DE102015109305B3 - Rasterlumineszenzlichtmikroskop mit Gittern aus Lumineszenzverhinderungslicht und weiterem Licht - Google Patents

Rasterlumineszenzlichtmikroskop mit Gittern aus Lumineszenzverhinderungslicht und weiterem Licht Download PDF

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Abstract

Ein Rasterlumineszenzlichtmikroskop (43) zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer einen Lumineszenzmarker aufweisenden Struktur einer Probe (15) weist eine Lumineszenzverhinderungslicht (38) und sich von dem Lumineszenzlicht unterscheidendes weiteres Licht bereitstellende Lichtquelle (46), eine Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung und einen Detektor (56) auf. Die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung formt aus zwei nicht kohärenten Strahlen (19, 20) des Lumineszenzverhinderungslichts (38) mittels optischer Gitter (21, 22) vier paarweise kohärente Teilstrahlen und fokussiert diese mit einem gemeinsamen Objektiv (25), so dass sie im Bereich der Probe (15) zwei sich kreuzende Liniengitter ausbilden. Die sich kreuzenden Liniengitter weisen jeweils eine Mehrzahl von eindimensional begrenzten lokalen Intensitätsminima auf, so dass eine Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts (38) in der Probe ein zweidimensionales Feld aus gleichartigen, mindestens zweidimensional begrenzten lokalen Intensitätsminima aufweist. Mindestens ein Strahl (39, 40) des weiteren Lichts (17) tritt zusammen mit einem der beiden Strahlen (19, 20) des Lumineszenzverhinderungslichts (38) in die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung ein, so dass die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung aus dem Strahl (39, 40) des weiteren Lichts (17) mittels eines der optischen Gitter (21, 22) zwei kohärente Teilstrahlen des weiteren Lichts (17) formt und die Teilstrahlen des weiteren Lichts (17) mit dem Objektiv (25) gemeinsam fokussiert, so dass sie im Bereich der Probe (15) ein Liniengitter ausbilden, das eine Mehrzahl von eindimensional begrenzten und sich parallel zu den lokalen Intensitätsminima eines der Liniengitter des Lumineszenzverhinderungslichts (38) erstreckenden lokalen Intensitätsmaxima und Intensitätsminima aufweist. Weiterhin richtet die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung das Liniengitter des weiteren Lichts (17) so gegenüber dem einen der Liniengitter des Lumineszenzverhinderungslichts (38) aus, dass die lokalen Intensitätsmaxima oder die lokalen Intensitätsminima des weiteren Lichts (17) mit den Intensitätsminima des Lumineszenzverhinderungslichts (38) zusammenfallen. Zudem verlagert die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung die Intensitätsverteilungen des weiteren Lichts (17) und des Lumineszenzverhinderungslichts (38) gegenüber der Probe (15), um einen interessierenden Bereich der Probe (15) mit den Intensitätsminima der Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts (38) abzutasten. Der Detektor (56) registriert das aus den Bereichen der einzelnen Intensitätsminima der Intensitätsverteilung des ...

Description

  • TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung bezieht sich auf ein Rasterlumineszenzlichtmikroskop zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer einen Lumineszenzmarker aufweisenden Struktur einer Probe.
  • Spezieller bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Rasterlumineszenzlichtmikroskop, das eine Lichtquelle für Lumineszenzverhinderungslicht und für weiteres Licht, eine Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung und einen Detektor aufweist, wobei der Detektor Lumineszenzlicht registriert, das von dem Lumineszenzmarker aus Intensitätsminima einer Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts emittiert wird.
  • STAND DER TECHNIK
  • Ein Verfahren zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer einen Lumineszenzmarker aufweisenden Struktur einer Probe ist als STED(Stimulated Emission Depletion)-Rasterlumineszenzlichtmikroskopie bekannt. Die Probe wird zunächst mit fokussiertem Anregungslicht beaufschlagt, das den Lumineszenzmarker aus einem anregbaren elektronischen Grundzustand heraus in einen lumineszierenden elektronischen Zustand anregt. Dann wird die Probe mit einer ein lokales Intensitätsminimum aufweisenden Intensitätsverteilung von Emissionsstimulationslicht beaufschlagt, das den Lumineszenzmarker zur Emission von Licht mit der Wellenlänge des Emissionsstimulationslichts, d. h. mit einer anderen Wellenlänge als derjenigen des Lumineszenzlichts, stimuliert und damit wieder in seinen Grundzustand abregt. Wenn das Emissionsstimulationslicht überall außerhalb seines Intensitätsminimums den Lumineszenzmarker aus dem angeregten lumineszierenden Zustand durch stimulierte Emission wieder abgeregt hat, kann anschließend aus dem Bereich der Intensitätsverteilung des Emissionsstimulationslichts emittiertes Lumineszenzlicht nur aus dessen Intensitätsminimum stammen. Damit kann dieses Lumineszenzlicht der Position des Intensitätsminimums in der Probe zugeordnet werden. Wenn das Intensitätsminimum beispielsweise eine Nullstelle eines Interferenzmuster des Emissionsstimulationslichts ist, verringert ein Erhöhen der Intensität des Emissionsstimulationslichts die Abmessungen des Intensitätsminimums, innerhalb derer das Emissionsstimulationslicht den Lumineszenzmarker nicht vollständig, d. h. nicht bis zur Sättigung der Abregung, wieder abregt. Durch das Erhöhen der Intensität des Emissionsstimulationslichts können die Abmessungen des Intensitätsminimums insbesondere kleiner als die Abbe'sche Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Anregungslichts und des Lumineszenzlichts gemacht werden, die die Ortsauflösung bei der Anregung er Probe mit dem fokussierten Anregungslicht bzw. bei der Abbildung der das Lumineszenzlicht emittierenden Struktur der Probe auf einen Bildsensor begrenzt.
  • Ein weiteres Verfahren zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer einen Lumineszenzmarker aufweisenden Struktur einer Probe ist als GSD(Ground State Depletion)-Rasterlumineszenzlichtmikroskopie bekannt. Bei diesem bekannten Verfahren wird die Probe, bevor sie mit fokussiertem Anregungslicht beaufschlagt wird, mit einer ein lokales Intensitätsminimum aufweisen Intensitätsverteilung von Lumineszenzverhinderungslicht beaufschlagt, das den Lumineszenzmarker in einen langlebigen elektronischen Dunkelzustand, z. B. einen Triplettzustand, überführt, aus dem heraus er mit dem Anregungslicht nicht in einen lumineszierenden Zustand angeregt wird. Überall außerhalb des Intensitätsminimums der Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts erfolgt diese Überführung in den Dunkelzustand bis zur Sättigung. D. h., nur in dem Intensitätsminimum der Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts liegt der Lumineszenzmarker nach dem Beaufschlagen mit dem Lumineszenzverhinderungslicht noch in seinem elektronischen Grundzustand vor, aus dem heraus er mit dem Anregungslicht in den lumineszierenden Zustand angeregt wird. Nach der Anregung mit dem Anregungslicht von dem Lumineszenzmarker emittiertes Lumineszenzlicht stammt deshalb aus dem Intensitätsminimum der Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts und kann daher unabhängig von der Ortsauflösung bei der Anregung der Probe und bei der Abbildung der Probe auf einen verwendeten Detektor der Position des Intensitätsminimums in der Probe zugeordnet werden.
  • Die STED- und die GSD-Rasterlumineszenzlichtmikroskopie zählen zur RESOLFT(Reversible Saturable Optical Flurorescence Transitions)-Rasterlumineszenzlichtmikroskopie. Ein weiteres zur RESOLFT-Rasterlumineszenzlichtmikroskopie zählendes Verfahren macht zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer einen Lumineszenzmarker aufweisenden Struktur einer Probe von sogenannten schaltbaren Lumineszenzmarkern Gebrauch. Schaltbare Lumineszenzmarker sind mit Hilfe von Lumineszenzverhinderungslicht aus einem ersten Konformationszustand, in dem sie als Lumineszenzmarker wirksam sind, in einen zweiten Konformationszustand umschaltbar. In dem zweiten Konformationszustand sind die Lumineszenzmarker nicht als Lumineszenzmarker wirksam, d. h. sie sind zumindest mit Hilfe von Anregungslicht, welches in dem ersten Konformationszustand zur Anregung eines lumineszierenden Zustands geeignet ist, nicht in einen lumineszierenden Zustand anregbar, aus welchem sie das registrierte Lumineszenzlicht emittieren. Um dieses Umschalten überall außerhalb eines lokalen Intensitätsminimums einer Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts bis zur Sättigung zu treiben, sind bei ausreichend langer Lebensdauer des zweiten Konformationszustands nur vergleichsweise geringe Lichtintensitäten erforderlich. Zudem besteht keine signifikante Gefahr, dass der in seinen anderen Konformationszustand überführte Lumineszenzmarker aus diesem anderen Konformationszustand heraus bleicht, weil er in diesem Konformationszustand auf das Lumineszenzverhinderungslicht und das Anregungslicht nicht anspricht.
  • Bei allen Varianten der RESOLFT-Rasterlumineszenzlichtmikroskopie wird immer nur Lumineszenzlicht aus einem Bereich der Probe registriert, der der Position des lokalen Intensitätsminimums des Lumineszenzverhinderungslichts in der Probe entspricht. Zum Abbilden eines größeren Bereichs der Probe ist es erforderlich, die Probe mit dem Intensitätsminimum abzuscannen. Durch das räumliche Zuordnen des gleichzeitig registrierten Lumineszenzlichts kann ein zusammengesetztes Gesamtbild des größeren Bereichs erzeugt werden.
  • In der Veröffentlichung Bingen, P., M. Reuss, J. Engelhardt, S. W. Hell: "Parallelized STED fluorescence nanoscopy," Opt. Express 19, 23716-23726 (2011) wird ein STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskop beschrieben, bei dem eine Intensitätsverteilung von Emissionsstimulationslicht aus vier nebeneinander angeordneten Teilintensitätsverteilungen zusammengesetzt ist, von denen jede ein zweidimensional begrenztes lokales Intensitätsminimum aufweist. Jeder der Teilintensitätsverteilungen des Emissionsstimulationslichts ist zudem eine Teilintensitätsverteilung von Anregungslicht überlagert, die am Ort des Intensitätsminimums des Emissionsstimulationslichts ein Intensitätsmaximum aufweist. Die Teilintensitätsverteilungen werden erzeugt, indem auf einer gemeinsamen optischen Achse ausgerichtete Strahlen des Emissionsstimulationslichts und des Anregungslichts zwei hintereinander angeordnete Wollaston-Prismen passieren. Von den Wollaston-Prismen werden die Strahlen in Teilstrahlen aufgeteilt, die sich paarweise in vier leicht verschiedenen Richtungen erstrecken. Die vier Paare von Teilstrahlen passieren eine segmentierte chromatische Phasenplatte, die selektiv die Wellenfronten der Teilstrahlen aus dem Lumineszenzverhinderungslicht deformiert, so dass diese Teilstrahlen beim anschließenden Fokussieren aller Teilstrahlen in die Probe die Teilintensitätsverteilungen mit den Intensitätsminima ausbilden. Durch die vier unterschiedlichen Richtungen der Teilstrahlen liegen die Teilintensitätsverteilungen in der Probe mit Abstand nebeneinander und definieren vier gleichartige Intensitätsminima, wobei das aus verschiedenen, jeweils eines der Intensitätsminima umfassenden Messbereichen emittierte Lumineszenzlicht räumlich getrennt registriert wird. Indem die Probe mit den vier voneinander beabstandeten Intensitätsminima des Lumineszenzverhinderungslichts gleichzeitig abgetastet wird, reduziert sich die für das Abbilden der Struktur erforderliche Zeitdauer gegenüber dem Abbilden der Struktur unter Verwendung nur eines Intensitätsminimums auf ein Viertel.
