DE102021002540A1

DE102021002540A1 - Hochauflösendes fluoreszenzbasiertes (Lokalisations-)Mikroskopieverfahren als Kombination aus RESOLFT (STED/GSD) und PALM/STORM und SIM

Info

Publication number: DE102021002540A1
Application number: DE102021002540.7A
Authority: DE
Inventors: gleich Anmelder Erfinder
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2021-05-14
Filing date: 2021-05-14
Publication date: 2022-11-17

Abstract

Bei dem hier offenbarten hochauflösenden fluoreszenzbasierten Mikroskopieverfahren wird die Probenoberfläche mit mindestens zwei streifenförmigen Beleuchtungsmustern beaufschlagt, bei denen sich zwischen den Intensitätsmaxima (Streifen) Intensitätsminima bzw. -nullstellen (Abstände zwischen den Streifen) periodisch ausbilden. Dies kann beispielsweise in Form von stehenden Wellen oder mit den durch das SIM-Verfahren bekannte Techniken der Streifenmustererzeugung realisiert werden. Beide streifenförmige Beleuchtungsmuster besitzen eine zueinander minimal unterschiedliche Periodenlänge bzw. Ortsfrequenz, so dass sich eine Art Schwebung ausbildet, deren Modulationsortsfrequenz die Abstände zwischen den Streifen und somit die Breite der Intensitätsnullstellen moduliert. Dadurch kann eine minimale Breite einer Intensitätsnullstelle räumlich periodisch eingestellt werden. Durch eine Relativbewegung der beiden Streifenmuster zueinander kann somit in kürzester Zeit die Oberfläche in einer Dimension superaufgelöst abgescannt werden. Mittels einer kreuzweisen Beleuchtung kann auch ein bildgebendes Verfahren mit mehrdimensionaler Auflösung realisiert werden.Aufgrund dieser Vorgehensweise bei der Beleuchtung der Probenoberfläche kann man dieses hybride Lokalisationsmikroskopieverfahren als Kombination aus den bisher bekannten hochauflösenden Mikroskopieverfahren RESOLFT, PALM und SIM auffassen, bei dem sämtliche Vorteile dieser Mikroskopieverfahren miteinander kombiniert werden.

Description

Stand der Technik:
In den letzten 30 bis 40 Jahren ist eine ganze Reihe von hoch- oder superauflösenden (fluoresenzbasierten) bildgebenden Mikroskopiemethoden (Lokalisationsmikroskopie) entwickelt worden, die das beugungsbegrenzte Auflösungsvermögen nach Abbe oder Rayleigh weit übertreffen.
Den Anfang dabei machte der sowjetische/russische Physiker Victor Okhonin im Jahre 1986, der in seiner Patentanmeldung SU 1 374 922 A1 ein Verfahren offenbarte, das die Grundidee eines Lokalisationsmikroskopieverfahrens in seinen Grundzügen theoretisch skizzierte, welche später als RESOLFT(STED/GSD) bezeichnet worden ist. Dabei hat Victor Okhonin vorgeschlagen, einer mit Fluorophoren belegten und zu vermessenden Probenoberfläche mittels stehender Lichtwellen zu beaufschlagen, um die zur Fluoreszenz angeregten Fluorophore lokal abzuregen, damit so das optische Auflösungsvermögen mit Hilfe der innerhalb der Nullstellen der stehenden Lichtwellen verbliebenen angeregten Fluorophore zu erhöhen.
Im Jahre 1994 wurde von S. Hell und J. Wichmann diese Idee aufgegriffen [1] und 1999 von Th. Klar und S. Hell zum ersten Mal experimentell umgesetzt [2] und als Patent angemeldet ( DE 10 2005 027 896 B4 ). Dabei wurde der Name STED (Stimulated Emission Depletion) geprägt.
Allerdings haben S. Hell u.a. zur Realisierung der Nullstellen keine stehenden Lichtwellen verwandt, sondern eine Vortex-Phasenplatte, um bei einem einzelnen Laserlichtstrahl eine Nullstelle zu realisieren, wobei dieser Laserstrahl die gesamte Probenoberfläche zeitlich nacheinander abrastert.
Allerdings blieb die Idee der stehenden Wellen zur Fluoreszenzabregung bei einem RESOLFT(STED/GSD)-Verfahren bestehen, wie beispielsweise in den Druckschriften DE 10 2006 062 823 B4 , DE 10 2006 009 830 A1 , DE 10 2006 009 831 A1 , DE 10 2006 009 832 B4 , DE 10 2006 009 833 A1 und WO 2006/058187 A2 offenbart.
Allerdings ist auch in diesen Druckschriften niemals von einem Moire-Muster oder einer Schwebung die Rede gewesen.
Alternativ dazu oder verallgemeinert kann anstelle von stehenden Wellen ein Lichtgitter oder periodisches Lichtmuster verwendet werden, welches wie auch immer erzeugt worden ist, wie bswp. in US 7 224 452 B2 und US 9 835 838 B2 offenbart worden ist.
Eigentlich wäre die RESOLFT(STED/GSD)-Mikroskopiemethode ebenfalls beugungsbegrenzt und damit keine wesentliche Erhöhung des optischen Auflösungsvermögen verbunden, da die Erzeugung der Nullstelle ebenfalls der Beugungserscheinung unterliegt, d.h. beugungsbegrenzt ist. Allerdings kommt dem ein Materialeffekt zu Hilfe, da bereits geringste Intensitäten eines Abregungs- oder Deaktivierungslichtstrahls ausreicht, um ein angeregtes oder aktiviertes Energieniveau eines Fluoreszenzvorgangs komplett zu entvölkern bzw. bereits geringste Intensitäten eines Anregungs- oder Aktivierungslichtstrahls ausreicht, um ein nicht-angeregtes oder nicht-aktiviertes Energieniveau eines Fluoreszenzvorgangs komplett zu entvölkern . Dies wird allgemein als Sättigung beschrieben [3] - [5].
