DE19904592C2

DE19904592C2 - Strahlteilervorrichtung

Info

Publication number: DE19904592C2
Application number: DE19904592A
Authority: DE
Inventors: Tim Nielsen; Peter Andresen
Original assignee: LaVision GmbH
Current assignee: Lavision Biotec GmbH
Priority date: 1999-02-05
Filing date: 1999-02-05
Publication date: 2001-03-08
Anticipated expiration: 2019-02-06
Also published as: FR2789498A1; GB2346453A; GB2346453B; JP4117594B2; DE19904592A1; JP2000275531A; US6219179B1; GB0002685D0; FR2789498B1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Strahlteilervorrichtung für ein Laserrastermikroskop mit einem einen Laserstrahl erzeugenden Laser und einem den Laserstrahl in Teilstrahlen aufteilenden, teilreflektierenden Spiegel, wobei die Teilstrahlen die Strahlteilervorrichtung in einer Ebene liegend verlassen und auf die zu untersuchende Probe geführt werden.

Aus der DE 196 53 413 A1 ist bekannt, mit einem aufgeweiteten Laser strahl mehrere nebeneinander liegende Mikrolinsen (Mikrolinsenraster) zu beleuchten, die aus dem einfallenden Strahl die Teilstrahlen ausbilden.

Das bedeutet insbesondere, dass jeder der Teilstrahlen aus einem anderen Teil des Strahlprofils des einfallenden Strahls hervorgeht.

Die Teilstrahlen werden von den Mikrolinsen im Abstand ihrer Brennweite in einer oder mehreren dicht hintereinander liegenden Ebenen hinter dem Mi krolinsenraster fokussiert und breiten sich dann zum Objektiv hin aus, mit dem sie in die Probe fokussiert werden. Dabei überstrahlen die Teilstrahlen die Apertur des Objektivs. Anzahl und Abstand der Teilstrahlen ist bei dem bekannten Mikroskop durch die Beschaffenheit des Mikrolinsenrasters fest vorgegeben.

Typischerweise ist bei einer solchen optischen Vorrichtung zwischen der Lichtquelle für den Laserstrahl und einer Probe eine Verzweigung des Strahlengangs der Teilstrahlen vorgesehen, so dass das von der Probe stammende Fluoreszenzlicht seitlich aus der Richtung der Teilstrahlen des Laserstrahls zu einem Photosensor ausgelenkt wird. Zur Auslenkung des Fluoreszenzlichts auf den Photosensor ist ein im Strahlengang angeordneter teildurchlässiger Umlenkspiegel vorgesehen.

Ein Problem des bekannten Mikroskops ist es, dass die einzelnen Teil strahlen erheblich unterschiedliche Intensitäten besitzen. Laserstrahlen weisen eine Verteilung der Lichtintensität über den Strahlquerschnitt auf. Die in der Rastermikroskopie eingesetzten Laser haben typischerweise ein gaußförmiges Strahlprofil. Das heißt, dass die Teilstrahlen, die mit Hilfe eines Mikrolinsenrasters aus dem Zentrum des Laserstrahls ausgebildet wer den, intensiver sind, als die Teilstrahlen, die aus dem Rand des aufge weiteten Strahls ausgebildet werden. Das beobachtete Signal ist die Fluo reszenz, die durch die Teilstrahlen angeregt wird. Dieses Signal ist im Falle von 1-Photonen-Anregung ebenso unterschiedlich wie die Intensität der an regenden Teilstrahlen.

Bei nichtlinearen Mikroskopietechniken (2, 3 oder Mehr-Photonen-Anregung) tritt dieser Effekt quadratisch bzw. zur dritten Potenz in Erscheinung. Haben zum Beispiel zwei Teilstrahlen eine um einen Faktor 4 unterschiedliche In tensität, sind die von diesen Strahlen erzeugten Signale, um einen Faktor 4 (1-Ph.-Anr.), 16 (2-Ph.-Anr.) oder 64 (3-Ph.-Anr.) unterschiedlich. Dies stellt ein Problem der Erzeugung der Teilstrahlen durch Mikrolinsen, beson ders in der nichtlinearen Rastermikroskopie, dar.

Ein weiteres Problem des bekannten Mikroskops ist es, dass die Auflösung, die erreicht wird, schlechter ist, als es der Beugungsbegrenzung des ver wendeten Objektivs entspräche.

