.
10.
Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die bilddrehenden Prismen Dove-Prismen sind.
11.
Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die bilddrehenden Prismen Abbe-König-Prismen sind.
12.
Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die bilddrehenden Prismen 90°-Prismen sind. Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die bilddrehenden Prismen in einer ortsfesten Nut eingebettet sind.
14.
Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Einrichtung zur Drehung der Orientierung aus nicht bilddrehenden periskopischen Spiegelanordnungen besteht, welche die Einzelspots ohne Änderung der
Orientierung umordnen und so die Ausrichtung der Spots in ihrer Verbindungsachse um vorzugsweise 90° drehen.
15.
Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Einrichtung zur Drehung der Orientierung aus Spiegelanordnungen besteht, die mittels vorzugsweise dreier 90° Reflexionen das Bild jedes einzelnen Spots um 90° drehen, jedoch die Orientierung der Verbindungsachse der Spots erhalten.
16.
Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die
Spiegelanordnungen monolithisch gefertigt sind.
17.
Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei monolithischen Teilanordnungen miteinander verkittet sind.
18.
Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein Beleuchtungsarray erzeugt wird, dass eine vorzugsweise matrixförmige
Lichtverteilung aufweist und vorzugsweise aus mindestens zwei Reihen oder Spalten von mindestens zwei Lichtquellen besteht.
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