Das Grundprinzip des STED-Verfahrens ist weitgehend bekannt und wird daher an dieser Stelle lediglich nur kurz skizziert; für weitergehende, detaillierte Betrachtungen wird auf die oben genannte einschlägige Literatur [1] - [5] sowie auf DE 10 2005 027 896 B4 verwiesen. Der STED-Prozess geht von drei unterschiedlichen (elektronischen) Energieniveaus aus (siehe DE 10 2015 015 497 A1 , DE 10 2017 004 247 A1 und DE 10 2017 011 843 A1 , dort jeweils 1):

Das unterste Energieniveau (erstes Energieniveau oder Energieniveau 1) wird als Dunkelzustand, deaktivierter oder ausgeschalteter Zustand, das mittlere Energieniveau (zweites Energieniveau oder Energieniveau 2) als Hellzustand, aktivierter, eingeschalteter, fluoreszenter oder fluoreszenzfähiger Zustand und das höchste Energieniveau (drittes Energieniveau oder Energieniveau 3) als angeregter oder fluoreszierender Zustand bezeichnet. Dementsprechend wird der Übergang vom ersten auf das zweite Energieniveau als Aktivieren / Aktivierung oder Anschalten, der Übergang vom zweiten auf das erste Energieniveau als Deaktivieren / Deaktivierung oder Ausschalten / Abschalten, der Übergang vom zweiten auf das dritte Energieniveau als Anregung und der Übergang vom dritten auf das zweite Energieniveau als Abregung, Fluoreszenzverhinderung oder Stimulation bezeichnet. Der letztgenannte Übergang kann entweder strahlungslos oder durch stimulierte Emission erfolgen.

Der STED-Prozess läuft nun wie folgt ab:

Die auf der zu untersuchenden Probenoberfläche sich befindlichen Fluorophore liegen in ihrer Ausgangslage im untersten Energieniveau (Energieniveau 1: Dunkelzustand) vor. Nun wird die Probenoberfläche in einem ersten Schritt mit einem ersten Lichtstrahl geeigneter Wellenlänge (Anschaltlicht) beaufschlagt, so dass die Fluorophore durch diesen Anschaltlichtstrahl vom ersten, unteren Energieniveau 1 auf das zweite, mittlere Energieniveau 2 gebracht werden, d.h. die Fluorophore werden angeschaltet oder aktiviert, so dass sämtliche Fluorophore innerhalb des durch den Anschaltlichtstrahl beaufschlagten Bereich der Probenoberfläche sich auf dem zweiten, mittleren Energieniveau 2 befinden (Schritt 1: Anschalten oder Aktivierung).

Danach werden in einem zweiten Schritt diese Fluorophore durch einen weiteren, zweiten Lichtstrahl geeigneter Wellenlänge (Anregungslicht) beaufschlagt, so dass die Fluorophore durch diesen Anregungslichtstrahl vom zweiten, mittleren Energieniveau 2 auf das dritte, obere Energieniveau 3 gelangen, d.h. die Fluorophore werden angeregt, so dass sämtliche Fluorophore innerhalb des durch den Anregungslichtstrahl beaufschlagten Bereich der Probenoberfläche sich auf dem dritten, oberen Energieniveau 3 befinden (Schritt 2: Anregung).
Dann werden in einem dritten Schritt diese Fluorophore durch einen weiteren, dritten Lichtstrahl mit geeigneter Wellenlänge (Abregungslicht) beaufschlagt, welcher in der Mitte ein Intensitätsminimum in Form einer Intensitäts-Nullstelle besitzt (sog. ringförmiges Donut-Profil). Dieser dritte Lichtstrahl wird auch STED-Lichtstrahl oder Fluoreszenzverhinderungslichtstrahl oder Stimulationslichtstrahl genannt. Durch Beaufschlagung mittels des STED-Strahls werden die Fluorophore vom dritten, oberen Energieniveau 3 auf das zweite, mittlere Energieniveau 2 gebracht, d.h. die Fluorophore werden abgeregt, so dass sämtliche Fluorophore außerhalb der Intensitäts-Nullstelle des die Probenoberfläche beaufschlagenden STED-Strahls vom dritten, oberen Energieniveaus 3 auf das zweite, mittlere Energieniveau 2 gelangen (Schritt 3: STED-Schritt oder Abregung oder Fluoreszenzverhinderung oder Stimulation oder stimulierte (Fluoreszenz)emission; dieser Schritt kann, muss aber nicht strahlungslos verlaufen). Lediglich die sich innerhalb des Bereichs der Intensitäts-Nullstelle befindlichen Fluorophore bleiben im angeregten Zustand und somit im dritten, oberen Energieniveau 3. Da bereits geringste Intensitäten des STED-Strahls ausreichen, das dritte, obere Energieniveau 3 komplett zu entvölkern [3] - [5], bleiben nur sehr wenige Fluorophore im angeregten Zustand, und zwar dort, wo die Nullstelle des STED-Strahls eine minimale Intensität (im Idealfall ist das Intensitätsminimum des STED-Strahls gleich Null) aufweist. Dies ist geometrisch gesehen genau im Zentrum der Intensitäts-Nullstelle des STED-Strahls. Da nun die Position der Intensitäts-Nullstelle des elektronisch gesteuerten STED-Strahls genau bekannt ist, ist es nun bei einer spontanen Emission des Fluoreszenzlichts ausgehend von den wenigen sich im Bereich der Nullstelle befindlichen Fluorophore möglich, bei der Detektion dieses Fluoreszenzlichts eine eineindeutige Zuordnung zwischen der genauen bekannten Position der Nullstelle einerseits und dem Emissions- oder Detektionsort des Fluoreszenzlichts andererseits durchzuführen und somit eine genaue Ortsbestimmung oder Lokalisierung der sich zentral in der Intensitäts-Nullstelle befindlichen Fluorophore zu erreichen, und zwar mit einer viel höheren Auflösung als der nach Abbe oder Rayleigh (Schritt 4: spontane Fluoreszenzemission).