Die laterale Auflösung bei der Rastermikroskopie ist durch die volle Halb wertsbreite der in der Probe erzeugten Foki gegeben. Bei dem bekannten Mikroskop wird die Größe der Foki nicht nur durch die Apertur des verwen deten Objektivs sondern auch durch Form und Größe der Mikrolinsen fest gelegt, da die Mikrolinsen die begrenzende beugende Öffnung für jeden Teilstrahl darstellen. Dies bedeutet insbesondere, daß die Auflösung immer schlechter wird, wenn die Anzahl der Teilstrahlen steigt, da sich dann die Größe der Mikrolinsen verringert und damit der Durchmesser der Foki steigt.

Zudem werden die Mikrolinsen nicht symmetrisch beleuchtet, sondern mit einem Teil des Strahlprofils des aufgeweiteten Laserstrahls, das im all gemeinen zum Rand hin abfällt. Dies führt dazu, dass auch die Foki in der Probe eine asymmetrische Intensitätsverteilung bekommen.

Da die Auflösung einen der wichtigsten Parameter bei der Mikroskopie dar stellt, ist dies ein nicht unerhebliches Problem.

Ein weiteres Problem des bekannten Mikroskops ist es, dass die Energie des einfallenden Laserstrahls nicht vollständig genutzt wird.

Ein Teil des aufgeweiteten Laserstrahls wird vom Rand des Mikrolinsen rasters und vom Rand der einzelnen Mikrolinsen abgeschnitten. Diese Ver luste summieren sich auf, so dass z. B. von 1,4 W Ausgangsleistung des La sers nur etwa 125 mW (9%) die Probe erreichen (Jörg Bewersdorf, Rainer Pick, Stefan W. Hell, "Multifocal multiphoton microscopy", Optics Letters, Vol. 23, No. 9 (1998)).

Der Verlust der Laserenergie reduziert die Effizienz des Mikroskops erheb lich, da die benötigte Meßzeit vom Ausnutzungsgrad der Laserenergie ab hängt.

Für biologische Anwendungen der Laserrastermikroskopie, bei denen Vor gänge in lebenden Zellen untersucht werden, ist auch die Meßzeit, die für ein Bild benötigt wird, ein wichtiges Kriterium, weil sie die maximale Ge schwindigkeit der Vorgänge, die noch beobachtbar sind, vorgibt. Die Unter suchung von Reizleitung in Nervenzellen (R. Yuste, W. Denk, "Dentritic spines as basic functional units of neuronal integration", Nature Vol. 375, pp. 682-684 (1995) ist ein Beispiel. Hier wird die Laserrastermikroskopie benötigt, um hochauflösende Bilder aus tief liegenden Schichten intakten Nervengewebes zu liefern. Diesem vorteilhaften Einsatz der Laserraster mikroskopie steht aber gegenüber, dass es die langsame Bildaufnahme ver hindert, die Reizleitung in den Nervenzellen bildgebend zu verfolgen. Gelingt es daher die Geschwindigkeit der Bildaufnahme zu steigern, stellt dies eine Erweiterung des Einsatzbereichs der Laserrastermikroskopie dar.

Entscheidend für die Geschwindigkeit der Bildaufnahme ist die Laserleistung in der Probe. Da sich die Leistung in einem Strahl, mit dem die Probe be leuchtet wird, nicht beliebig steigern läßt, ohne die Probe zu zerstören, kann die Leistung in der Probe nur dadurch wesentlich erhöht werden, dass man mehrere Strahlen zur simultanen Beleuchtung mehrerer Punkte verwen det.

Die Effizienz bei der Strahlaufteilung bestimmt (bei gegebener Ausgangs leistung des Lasers) die maximale Anzahl der Teilstrahlen.

Ein weiteres Problem des bekannten Mikroskops ist es, dass Abstand und s Anzahl der Teilstrahlen durch die Beschaffenheit des Mikrolinsenrasters fest vorgegeben sind. Je nach Anwendungsfall kann jedoch ein kleiner oder ein größerer Strahlabstand sinnvoll sein.

Einzelne Zellen können mit maximaler Geschwindigkeit untersucht werden, indem alle Strahlen auf die eine Zelle, die untersucht werden soll, gelenkt werden. In diesem Fall ist ein Abstand von etwa 2 µm sinnvoll.

