DE19904592A1

DE19904592A1 - Optische Vorrichtung

Info

Publication number: DE19904592A1
Application number: DE19904592A
Authority: DE
Inventors: Tim Nielsen; Peter Andresen
Original assignee: LaVision GmbH
Current assignee: Lavision Biotec GmbH
Priority date: 1999-02-05
Filing date: 1999-02-05
Publication date: 2000-09-28
Anticipated expiration: 2019-02-06
Also published as: GB2346453B; DE19904592C2; FR2789498A1; FR2789498B1; US6219179B1; GB2346453A; GB0002685D0; JP4117594B2; JP2000275531A

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist eine optische Vorrichtung, insbesondere eines Rastermikroskops, mit einem Laser sowie mit mindestens einer optischen Anordnung zur Teilung des Laserstrahles in Teilstrahlen, wobei die optische Anordnung zur Teilung des Laserstrahles (1) in Teilstrahlen (5) mindestens einen im Strahlengang des Lasers (1) angeordneten teildurchlässigen Spiegel (2) und mindestens einen hochreflektierenden Spiegel (3, 4) umfaßt, wobei der teildurchlässige Spiegel (2) sich vor dem hochreflektierenden Spiegel (3, 4) befindet.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine optische Vorrichtung, insbesondere eines Rastermikroskopes, mit einem Laser, sowie mit mindestens einer optischen Anordnung zur Teilung des Laserstrahls in Teilstrahlen.

Eine optische Vorrichtung der eingangs beschriebenen Art ist, aus der DE 196 53 413 A1 bekannt. Hier werden mit einem aufgeweiteten Laserstrahl mehrere nebeneinander liegende Mikrolinsen (Mikrolinsenraster) beleuchtet, die aus dem einfallenden Strahl die Teilstrahlen ausbilden. Das bedeutet insbesondere, daß jeder der Teilstrahlen aus einem anderen Teil des Strahlprofils des einfallenden Strahls hervorgeht.

Die Teilstrahlen werden von den Mikrolinsen im Abstand ihrer Brennweite in einer oder mehreren dicht hintereinander liegenden Ebenen hinter dem Mikrolinsenraster fokussiert und breiten sich dann zum Objektiv hin aus, mit dem sie in die Probe fokussiert werden. Dabei überstrahlen die Teilstrahlen die Apertur des Objektivs. Anzahl und Abstand der Teilstrahlen ist bei dem bekannten Mikroskop durch die Beschaffenheit des Mikrolinsenrasters fest vorgegeben.

Typischerweise ist bei einer solchen optischen Vorrichtung zwischen der Lichtquelle für den Laserstrahl und einer, Probe eine Verzweigung des Strahlengangs der Teilstrahlen vorgesehen, so daß das von der Probe stammende Fluoreszenzlicht seitlich aus der Richtung der Teilstrahlen des Laserstrahls zu dem Photosensor ausgelenkt wird. Zur Auslenkung des Fluoreszenzlichts auf den Photosensor ist ein im Strahlengang angeordneter teildurchlässiger Umlenkspiegel vorgesehen.

Ein Problem des bekannten Mikroskops ist es, daß die einzelnen Teilstrahlen erheblich unterschiedliche Intensitäten besitzen. Laserstrahlen weisen eine Verteilung der Lichtintensität über den Strahlquerschnitt auf. Die in der Rastermikroskopie eingesetzten Laser haben typischerweise ein gaußförmiges Strahlprofil. Das heißt, daß die Teilstrahlen, die mit Hilfe eines Mikrolinsenrasters aus dem Zentrum des Laserstrahls ausgebildet werden, intensiver sind, als die Teilstrahlen, die aus dem Rand des aufgeweiteten Strahls ausgebildet werden. Das beobachtete Signal ist die Fluoreszenz, die durch die Teilstrahlen angeregt wird. Dieses Signal ist im. Falle von 1-Photonen-Anregung ebenso unterschiedlich wie die Intensität der anregenden Teilstrahlen. Bei nichtlinearen Mikroskopietechniken (2, 3 oder Mehr-Photonen-Anregung) tritt dieser Effekt quadratisch bzw. zur dritten Potenz in Erscheinung. Haben zum Beispiel zwei Teilstrahlen eine um einen Faktor 4 unterschiedliche Intensität, sind die von diesen Strahlen erzeugten Signale, um einen Faktor 4 (1-Ph.-Anr.), 16 (2-Ph.-Anr.) oder 64 (3-Ph.-Anr.) unterschiedlich. Dies stellt ein Problem der Erzeugung der Teilstrahlen durch Mikrolinsen, besonders in der nichtlinearen Rastermikroskopie, dar.