Es gibt verschiedene Varianten dieses-Verfahrens ( DE 10 2015 015 497 A1 , DE 10 2017 004 247 A1 , DE 10 2017 011843 A1 ) wie beispielsweise der GSD-Prozess (Ground State Depletion). Im Unterschied zum STED-Prozess wird als zweiter Schritt nicht der Anregungsschritt vorgenommen, bei der der Anregungslichtstrahl die Fluorophore vom zweiten, mittleren Energieniveau 2 in das dritte, obere Energieniveau 3 anregt, sondern der STED-Schritt wird sozusagen dem ursprünglich zweiten Schritt (Anregung) vorgezogen, bei der die Probenoberfläche mit den „angeschalteten“, Fluorophoren mittels eines STED-Lichtstrahls geeigneter Wellenlänge und einer Intensitäts-Nullstelle (sog. ringförmiges Donut-Profil) beaufschlagt wird. Dadurch werden sämtliche „angeschalteten“ Fluorophore im fluoreszenten (fluoreszenzfähigen) Zustand vom zweiten, mittleren Energieniveau 2 entweder zurück in das erste, untere Energieniveau 1 (Dunkelzustand) oder in einen anderen Dunkelzustand, beispielsweise einen metastabilen Triplett-Zustand, überführt, jedoch nur bis auf die wenigen Fluorophore im Zentrum der Intensitäts-Nullstelle des STED-Strahls. Diese bleiben im „angeschalteten“, fluoreszenzfähigen Zustand, so dass bei Beaufschlagung mit Anregungslicht (beim GSD-Prozess der Schritt 3: Anregung) diese wenigen Fluorphore vom zweiten, mittleren Energieniveau 2 auf das dritte, obere Energieniveau 3 angehoben werden. Durch Abregung vom dritten, oberen Energieniveau 3 auf das zweite, mittlere Energieniveau 2 (oder auf ein anderes Energieniveau) und damit verbunden mit einer spontanen Emission von Fluoreszenz-Photonen kann die genaue Position der wenigen im Bereich der Nullstelle verbliebenen nicht „ausgeschalteten“, fluoreszenten oder fluoreszierenden Fluorophore weit oberhalb des Auflösungsvermögens nach Abbe bestimmt werden (Schritt 4: Abregung oder spontane Fluoreszenzemission).
Alle diese Ausführungsformen werden unter dem Oberbegriff RESOLFT zusammengefasst. Unter einem RESOLFT-Verfahren versteht man also die Verallgemeinerung des STED- oder GSD-Verfahrens und umfasst als Fluoreszenzverhinderungsvorgang nicht nur Übergänge zwischen elektronischen Zuständen, sondern auch lichtinduzierte chemische Reaktionen wie Zyklisierungs-, Zykloreversions- oder Isomerisierungsvorgänge wie beispielsweise Übergänge zwischen bestimmten cis- und trans-Zuständen von Cycloalkanmolekülen [5].
Als eine weitere hoch- oder superauflösende fluoreszenzbasierte Lokalisationsmikroskopiemethode ist die sogenannte Lokalisationsmikroskopie nach Photoaktivierung oder auch photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie bekannt, das unabhängig, aber gleichzeitig von E. Betzig u.a. (von ihnen als PALM-Verfahren benannt) [6], S. T. Hess u.a. (von ihnen als FPALM bezeichnet) [7] und X. Zhuang u.a. (von ihnen als STORM benannt) [8] entwickelt worden ist. Bei dieser Mikroskopiemethode liegt eine Probenoberfläche vor, die mit Fluorophoren oder Luminophoren belegt ist, die in einem deaktivierten oder ausgeschalteten Dunkelzustand (Fall 1) oder in einem aktivierten oder eingeschalteten Hellzustand (Fall 2) vorliegen. Nun wird die Probenoberfläche großflächig mit einem Aktivierungslichtstrahl (Fall 1) oder einem Anregungslichtstrahl (Fall 2) mit einer so geringen Intensität beaufschlagt, dass nur eine sehr kleine Teilmenge der Fluorophore / Luminophore, also nur sehr wenige Fluorophore / Luminophore, in einen aktivierten oder angeschalteten Zustand (Fall 1) oder angeregten Zustand (Fall 2) gelangen. Aus stochastischen Gründen besteht dann zwischen zwei benachbarten aktivierten / angeschalteten oder angeregten Fluorophoren oder Luminophoren ein relativ großer Abstand, der im Schnitt größer ist als der Minimalabstand nach Abbe oder Rayleigh, bei der noch eine optische Auflösung gerade möglich ist, da diese aktivierten / angeschalteten oder angeregten Fluorophore oder Luminophore statistisch gesehen relativ gleichmäßig über die gesamte Probenoberfläche verteilt sind. Werden nun die aktivierten oder angeschalteten Fluorophore / Luminophore durch eine Anregungsstrahlung zur Fluoreszenz / Lumineszenz angeregt (Fall 1) oder emittieren die bereits angeregten Fluorophore / Luminophore ein Fluoreszenz- oder Lumineszenzphoton (Fall 2), dann kann wegen des durchschnittlich relativ großen Abstands der einzelnen angeregten Fluorophore / Luminophore zueinander im Allgemeinen deren Punktspreizfunktion vollständig erfasst werden, da sich diese eben wegen des durchschnittlich relativ großen Abstandes der Fluorophore / Luminophore zueinander nicht überschneiden oder überlappen. Dies wird durch einen Algorithmus ermöglicht, bei dem der Mittelpunkt der jeweiligen Punktspreizfunktion eines einzelnen Fluorophors / Luminophors berechnet wird, womit eine supergenaue Bestimmung der örtlichen Position der einzelnen Fluorophore / Luminophore auf der Probenoberfläche weit über dem klassischen Auflösungsvermögen hinaus möglich ist. Allerdings ist dann nur die genaue Position von einer sehr kleinen Teilmenge der Fluorophore / Luminophore bekannt, so dass diese Prozedur vielfach wiederholt werden muss, bei der dann jeweils eine andere kleine Teilmenge von Fluorophoren / Luminophoren aktiviert / angeschaltet oder angeregt werden (Fall 1 und 2), deren Punktspreizfunktion und somit die entsprechende genaue örtliche Position auf der Probenoberfläche wiederum auf dieselbe Weise wie oben beschrieben bestimmt werden. Da bei jeder Wiederholung eine andere kleine Teilmenge der Fluorophore / Luminophore aktiviert / angeschaltet oder angeregt wird (Fall 1 und 2), kann durch die Zusammenschau der Ergebnisse sämtlicher Wiederholungen rechnerisch ein vollständiges Bild der räumlichen Verteilung der Fluorophore / Luminophore auf der gesamten Probenoberfläche mit einer supergenauen Auflösung gewonnen werden. Jedoch ist neben einem möglichen Ausbleichen der Fluorophore / Luminophore damit auch eine gewaltige Anforderung an die Rechenleistung verbunden, um den komplizierten rechenintensiven Auswertealgorithmus zu bewältigen, was den Einsatz von sehr leistungsfähigen Rechnern voraussetzt und außerdem auch einen gewissen Zeitaufwand erfordert.