  • Aus der WO 2006/127692 A2 ist ein auf dem RESOLFT-Konzept basierendes Verfahren zum hochaufgelösten Abbilden einer einen photoschaltbaren optischen Marker (engl. Phototransformable Optical Label, PTOL) aufweisenden Struktur in einer Probe bekannt. Der PTOL wird durch einen Puls von Aktivierungslicht aus einem inaktiven Zustand in einen aktivierten Zustand überführt, wobei der PTOL in dem aktivierten Zustand (im Gegensatz zu dem inaktiven Zustand) durch Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht veranlasst werden kann. Die Probe wird mit einer Intensitätsverteilung des Aktivierungslichts in Form eines Aktivierungsgitters aus punktförmigen Intensitätsmaxima beaufschlagt. Damit soll der PTOL in Bereichen nicht verschwindender Intensität des Aktivierungslichts, insbesondere in den Intensitätsmaxima aktiviert werden. Anschließend, d. h. noch vor dem Beaufschlagen mit dem Anregungslicht, wird die Probe mit einem Puls von Deaktivierungslicht beaufschlagt, das den PTOL zurück in seinen inaktiven Zustand überführt. Die Intensitätsverteilung des Deaktivierungslichts ist als ein Deaktivierungsgitter ausgebildet, das dem Aktivierungsgitter ähnlich ist. Bei dem Deaktivierungsgitter liegen an den Gitterpunkten jedoch Intensitätsminima des Deaktivierungslichts, die von einer Hülle mit höherer Intensität des Deaktivierungslichts umgeben sind. Indem das Deaktivierungsgitter dem Aktivierungsgitter derart überlagert wird, dass jedes Intensitätsmaximum des Aktivierungslichts mit einem Intensitätsminimum des Deaktivierungslichts zusammenfällt, wird der PTOL überall außerhalb der Intensitätsminima wieder in den inaktiven Zustand überführt. Bei einem anschließenden Beaufschlagen der Probe mit einem Anregungsgitter aus dem Anregungslicht, welches in den Bereichen der lokalen Maxima des Aktivierungsgitters ebenfalls lokale Intensitätsmaxima aufweist, wird der PTOL dann nur in den Bereichen der Intensitätsminima des Deaktivierungsgitters, in denen der PTOL noch in seinem aktivierten Zustand vorliegt, zur Emission des Lumineszenzlichts angeregt. Durch die gitterförmige Beleuchtung mit dem Aktivierungs-, dem Deaktivierungs- und dem Anregungslicht soll insgesamt ein parallelisiertes hochaufgelöstes Abbilden der Struktur der Probe ermöglicht werden. In Bezug auf das Erzeugen der gitterförmigen Intensitätsverteilungen wird in der WO 2006/127692 A2 auf die WO 2006/058187 A2 verwiesen.
  • Gemäß der WO 2006/058187 A2 wird eine zwei- bzw. dreidimensionale punktgitterförmige Intensitätsverteilung in einer Probe mit lokalen Intensitätsmaxima an ihren Gitterpunkten erzeugt, indem drei bzw. vier Strahlen von kohärentem Licht mit verschiedenen Ausbreitungsrichtungen in der Probe überlagert und zur Interferenz gebracht werden. Durch Anpassung einer Phase der einzelnen Lichtstrahlen soll es zudem möglich sein, dass an den Gitterpunkten lokale Intensitätsminima erzeugt werden, die von einem Bereich höherer Intensität umgeben sind. Die Anpassung der Phase wird über einen verschiebbaren Reflektor, einen optischen Phasenmodulator oder einen räumlichen Modulator (engl. Spatial Light Modulator, SLM) erreicht. Um die Gitter aus dem Aktivierungs-, dem Deaktivierungs- und dem Anregungslicht zu erzeugen, wird immer eine Mehrzahl von kohärenten Lichtstrahlen mit verschiedenen Ausbreitungsrichtungen in der Probe zur Überlagerung gebracht, so dass sich die gewünschte Intensitätsverteilung durch Interferenz ergibt. Gemäß der WO 2006/058187 A2 können die gitterförmigen Intensitätsverteilungen bei einem STED-Rasterfluoreszenzmikroskop zum Einsatz kommen: Die Probe wird mit einer gitterförmigen Intensitätsverteilung von gepulstem Anregungslicht mit lokalen Intensitätsmaxima an den Gitterpunkten beaufschlagt, das einen in der Probe befindlichen Fluoreszenzfarbstoff zur Emission von Fluoreszenzlicht veranlasst. Zusätzlich wird die Probe mit einer mehrere lokale Intensitätsminima aufweisenden Intensitätsverteilung von gepulstem Emissionsstimulationslicht beaufschlagt, das den Fluoreszenzfarbstoff durch stimulierte Emission zurück in seinen Grundzustand überführt. Zum Erzeugen der Intensitätsverteilung des Emissionsstimulationslichts mit den lokalen Intensitätsminima an den Gitterpunkten, die jeweils von einem Bereich höherer Intensität umgeben sind, werden gemäß der WO 2006/058187 A2 mehrere gleichartige Untergitter aus dem Emissionsstimulationslicht, in der Probe erzeugt und überlagert. Jedes Untergitter ist als dreidimensionales Punktgitter mit lokalen Intensitätsmaxima an den Gitterpunkten ausgebildet. Dabei werden für jedes Untergitter drei bzw. vier Lichtstrahlen eingesetzt, deren Phasen derart aufeinander abgestimmt sind, dass die Untergitter in der Probe jeweils die gewünschte Symmetrie und Periodizität aufweisen. Die Gitter werden dann (durch Anpassung der Phasen der Lichtstrahlen und damit durch Verschiebung der Untergitter relativ zueinander) derart in der Probe überlagert, dass sie zusammen ein Gitter mit lokalen Intensitätsminima ausbilden. Die Intensitätsmaxima der Untergitter sind dabei relativ zu den Intensitätsminima des Gitters in unterschiedlichen Richtungen versetzt angeordnet. Die Form der Intensitätsminima ist durch die relative Anordnung der sie begrenzenden Intensitätsmaxima vorgegeben. Aufgrund der Begrenzung der Intensitätsminima durch punkt- oder kugelförmige Intensitätsmaxima weisen die Intensitätsminima keine runde Form sondern in unterschiedlichen Richtungen unterschiedliche Abmessungen auf.
  • Ein Rasterlumineszenzlichtmikroskop zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben, das die Merkmale des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 aufweist, ist in der DE 10 2006 009 833 B4 offenbart. Hier sind Mittel zur Bereitstellung von vier paarweise kohärenten Lichtstrahlen des Lumineszenzverhinderungslichts sowie Mittel zum Fokussieren der vier paarweise kohärenten Lichtstrahlen in die Pupille eines Objektivs vorgesehen, um in zwei Richtungen überlagerte Stehwellen, d. h. zwei sich kreuzende Liniengitter, zu erzeugen. Die Mittel zur Bereitstellung der vier paarweise kohärenten Lichtstrahlen umfassen ein beispielsweise holographisches Gitter im Strahlengang. Verstellbare Retroreflektoren sind zur Durchführung eines Weglängenabgleichs zwischen den paarweise kohärenten Lichtstrahlen vorgesehen. Eine zusätzliche Lichtquelle beispielsweise für Umschaltlicht oder Anregungslicht leuchtet das Gesichtsfeld des Rasterlumineszenzlichtmikroskops großräumig aus.
  • AUFGABE DER ERFINDUNG
  • Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Rasterlumineszenzlichtmikroskop zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer einen Lumineszenzmarker aufweisenden Struktur einer Probe aufzuzeigen, bei dem die Lichtintensitätsverteilungen des Lumineszenzlichts und des weiteren Lichts auch über eine Vielzahl von Intensitätsminima des Lumineszenzverhinderungslichts hinweg optimiert sind.
  • LÖSUNG
  • Die Aufgabe der Erfindung wird erfindungsgemäß durch ein Rasterlumineszenzlichtmikroskop mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 gelöst. Weitere erfindungsgemäße Ausgestaltungen sind den abhängigen Patentansprüchen zu entnehmen.
  • BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Ein erfindungsgemäßes Rasterlumineszenzlichtmikroskop weist eine Lichtquelle, eine Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung und einen Detektor auf. Die Lichtquelle stellt Lumineszenzverhinderungslicht und sich von dem Lumineszenzlicht unterscheidendes weiteres Licht bereit. Aus zwei nicht kohärenten Strahlen des Lumineszenzverhinderungslichts formt die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung mittels optischer Gitter vier paarweise kohärente Teilstrahlen des Lumineszenzverhinderungslichts und überlagert fokussiert diese Teilstrahlen gemeinsamen mit einem Objektiv, so dass sie im Bereich der Probe zwei sich kreuzende Liniengitter ausbilden. Die sich kreuzenden Liniengitter weisen jeweils eine Mehrzahl von eindimensional begrenzten lokalen Intensitätsminima auf, so dass eine Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts in der Probe ein zweidimensionales Feld aus gleichartigen, mindestens zweidimensional begrenzten lokalen Intensitätsminima aufweist. Mindestens ein Strahl des weiteren Lichts tritt zusammen mit einem der beiden Strahlen des Lumineszenzverhinderungslichts in die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung ein, so dass die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung aus dem Strahl des weiteren Lichts mittels eines der optischen Gitter zwei kohärente Teilstrahlen des weiteren Lichts formt und die Teilstrahlen des weiteren Lichts mit dem Objektiv gemeinsam fokussiert, so dass sie im Bereich der Probe ein Liniengitter ausbilden, das eine Mehrzahl von eindimensional begrenzten und sich parallel zu den lokalen Intensitätsminima eines der Liniengitter des Lumineszenzverhinderungslichts erstreckenden lokalen Intensitätsmaxima und Intensitätsminima aufweist. Weiterhin richtet die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung das Liniengitter des weiteren Lichts so gegenüber dem einen der Liniengitter des Lumineszenzverhinderungslichts aus, dass die lokalen Intensitätsmaxima oder die lokalen Intensitätsminima des weiteren Lichts mit den Intensitätsminima des Lumineszenzverhinderungslichts zusammenfallen. Zudem verlagert die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung die Intensitätsverteilungen des weiteren Lichts und des Lumineszenzverhinderungslichts gegenüber der Probe, um einen interessierenden Bereich der Probe mit den Intensitätsminima der Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts abzutasten. Der Detektor registriert das aus den Bereichen der einzelnen Intensitätsminima der Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts emittierte Lumineszenzlicht für jedes der Intensitätsminima und für jede Lage jedes der Intensitätsminima.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Rasterlumineszenzlichtmikroskop ist die Intensität des für die einzelnen Intensitätsminima der Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts registrierten Lumineszenzlichts ein Maß für die Konzentration des Lumineszenzmarkers an der Position des jeweiligen Intensitätsminimums in der Probe. Durch Abscannen der Probe mit den Intensitätsminima der Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts und Registrieren des Lumineszenzlichts für jede Position der Intensitätsminima wird die Verteilung des Lumineszenzmarkers in der Probe erfasst und so die mit den Lumineszenzmarker aufweisende Struktur abgebildet.
  • Die interessierende Struktur der Probe kann den Lumineszenzmarker natürlich, d. h. von sich aus aufweisen. Die interessierende Struktur der Probe kann jedoch mit dem Lumineszenzmarker auch künstlich markiert sein. Die künstliche Markierung der Struktur mit dem Lumineszenzmarker kann z. B. durch sogenannte Antikörperfärbung, d. h. durch Ankoppeln des Lumineszenzmarkers über eine Immunreaktion, oder durch eine gentechnische Veränderung vorgenommen werden, die zu einer gemeinsamen Exprimierung des Lumineszenzmarkers mit der interessierenden Struktur führt; ein Beispiel hierfür sind fluoreszente Proteine.