Ein weiteres Problem des bekannten Mikroskops ist es, daß die Auflösung, die erreicht wird, schlechter ist, als es der Beugungsbegrenzung des verwendeten Objektivs entspräche.

Die laterale Auflösung beider Rastermikroskopie ist durch die volle Halbwertsbreite der in der Probe erzeugten Foki gegeben. Bei dem bekannten Mikroskop wird die Größe der Foki nicht nur durch die Apertur des verwendeten Objektivs sondern auch durch Form und Größe der Mikrolinsen festgelegt, da die Mikrolinsen die begrenzende beugende Öffnung für jeden Teilstrahl darstellen. Dies bedeutet insbesondere, daß die Auflösung immer schlechter wird, wenn, die Anzahl der Teilstrahlen steigt, da sich dann die Größe der Mikrolinsen verringert und damit der Durchmesser der Foki steigt.

Zudem werden die Mikrolinsen nicht symmetrisch beleuchtet, sondern mit einem Teil des Strahlprofils des aufgeweiteten Laserstrahls, das im allgemeinen zum Rand hin abfällt. Dies führt dazu, daß auch die Foki in der Probe eine asymmetrische Intensitätsverteilung bekommen.

Da die Auflösung einen der wichtigsten Parameter bei der Mikroskopie darstellt, ist dies ein nicht unerhebliches Problem.

Ein weiteres Problem des bekannten Mikroskops ist es, daß die Energie des einfallenden Laserstrahls nicht vollständig genutzt wird.

Ein Teil des aufgeweiteten Laserstrahls wird vom Rand des Mikrolinsenrasters und vom Rand der einzelnen Mikrolinsen abgeschnitten. Diese Verluste summieren sich auf, so daß z. B. von 1.4 W Ausgangsleistung des Lasers nur etwa 125 mW (9%) die Probe erreichen (Jörg Bewersdorf, Rainer Pick, Stefan W. Hell, "Multifocal multiphoton microscopy", Optics Letters, Vol. 23, No. 9 (1998).

Der Verlust der Laserenergie reduziert die Effizienz des Mikroskops erheblich, da die benötigte Meßzeit vom Ausnutzungsgrad der Laserenergie abhängt.

Für biologische Anwendungen der Laserrastermikroskopie, bei denen Vorgänge in lebenden Zellen untersucht werden, ist auch die Meßzeit, die für ein. Bild benötigt wird, ein wichtiges Kriterium, weil sie die maximale Geschwindigkeit der Vorgänge, die noch beobachtbar sind, vorgibt. Die Untersuchung von Reizleitung in Nervenzellen (R. Yuste, W. Denk, "Dentritic spines as basic functional units of neuronal integration", Nature Vol. 375, pp. 682-684 (1995) ist ein Beispiel. Hier wird die Laserrastermikroskopie benötigt, um hochauflösende Bilder aus tief liegenden Schichten intakten Nervengewebes zu liefern. Diesem vorteilhaften Einsatz der Laserrastermikroskopie steht aber gegenüber, daß es die langsame Bildaufnahme verhindert, die Reizleitung in den Nervenzellen bildgebend zu verfolgen. Gelingt es daher die Geschwindigkeit der Bildaufnahme zu steigern, stellt dies eine Erweiterung des Einsatzbereichs der Laserrastermikroskopie dar.