Sollen mikrostrukturierte Substrate zur Analyse biochemischer Reaktionen (Biochips) ausgelesen werden, ist ein Strahlabstand von der Strukturgröße des Substrats sinnvoll (ca. 20 µm). Die Strahlvervielfachung auf die bekan nte Art bietet nicht die Möglichkeit, Anzahl und Abstand der Strahlen leicht zu variieren.

Aus dem Stand der Technik ist weiterhin die DE 39 18 412 A1 bekannt, die eine Strahlteilervorrichtung für ein Laserrastermikroskop zeigt, mit ei nem einen Laserstrahl erzeugenden Laser und einem den Laserstrahl in Teil strahlen aufteilenden, teilreflektierenden Spiegel, wobei die Teilstrahlen die Strahlteilervorrichtung in einer Ebene liegend verlassen und über die zu un tersuchende Probe geführt werden.

Die DE 195 35 525 A1 zeigt einen Strahlvervielfacher mit einer teildurch lässigen und einer vollreflektierenden Reflektorschicht, wobei die teildurch lässige Schicht der vollreflektierenden Schicht im Strahlengang vorgeschal tet ist und auf diese zurück reflektiert und einen mit zunehmender Re flexionsnummer ansteigendem Transmissionsgrad aufweist, um den ent stehenden Teilstrahlen gleiche Intensität zu verleihen.

Die EP 03 86 643 A2 zeigt einen Strahlvervielfacher mit einer teildurch lässigen und einer vollreflektierenden Reflektorschicht, wobei die teildurch lässige Schicht der vollreflektierenden Schicht im Strahlengang vorge schaltet ist und in Ausgestaltungen gegenüber der teildurchlässigen Schicht gekippt oder stufig ausgebildet ist, und wobei in einer weiteren Ausge staltung zwei um 90 Grad zueinander verdrehte Strahlvervielfacher vorge sehen sind, um eine zweidimensionale Beleuchtungsmatrix zu erzeugen.

In der DE 38 76 344 T2 ist ein Optoverteiler mit einer teildurchlässigen Schicht konstanter Transmissionen zwischen zwei vollreflektierenden Schichten beschrieben, wobei die Schichten parallel zueinander angeordnet sind und die teildurchlässige Schicht das anfallende Licht unter jeweils glei cher Abschwächung zu dem einen hochreflektierenden Spiegel transmittiert und zum anderen hochreflektierenden Spiegel reflektiert und erneut und wiederholt unter jeweils gleicher Abschwächung zu dem einen hochreflek tierenden Spiegel transmittiert und zum anderen hochreflektierenden Spie gel reflektiert.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Strahlteilervorrichtung für ein Laserrastermikroskop anzugeben, mit dem Anzahl und Abstand der Teil strahlen voneinander auf einfache Weise zu variieren sind.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass der teildurch lässige Spiegel eine konstante Transmission aufweist und zwischen zwei hochreflektierenden Spiegeln angeordnet ist und den Laserstrahl unter je weils gleicher Abschwächung zu dem einen hochreflektierenden Spiegel re flektiert und zum anderen hochreflektierenden Spiegel transmittiert und er neut und wiederholt unter jeweils im Wesentlichen gleicher Abschwächung zu dem einen hochreflektierenden Spiegel reflektiert und zum anderen hoch reflektierenden Spiegel transmittiert, dass der teilreflektierende Spiegel von den beiden hochreflektierenden Spiegeln unterschiedlich beabstandet ist und/oder die beiden hochreflektierenden Spiegel gegenüber dem teilreflek tierenden Spiegel unterschiedlich stark gekippt sind und somit Teilstrahlen, die von dem teilreflektierenden Spiegel reflektiert wurden nicht mit Teil strahlen zusammenfallen, die von den hochreflektierenden Spiegeln reflek tiert wurden, und dass am Austrittsbereich der Teilstrahlen aus der Strahl teilervorrichtung die Endkante des teilreflektierenden Spiegels gegenüber der Endkante des einen hochreflektierenden Spiegels in Austrittsrichtung zurückversetzen und gegenüber der Endkante des anderen hochreflek tierenden Spiegels vorversetzt ist.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Diese Art, den Strahl in Teilstrahlen aufzuspalten, besitzt folgende Vorteile:

1. Die Energie des einfallenden Lasers wird vollständig genutzt und auf die einzelnen Teilstrahlen aufgeteilt;
2. jeder Teilstrahl besitzt das gleiche Strahlprofil, wie der einfallende Strahl;
3. teilt der teildurchlässige Spiegel die Intensität der Strahlen im Verhältnis 1 : 1, so sind auch die Teilstrahlen gleich intensiv;
4. befinden sich die Spiegel zueinander parallel, so sind auch die erzeugten Teilstrahlen parallel. Werden einer oder beide hochreflektierende Spiegel gegenüber dem teildurchlässigen Spiegel verkippt, weisen die erzeugten Teilstrahlen einen Winkel relativ zueinander auf. Der Winkel der Teilstrahlen legt die Abstände der vom Objektiv in der Probe erzeugten Foki fest, d. h. durch Verkippen der hochreflektierenden Spiegel, können die Abstände der Foki verändert werden;
5. der Abstand der Teilstrahlen beim Austritt aus der optischen Anordnung zur Teilung des Laserstrahls in Teilstrahlen ist durch die Differenz der Abstände der hochreflektierenden Spiegel zum halbdurchlässigen Umlenkspiegel gegeben.

Allgemein gilt, daß eine besonders hohe Effizienz der Strahlaufspaltung und eine gleichmäßige Intensität der Teilstrahlen beim Einsatz in der Laserraster mikroskopie sehr vorteilhaft ist und zu einer Beschleunigung der Bildauf nahme führt. Die Möglichkeit, die Abstände der Foki zu verändern, bildet die nötige Flexibilität, um den Erfordernissen der jeweiligen Anwendung ge recht zu werden.

Fig. 1 zeigt eine optische Anordnung aus zwei hochreflektierenden Spie geln und einem dazwischen angeordneten teildurchlässigen Spie gel;

Fig. 2 zeigt eine Reihenanordnung von zwei optischen Anordnungen zur Teilung des Laserstrahles, wobei zwischen den beiden optischen Anordnungen ein Periskop im Strahlengang vorgesehen ist;

Fig. 3 zeigt die Strahlaufteilung mit einem Laserrastermikroskop;

Fig. 4 zeigt eine Anordnung von mehreren in Reihe geschalteten hoch reflektierenden Spiegeln mit dazwischen angeordneten mehreren teildurchlässigen Spiegeln.

Gemäß der Fig. 1 ist eine Ausführungsform erkennbar, bei der der ein fallende Strahl 1 in acht Teilstrahlen 5 aufgespalten wird. Die Strahlen 5 liegen auf einer Linie nebeneinander. Hierbei ist der mit 3 bezeichnete hoch reflektierende Spiegel mit einer Stufe versehen, d. h. der Abstand dieses Spiegels ist hierbei gegenüber dem hochreflektierenden Spiegel 4 bzw. dem dazwischenliegenden teildurchlässigen Spiegel 2 durch diese Stufe 3 vari abel.

Bei der Ausführungsform gemäß Fig. 2 ist zwischen zwei optischen An ordnungen zur Teilung des Laserstrahles ein Periskop 6 vorgesehen. Auf dieses Periskop 6 treffen die Teilstrahlen 5, wobei ein Teilstrahl durch das Periskop zu der zweiten optischen Anordnung zur Teilung dieses Strahles geführt wird. Durch diese zweite optische Anordnung wird jeder Laserstrahl wieder in mehrere Teilstrahlen 5 unterteilt, so dass sich ein im Prinzip zwei dimensionales Raster von Teilstrahlen ergibt. Das gleiche Ergebnis wird im Übrigen erzielt, wenn die beiden optischen Anordnungen zur Teilung des Laserstrahles jeweils um einen Winkel, insbesondere um einen Winkel von 90 Grad zueinander versetzt sind.