  • Der Lumineszenzmarker, den die interessierende Struktur in der Probe aufweist, kann insbesondere ein Fluorophor sein. In diesem Fall ist das Lumineszenzlicht, das von dem Lumineszenzmarker emittiert wird, Fluoreszenzlicht. Das Lumineszenzlicht kann aber auch basierend auf anderen Vorgängen als Fluoreszenz von dem Lumineszenzmarker emittiert werden. Ein Beispiel für einen solchen anderen Vorgang ist Autolumineszenz, d. h. rein thermisch angeregte Lumineszenz. Häufig wird der Lumineszenzmarker jedoch durch Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht angeregt werden. Dieses Anregungslicht kann das sich von dem Lumineszenzlicht unterscheidende weitere Licht sein, das von der Lichtquelle des Rasterlumineszenzlichtmikroskops bereitgestellt wird. Grundsätzlich kann das weitere Licht aber auch eine andere Funktion haben. Beispielsweise kann das weitere Licht einen Lumineszenzmarker in Form eines schaltbaren Proteins in einen grundsätzlich fluoreszenzfähigen Zustand schalten, in dem er dann durch zusätzliches Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht in Form von Fluoreszenzlicht angeregt wird. Dabei kann das zusätzliche Anregungslicht eine zusätzliche Komponente des weiteren Lichts mit einer anderen Wellenlänge als die Komponente des weiteren Lichts sein, die den Lumineszenzmarker in seinen fluoreszenzfähigen Zustand schaltet, wobei die Intensitätsmaxima beider Komponenten des weiteren Lichts mit den Intensitätsminima des Fluoreszenzverhinderungslichts zusammenfallen. In einem weiteren Beispiel schaltet das weitere Licht einen Lumineszenzmarker in Form eines schaltbaren Proteins in einen Schutzzustand, in dem der Lumineszenzmarker vor Bleichen unter Einwirkung des Lumineszenzverhinderungslichts geschützt ist. Dann ist es in der Regel erwünscht, dass die Intensitätsminima zumindest dieser in den Schutzzustand schaltenden Komponente des weiteren Lichts mit den Intensitätsminima des Fluoreszenzverhinderungslichts zusammenfallen. Auch bei der letzteren Ausführungsform kann dann zusätzliches Anregungslicht den Lumineszenzmarker zur Emission von Lumineszenzlicht in Form von Fluoreszenzlicht anregen und eine zusätzliche Komponente des weiteren Lichts mit einer anderen Wellenlänge ausbilden. In diesem Fall werden die Intensitätsmaxima des Anregungslichts mit den Intensitätsminima des Lumineszenzverhinderungslichts und der schaltenden Komponente des weiteren Lichts zusammenfallen.
  • Das weitere Licht kann ganz allgemein mehrere Funktionen haben und dann mehrere Komponenten mit unterschiedlichen Wellenlängen aufweisen. Dabei können die Intensitätsminima und/oder Intensitätsmaxima der einzelnen Komponenten mit den Intensitätsminima des Lumineszenzverhinderungslichts zusammenfallen. So können auch die Intensitätsmaxima einer Komponente mit den Intensitätsminima einer anderen Komponente des weiteren Lichts zusammenfallen.
  • Das Lumineszenzverhinderungslicht wirkt sich auf den Lumineszenzmarker so aus, dass er im Einwirkungsbereich des Lumineszenzverhinderungslichts nicht zur Emission von Lumineszenzlicht in der Lage ist. Der dahinterstehende Mechanismus der Lumineszenzverhinderung kann ganz unterschiedlich sein. Das Lumineszenzverhinderungslicht kann den bereits angeregten Lumineszenzmarker durch stimulierte Emission wieder abregen. Das Lumineszenzverhinderungslicht kann den Lumineszenzmarker in einen Dunkelzustand überführen, aus dem heraus keine Emission von Fluoreszenzlicht und keine Anregung zur Emission von Fluoreszenzlicht mehr möglich ist. Bei diesem Dunkelzustand kann es sich beispielsweise um einen elektronischen Zustand, konkret einen Triplett-Zustand, oder einen nicht lumineszenten Konformationszustand, beispielsweise eines schaltbaren Proteins, handeln.
  • Wenn hier von Intensitätsminima der Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts die Rede ist, so sind hiermit insbesondere Nullstellen der Intensitätsverteilung gemeint. Dabei mag es sich um echte Nullstellen handeln, in denen die Intensität des Lumineszenzverhinderungslichts tatsächlich auf null zurückgeht, oder aber um solche, in denen die Intensität des Lumineszenzverhinderungslichts mangels idealer optischer Verhältnisse nur im Wesentlichen auf null zurückgeht.
  • Wenn hier von Abmessungen von Intensitätsminima die Rede ist, so beziehen sich diese Abmessungen insbesondere auf die Abmessungen der Fläche oder des Volumens, in dem das jeweilige Licht den mit ihm angestrengten Effekt, beispielsweise die Lumineszenzverhinderung, nicht bis zur Sättigung herbeiführt.
  • Wenn hier davon die Rede ist, dass das Lumineszenzlicht für jedes der verschiedenen Intensitätsminima der Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts und für jede Lage der Intensitätsminima registriert wird, bedeutet dies insbesondere ein getrenntes Registrieren für die einzelnen Intensitätsminima und deren verschiedene Lagen. Dies schließt aber nicht aus, dass bei eng beieinander liegenden Intensitätsminima auch Lumineszenzlicht aus dem einen Intensitätsminimum mit registriert wird, wenn eigentlich (nur) Lumineszenzlicht aus dem anderen Intensitätsminimum registriert werden soll. Ein solches Übersprechen des Lumineszenzlichts zwischen den Intensitätsminima ist unkritisch, solange es per se irrelevant ist, d. h. ohne nennenswerte Auswirkungen auf das interessierende Abbild der den Lumineszenzmarker aufweisenden Struktur bleibt, oder wenn es bei der Auswertung des Lumineszenzlichts herausgerechnet werden kann.
  • Die Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts wird in dem erfindungsgemäßen Rasterlumineszenzlichtmikroskop durch zwei nicht kohärent überlagerte Teilintensitätsverteilungen in Form von Liniengittern erzeugt. Dabei weist jedes der Liniengitter mehrere lokale Intensitätsminima auf, die anders als die zumindest zweidimensional begrenzten lokalen Intensitätsminima der sich insgesamt ergebenden Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts jedoch nur eindimensional begrenzt sind. Dabei werden zwei oder auch noch mehr der Liniengitter zu der Intensitätsverteilung überlagert werden. Zum Erzeugen einer Intensitätsverteilung mit Intensitätsminima, die zweidimensional begrenzt sind, ist es ausreichend, wenn zwei Liniengitter mit eindimensional begrenzten Intensitätsminima überlagert werden. Soll eine Intensitätsverteilung mit Intensitätsminima erzeugt werden, die in drei Dimensionen begrenzt sind, werden mindestens drei Liniengitter mit eindimensional begrenzten Intensitätsminima benötigt. In dem erfindungsgemäßen Rasterlumineszenzlichtmikroskop werden zumindest die Paare aus kohärenten Teilstrahlen zur Ausbildung von zwei der sich kreuzenden Liniengitter mittels optischer Gitter geformt.
  • Die Zahl der erzeugten mehrdimensional begrenzten Intensitätsminima der Intensitätsverteilung hängt von der Zahl der überlagerten Intensitätsminima der Liniengitter ab. Werden z. B. zwei Liniengitter überlagert, die jeweils drei sich in der Überlagerung überschneidende, eindimensional begrenzte Intensitätsminima aufweisen, weist die resultierende Intensitätsverteilung neun zweidimensional begrenzte lokale Intensitätsminima auf. D. h. die Zahl der Intensitätsminima der Intensitätsverteilung ergibt sich aus einer Multiplikation der Zahl der zur Überlagerung gebrachten eindimensional begrenzten Intensitätsminima der Liniengitter. Das Überlagern der Liniengitter entspricht demnach nicht einem einfachen "Aufaddieren" der mehrdimensional begrenzten lokalen Intensitätsminima. Entsprechend kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auf einfachere Weise eine Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts mit einer großen Anzahl von mehrdimensional begrenzten Intensitätsminima erzeugt werden, wodurch ein schnelles Abtasten der Probe ermöglicht wird.
  • Indem das erfindungsgemäße Rasterlumineszenzlichtmikroskops die Liniengitter mit Hilfe von Gittern ausbildet, wobei sowohl Transmissions- als auch Reflexionsgitter verwendet werden können, sind die lokalen Intensitätsminima der Liniengitter jeweils im Wesentlichen äquidistant zueinander angeordnet und parallel zueinander ausgerichtet. So wird erreicht, dass die Intensitätsminima der resultierenden Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts in einem gleichmäßigen Raster angeordnet sind. Dadurch kann die Probe besonders effizient mit den Intensitätsminima abgetastet werden.
  • Wenn die Liniengitter mit den nur eindimensional begrenzten Intensitätsminima beim Erzeugen einer Intensitätsverteilung mit mehrdimensional begrenzten Intensitätsminima derart überlagert werden, dass ihre eindimensional begrenzten Intensitätsminima orthogonal zueinander ausgerichtet sind, weist die so erzeugte Intensitätsverteilung eine maximale Dichte an mehrdimensional begrenzten Intensitätsminima auf. Außerdem wird jedes mehrdimensional begrenzte Intensitätsminimum in Richtung der Abfolge der eindimensional begrenzten Intensitätsminima jedes Liniengitters des Lumineszenzverhinderungslichts eng von den angrenzenden lokalen Maxima dieser Liniengitter begrenzt, während es in den dazwischen liegenden diagonalen Richtungen zwar weniger eng aber von den überlagerten lokalen Intensitätsmaxima der Liniengitter und damit von entsprechend höheren absoluten Intensitäten des Lumineszenzverhinderungslichts begrenzt wird. Dadurch ergeben sich gleiche effektive Abmessungen der mehrdimensional begrenzten Intensitätsminima in allen Richtungen.
  • Konkret sind die Intensitätsminima der Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts in einer Ebene, die durch die Richtungen der eindimensionalen Begrenzungen aufgespannt ist, jeweils von einer Linie umschlossen, entlang der die Intensität des Lumineszenzverhinderungslichts abwechselnd von der einfachen Intensität der lokalen Maxima der Liniengitter auf die zweifache Intensität in den Kreuzungspunkten der lokalen Maxima ansteigt und dazwischen wieder auf die einfache Intensität abfällt. Werden die Liniengitter orthogonal zueinander überlagert werden, sind die Punkte auf der Linie, in denen die zweifache Intensität erreicht wird, maximal von dem lokalen Minimum entfernt, während die Punkte mit der einfachen Intensität den kleinsten Abstand zu dem lokalen Minimum aufweisen. Die mehrdimensional begrenzten lokalen Intensitätsminima der resultierenden Intensitätsverteilung sind daher im zweidimensionalen Fall im Wesentlichen kreisförmig und im dreidimensionalen Fall im Wesentlichen kugelförmig.
  • Während in dem erfindungsgemäßen Rasterlumineszenzlichtmikroskop zum Ausbilden der Liniengitter Interferenz der mit den optischen Gittern geformten kohärenten Teilstrahlen des Lumineszenzverhinderungslichts ausgenutzt wird, um einen kleinen Abstand der eindimensional begrenzten Intensitätsminima zu erreichen, behindern Interferenzeffekte bei der Überlagerung der einzelnen Liniengitter das Erzeugen der gewünschten Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts. Dem wird entgegengewirkt, indem die Liniengitter nichtkohärent zu der Intensitätsverteilung überlagert werden. D. h. das Lumineszenzverhinderungslicht des einen Liniengitters ist in der Probe nicht kohärent zu dem Lumineszenzverhinderungslicht des anderen Liniengitters. Dies wird z. B. erreicht, indem das Lumineszenzverhinderungslicht für die beiden Liniengitter von zwei separaten Teillichtquellen bereitgestellt wird. Wenn das Lumineszenzverhinderungslicht für die Liniengitter ein- und derselben Teillichtquelle entnommen wird, kann die nicht kohärente Überlagerung auch dadurch erreicht werden, dass sich Lichtwege des Lumineszenzverhinderungslichts für die verschiedenen Liniengitter in ihrer Länge von der Teillichtquelle bis zur Probe mindestens um seine Kohärenzlänge unterscheiden. Eine nicht kohärente Überlagerung der Liniengitter in der Probe kann auch dadurch sichergestellt werden, wenn zum Erzeugen der verschiedenen Liniengitter Lumineszenzverhinderungslicht unterschiedlicher Wellenlängen oder unterschiedlicher Polarisationen eingesetzt wird.