Entscheidend für die Geschwindigkeit der Bildaufnahme ist die Laserleistung in der Probe. Da sich die Leistung in einem Strahl, mit dem die Probe beleuchtet wird, nicht beliebig steigern läßt, ohne die Probe zu zerstören, kann die Leistung in der Probe nur dadurch wesentlich erhöht werden, daß man mehrere Strahlen zur simultanen Beleuchtung mehrerer Punkte verwendet. Die Effizienz bei der Strahlaufteilung bestimmt (bei gegebener Ausgangsleistung des Lasers) die maximale Anzahl der Teilstrahlen.

Ein weiteres Problem des bekannten Mikroskops ist es, daß Abstand und Anzahl der Teilstrahlen durch die Beschaffenheit des Mikrolinsenrasters fest vorgegeben sind. Je nach Anwendungsfall kann jedoch ein kleiner oder ein größerer Strahlabstand sinnvoll sein.

Einzelne Zellen können mit maximaler Geschwindigkeit untersucht werden, indem alle Strahlen auf die eine Zelle, die untersucht werden soll, gelenkt werden. In diesem Fall ist ein Abstand von etwa 2 µm sinnvoll. Sollen mikrostrukturierte Substrate zur Analyse biochemischer Reaktionen (Biochips) ausgelesen werden, ist ein Strahlabstand von der Strukturgröße des Substrats sinnvoll (ca. 20 µm). Die Strahlvervielfachung auf die bekannte Art bietet nicht die Möglichkeit, Anzahl und Abstand der Strahlen leicht zu variieren.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine optische Vorrichtung, d. h. insbesondere ein Rastermikroskop, der eingangs beschriebenen Art derart weiterzuentwickeln, daß die oben genannten Nachteile, die bei der Aufspaltung des Laserstrahls durch ein Mikrolinsenraster in viele Teilstrahlen entstehen, entfallen.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die optische Anordnung zur Teilung des Laserstrahls in Teilstrahlen mindestens einen im Strahlengang des Lasers angeordneten teildurchlässigen Umlenkspiegel und mindestens einen hochreflektierenden Spiegel umfaßt, wobei der teildurchlässige Spiegel sich vor dem hochreflektierenden Spiegel befindet.

Vorteilhaft ist vorgesehen, daß der teildurchlässige Spiegel als Umlenkspiegel zwischen zwei hochreflektierenden Spiegeln im Strahlengang des Lasers angeordnet ist. Der einfallende Laserstrahl wird durch den teildurchlässigen (Umlenk-)Spiegel zunächst in zwei Strahlen aufgespalten, die dann auf den entsprechenden hochreflektierenden Spiegel fallen. Von dort werden die Strahlen wieder auf den teildurchlässigen Spiegel zurückgeworfen und dort in vier Strahlen aufgespalten. Dieser Vorgang kann sich mehrere Male wiederholen, wobei sich die Zahl der Strahlen bei jedem Kontakt mit dem teildurchlässigen Spiegel verdoppelt. Diese Art, den Strahl in Teilstrahlen aufzuspalten, besitzt folgende Vorteile:

1. Die Energie des einfallenden Lasers wird vollständig genutzt und auf die einzelnen Teilstrahlen aufgeteilt;
2. jeder Teilstrahl besitzt das gleiche Strahlprofil, wie der einfallende Strahl;
3. teilt der teildurchlässige Spiegel die Intensität der Strahlen im Verhältnis 1 : 1, so sind auch die Teilstrahlen gleich intensiv;
4. befinden sich die Spiegel zueinander parallel, so sind auch die erzeugten Teilstrahlen parallel. Werden einer oder beide hochreflektierende Spiegel gegenüber dem teildurchlässigen Spiegel verkippt, weisen die erzeugten Teilstrahlen einen Winkel relativ zueinander auf. Der Winkel der Teilstrahlen legt die Abstände der vom Objektiv in der Probe erzeugten Foki fest, d. h. durch Verkippen der hochreflektierenden Spiegel, können die Abstände der Foki verändert werden;
5. der Abstand der Teilstrahlen beim Austritt aus der optischen Anordnung zur Teilung des Laserstrahls in Teilstrahlen ist durch die Differenz der Abstände, der hochreflektierenden Spiegel zum halbdurchlässigen Umlenkspiegel gegeben.