Es ist eine ganze Reihe von verschiedenen Ausgestaltungsformen dieser Art der Lokalisationsmikroskopie wie PALMIRA, dSTORM u.a. entwickelt worden.
Die beiden hoch- oder superauflösenden fluoreszenzbasierten Mikroskopieverfahren RESOLFT/STED/GSD einerseits und PALM/STORM andererseits unterscheiden sich geringfügig bezüglich der Lateralauflösung sowie der Tiefenauflösung. Beispielsweise liegt die Auflösung von RESOLFT/STED/GSD bei ca. 20 bis 30 nm.
Beiden Mikroskopieverfahren ist jedoch gemeinsam, dass sie sehr rechen- und zeitintensiv sind. In-situ-Untersuchungen sind somit nur begrenzt möglich.
Der dem fluoreszenzbasierten RESOLFT/STED/GSD-Verfahren einerseits und dem fluoreszenzbasierten PALM/STORM-Verfahren andererseits zu Grunde liegende Grundgedanke ist aber derselbe und eigentlich recht simpel: Dabei wird eigentlich die Anregung der Fluorophore lediglich zeitlich auseinandergezogen, so dass nicht alle Fluorophore auf einmal sich im Fluoreszenzzustand befinden, sondern sie werden zeitlich nacheinander angeregt und abgeregt. Allerdings wird dieser Grundgedanke bei den verschiedenen fluoreszenzbasierten Mikroskopieverfahren auf unterschiedliche Art und Weise umgesetzt.
Eine Kombination zwischen RESOLFT/STED/GSD einerseits und PALM/SOTRM andererseits stellt sowohl das MINFLUX-Verfahren [9] ( DE 10 2016 117 096 A1 , DE 10 2016 119 262 A1 , DE 10 2016 119 263 A1 , DE 10 2016 119 264 A1 , DE 10 2017 104 736 A1 ) als auch das MINSTED-Verfahren [10] dar. Beim MINFLUX wird zunächst die mit Fluorophoren versehene Probenoberfläche großflächig mit einem Aktivierungslichtstrahl geringer Intensität beaufschlagt, um einzelne, durchschnittlich voneinander weit beabstandete Fluorophore stochastisch zum Leuchten zu bringen. Danach werden die Positionen dieser einzelnen, leuchtenden Fluorophore durch einen STED-Strahl mittels immer weiter werdenden Kreisbewegungen um sie herum genau lokalisiert, bis der Mittelpunkt der Nullstelle mit der Position des Fluorophors möglichst genau übereinstimmt. Allerdings dient in diesem Fall der ringförmige STED-Strahl im Gegensatz zum oben beschriebenen STED-Verfahren nicht zur Abregung, sondern zur Anregung des Fluorophors, so dass in diesem Fall bei minimal detektierter Intensität des emittierten Fluoreszenzlichts die Position des Fluorophors optimal bestimmt worden ist. Die laterale Auflösungen von MINFLUX ist gegenüber STED um eine Größenordnung verbessert und liegt bei ca. 2 bis 3 nm und kommt schon den Abmessungen eines größeren Moleküls schon recht nahe.
Das MINSTED-Verfahren ähnelt dem MINFLUX-Verfahren, allerdings wird im Gegensatz zum MINFLUX-Verfahren beim MINSTED-Verfahren ein ringförmiger STED-Strahl verwandt, der nicht zur Anregung, sondern wie beim klassischen STED-Verfahren zur Abregung dient, so dass beim MINSTED bei maximal detektierter Intensität des emittierten Fluoreszenzlichts die Position des Fluorophors optimal bestimmt worden ist. Somit kommt beim MINSTED-Verfahren die Beiträge des klassischen STED-Verfahrens stärker zur Geltung als beim MINFLUX-Verfahren.
Sowohl das MINFLUX- als auch das MINSTED-Verfahren erreichen Auflösungen im einstelligen nm-Bereich.
Eine weitere hochauflösende Mikroskopiemethode stellt das sogenannte SIM-Verfahren (Structured Illumination Microscopy) dar [11], bei der die zu untersuchende Probenoberfläche mit einem periodisch strukturierten Beleuchtungsmuster, insbesondere von zueinander parallelen Linien oder Streifen, beaufschlagt wird. Dadurch werden im reziproken Raum die zu der zu untersuchenden Probenstruktur gehörigen Wellenzahlvektoren zu höheren Werten verschoben, was mit einer erhöhten Auflösung verbunden ist. Die Auflösung des SIM-Verfahrens steigert sich gegenüber dem klassischen Auflösungsvermögen maximal um eine Größenordnung; meist liegt sie aber deutlich darunter, d.h. sie ist gegenüber dem klassischen Auflösungsvermögen „lediglich“ verdoppelt.