  • Dass die Liniengitter in der Probe nicht kohärent überlagert werden, kann auch realisiert werden, indem die Probe in zeitlicher Abfolge, d. h. nacheinander, mit den Liniengittern beaufschlagt wird. Die zeitliche Abfolge ist dabei vorzugsweise kurz gegenüber der zeitlichen Abfolge aller anderen Schritte bei der Verwendung des erfindungsgemäßen Rasterlumineszenzlichtmikroskops. Die zeitliche Abfolge kann dazu führen, dass die Probe zu jedem Zeitpunkt mit allenfalls einem der Liniengitter beaufschlagt wird. Dann ist zwar zu keinem Zeitpunkt der Abfolge die doppelte Intensität an den Kreuzungspunkten der Liniengitter oder ein kreis- oder kugelförmiges Minimum der Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts in der Probe vorhanden. Was aber auch dann kreis- oder kugelförmig ist, sind die effektiven Intensitätsminima der Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts, in denen der Lumineszenzmarker durch das Lumineszenzverhinderungslicht nicht an der Emission von Lumineszenzlicht gehindert wird. Eine zeitliche Abfolge der Liniengitter und deren Resultat, dass zu keinem Zeitpunkt die doppelte Intensität an den Kreuzungspunkten der Liniengitter vorliegt, kann die Gefahr eines photochemischen Bleichens des Lumineszenzmarkers durch das Lumineszenzverhinderungslicht reduzieren, wenn diese beispielsweise nichtlinear von der Intensität des Lumineszenzverhinderungslichts abhängt.
  • Für den Erhalt des Messsignals und damit für das Abbilden der Struktur der Probe kann das Beaufschlagen der Probe mit der Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts bereits ausreichend sein. D. h. zum Registrieren des Messsignals ist dann keine zusätzliche Beaufschlagung mit Anregungslicht zum Anregen des Lumineszenzmarkers zur Emission des Lumineszenzlichts erforderlich. Dies kann daraus resultieren, dass der Lumineszenzmarker autolumineszent ist oder dass das Lumineszenzverhinderungslicht den Lumineszenzmarker zwar bei höheren Intensitäten in einen Zustand transferiert, aus dem der Lumineszenzmarker kein Lumineszenzlicht emittiert, bei niedrigeren Intensitäten, wie sie in den Intensitätsminima seiner Intensitätsverteilung herrschen, aber zur Emission von Lumineszenzlicht anregt. Dies kann zum Beispiel, bei einer GSD-Ausführung des erfindungsgemäßen Rasterlumineszenzlichtmikroskops realisiert werden.
  • In dem erfindungsgemäßen Rasterlumineszenzlichtmikroskop findet aber in jedem Fall das sich von dem Lumineszenzverhinderungslicht unterscheidende weitere Licht Verwendung.
  • Mindestens ein Strahl dieses weiteren Lichts wird mit Hilfe eines derselben optischen Gitter, die zum Formen der Teilstrahlen aus dem Lumineszenzverhinderungslicht genutzt werden, in Teilstrahlen aufgespalten, und diese Teilstrahlen werden mit demselben Objektiv in die Probe fokussiert, das auch zum Fokussieren der Teilstrahlen des Lumineszenzverhinderungslichts verwendet wird, so dass sich dort ein Liniengitter ausbildet. Dabei wirkt sich vorteilhaft aus, dass abgesehen von chromatischen Fehlern des Objektivs die parallel zueinander verlaufenden Liniengitter in der Probe eine von den Wellenlängen des Lumineszenzlichts und des weiteren Lichts unabhängige, d. h. immer gleiche Gitterkonstante aufweisen. Die Teilstrahlen von Licht größerer Wellenlänge werden von demselben optischen Gitter über einen größeren Winkel abgelenkt als diejenigen von Licht kleiner Wellenlänge; und dieser größere Winkel gleicht genau den Einfluss der Wellenlänge auf die Gitterkonstante des sich beim gemeinsamen Fokussieren der Teilstrahlen in der Probe ausbildenden Liniengitters aus. Dies macht es möglich, die Intensitätsminima oder die Intensitätsmaxima des Liniengitters des weiteren Lichts unabhängig von dessen Wellenlänge mit den Intensitätsminima des Liniengitters des Lumineszenzverhinderungslichts über einige Perioden der Liniengitter hinweg exakt in Überdeckung zu bringen.
  • So kann beispielsweise die Intensität von Anregungslicht, das als weiteres Licht zum Einsatz kommt und das den Lumineszenzmarker zur Emission von Lumineszenzlicht anregt, in den Intensitätsminima zumindest eines Liniengitters des Lumineszenzverhinderungslichts konzentriert werden. Ebenso kann die Intensität von Aktivierungslicht, das als weiteres Licht zum Einsatz kommt und das den Lumineszenzmarker in einen aktiven Zustand schaltet, in dem er zur Emission von Lumineszenzlicht anregbar ist, in den Intensitätsminima zumindest eines Liniengitters des Lumineszenzverhinderungslichts konzentriert werden.
  • Umgekehrt kann die Intensität von Deaktivierungslicht, das neben Stimulationslicht als Lumineszenzverhinderungslicht als weiteres Licht zum Einsatz kommt und das den Lumineszenzmarker in einen inaktiven Zustand schaltet, in dem er nicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbar ist, außerhalb der Intensitätsminima zumindest eines Liniengitters des Lumineszenzverhinderungslichts konzentriert werden, so dass die Intensitätsminima dieser beiden Liniengitter zusammenfallen. In diesem Fall wird einerseits die effektive Größe der Intensitätsminima, aus denen das Lumineszenzlicht noch emittiert werden kann, sowohl durch das Lumineszenzverhinderungslicht als auch das weitere Licht eingeschränkt. Andererseits verhindert das weitere Licht, dass der Lumineszenzmarker in seinem aktiven Zustand hohen Intensitäten des Lumineszenzverhinderungslichts ausgesetzt wird, die mit dem Risiko seines Bleichens verbunden sind.
  • In bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Rasterlumineszenzlichtmikroskops tritt nicht nur ein Strahl des weiteren Lichts zusammen mit einem der beiden Strahlen des Lumineszenzverhinderungslichts in die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung ein, sondern auch das weitere Licht umfasst zwei nicht kohärente Strahlen, die jeweils zusammen mit einem der beiden Strahlen des Lumineszenzverhinderungslichts in die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung eintreten. Die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung formt so aus den beiden Strahlen des weiteren Lichts mittels der optischen Gitter, die auch die Strahlen des Lumineszenzverhinderungslichts aufspalten, paarweise kohärente Teilstrahlen des weiteren Lichts. Die Teilstrahlen des weiteren Lichts werden dann mit demselben Objektiv wie die Teilstrahlen des Lumineszenzverhinderungslichts gemeinsam fokussiert, so dass sie im Bereich der Probe zwei sich kreuzende Liniengitter ausbilden, die jeweils eine Mehrzahl von eindimensional begrenzten und sich parallel zu den lokalen Intensitätsminima eines der Liniengitter des Lumineszenzverhinderungslichts erstreckenden lokalen Intensitätsminima und Intensitätsmaxima aufweisen. So weist eine Intensitätsverteilung des weiteren Lichts in der Probe ein zweidimensionales Feld aus gleichartigen mindestens zweidimensional begrenzten lokalen Intensitätsmaxima und Intensitätsminima auf. Von der Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung wird diese Intensitätsverteilung des weiteren Lichts so gegenüber der Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts ausgerichtet, dass die lokalen Intensitätsmaxima oder die lokalen Intensitätsminima der Intensitätsverteilung des weiteren Lichts mit den lokalen Intensitätsminima der Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts zusammenfallen. Wenn die lokalen Intensitätsminima der Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts nicht nur zwei-, sondern sogar dreidimensional begrenzt sind, wozu mindestens drei nicht kohärente Strahlen des Lumineszenzverhinderungslichts jeweils in ein Paar von kohärenten Teilstrahlen aufgespalten werden, können auch drei nicht kohärente Strahlen des weiteren Lichts zum Einsatz kommen und jeweils in ein Paar kohärenter Teilstrahlen aufgespalten und in der Probe zu einem Liniengitter überlagert werden. Für den dritten Strahl des weiteren Lichts kommt auch dann vorzugsweise dasselbe Gitter und dasselbe Objektiv zum Einsatz, das auch für das Aufspalten des dritten Strahls des Lumineszenzverhinderungslichts und das gemeinsame Fokussieren dessen Teilstrahlen in die Probe verwendet wird.
  • Ob die lokalen Intensitätsmaxima oder die lokalen Intensitätsminima des Liniengitters des weiteren Lichts mit den parallelen lokalen Minima des jeweiligen Liniengitters des Lumineszenzverhinderungslichts zusammenfallen, ist eine Frage der Abstimmung der optischen Weglängen der Teilstrahlen jedes Paars von kohärenten Teilstrahlen des weiteren Lichts auf die optischen Weglängen der Teilstrahlen des Paars von mittels desselben optischen Gitters geformten kohärenten Teilstrahlen des Lumineszenzverhinderungslichts, wobei es um die Weglängen von dem jeweiligen optischen Gitter bis zu den jeweiligen Liniengittern des weiteren Lichts und des Lumineszenzverhinderungslichts geht. Diese optischen Weglängen werden in dem erfindungsgemäßen Rasterlumineszenzlichtmikroskop mit der Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung festgelegt. Zum Beispiel kann dazu ein Spiegel, der von jedem Paar der kohärenten Teilstrahlen nur einen Teilstrahl reflektiert, verlagert werden, um die optische Weglänge für die von ihm reflektierten Teilstrahlen zu verändern. Diese Veränderung wirkt sich auf beide reflektierten Teilstrahlen aus. Bei unterschiedlichen Wellenlängen des weiteren Lichts und des Lumineszenzverhinderungslichts verändert sich dabei aber auch die relative Weglänge, d. h. die relative Phase zwischen den beiden Teilstrahlen des weiteren Lichts und den beiden Teilstrahlen des Lumineszenzverhinderungslichts und damit die relative Lage der Intensitätsmaxima oder Intensitätsminima des Liniengitters des weiteren Lichts gegenüber den parallelen Intensitätsminima des Liniengitters des Lumineszenzverhinderungslichts.
  • In einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Rasterlumineszenzlichtmikroskops weist die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung mindestens ein optisches Element auf, das selektiv in einem der Teilstrahlen eines der Paare von kohärenten Teilstrahlen des weiteren Lichts und/oder einem der Teilstrahlen des Paars von mittels desselben optischen Gitters geformten kohärenten Teilstrahlen des Lumineszenzverhinderungslichts angeordnet ist. Dieses optische Element ist dazu vorgesehen, die Abstimmung zwischen den optischen Weglängen des einen Paars von kohärenten Teilstrahlen des weiteren Lichts und des Paars von mittels desselben optischen Gitters geformten kohärenten Teilstrahlen des Lumineszenzverhinderungslichts vorzunehmen. Wenn das optische Element austauschbar ist, können unterschiedliche optische Elemente vorgesehen sein, um einerseits die lokalen Intensitätsmaxima und andererseits die lokalen Intensitätsminima der Intensitätsverteilung des weiteren Lichts mit den lokalen Intensitätsminima der Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts zusammenfallen zu lassen und um andererseits verschiedene Kombinationen von Wellenlängen des weiteren Lichts und des Lumineszenzverhinderungslichts abzudecken. Konkret kann das optische Element ein chromatisches und/oder doppelbrechendes optisches Element sein, mit dem die gewünschten Phasenbeziehungen zwischen den beiden Paaren von Teilstrahlen des weiteren Lichts und des Lumineszenzverhinderungslichts eingestellt werden.
  • Grundsätzlich kann das optische Element auch so ausgebildet sein, dass es die optischen Wellenlängen der Teilstrahlen jedes Paars von kohärenten Teilstrahlen des weiteren Lichts und der optischen Weglängen der Teilstrahlen des Paars von mittels desselben optischen Gitters geformten kohärenten Teilstrahlen des Lumineszenzverhinderungslichts für verschiedene Wellenlängen des weiteren Lichts und/oder des Lumineszenzverhinderungslichts so aufeinander abstimmt, dass die lokalen Intensitätsmaxima oder die lokalen Intensitätsminima des Liniengitters des weiteren Lichts so wie gewünscht mit den parallelen lokalen Intensitätsminima des jeweiligen Liniengitters des Lumineszenzverhinderungslichts zusammenfallen. Auf diese Weise wird ein Austauschen des optischen Elements zumindest über verschiedene Kombinationen der Wellenlängen des weiteren Lichts und/oder des Lumineszenzverhinderungslichts unnötig.