Allgemein gilt, daß eine besonders hohe Effizienz der Strahlaufspaltung und eine gleichmäßige Intensität der Teilstrahlen beim Einsatz in der Laserrastermikroskopie sehr vorteilhaft ist und zu einer Beschleunigung der Bildaufnahme führt. Die Möglichkeit, die Abstände der Foki zu verändern, bildet die nötige Flexibilität, um den Erfordernissen der jeweiligen Anwendung gerecht zu werden.

Weitere vorteilhafte Merkmale sind den Unteransprüchen zu entnehmen. Anhand der Zeichnungen wird die Erfindung nachstehend beispielhaft näher erläutert:

Fig. 1 zeigt eine optische Anordnung aus zwei hochreflektierenden Spiegeln und einem dazwischen angeordneten teildurchlässigen Spiegel;

Fig. 2 zeigt eine Reihenanordnung von zwei optischen Anordnungen zur Teilung des Laserstrahles, wobei zwischen den beiden optischen Anordnungen ein Periskop im Strahlengang vorgesehen ist;

Fig. 3 zeigt die Strahlaufteilung mit einem Laserrastermikroskop;

Fig. 4 zeigt eine Anordnung von mehreren in Reihe geschalteten hochreflektierenden Spiegeln mit dazwischen angeordneten mehreren teildurchlässigen Spiegeln.

Gemäß der Fig. 1 ist eine Ausführungsform erkennbar, bei der der einfallende Strahl 1 in acht Teilstrahlen 5 aufgespalten wird. Die Strahlen 5 liegen auf einer Linie nebeneinander. Hierbei ist der mit 3 bezeichnete hochreflektierende Spiegel mit einer Stufe versehen, d. h. der Abstand dieses Spiegels ist hierbei gegenüber dem hochreflektierenden Spiegel 4 bzw. dem dazwischenliegenden teildurchlässigen Spiegel 2 durch diese Stufe 3 variabel.

Bei der Ausführungsform gemäß Fig. 2 ist zwischen zwei optischen Anordnungen zur Teilung des Laserstrahles ein Periskop 6 vorgesehen. Auf dieses Periskop 6 treffen die Teilstrahlen 5, wobei ein Teilstrahl durch das Periskop zu der zweiten optischen Anordnung zur Teilung dieses Strahles geführt wird. Durch diese zweite optische Anordnung wird jeder Laserstrahl wieder in mehrere Teilstrahlen 5 unterteilt, so daß sich ein im Prinzip zweidimensionales Raster von Teilstrahlen ergibt. Das gleiche Ergebnis wird im übrigen erzielt, wenn die beiden optischen Anordnungen zur Teilung des Laserstrahles jeweils um einen Winkel, insbesondere um einen Winkel von 90° zueinander versetzt sind.

Bei der Darstellung gemäß Fig. 3 sind die Strahlen bei einem Laserrastermikroskop dargestellt. Hierbei ist zwischen der Probe 9 und dem Photosensor 12 ein Umlenkspiegel 10 vorgesehen, der teildurchlässig ausgebildet ist. Das heißt, daß dieser Spiegel derart teildurchlässig ausgebildet ist, dass er die von der optischen Anordnung zur Teilung des Laserstrahles in Teilstrahlen 5 auftreffenden Strahlen unmittelbar auf die Probe reflektiert, die von der Probe ausgesendeten Strahlen durch den Umlenkspiegel 10 aufgrund ihrer unterschiedlichen Wellenlänge zu dem Photosensor 12 durchgelassen werden. Vor dem Photosensor 12 befindet sich - wie aus Fig. 3 erkennbar - eine Tubuslinse 11.