Das Grundprinzip des SIM-Verfahrens ist gegenüber den anderen hochauflösenden Verfahren relativ gesehen sehr alt; es wurde bereits 1963 vorgestellt [12].
Eine Auswahl von möglichen periodisch strukturierten Beleuchtungsmustern ist in DE 10 2016 007 839 A1 offenbart.
Als weiteres superauflösendes (fluoreszenz-basiertes) Mikroskopieverfahren ist u.a. auch das SPDM-Verfahren (Spektrale Präzisions-Distanz-Mikroskopie) zu benennen, bei dem bei optisch isolierten Fluorophoren unterschiedliche optische Emissionseigenschaften, beispielsweise mittels unterschiedlicher spektraler Markierung, zur supergenauen Lokalisierung ausgenutzt wird [13].
Das weiterentwickelte SPDMphymod basiert dagegen speziell auf den Blinkeigenschaften von vielen bekannten fluoreszierenden Farbstoffen [13].
Es gibt noch weitere superauflösende Fluoreszenz-basierte Mikroskopieverfahren sowie Kombinationen hiervon [14] - [15].
Der Vollständigkeit wird noch auf die 4π- und konfokale Mikroskopie sowie auf die verschiedenen optischen, elektronenoptischen und nicht-optischen rastermikroskopischen Methoden wie SNOM, REM, AFM u.a. hingewiesen, wobei letztere auch ein sub-µm-Auflösungsvermögen bis in den mittleren oder unteren nm-Bereich besitzen, die aber für diesen erfindungsgemäßen Gegenstand nicht weiter relevant sind.
Allerdings basiert die 4π-Mikroskopie auch auf stehende Wellenfelder.
Aufgabenstellung:
Es wird ein neuartiges, hybrides fluoreszenzbasiertes Lokalisationsmikroskopieverfahren vorgestellt, welches zumindest in einer Raumdimension eine gegenüber den bisher bekannten superauflösenden Mikroskiopieverfahren wie RESOLFT (STED/GSD), PALM/STROM und SIM einerseits ein höheres Auflösungsvermögen und andererseits eine sehr stark reduzierte Messdauer besitzt.
Dies wird durch eine neuartige Vorgehensweise bei der Beleuchtung der Probenoberfläche erreicht, so dass man dieses hybride Lokalisationsmikroskopieverfahren als Kombination aus den bisher bekannten hochauflösenden Mikroskopieverfahren RESOLFT (STED/GSD), PALM/STORM und SIM auffassen kann, bei dem sämtliche Vorteile dieser bereits bekannten superauflösenden Mikroskopieverfahren RESOLFT (STED/GSD), PALM/STORM und SIM miteinander kombiniert werden.
Prinzipieller Lösungsansatz:
Zunächst wird eine mit Fluorphoren belegte Probenoberfläche präpariert und bereitgestellt. Dann wird derselbe Bereich der Probenoberfläche mit einem ersten periodischen Lichtmuster beispielsweise in Form eines Gitters (Lichtgitter 1) mit einer die Periode charakterisierenden Größe wie beispielsweise einer Gitterkonstanten g1 (gleich dem Abstand zwischen zwei benachbarten Streifen oder Intensitätsmaxima oder -minima des Lichtgitters) und einem zweiten periodischen Lichtmuster ebenfalls in Form eines Gitters (Lichtgitter 2) mit einer Gitterkonstanten g2 gleichzeitig beaufschlagt. Optional kann es sich auch um verschiedene Arten von periodischen Lichtmustern handeln wie beispielsweise Sternmuster oder Punktmuster, wie bspw. in DE 10 2016 007 839 A1 manifestiert; der Einfachheit halber wird im Folgenden aber an zwei einfache Lichtgitter in Form eines geradlinigen Liniengitters, im Folgenden auch streifenförmiges Beleuchtungsmuster genannt, festgehalten. Diese streifenförmigen Beleuchtungsmuster sind gekennzeichnet durch eine periodische Anordnung oder Ausbildung von Intensitätsmaxima (helle Streifen) und Intensitätsminima bzw. Intensitätsnullstellen (lokalisiert zwischen zwei hellen Streifen, im Folgenden auch dunkle Streifen oder Spalten genannt). Der Einfachheit halber wird angenommen, dass beide streifenförmige Beleuchtungsmuster in Form der Lichtgitter 1 und 2 zueinander parallel angeordnet sind, d.h. die (hellen und dunklen) Streifen und Spalten beider streifenförmiger Beleuchtungsmuster sind zueinander parallel.
Bei den beiden streifenförmigen Licht- oder Beleuchungsmustern in Form von Lichtgittern kann es sich entweder um Anschaltlicht, Anregungslicht, Fluoreszenzverhinderungslicht zum Abregen (Stimulation) oder Ausschaltlicht handeln, je nachdem, welche Fluorophore und welche Wellenlänge gewählt und verwendet werden.