  • Statt die optischen Weglängen zwischen dem jeweiligen optischen Gitter und dem Liniengitter in der Probe gleichzeitig für die Teilstrahlen des weiteren Lichts und des Lumineszenzverhinderungslichts aufeinander abzustimmen, kann in dem erfindungsgemäßen Rasterlumineszenzlichtmikroskop die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung das weitere Licht und das Lumineszenzverhinderungslicht auch nacheinander auf die Probe richten und die Intensitätsverteilungen des weiteren Lichts und des Lumineszenzverhinderungslichts zwischenzeitlich so relativ zueinander verlagern, dass die gewünschte Relativanordnung der lokalen Intensitätsmaxima oder der lokalen Intensitätsminima des weiteren Lichts gegenüber den lokalen Intensitätsminima des Lumineszenzverhinderungslichts erreicht wird. In dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Rasterlumineszenzlichtmikroskops wird beim Übergang von dem weiteren Licht auf das Lumineszenzverhinderungslicht oder umgekehrt die optische Weglänge jeweils eines der Teilstrahlen jedes Paars von Teilstrahlen verändert, um die gewünschte Relativlage der lokalen Intensitätsmaxima oder Intensitätsminima des weiteren Lichts gegenüber den lokalen Intensitätsminima des Lumineszenzverhinderungslichts einzustellen.
  • Wie bereits mehrfach angedeutet wurde, unterscheidet sich das weitere Licht von dem Lumineszenzverhinderungslicht häufig durch seine Wellenlänge. Grundsätzlich können sich das Lumineszenzverhinderungslicht und das weitere Licht aber auch hinsichtlich ihrer Intensitäten unterscheiden. Im Fall unterschiedlicher Intensitäten bei gleicher Wellenlänge ist es bei dem erfindungsgemäßen Rasterlumineszenzlichtmikroskop von größerer Bedeutung, dass die lokalen Intensitätsmaxima der Intensitätsverteilung des weiteren Lichts mit den lokalen Intensitätsminima der Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts in der Probe zur Überdeckung gebracht werden können.
  • Das erfindungsgemäße Rasterlumineszenzlichtmikroskop kann separate Teillichtquellen für das weitere Licht und das Lumineszenzverhinderungslicht aufweisen, insbesondere wenn deren Wellenlängen unterschiedlich sind. Das weitere Licht und das Lumineszenzverhinderungslicht können aber grundsätzlich auch aus dem Licht einer einzigen Lichtquelle mit mehreren Linien oder einem kontinuierlichen Spektrum des emittierten Lichts selektiert werden. Weiterhin kann auch Licht einer Lichtquelle, die Licht einer einzigen Wellenlänge emittiert, durch Frequenzverschiebung in Licht unterschiedlicher Wellenlängen umgewandelt werden. Allgemein kann die Lichtquelle das weitere Licht und das Lumineszenzverhinderungslicht also aus Licht einer einzigen Ausgangswellenlänge oder einer Ausgangswellenlängenverteilung, das von einer einzigen Teillichtquelle kommt, generieren und/oder selektieren.
  • Die Lichtquelle des erfindungsgemäßen Rasterlumineszenzlichtmikroskops kann auch separate Teillichtquellen für jeden nicht kohärenten Strahl des weiteren Lichts und des Lumineszenzverhinderungslichts aufweisen. Um die Kohärenz zwischen den Strahlen des weiteren Lichts und des Lumineszenzverhinderungslichts zu verhindern, können aber auch unterschiedliche Delays verwendet werden, die länger als eine Kohärenzlänge der Lichtquelle sind; oder die Kohärenz wird durch andere Dinge verhindert, wie unterschiedliche Polarisierung oder Wellenlängen der Teilstrahlen.
  • Außerdem kann die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung die einzelnen Liniengitter des Lumineszenzverhinderungslichts und/oder des weiteren Lichts nacheinander in der Probe ausbilden, um sie nicht kohärent zu der Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts und/oder des weiteren Lichts zu überlagern. Solange dieses nacheinander Ausbilden der einzelnen Liniengitter verglichen mit den weiteren beim Registrieren des Lumineszenzlichts von der Probe zu jeder Lage der Intensitätsminima des Lumineszenzverhinderungslichts schnell erfolgt, wirken sich die nacheinander in der Probe ausgebildeten Liniengitter, zumindest was die Anregung von Einphotonenprozessen anbelangt, nicht anders aus als gleichzeitig ausgebildete Liniengitter.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Rasterlumineszenzlichtmikroskop kann die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung den interessierenden Bereich der Probe abtasten, indem sie relative Phasen der kohärenten Teilstrahlen des weiteren Lichts und des Lumineszenzverhinderungslichts variiert. Wenn das weitere Licht und das Lumineszenzverhinderungslicht gleichzeitig auf die Probe treffen, so dass die optischen Weglängen von dem jeweiligen optischen Gitter bis zu dem Linienmuster in der Probe gleichzeitig für das weitere Licht und das Lumineszenzlicht aufeinander abgestimmt werden müssen, ist es jedoch schwierig, die relativen Phasen der kohärenten Teilstrahlen zum Abscannen des interessierenden Teilbereichs der Probe zu variieren, ohne die gewünschte Relativlage der Intensitätsminima oder -maxima des weiteren Lichts gegenüber den Intensitätsminima des Lumineszenzverhinderungslichts zu beeinträchtigen. In diesem Fall kann es günstiger sein, dass die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung die überlagerten Intensitätsverteilungen des Lumineszenzverhinderungslichts und des weiteren Lichts unverändert lässt und gemeinsam gegenüber der Probe verlagert. Dies kann auch dadurch geschehen, dass die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung die Probe gegenüber dem Objektiv verlagert.
  • Wie bereits angesprochen wurde, kann das weitere Licht bei dem erfindungsgemäßen Rasterlumineszenzlichtmikroskop Anregungslicht sein, das den Lumineszenzmarker zur Emission von Lumineszenzlicht anregt, wobei die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung die Intensitätsverteilung des weiteren Lichts so gegenüber der Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts ausrichtet, dass die lokalen Intensitätsmaxima der Intensitätsverteilung des weiteren Lichts mit den lokalen Intensitätsminima der Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts zusammenfallen. Das Lumineszenzverhinderungslicht kann den Lumineszenzmarker z. B. zur stimulierten Emission veranlassen und auf diese Weise wieder abregen oder den Lumineszenzmarker in einen grundsätzlich nicht lumineszenzfähigen Dunkelzustand überführen oder schalten. In dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Rasterlumineszenzlichtmikroskops kann das Lumineszenzverhinderungslicht kontinuierlich auf die Probe aufgebracht werden, wobei das weitere Licht als Anregungslicht in Pulsen auf die Probe aufgebracht wird. In diesem und jedem anderen Fall von gepulstem Anregungslicht als weiteres Lichts ist es vorteilhaft, das Lumineszenzlicht mit zeitlicher Auflösung nach jedem Puls des Anregungslichts zu registrieren, um Ortsauflösung und Kontrast zu maximieren, wie dies grundsätzlich aus der WO 2012/069076 A1 für ein STED-Rasterlumineszenzlichtmikroskop bekannt ist.
  • Um das aus den Bereichen der einzelnen Intensitätsminima der Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts emittierte Lumineszenzlicht getrennt zu registrieren, kann für jedes Intensitätsminimum ein separater Detektor eingesetzt werden. Bei diesen Detektoren kann es sich auch um nicht räumlich auflösende Detektoren, wie Punktdetektoren, handeln. Bevorzugt wird das Lumineszenzlicht jedoch mittels eines räumlich auflösenden Detektors registriert. Um ein getrenntes Registrieren zu ermöglichen, muss beim Abbilden des Lumineszenzlichts auf den räumlich auflösenden Detektor sichergestellt sein, dass den Bereichen der einzelnen Intensitätsminima nicht oder zumindest nicht wesentlich überlappende Bereiche des Detektors zugeordnet werden können. Beispielsweise kann das von den Messbereichen emittierte Lumineszenzlicht auf eine Kamera und insbesondere auf eine Kamera mit einem matrixartigen Sensor, wie beispielsweise einem CCD-oder CMOS-Sensor, abgebildet werden. Zum Zuordnen des registrierten Lumineszenzlichts zu den Messbereichen können dann die Pixel des Sensors in distinkte Gruppen zusammengefasst werden und die Gruppen den verschiedenen Messbereichen zugeordnet werden.
  • Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibung genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile zwingend von erfindungsgemäßen Ausführungsformen erzielt werden müssen. Ohne dass hierdurch der Gegenstand der beigefügten Patentansprüche verändert wird, gilt hinsichtlich des Offenbarungsgehalts der ursprünglichen Anmeldungsunterlagen und des Patents Folgendes: weitere Merkmale sind den Zeichnungen – insbesondere der relativen Anordnung und den Wirkverbindungen mehrerer Bauteile – zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen der Erfindung entfallen.
  • Die in den Patentansprüchen und der Beschreibung genannten Merkmale sind bezüglich ihrer Anzahl so zu verstehen, dass genau diese Anzahl oder eine größere Anzahl als die genannte Anzahl vorhanden ist, ohne dass es einer expliziten Verwendung des Adverbs "mindestens" bedarf. Wenn also beispielsweise von einem Element die Rede ist, ist dies so zu verstehen, dass genau ein Element, zwei Elemente oder mehr Elemente vorhanden sind. Diese Merkmale können durch andere Merkmale ergänzt werden oder die einzigen Merkmale sein, aus denen das jeweilige Erzeugnis besteht.
  • Die in den Patentansprüchen enthaltenen Bezugszeichen stellen keine Beschränkung des Umfangs der durch die Patentansprüche geschützten Gegenstände dar. Sie dienen lediglich dem Zweck, die Patentansprüche leichter verständlich zu machen.
  • KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • Im Folgenden wird die Erfindung anhand in den Figuren dargestellter bevorzugter Ausführungsbeispiele weiter erläutert und beschrieben.
  • 1 zeigt zwei Liniengitter und deren Überlagerung zu einer Intensitätsverteilung.
  • 2 zeigt die Intensitätsverteilung gemäß 1 in Schnitten entlang verschiedener Richtungen.
  • 3 illustriert Verfahrensschritte eines erfindungsgemäßen Verfahrens zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer mit einem Lumineszenzmarker markierten Struktur einer Probe.
  • 4 illustriert eine aus der Überlagerung von zwei Liniengittern resultierenden Intensitätsverteilung und eine zu der Intensitätsverteilung gehörende effektive Punktabbildungsfunktion.
  • 5 illustriert eine erfindungsgemäße Vorrichtung zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer mit einem Lumineszenzmarker markierten Struktur einer Probe.
  • FIGURENBESCHREIBUNG
  • 1(a) und (b) zeigen jeweils ein Liniengitter 1, 2, hier aus Lumineszenzverhinderungslicht. Jedes der Liniengitter 1 und 2 weist eine Mehrzahl von eindimensional begrenzten lokalen Intensitätsminima 3, 4 auf. Bei dem in 1 dargestellten Beispiel weist jedes der Liniengitter 1 und 2 drei lokale Intensitätsminima 3, 4 auf. Die lokalen Intensitätsminima 3, 4 sind jeweils äquidistant angeordnet und parallel zueinander ausgerichtet. Zu beiden Seiten hin grenzen lokale Intensitätsmaxima 5, 6 an die lokalen Intensitätsminima 3, 4 an, wobei die Intensität des Lumineszenzverhinderungslicht von den lokalen Intensitätsminima 3, 4 zu den lokalen Intensitätsmaxima 5, 6 hin zunimmt. Das Lumineszenzverhinderungslicht der beiden Liniengitter ist nicht kohärent.