Bei der Darstellung gemäß Fig. 3 sind die Strahlen bei einem Laserraster mikroskop dargestellt. Hierbei ist zwischen der Probe 9 und dem Photo sensor 12 ein Umlenkspiegel 10 vorgesehen, der teildurchlässig ausgebildet ist. Das heißt, dass dieser Spiegel derart teildurchlässig ausgebildet ist, dass er die von der optischen Anordnung zur Teilung des Laserstrahles in Teilstrahlen 5 auftreffenden Strahlen unmittelbar auf die Probe reflektiert, die von der Probe ausgesendeten Strahlen durch den Umlenkspiegel 10 auf grund ihrer unterschiedlichen Wellenlänge zu dem Photosensor 12 durchge lassen werden. Vor dem Photosensor 12 befindet sich - wie aus Fig. 3 er kennbar - eine Tubuslinse 11.

Die Darstellung gemäß Fig. 4 unterscheidet sich nur unwesentlich gegen über der gemäß Fig. 1; hier ist lediglich eine Aufteilung der hochreflek tierenden und teildurchlässigen Spiegel in mehrere einzelne hintereinander angeordnete Spiegel vorgenommen worden. Das Ergebnis in Bezug auf die Strahlaufteilung eines Laserstrahles ist das Gleiche, wie gemäß Fig. 1.

Bezugszeichenliste

1

Laserstrahl

2

teildurchlässiger Spiegel

3

hochreflektierender Spiegel

4

hochreflektierender Spiegel

5

Teilstrahl

6

Periskop

7

Objektiv

8

Fokuspunkt

9

Probe

10

Umlenkspiegel

11

Tubuslinse

12

Photosensor

Claims

1. Strahlteilervorrichtung für ein Laserrastermikroskop, mit einem einen Laserstrahl (1) erzeugenden Laser und einem den Laserstrahl (1) in Teilstrahlen (5) aufteilenden, teilreflektierenden Spiegel (2), wobei die Teilstrahlen (5) die Strahlteilervorrichtung in einer Ebene liegend ver lassen und auf die zu untersuchende Probe geführt werden, dadurch gekennzeichnet, dass der teildurchlässige Spiegel (2) eine konstante Transmission auf weist und zwischen zwei hochreflektierenden Spiegeln (3, 4) angeord net ist und den Laserstrahl (1) unter jeweils gleicher Abschwächung zu dem einen hochreflektierenden Spiegel (3) reflektiert und zum anderen hochreflektierenden Spiegel (4) transmittiert und erneut und wiederholt unter jeweils im Wesentlichen gleicher Abschwächung zu dem einen hochreflektierenden Spiegel (3) reflektiert und zum anderen hochreflek tierenden Spiegel (4) transmittiert, dass der teilreflektierende Spiegel (2) von den beiden hochreflektierenden Spiegeln (3, 4) unterschiedlich beabstandet ist und/oder die beiden hochreflektierenden Spiegel (3, 4) gegenüber dem teilreflektierenden Spiegel (2) unterschiedlich stark ge kippt sind und somit Teilstrahlen (5), die von dem teilreflektierenden Spiegel (2) reflektiert wurden nicht mit Teilstrahlen (5) zusammen fallen, die von den hochreflektierenden Spiegeln (3, 4) reflektiert wur den, und dass am Austrittsbereich der Teilstrahlen (5) aus der Strahl teilervorrichtung die Endkante des teilreflektierenden Spiegels (2) gegenüber der Endkante des einen hochreflektiereden Spiegels (3) in Austrittsrichtung zurückversetzt und gegenüber der Endkante des an deren hochreflektierenden Spiegels (4) vorversetzt ist.

2. Strahlteilervorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Strahlteilervorrichtungen hintereinander geschaltet sind und alle Teilstrahlen (5) die Strahlteilervorrichtung in einer Ebene lie gend verlassen.

3. Strahlteilervorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zwei, vorzugsweise um einen Winkel von 90 Grad gegen einander verkippte Strahlteilervorrichtungen hintereinander geschaltet sind, wobei alle Teilstrahlen (5) einer jeden Strahlteilervorrichtung die se in einer Ebene liegend verlassen und wobei die Teilstrahlen (5) bei der Strahlteilervorrichtungen insgesamt eine zweidimensionale Beleuchtungsmatrix erzeugen.

4. Strahlteilervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Objektiv des Laserrastermikroskops die Teilstrahlen in unter schiedlichen Brennpunkten fokussiert.

5. Strahlteilervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilstrahlen vor Eintritt in das Objektiv des Laserrastermikroskops in ihren Durchmessern verändert sind.