Allerdings ist es entscheidend, dass sich beide Lichtgitter 1 und 2 zumindest hinsichtlich der Gitterkonstanten unterscheiden, d.h. g1 ist ungleich g2. Allerdings ist der Unterschied der Gitterkonstanten g1 und g2 nur sehr gering, d.h. g1 ≈ g2, aber es muss auf jeden Fall gelten: g1 ≠ g2. Wenn man nun die Gitterkonstanten g1 und g2 in die entsprechenden Ortsfrequenzen f1 und f2 umrechnet, dann entsteht als Ergebnis einer gegenseitigen Überlagerung der beiden Lichtgitter 1 und 2 eine Art Moiremuster in Form einer Schwebung gekennzeichnet durch zueinander parallele Streifen und Spalten, deren Breite mit der Modulationsortsfrequenz fm = |f1- f2| periodisch räumlich moduliert werden [16]. Dabei entspricht der Kehrwert der Modulationsortsfrequenz fm der Modulationsperiode Pm = 1/fm. Da eben die Streifen- oder Spaltbreite (oder auch Streifen- oder Spaltdicke oder Streifen- oder Spaltabstand) des Schwebungsmusters periodisch mit der Modulationsortsfreqeuenz fm moduliert wird, ist somit die Spaltbreite dieser Schwebung vom Ort abhängig: innerhalb einer (halben) Periode unterscheidet sich die Spaltbreite an zwei unterschiedlichen Orten, da am Anfang einer Periode die Spaltbreite beispielsweise erst einmal zunimmt, um nach Erreichen der maximalen Spaltbreite wieder abzunehmen. Dagegen sind die Spaltbreiten an zwei unterschiedlichen Orten, die um ein ganzzahliges Vielfaches der Periodenlängen Pm gegenseitig verschoben sind (also sich an zwei entsprechenden Stellen in zwei unterschiedlichen Periodenfolgen befinden) gleich groß. Da sich die Spaltbreite mit dem Ort periodisch verändert, werden praktisch die zu vermessenden Bereiche auf der Probenoberfläche räumlich auseinandergezogen, die zum selben Zeitpunkt untersucht werden können.
Es ist auch vorstellbar, dass sich die beiden Lichtgitter in einer nichtparallelen Art und Weise mit einem Verdrehungswinkel größer als Null gegenseitig überlagern; es gelten dann die in [16] angestellten Überlegungen.
In dem einfachen Beispiel zweier parallel zueinander ausgerichteter Lichtgitter 1 und 2 mit nur leicht unterschiedlicher Gitterkonstanten g1 und g2 bzw. leicht unterschiedlicher Raum- oder Ortsfrequenzen f1 und f2 gibt die Modulationsortsfrequenz fm = |f1 -f2| an, mit welcher Periode die Spaltabstände oder Spaltbreiten moduliert werden, d.h. die Modulationsortsfrequenz fm bzw. die Modulationsperiode Pm = 1/fm ist ein Maß dafür, nach welcher Wegstrecke die Modulationsperiode der Spaltbreiten wieder von vorne anfängt, d.h. nach welcher Wegstrecke die Spaltbreiten wieder ihren Ausgangswert annehmen und der periodische Zyklus der Spaltbreitenveränderung wieder von vorne anfängt. Allerdings sind die durch das Schwebungsmuster erreichten Spaltbreiten erheblich kleiner als die Modulationsortsfrequenz fm bzw. Modulationsperiode Pm: Es existieren also innerhalb einer Modulationsperiode Bereiche mit breiten, schmalen, sehr schmalen und gar keinen Spalten. Die Bereiche mit Spalten mit einer großen Spaltbreite und die mit einer Spaltbreite gleich Null (d.h. keine Spalten) sind für dieses Verfahren eher uninteressant; dagegen sind die Spalten mit einer sehr, sehr geringen, nahezu verschwindend kleinen Spaltbreite, aber noch deutlich messbar größer als Null, von besonders herausragender Bedeutung für dieses Verfahren. Diese Spalten mit einer sehr, sehr geringen, nahezu verschwindend kleinen Spaltbreite können sehr viel kleiner sein als die Modulationsperiode Pm des Schwebungsfeldes.
Durch die Anwesenheit eines Streifenmusters in Form eines streifenförmigen Beleuchtungsmusters sowie die Nähe einer Kante eines Beleuchtungsstreifens des streifenförmigen Beleuchtungsmusters zum Fluorophor bzw. Luminphor kann das Auflösungsvermögen noch einmal gesteigert wird, da gemäß SIM und DE 10 2016 007 839 A1 die dazugehörigen Wellenzahlvektoren im reziproken Raum entsprechend verschoben werden.
Um das Auflösungsvermögen noch weiter zu steigern, kann optional auch das unterschiedliche Blinkverhalten der einzelnen Fluorophore / Luminophore ausgenutzt werden. Dann können nämlich auch höhere Intensitäten des Anschalt- oder Aktivierungs- oder Anregungslichts verwendet werden, da der Abstand der einzelnen fluoreszierenden oder lumineszierenden Farbstoffen nicht mehr allzu groß sein muss. Dadurch wird die Aufnahmezeit deutlich verringert. In diesem Zusammenhang wird auf [13] - [15] verwiesen. Außerdem können verschiedenartige Fluorphore / Luminophore eingesetzt werden ähnlich wie bei FISH (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung), um ein mehrfarbiges Bild der Probenoberfläche zu erhalten.
Der erfindungsgemäße Gegenstand ist nicht nur auf zwei Lichtgitter zur Erzeugung eines Schwebungsfeldes beschränkt; es können auch drei oder mehr als drei Lichtgitter eingesetzt werden. Dabei können alle Lichtgitter dieselbe Amplitude / Intensität oder (teilweise) auch unterschiedliche Amplituden / Intensitäten besitzen. Allerdings sollten alle Lichtgitter 1, 2, ..., n voneinander (leicht) unterschiedliche Gitterkonstanten g1, g2, ..., gn aufweisen und somit zueinander keine konstante Phasenbeziehung besitzen.
Auch eine zeitabhängige Ausführungsform, bei der sich die einzelnen zur Erzeugung des Schwebungsfeldes notwendigen Lichtgitter zeitabhängig verändern, kann realisiert werden. Das kann bedeuten, dass sich entweder die einzelnen Lichtgitter relativ gegeneinander bewegen, indem das eine (statische) Lichtgitter räumlich fest fixiert ist, während sich das oder die anderen (dynamischen) Lichtgitter bewegen, ohne ihre Form (Ortsfrequenz fm / Periodenlänge Pm und Amplitude A / Intensität I des Lichtgitters sowie Wellenlänge λ / Frequenz f der verwendeten Lichtstrahlung usf.) zu verändern, oder dass sich alle Lichtgitter in entgegengesetzte oder beliebig unterschiedliche Richtungen (mit einem Winkel zwischen 0 und 180°) oder in gleicher Richtung mit unterschiedlicher Geschwindigkeit bewegen. Dabei ändert sich nur die Phase der beteiligten bewegten Lichtgitter und somit die Phasenbeziehung zueinander.