  • Die beiden Liniengitter 1 und 2 werden derart überlagert, dass die lokalen Intensitätsminima 3 und 4 in der in 1(c) gezeigten Überlagerung zur Intensitätsverteilung 7 orthogonal zueinander ausgerichtet sind. Da das Lumineszenzverhinderungslicht der beiden Liniengitter nicht kohärent ist, kommt es bei der Überlagerung der Liniengitter 1 und 2 zu einer einfachen Addition ihrer Intensitäten. An Kreuzungspunkten 8, in denen sich die lokalen Intensitätsminima 3 und 4 der Liniengitter 1 und 2 kreuzen, bilden sich zweidimensional durch die lokalen Intensitätsmaxima 5, 6 begrenzte lokale Intensitätsminima 9. Um eine Begrenzung der lokalen Intensitätsminima 9 in der dritten Dimension zu erreichen, kann ein weiteres Liniengitter, dessen lokalen Intensitätsminima quer zu den lokalen Intensitätsminima 3 und 4 ausgerichtet sind, überlagert werden.
  • Bei der in 1(c) dargestellten Intensitätsverteilung 7 kommt jedes der drei lokalen Intensitätsminima 3 des Liniengitters 1 mit jedem der drei lokalen Intensitätsminima 4 des Liniengitters 2 zur Überlagerung, so dass die resultierende Intensitätsverteilung 7 insgesamt neun Kreuzungspunkte 8 und damit auch neun lokale Intensitätsminima 9 aufweist. Die lokalen Intensitätsminima 3 und 4 stellen Nullstellen dar, in denen die Intensität des Lumineszenzverhinderungslichts im Idealfall verschwindet. In den zweidimensional begrenzten lokalen Intensitätsminima 9 weist das Lumineszenzverhinderungslicht dann ebenfalls verschwindende Intensitäten auf.
  • Entsprechend der äquidistanten Anordnung der lokalen Intensitätsminima 3 und 4, wobei die Abstände der lokalen Intensitätsminima 3 und 4 der beiden Liniengitter 1 und 2 übereinstimmen, sind die lokalen Intensitätsminima 9 der Intensitätsverteilung 7 in einem quadratischen Raster angeordnet. Wenn die lokalen Intensitätsmaxima 5 und 6 der beiden Liniengitter 1 und 2 jeweils gleiche Intensitäten aufweisen, werden die lokalen Intensitätsminima 9 in Richtung der eindimensional begrenzten lokalen Intensitätsminima 3 und 4 jeweils durch die lokalen Intensitätsmaxima 5 oder 6 mit einfacher Intensität begrenzt. In einer Richtung diagonal zu den lokalen Intensitätsminima 3, 4 addieren sich die Intensitäten der lokalen Intensitätsmaxima 5 und 6 bis auf das Doppelte in ihren Kreuzungspunkten 10 auf. Die voranstehende Betrachtung gilt streng für gleichzeitig einfallende Liniengitter 1, 2 aus Lumineszenzverhinderungslicht. Eine gleiche Wirkung kann mit kurz aufeinander folgenden Liniengittern 1 und 2 erreicht werden. Auch dabei fallen an den Kreuzungspunkten 10 doppelt so große Lichtmengen ein wie im Bereich der einzelnen lokalen Intensitätsmaxima 5 und 6 der Liniengitter 1, und entsprechend wird zumindest bei einer auf einem Einphotonenprozess basierenden Wirkung des Lumineszenzverhinderungslichts dieselbe Verteilung der Transferwirkung des Lumineszenzverhinderungslichts um die lokalen Intensitätsminima 9 herum erreicht.
  • In 2 ist ein Verlauf 11 der Intensitätsverteilung 7 in einem Schnitt quer zu den eindimensional begrenzten lokalen Intensitätsminima 3, 4 dargestellt. In direktem Vergleich dazu, ist ein Verlauf 12 der Intensitätsverteilung 7 in einem Schnitt diagonal zu den eindimensional begrenzten lokalen Intensitätsminima 3 und 4 gezeigt. Die Verläufe 11 und 12 zeigen jeweils eine Intensität I über einer Ortskoordinate S an.
  • Wie aus 2 ersichtlich wird, weist der Verlauf 12 im Vergleich zu dem Verlauf 11 als Maximalwert die doppelte Intensität auf, der an den Kreuzungspunkten 10 der lokalen Intensitätsmaxima 5 und 6 erreicht wird. Diese Kreuzungspunkte liegen aber weiter von dem Zentrum des lokalen Intensitätsminimums 9 entfernt als die lokalen Intensitätsmaxima 5 bzw. 6 längs des Verlaufs 11. So wird eine die Abmessungen des lokalen Intensitätsminimums 9 definierende Sättigungsintensität bei beiden Verläufen in gleichem Abstand zu dem Zentrum des lokalen Minimums 9 erreicht. Während sich die Verläufe 11 und 12 also außerhalb des lokalen Minimums 9 unterscheiden, sind ihre Unterschiede innerhalb und am Rand des lokalen Minimums 9 vernachlässigbar. Im Ergebnis sind die lokalen Intensitätsminima 9 der Intensitätsverteilung 7 im Wesentlichen kreisförmig ausgebildet.
  • Dass die lokalen Intensitätsminima der Intensitätsverteilung im Wesentlichen kreisförmig sind, wenn zwei zueinander orthogonal ausgerichtete Liniengittern mit einem sinusförmigen Intensitätsverlauf gleicher Periode überlagert werden, lässt sich auch anhand der folgenden Überlegungen nachvollziehen:
    Ein Verlauf I(x, y) der Intensitätsverteilung, die aus der Überlagerung von zwei orthogonal zu einander ausgerichteten sinusförmigen Liniengittern mit der Amplitude I0 und der Periode l resultiert, kann durch die Funktion
    Figure DE102015109305B3_0002
    beschrieben werden, wobei x und y die durch die Strukturierung der Liniengitter vorgegebenen Raumkoordinaten sind. Bei einem auf dem RESOLFT-Konzept basierenden Verfahren kann aus der Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts unmittelbar auf eine effektive Punktabbildungsfunktion geschlossen werden. Diese effektive Punktabbildungsfunktion heff ist gegeben durch
    Figure DE102015109305B3_0003
    wobei IS die Sättigungsintensität des Lumineszenzverhinderungslichts bezeichnet, bei der die Hälfte des im Bereich der maximalen Amplitude des Intensitätsverlaufs befindlichen Lumineszenzmarkers in den zweiten Zustand transferiert ist. Für hohe Intensitäten I0 im Vergleich zu IS wird nur für kleine Werte für x und y ein nicht verschwindender Wert erreicht. Entsprechend kann die effektive Punktabbildungsfunktion im Rahmen einer Taylor-Entwicklung genähert werden durch
    Figure DE102015109305B3_0004
    mit einer radialen Frequenz ω = 2π/l der resultierenden Intensitätsverteilung und einer radialen Koordinate r, die einem Abstand vom Zentrum des lokalen Minimums der Intensitätsverteilung entspricht. Als volle Halbwertsbreite Δr des lokalen Minimums der resultieren Intensitätsverteilung erhält man dann
    Figure DE102015109305B3_0005
  • Insgesamt ergibt sich also ein näherungsweise radialsymmetrisches lokales Minimum, dessen Ausdehnung von einem Verhältnis der Sättigungsintensität und der Amplitude der Liniengitter sowie von einer Periode der Liniengitter abhängt.
  • Bei einem erfindungsgemäßen Rasterfluoreszenzlichtmikroskop wird nicht nur das Lumineszenzverhinderungslicht strukturiert. Vielmehr wird auch weiteres in dem Rasterfluoreszenzlichtmikroskop zum Einsatz kommendes Licht, das sich von dem Lumineszenzverhinderungslicht unterscheidet, im Bereich der jeweiligen Probe strukturiert. Dabei wird auch aus dem weiteren Licht zumindest ein Liniengitter ausgebildet, vorzugsweise werden mehrere solcher Liniengitter ausgebildet und so überlagert, dass sich ihre jeweiligen parallelen Intensitätsmaxima und Intensitätsminima orthogonal kreuzen. Wenn es sich bei dem weiteren Licht z. B. um Anregungslicht handelt, ergeben sich an den Kreuzungspunkten der eindimensional begrenzten Intensitätsmaxima seiner Liniengitter zweidimensional von seinen überlagerten lokalen Intensitätsminima begrenzte Intensitätsmaxima, in denen ein Lumineszenzfarbstoff in der jeweiligen Probe maximal angeregt wird. Diese Intensitätsmaxima werden auf die Intensitätsminima der Intensitätsverteilung der überlagerten Liniengitter des Lumineszenzverhinderungslichts ausgerichtet, wie im Folgenden beispielhaft beschrieben wird.
  • 3(a) bis (c) zeigen Schritte beim räumlich hochaufgelösten Abbilden einer einen Lumineszenzmarker 13 aufweisenden Struktur 14 einer Probe 15. Bei dem in 3(a) gezeigten Schritt wird die Probe 15 in einem interessierenden Bereich gleichzeitig mit mehreren zweidimensional begrenzten lokalen Intensitätsmaxima 16 einer Intensitätsverteilung 33 von Anregungslicht 17 beaufschlagt, das den Lumineszenzmarker 13 in einen lumineszierenden Zustand anregt, aus dem der Lumineszenzmarker 13 unter Emission von Lumineszenzlicht 18 in seinen Grundzustand zurückkehren kann. Die zweidimensional begrenzten lokalen Intensitätsminima 16 der Intensitätsverteilung 33 bilden sich an den Kreuzungspunkten von eindimensional begrenzten Intensitätsmaxima 34 und 35 von zwei Liniengittern 36 und 37 des Anregungslichts aus, die analog zu 1 in der Probe 15 orthogonal überlagert sind.
  • Gemäß 3(b) wird die Probe 15 zusätzlich zu der Intensitätsverteilung 33 des Anregungslichts 17 mit der Intensitätsverteilung 7 des Lumineszenzverhinderungslicht 38 beaufschlagt, die durch die Überlagerung der beiden Liniengittern 1 und 2 gemäß 1 erzeugt wird. Die Intensitätsverteilung 7 weist ihre gleichartigen, zweidimensional begrenzten lokalen Intensitätsminima 9 dabei jeweils am Ort eines der Intensitätsmaxima 16 auf. Durch das Beaufschlagen der Probe 15 mit dem Lumineszenzverhinderungslicht 38 wird der Lumineszenzmarker 13 überall außerhalb der lokalen Intensitätsminima 9 seiner Intensitätsverteilung 7 aus seinem angeregten lumineszierenden Zustand zurück in seinen elektronischen Grundzustand überführt, ohne dass dabei das Lumineszenzlicht 18 emittiert wird. Nach dem Schritt gemäß 3(b) befindet sich der Lumineszenzmarker 13 damit nur noch in durch die lokalen Intensitätsminima 9 vorgegebenen Bereichen der Probe 15 in seinem lumineszierenden Zustand.
  • In dem in 3(c) dargestellten Verfahrensschritt wird das aus jedem der Intensitätsminima 9 emittierte Lumineszenzlicht 18 räumlich getrennt registriert. Auch wenn die Ortsauflösung beim Registrieren des Lumineszenzlichts 18 nicht besser ist als diejenige beim Ausbilden der Intensitätsmaxima 16 des Anregungslichts, kann das für jedes Intensitätsminimum 9 getrennt registrierte Lumineszenzlicht 18 der Position dieses Intensitätsminimums 9 zugeordnet werden, da das emittierte Lumineszenzlicht 18 nur aus seinem Bereich stammen kann.
  • Die in 3 gezeigten Schritte werden beim Abtasten der Probe mit den Intensitätsminima 9 wiederholt. Dabei wird eine Konzentrationsverteilung des Lumineszenzmarkers 13 in der Probe 15 erfasst und somit die Struktur 14 abgebildet. Da die Probe 15 nicht nur mit einem einzigen Messbereich, sondern gleichzeitig mit den mehreren Messbereichen 16 abgetastet wird, wird das Abtasten eines größeren Bereichs der Probe 15 und damit das Abbilden der Struktur 14 in diesem Bereich erheblich beschleunigt. Für den in 3 dargestellten Fall reduziert sich die Zeit für das Abtasten beispielsweise auf ein Neuntel der Zeit, die bei der Verwendung einer Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts mit nur einem lokalen Minimum erforderlich wäre.