Die Darstellung gemäß Fig. 4 unterscheidet sich nur unwesentlich gegenüber der gemäß Fig. 1; hier ist lediglich eine Aufteilung der hochreflektierenden und teildurchlässigen Spiegel in mehrere einzelne hintereinander angeordnete Spiegel vorgenommen worden. Das Ergebnis in Bezug auf die Strahlaufteilung eines Laserstrahles ist das gleiche, wie gemäß Fig. 1.

Bezugszeichenliste

1

Laserstrahl

2

teildurchlässiger Spiegel

3

hochreflektierender Spiegel

4

hochreflektierender Spiegel

5

Teilstrahl

6

Periskop

7

Objektiv

8

Fokuspunkt

9

Probe

10

Umlenkspiegel

11

Tubuslinse

12

Photosensor

Claims

1. Optische Vorrichtung, insbesondere eines Rastermikroskopes, mit einem Laser, sowie mit mindestens einer optischen Anordnung zur Teilung des Laserstrahles in Teilstrahlen, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Anordnung zur Teilung des Laserstrahles (1) in Teilstrahlen (5) mindestens einen im Strahlengang des Lasers (1) angeordneten teildurchlässigen Spiegel (2) und mindestens einen hochreflektierenden Spiegel (3, 4) umfaßt, wobei der teildurchlässige Spiegel (2) sich vor dem hochreflektierenden Spiegel (3, 4) befindet.

2. Optische Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der teildurchlässige Spiegel (2) zwischen zwei hochreflektierenden Spiegeln (3, 4) im Strahlengang des Lasers (1) angeordnet ist.

3. Optische Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Vorrichtung mehrere in Reihe angeordnete optische Anordnungen zur Erzeugung von Teilstrahlen (5) aufweist.

4. Optische Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die aus der optischen Anordnung austretenden Strahlen (5) zur Erzeugung eines zweidimensionalen Strahlenrasters um einen Winkel (vorzugsweise um einen Winkel von 90°) gekippt werden.

5. Optische Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die einer ersten optischen Anordnung zur Erzeugung von Teilstrahlen (5) nachgeordnete zweite optische Anordnung gegenüber der ersten optischen Anordnung um 90° gekippt ist.

6. Optische Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß einer ersten optischen Anordnung zur Erzeugung von Teilstrahlen im Strahlengang der Teilstrahlen ein Periskop (6) angeordnet ist.

7. Optische Vorrichtung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen mehreren in Reihe und parallel zueinander angeordneten hochreflektierenden Spiegeln (3, 4) mehrere halbdurchlässige Spiegel (2) angeordnet sind.

8. Optische Vorrichtung nach einem oder mehreren der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstand zwischen hochreflektierenden (3, 4) und teildurchlässigen Spiegeln (2) zur Erzeugung unterschiedlicher Abstände zwischen den Teilstrahlen unterschiedlich ist.

9. Optische Vorrichtung nach einem oder mehreren der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Winkel zwischen hochreflektierenden und teildurchlässigen Spiegeln zur Erzeugung unterschiedlicher Abstände zwischen den Teilstrahlen (5) unterschiedlich ist.

10. Optische Vorrichtung nach einem oder mehreren der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilstrahlen (5) durch ein Objektiv (7) in jeweils einem Focuspunkt zur optischen Anregung der Probe (9) fokussiert werden, wobei durch einen Photosensor (12) das aus den einzelnen Fokuspunkten stammende Fluoreszenzlicht registriert wird.

11. Optische Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Photosensor (12) als CCD-Array ausgebildet ist.

12. Optische Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Durchmesser der Teilstrahlen vor dem Eintritt in das Objektiv durch ein Teleskop veränderbar ist.