Es ist aber auch denkbar, dass bei dieser Ausführungsform neben der Phase auch andere Kennwerte der Lichtgitter (wie bswp. Ortsfrequenz fm / Periodenlänge Pm und Amplitude A / Intensität I des Lichtgitters sowie Wellenlänge λ / Frequenz f der verwendeten Lichtstrahlung usf.) teilweise und/oder vollständig von der Zeit abhängen.
Im Falle von ungleichen Amplituden der Lichtgitter 1 und 2 erhält man anstelle einer reinen Schwebung eine sogenannte unreine Schwebung, bei der die Amplitudenminima ungleich größer als Null sind.
Im Extremfall kann bei einer zeitabhängigen Überlagerung von vielen Lichtgittern eine Art Gauß'sches Wellenpaket oder eine Art Soliton erzeugt werden, welche sich über die Probenoberfläche ausbreitet und diese mit ihrem Beleuchtungsmuster kurzzeitig beaufschlagt. Im letzteren Fall („Soliton“) muss sich die Probe in ein anomal dispersives und nichtlineares Medium befinden, beispielsweise muss sie innerhalb eines NLO-(Nichtlinear Optischen) Kristalls oder in einem Medium mit anomaler Dispersion eingelagert sein.
Im zeitabhängigen Fall muss zur Auswertung statt der Fouriertransformation die LaPlaceTransformation angewandt werden.
In einer speziellen Ausführungsform können die Lichtgitter als stehende Wellen realisiert werden, wobei durch die Überlagerung von zwei stehenden Wellenfeldern mit (leicht) unterschiedlicher Periode ein Schwebungsfeld entsteht.
Nachdem die Nullstellen des Moire-Musters in Form einer Art von Schwebung mittels Lichtgitter bspw. als stehende Wellen ausgebildet worden sind, können die im Stand der Technik beschriebenen entsprechenden Schritte eines RESOLFT-Prozesses durchgeführt werden, um eine supergenaue Positionsbestimmung derjenigen Fluorophore F1 zu erreichen, die sich an einer ersten Stelle ST1 der Probenoberfläche in den entsprechenden sehr, sehr engen oder schmalen Nullstellen N1 oder Spalten S1 befinden, wie bereits oben ausführlich darsgestellt. Alternativ anstelle von Fluorophoren können auch Luminophore oder phospheszierende Fabrstoffe eingesetzt werden. Im Folgenden werden aber ohne Beschränkung der Allgemeinheit nur Fluorphore explizit angegeben. Nachdem das erste Bild B1 von dem von den sich in den ersten sehr, sehr engen oder schmalen Spalten S1 befindlichen Fluorophoren-F1 emittierten Fluoreszenzlicht FL1 aufgenommen worden ist, kann das sich durch Überlagerung aus den beiden streifenförmigen Beleuchtungsmustern bzw. Lichtgittern 1 und 2 entstandene streifenförmige Schwebungsmuster um eine entsprechende Weglänge L weiterverschoben werden, so dass sich an einer anderen Stelle ST2 der Probenoberfläche neue, weitere sehr, sehr enge oder schmale Spalten S2 ausbilden, in der sich weitere, andere Fluorophore F2 befinden (die bislang noch nicht belichtet, d.h. noch nicht mit irgendeinem Licht beaufschlagt und somit noch nicht aufgebleicht worden sind), wobei diese an einer anderen Stelle ST2 der Probenoberfläche sich befindlichen neuen, weiteren sehr, sehr engen oder schmalen Spalten S2 sich direkt neben den sich an der ersten Stelle ST1 der Probenoberfläche befindlichen alten, ersten sehr, sehr engen oder schmalen Spalten S1 befinden können und parallel zu diesen ausgerichtet sind. So kann ein weiteres, zweites Bild B2 von dem von den sich in den nun zu den ersten sehr, sehr engen oder schmalen Spalten S1 benachbarten weiteren sehr, sehr engen oder schmalen Spalten S2 befindlichen Fluorophoren F2 emittierten Fluoreszenzlicht FL2 aufgenommen werden. Dabei kann die Weglänge L so gewählt werden, das sich zwischen den Bereichen der ersten und der weiteren sehr, sehr engen oder schmalen Spalten S1 und S2 praktisch kein Abstand besteht, so dass bei dem Abrastervorgang die gesamte Probenoberfläche vollständig abgerastert und somit erfasst wird. Dies ist allgemein der Fall, wenn die Weglänge L ungefähr der Breite der sehr, sehr engen oder schmalem Spalten S1 und S2 entspricht. Nach erfolgter Messung kann diese Prozedur solange wiederholt werden, bis die gesamte Probenoberfläche abgerastert worden ist.
Da bei einem einzigen Messschritt eine Vielzahl von sehr, sehr engen oder schmalen Spalten S oder Nullstellen N gleichzeitig ausgebildet werden, können alle Fluorophore F, die sich in sämtlichen dieser sehr, sehr engen oder schmalen Spalten S oder Nullstellen N befinden, gleichzeitig erfasst und bezüglich ihrer Position gleichzeitig vermessen werden.