  • In 4(a) ist stark schematisiert gezeigt, wie die oben beschriebenen orthogonal zu einander ausgerichteten sinusförmigen Liniengittern erzeugt und zu der durch die Funktion I(x, y) vorgegebenen Intensitätsverteilung 7 des Lumineszenzverhinderungslichts 38 und der dazu in beiden Richtungen um jeweils ein halbe Gitterkonstante versetzten Intensitätsverteilung 33 des Lumineszenzverhinderungslichts 17 überlagert werden können. Zum Erzeugen der Liniengitter 1 und 2 sowie 36 und 37 passieren zwei senkrecht zueinander polarisierte Paare von Strahlen 19 und 39 sowie 20 und 40 jeweils eines von zwei senkrecht zueinander ausgerichteten optischen Gittern 21, 22. Die Strahlen 19 und 20 sind dabei Strahlen des Lumineszenzverhinderungslichts 38 und ebenso senkrecht zueinander polarisiert wie die Strahlen 20 und 40 des Anregungslichts. Jeder Teilstrahl 19, 20, 39, 40 wird von dem jeweiligen Gitter in Teilstrahlen aufgespalten, von denen die beiden den Beugungsmaxima 1. Ordnung entsprechenden Teilstrahlen genutzt werden. Alle Teilstrahlen werden anschließend über einen polarisierenden Strahlteiler 23 zusammengeführt und durch eine Linse 24 in die rückseitige Apertur eines Objektivs 25 fokussiert. Eine im Ausschnitt 26 stark schematisiert dargestellte Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts und des Anregungslichts in der rückseitigen Apertur des Objektivs 25 weist jeweils vier symmetrisch angeordnete Fokusse 27 und 28 mit den durch die Pfeile angedeuteten Polarisationen auf. Die sich jeweils gegenüberliegenden Fokusse 27 entsprechen den Beugungsmaxima 1. Ordnung des Strahls 19, 20 des Lumineszenzverhinderungslichts mit der entsprechenden Polarisation. Analog entsprechen die sich jeweils gegenüberliegenden Fokusse 28 den Beugungsmaxima 1. Ordnung des Strahls 39, 40 des Anregungslichts mit der entsprechenden Polarisation. Im vorliegenden Fall liegen die Fokusse 28 dichter beieinander als die Fokusse 27, was einem aufgrund kürzerer Wellenlänge des Anregungslichts als des Lumineszenzverhinderungslichts kleineren Ablenkwinkel der Strahlen 39 und 40 als der Strahlen 19 und 20 durch die Gitter 21 und 22 entspricht.
  • Durch das Abbilden der beiden Teilstrahlen aller Strahlen 19, 20, 39, 40 werden die Liniengitter in der Fokusebene des Objektivs 25 erzeugt und überlagert. Aus der Überlagerung resultiert dann die Intensitätsverteilung 7 des Lumineszenzverhinderungslichts mit dem Intensitätsverlauf gemäß der Funktion I(x, y). In 4(a) ist die Intensitätsverteilung 33 des Anregungslichts, die aus den Strahlen 39 und 40 ausgebildet wird, nicht separat dargestellt. Diese Intensitätsverteilung 33 ist insoweit komplementär zu der Intensitätsverteilung 7, als dass in jedem lokalen Intensitätsminimum der Intensitätsverteilung 7 ein lokales Intensitätsmaximum der nicht dargestellten Intensitätsverteilung 33 angeordnet ist. Eine gleiche Gitterkonstante der die Intensitätsverteilungen 7 und 33 ausbildenden Liniengitter ergibt sich trotz unterschiedlicher Wellenlänge des Anregungslichts und des Lumineszenzverhinderungslichts dadurch, dass die Gitterkonstante genauso von dem Quotienten aus dem Winkel des jeweiligen Teilstrahls und seiner Wellenlänge abhängt, wie sich zuvor die optischen Gitter 21 und 22 unterschiedlich auf den Winkel der Teilstrahlen ausgewirkt haben. Die relative Lage der Intensitätsmaxima des Anregungslichts gegenüber den Intensitätsminima des Lumineszenzverhinderungslichts wird durch optische Elemente 41 und 42 eingestellt, die in jeweils einem der Teilstrahlen jedes der Strahlen 19, 20, 39, 40 angeordnet sind. Mit diesen optischen Elementen 41 und 42 werden jeweils die parallel zueinander verlaufenden Intensitätsmaxima eines der Liniengitter des Anregungslichts und die parallel zueinander verlaufenden Intensitätsminima eines der Gitter des Lumineszenzverhinderungslichts zur Deckung gebracht, indem die optischen Weglängen von den optischen Gittern 22, 22 bis zu der Fokusebene des Objektivs 25 aufeinander abgestimmt werden. Die optischen Elemente 41 und 42 können beispielsweise aus hochbrechendem Material bestehen, mit dem die optische Weglänge für die hindurchtretenden Teilstrahlen verlängert wird. Dies führt nicht nur zu einer gemeinsamen Verlagerung der parallelen Intensitätsmaxima und Intensitätsminima der mittels desselben optischen Gitters 21 bzw. 22 erzeugten Liniengitter aus dem Anregungslicht und dem Lumineszenzverhinderungslicht, sondern auch zu einer Relativverschiebung der Intensitätsmaxima des Anregungslichts gegenüber den Intensitätsminima des Lumineszenzverhinderungslichts. Dies beruht darauf, dass sich eine absolut gleiche Änderung der optischen Weglängen aufgrund der unterschiedlichen Wellenlängen des Anregungslichts und des Lumineszenzverhinderungslichts unterschiedlich auf die relativen Phasen zwischen den Teilstrahlen des jeweiligen Strahls 19, 20 bzw. 39, 40 auswirken.
  • In 4(b) ist die Intensitätsverteilung 7 in der Fokusebene in einem vergrößerten Ausschnitt 29 mit vier zweidimensional begrenzten lokalen Intensitätsminima 9 dargestellt. Die lokalen Intensitätsminima 9 sind näherungsweise kreisförmig, wobei ihr Radius etwa der halben Periode l der Liniengitter entspricht. In 4(c) sind beispielhaft zwei zu der Intensitätsverteilung 7 gehörige effektive Punktabbildungsfunktionen 30, 31 entsprechend dem in 4(b) dargestellten Ausschnitt gezeigt und können in erster Näherung jeweils durch die Funktion heff. Bei der links dargestellten effektiven Punktabbildungsfunktion 30 beträgt das Verhältnis von I0 zu IS fünf. Die Punktabbildungsfunktion 30 weist vier den lokalen Intensitätsminima 9 entsprechende kreisförmige lokale Maxima mit der vollen Halbwertsbreite
    Figure DE102015109305B3_0006
    auf. Dabei wird durch jedes lokale Maximum und dessen Halbwertsbreite der Bereich in der Probe vorgegeben, dem das von dem in dem zugehörigen Messbereich befindlichen Lumineszenzmarker emittierte Messsignal zugeordnet werden kann. Bei der rechts dargestellten Punktabbildungsfunktion 31 beträgt das Verhältnis von I0 zu IS 100, womit sich die
  • Halbwertsbreite auf
    Figure DE102015109305B3_0007
    verringert. Das Messsignal kann entsprechend einem kleineren Bereich in der Probe zugeordnet werden, d. h. es wird eine verbesserte Auflösung erreicht. Zum Abbilden der Struktur wird die Probe beispielsweise gemäß dem Raster 32 abgetastet, wobei das für eine Position erhaltene Messsignal jeweils einem Pixel des Rasters 32 zugeordnet wird.
  • In 5 ist stark schematisiert ein Beispiel für ein erfindungsgemäßes Rasterlumineszenzlichtmikroskop 43 zum hochaufgelösten Abbilden einer mit einem Lumineszenzmarker markierten Struktur einer Probe 15 gezeigt. Das Lumineszenzverhinderungslicht 38 wird von einer Teillichtquelle 44 und das Anregungslicht 17 von einer Teillichtquelle 45 einer Lichtquelle 46 bereitgestellt. Über einen dichroitischen Strahlteiler 47 werden das Lumineszenzverhinderungslicht 38 und das Anregungslicht 17 zusammengeführt. Eine optische Faser 48 mit zugehöriger Faseroptik dient zur Strahlaufreinigung, eine für die Wellenlänge des Lumineszenzverhinderungslichts 38 und die Wellenlänge des Anregungslichts 17 wirksame λ/2-Platte 49 zur Polarisationsdrehung. Über einen polarisierenden Strahlteiler 50 werden das Lumineszenzverhinderungslicht 38 und das Anregungslicht 17 in die beiden jeweils senkrecht zueinander polarisierten Strahlen 19 und 20 bzw. 39 und 40 aufgeteilt. Die Strahlen 19 und 39 bzw. 20 und 40 passieren dann gemeinsam eines der beiden das optische Gitter 21, 22. Über einen weiteren polarisierenden Strahlteiler 51 werden die Strahlen 19 und 20 sowie 39 und 40 wieder zusammengeführt. Nach dem Passieren einer Optik 52 zur Selektion der Beugungsmaxima 1. Ordnung, in der auch die optischen Elemente 41 und 42 angeordnet sind, werden die Strahlen 19, 20 und 39, 40 über die Linse 24, einen weiteren dichroitischen Strahlteiler 53, eine Strahlablenkeinrichtung 54 und das Objektiv 25 in die Probe 15 abgebildet. Mit dem Abbilden der Strahlen 19, 20 werden in der Fokusebene des Objektivs 25 die zwei Liniengitter mit eindimensional begrenzten Intensitätsminima des Lumineszenzverhinderungslichts erzeugt und überlagert. Aus der Überlagerung der Liniengitter des Lumineszenzverhinderungslichts resultiert die Intensitätsverteilung mit einer Mehrzahl von zweidimensional begrenzten lokalen Intensitätsminima. Mit dem Abbilden der Strahlen 39, 40 werden in der Fokusebene des Objektivs 25 die zwei Liniengitter mit eindimensional begrenzten Intensitätsmaxima des Anregungslichts erzeugt und überlagert. Aus der Überlagerung der Liniengitter des Anregungslichts resultiert die Intensitätsverteilung mit einer Mehrzahl von zweidimensional begrenzten lokalen Intensitätsmaxima. Mit den optischen Elementen 41 und 42 werden dabei die relativen Phasenlagen so aufeinander abgestimmt, dass jeweils ein zweidimensional begrenztes lokales Intensitätsmaximum des Anregungslichts mit einem zweidimensional begrenzten lokalen Intensitätsminimum des Lumineszenzverhinderungslichts zusammenfällt.
  • Das aus der Probe 15 emittierte Lumineszenzlicht 18 wird von dem dichroitischen Strahlteiler 53 selektiv durchgelassen und dahinter von einer Linse 55 auf eine Kamera 56 abgebildet. Die Kamera 56 registriert das Lumineszenzlicht für jedes der Intensitätsminima der Intensitätsverteilung des Lumineszenzverhinderungslichts und für jede Lage jedes dieser Intensitätsminima, während ein interessierender Bereich der Probe 15 mit Hilfe der Abtasteinrichtung 54 mit diesen Intensitätsminima abgetastet wird. Das Abtasten kann sich dabei jeweils auf den Teilbereich des interessierenden Bereichs der Probe 15 beschränken, der sich in einer Startposition zwischen benachbarten Intensitätsminima befindet.
  • Die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung des erfindungsgemäßen Rasterlumineszenzlichtmikroskops 43 gemäß 5 umfasst alle dessen Bestandteile bis auf die Lichtquelle 46 und die Kamera 56 mit der Linse 55.
  • Bezugszeichenliste
    • 1
    Liniengitter
    2
    Liniengitter
    3
    Intensitätsminimum
    4
    Intensitätsminimum
    5
    Intensitätsmaximum
    6
    Intensitätsmaximum
    7
    Intensitätsverteilung (Lumineszenzverhinderungslicht)
    8
    Kreuzungspunkt
    9
    Intensitätsminimum
    10
    Kreuzungspunkt
    11
    Verlauf
    12
    Verlauf
    13
    Lumineszenzmarker
    14
    Struktur
    15
    Probe
    16
    Intensitätsmaximum
    17
    Anregungslicht
    18
    Lumineszenzlicht
    19
    Strahl (Lumineszenzverhinderungslicht)
    20
    Strahl (Lumineszenzverhinderungslicht)
    21
    optisches Gitter
    22
    optisches Gitter
    23
    polarisierender Strahlteiler
    24
    Linse
    25
    Objektiv
    26
    Ausschnitt
    27
    Fokus
    28
    Ausschnitt
    29
    Ausschnitt
    30
    effektive Punktabbildungsfunktion
    31
    effektive Punktabbildungsfunktion
    32
    Raster
    33
    Intensitätsverteilung (Anregungslicht)
    34
    Intensitätsmaximum
    35
    Intensitätsmaximum
    36
    Liniengitter
    37
    Liniengitter
    38
    Lumineszenzverhinderungslicht
    39
    Strahl (Anregungslicht)
    40
    Strahl (Anregungslicht)
    41
    optisches Element
    42
    optisches Element
    43
    Rasterlumineszenzlichtmikroskop
    44
    Teillichtquelle
    45
    Teillichtquelle
    46
    Lichtquelle
    47
    dichroitischer Strahlteiler
    48
    optische Faser
    49
    λ/2-Platte
    50
    polarisierender Strahlteiler
    51
    polarisierender Strahlteiler
    52
    Optik
    53
    dichroitischer Strahlteiler
    54
    Scaneinrichtung
    55
    Linse
    56
    Objektiv
    l
    Periode
    I0
    Intensität
    I
    Intensität
    S
    Ortskoordinate

Claims (15)

  1. Rasterlumineszenzlichtmikroskop (43) zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer einen Lumineszenzmarker (13) aufweisenden Struktur (14) einer Probe (15) mit – einer Lumineszenzverhinderungslicht (38) und sich von dem Lumineszenzverhinderungslicht (38) unterscheidendes weiteres Licht bereitstellenden Lichtquelle (46), – einer Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung, die aus zwei nicht kohärenten Strahlen (19, 20) des Lumineszenzverhinderungslichts (38) mittels optischer Gitter (21, 22) vier paarweise kohärente Teilstrahlen des Lumineszenzverhinderungslichts (38) formt, die die Teilstrahlen des Lumineszenzverhinderungslichts (38) mit einem Objektiv (25) so gemeinsam in die Probe (15) fokussiert, dass sie im Bereich der Probe (15) zwei sich kreuzende Liniengitter (1, 2) ausbilden, die jeweils eine Mehrzahl von eindimensional begrenzten lokalen Intensitätsminima (3, 4) aufweisen, so dass eine Intensitätsverteilung (7) des Lumineszenzverhinderungslichts (38) in der Probe (15) ein zweidimensionales Feld aus gleichartigen, mindestens zweidimensional begrenzten lokalen Intensitätsminima (9) aufweist, die eine Intensitätsverteilung (33) des weiteren Lichts in der Probe mit der Intensitätsverteilung (7) des Lumineszenzverhinderungslichts (38) überlagert, und die die Intensitätsverteilung (7) des Lumineszenzverhinderungslichts (38) gegenüber der Probe (15) verlagert, um einen interessierenden Bereich der Probe (15) mit den Intensitätsminima (9) der Intensitätsverteilung (7) des Lumineszenzverhinderungslichts (38) abzutasten, und – einem Detektor, der das aus den Bereichen der einzelnen Intensitätsminima (9) der Intensitätsverteilung (7) des Lumineszenzverhinderungslichts (38) emittierte Lumineszenzlicht (18) für jedes der Intensitätsminima (9) und für jede Lage jedes der Intensitätsminima (9) registriert, dadurch gekennzeichnet, – dass mindestens ein Strahl (39, 40) des weiteren Lichts zusammen mit einem der beiden Strahlen (19, 20) des Lumineszenzverhinderungslichts (38) in die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung eintritt, so dass die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung aus dem Strahl (39, 40) des weiteren Lichts mittels eines der optischen Gitter (21, 22) zwei kohärente Teilstrahlen des weiteren Lichts formt und die Teilstrahlen des weiteren Lichts mit dem Objektiv (25) so gemeinsam in die Probe (15) fokussiert, dass sie im Bereich der Probe (15) ein Liniengitter ausbilden, das eine Mehrzahl von eindimensional begrenzten und sich parallel zu den lokalen Intensitätsminima (3, 4) eines der Liniengitter (1, 2) des Lumineszenzverhinderungslichts (38) erstreckenden lokalen Intensitätsmaxima (34, 35) und Intensitätsminima aufweist, und – dass die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung das Liniengitter (36, 37) des weiteren Lichts so gegenüber dem einen der Liniengitter (1, 2) des Lumineszenzverhinderungslichts (38) ausrichtet, dass die lokalen Intensitätsmaxima (34, 35) oder die lokalen Intensitätsminima des Liniengitters (36, 37) des weiteren Lichts mit den parallelen lokalen Intensitätsminima (3, 4) des einen der Liniengitter (1, 2) des Lumineszenzverhinderungslichts (38) zusammenfallen.
  2. Rasterlumineszenzlichtmikroskop (43) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, – dass zwei nicht kohärente Strahlen (39, 40) des weiteren Lichts jeweils zusammen mit einem der beiden Strahlen (19, 20) des Lumineszenzverhinderungslichts (38) in die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung eintreten, so dass die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung aus den beiden Strahlen (39, 40) des weiteren Lichts mittels der optischen Gitter (21, 22) vier paarweise kohärente Teilstrahlen des weiteren Lichts formt und die Teilstrahlen des weiteren Lichts mit dem Objektiv (25) gemeinsam fokussiert, so dass sie im Bereich der Probe (15) zwei sich kreuzende Liniengitter (36, 37) ausbilden, die jeweils eine Mehrzahl von eindimensional begrenzten und sich parallel zu den lokalen Intensitätsminima (3, 4) eines der Liniengitter (1, 2) des Lumineszenzverhinderungslichts (38) erstreckenden lokalen Intensitätsmaxima (34, 35) und Intensitätsminima aufweisen, so dass eine Intensitätsverteilung des weiteren Lichts in der Probe (15) ein zweidimensionales Feld aus gleichartigen, mindestens zweidimensional begrenzten lokalen Intensitätsmaxima (16) und Intensitätsminima aufweist, und – dass die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung die Intensitätsverteilung (33) des weiteren Lichts so gegenüber der Intensitätsverteilung (7) des Lumineszenzverhinderungslichts (38) ausrichtet, dass die lokalen Intensitätsmaxima (16) oder die lokalen Intensitätsminima der Intensitätsverteilung (33) des weiteren Lichts mit den lokalen Intensitätsminima (9) der Intensitätsverteilung (7) des Lumineszenzverhinderungslichts (38) zusammenfallen.
  3. Rasterlumineszenzlichtmikroskop (43) nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung die optischen Weglängen der Teilstrahlen jedes Paars von kohärenten Teilstrahlen des weiteren Lichts und die optischen Weglängen der Teilstrahlen des Paars von mittels desselben optischen Gitters (21, 22) geformten kohärenten Teilstrahlen des Lumineszenzverhinderungslichts (38) von dem jeweiligen optischen Gitter (21, 22) bis zu den jeweiligen Liniengittern (3, 4, 36, 37) des weiteren Lichts und des Lumineszenzverhinderungslichts (38) so festlegt, dass die lokalen Intensitätsmaxima (16) oder die lokalen Intensitätsminima des Liniengitters (36, 37) des weiteren Lichts mit den parallelen lokalen Intensitätsminima (3, 4) des jeweiligen Liniengitters (1, 2) des Lumineszenzverhinderungslichts (38) zusammenfallen.
  4. Rasterlumineszenzlichtmikroskop (43) nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung mindestens ein optisches Element (41, 42) aufweisen, das selektiv in einem der Teilstrahlen eines der Paare von kohärenten Teilstrahlen des weiteren Lichts und/oder einem der Teilstrahlen des Paars von mittels desselben optischen Gitters (21, 22) geformten kohärenten Teilstrahlen des Lumineszenzverhinderungslichts (38) angeordnet ist.
  5. Rasterlumineszenzlichtmikroskop (43) nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Element (41, 42) austauschbar ist.
  6. Rasterlumineszenzlichtmikroskop (43) nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Element (41, 42) ein chromatisches und/oder doppelbrechendes optisches Element ist.
  7. Rasterlumineszenzlichtmikroskop (43) nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Element (41, 42) die optischen Weglängen der Teilstrahlen jedes Paars von kohärenten Teilstrahlen des weiteren Lichts und die optischen Weglängen der Teilstrahlen des Paars von mittels desselben optischen Gitters (21, 22) geformten kohärenten Teilstrahlen des Lumineszenzverhinderungslichts (38) von dem jeweiligen optischen Gitter (21, 22) bis zu den jeweiligen Liniengittern (1, 2, 36, 37) des weiteren Lichts und des Lumineszenzverhinderungslichts (38) für verschiedene Wellenlängen des weiteren Lichts und/oder des Lumineszenzverhinderungslichts (38) so aufeinander abstimmt, dass die lokalen Intensitätsmaxima (16) oder die lokalen Intensitätsminima des Liniengitters (36, 37) des weiteren Lichts mit den parallelen lokalen Intensitätsminima (9) des jeweiligen Liniengitters (1, 2) des Lumineszenzverhinderungslichts (38) zusammenfallen.
  8. Rasterlumineszenzlichtmikroskop (43) nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung das weitere Licht und das Lumineszenzverhinderungslicht (38) nacheinander auf die Probe richtet und die Intensitätsverteilungen (7, 33) des Lumineszenzverhinderungslichts (38) und des weiteren Lichts zwischenzeitlich so relativ zueinander verlagert, dass die lokalen Intensitätsmaxima (16) oder die lokalen Intensitätsminima der Intensitätsverteilung (33) des weiteren Lichts mit den lokalen Intensitätsminima (9) der Intensitätsverteilung (7) des Lumineszenzverhinderungslichts (38) zusammenfallen.
  9. Rasterlumineszenzlichtmikroskop (43) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sich das Lumineszenzverhinderungslicht (38) und das weitere Licht hinsichtlich ihrer Wellenlängen und/oder hinsichtlich ihrer Intensitäten unterscheiden.
  10. Rasterlumineszenzlichtmikroskop (43) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (46) separate Teillichtquellen (44, 45) für das weitere Licht und das Lumineszenzverhinderungslicht (38) aufweist.
  11. Rasterlumineszenzlichtmikroskop (43) nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (46) separate Teillichtquellen für jeden nicht kohärenten Strahl des weiteren Lichts und des Lumineszenzverhinderungslichts (38) aufweist.
  12. Rasterlumineszenzlichtmikroskop (43) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (46) das weitere Licht und das Lumineszenzverhinderungslicht (38) aus Licht einer Ausgangswellenlänge oder einer Ausgangswellenlängenverteilung generiert und/oder selektiert.
  13. Rasterlumineszenzlichtmikroskop (43) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung die einzelnen Liniengitter (1, 2, 36, 37) des Lumineszenzverhinderungslichts (38) und/oder des weiteren Lichts nacheinander in der Probe (15) ausbildet, um sie nicht kohärent zu der Intensitätsverteilung (7, 33) des Lumineszenzverhinderungslichts (38) und/oder des weiteren Lichts zu überlagern.
  14. Rasterlumineszenzlichtmikroskop (43) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung den interessierenden Bereich der Probe (15) abtastet, indem sie relative Phasen der kohärenten Teilstrahlen des weiteren Lichts und des Lumineszenzverhinderungslichts (38) variiert und/oder indem sie die überlagerten Intensitätsverteilungen (7, 33) des Lumineszenzverhinderungslichts (38) und des weiteren Lichts gemeinsam gegenüber der Probe (15) verlagert.
  15. Rasterlumineszenzlichtmikroskop (43) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das weitere Licht Anregungslicht (17) ist, das den Lumineszenzmarker (13) zur Emission von Lumineszenzlicht (18) anregt, wobei die Lichtformungs- und -ausrichteinrichtung die Intensitätsverteilung (33) des weiteren Lichts so gegenüber der Intensitätsverteilung (7) des Lumineszenzverhinderungslichts (38) ausrichtet, dass die lokalen Intensitätsmaxima (16) der Intensitätsverteilung (33) des weiteren Lichts mit den lokalen Intensitätsminima (9) der Intensitätsverteilung (7) des Lumineszenzverhinderungslichts (38) zusammenfallen.
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