Da die Schwebungen (ähnlich wie die Gauß'schen Wellenpakete und Solitonen) sich bewegen (zumindest, wenn sich mindestens ein Lichtgitter bewegt), d.h. die örtlichen Positionen von den Amplitudenmaxima und -minima der Schwebungen sind zeitabhängig, lässt sich diese Zeitabhängigkeit beim Abrastern der Probenoberfläche ausnutzen: da wie bereits oben angegeben die Amplitudenmaxima und -minima der Schwebung sich ausbreiten, wird die gesamte Probenoberfläche innerhalb einer kurzen Zeitspanne von den Amplitudenmaxima und -minima der Schwebung zeitlich nacheinander beaufschlagt bzw. streichen oder wandern die Amplitudenmaxima und -minima (Nullstellen) innerhalb der kurzen Zeitspanne vollständig über die gesamte Probenoberfläche rüber, wodurch die Probenoberfläche durch die Amplitudenmaxima und -minima (Nullstellen) automatisch komplett abgerastert wird, ohne dass man erst aufwendige Rastertechniken einsetzen muss. Da sich durch die geeignete Überlagerung von Wellen nicht nur stehende Wellen und Schwebungen, sondern auch Gauß'sche Wellenpakete und (innerhalb eines nichtlinearoptischen und anomal dispersiven Mediums) auch Solitonen erzeugen lassen können, welche ähnlich wie stehende Wellen und Schwebungen zeit- und ortabhängige Amplitudenmaxima und Amplitudenminima ausbilden (Gauß'sche Wellenpakete und Solitonen sind im Allgemeinen wie Schwebungen ebenfalls ort- und zeitabhängige Phänomene), gilt hinsichtlich des Abrasterns der Probenoberfläche bezüglich der Schwebungszustände Analoges auch für Gauß'sche Wellenpakete und Solitonen.
Das Ausbilden von Schwebungen sowie deren Abrasterungsvorgangs ist nicht nur auf eine räumliche Dimension beschränkt, sondern kann auch gleichzeitig in zwei oder drei Raumdimensionen stattfinden. Dazu müssen dann die entsprechenden zur Erzeugung des ersten Schwebungsfelds erforderlichen mindestens zwei stehenden Wellenfelder (erstes stehendes Wellenfeldpaar) mit einer Orientierungsrichtung in eine erste Raumrichtung mit anderen zur Erzeugung eines zweiten Schwebungsfelds notwendigen mindestens zwei stehenden Wellenfelder (zweites stehendes Wellenfeldpaar) mit einer Orientierungsrichtung in eine zweite Raumrichtung, die von der ersten Raumrichtung verschieden ist, überlagert werden. Dabei müssen die zum selben stehenden Wellenfeldpaar gehörigen stehenden Wellenfeldern in jeweils dieselbe Raumrichtung zeigen. Optional können noch entsprechende zur Erzeugung eines dritten oder noch eines weiteren Schwebungsfelds erforderliche mindestens zwei stehende Wellenfelder (drittes oder noch ein weiteres stehendes Wellenfeldpaar) mit einer Orientierungsrichtung in eine dritte Raumrichtung, die sich von den zwei vorangegangenen Raumrichtungen unterscheiden, ausgebildet werden, so dass zu der Überlagerung der ersten beiden Schwebungsfelder noch ein drittes oder noch ein weiteres Schwebungsfeld hinzukommt.
Die so in zwei oder drei verschiedenen Raumrichtungen erzeugten Schwebungsfelder können dann einander kreuzweise überlagert werden, so dass sämtliche Schwebungsfelder gleichzeitig eine gesamte Probenoberfläche oder ein gesamtes Probenvolumen beaufschlagen und durch einen geeigneten Abrasterungsvorgang in Form von gleichzeitig in mehreren Raumrichtungen ablaufenden Parallelverschiebungen der jeweils einzelnen Schwebungsfelder in allen zwei oder drei Raumdimensionen abrastern können.
Dies ermöglicht eine laterale oder räumliche optische Auflösung der Probenoberfläche oder des Probenvolumens und somit eine supergenaue Ortsbestimmung von Fluorophoren / Luminophoren in zwei oder drei Raundimensionen in kürzester Zeit.
Dabei müssen die die Schwebungszustände erzeugenden stehenden Wellenfelder nicht unbedingt senkrecht aufeinander stehen, sondern deren räumliche Orientierungsrichtungen können zueinander jeden beliebigen Winkel größer als Null annehmen. Auch sind Rotationsbewegungen eines Schwebungsfeldes denkbar, um eine Probenoberfläche abzurastern.
Es steht dem Fachmann frei, die Probenoberfläche oder das Probenvolumen in alle Raumrichtungen mit den entsprechenden Schwebungsfeldern entweder gleichzeitig oder zeitlich nacheinander oder zeitlich abwechselnd abzuscannen.
Ausführungsbeispiele
Erzeugung der streifenförmigen Beleuchtungsmuster
Es gibt mehrere Möglichkeiten, wie diese streifenförmigen Beleuchtungsmuster, beispielsweise in Form eines Lichtgitters, erzeugt werden können.
In einer ersten Ausführungsform kann man die in der SIM-Mikroskopie bekannten Techniken zur periodischen Lichtstreifenmustererzeugung anwenden. Dann werden einfach zwei Vorrichtungen zur Lichtstreifenmustererzeugung verwendet, wobei die erste Vorrichtung ein streifenförmiges Beleuchtungsmuster mit einer ersten Periode P1 bzw. Ortsfrequenz f1 und die zweite Vorrichtung ein streifenförmiges Beleuchtungsmuster mit einer zweiten Periode P2 bzw. Ortsfrequenz f2 erzeugt. Beide streifenförmige Beleuchtungsmuster können dann in gewünschter Weise gegenseitig überlagert werden, um ein resultierendes oder gesamtes Beleuchtungsmuster, im Folgenden auch Schwebungsbeleuchtungsmuster genannt, in Form einer Art Schwebung mit einer Modulationsortsfrequenz fm = |f2 - f1| zu realisieren. Die Überlagerung kann auch bei verschiedenen Winkeln stattfinden, da beide Vorrichtungen zur Erzeugung der streifenförmigen Beleuchtungsmuster unabhängig voneinander operieren können. Die bevorzugte Ausführungsform ist jedoch, dass beide streifenförmige Beleuchtungsmuster zueinander parallel ausgebildet sind.
Man kann auch vier Vorrichtungen zur streifenförmigen Beleuchtungsmustererzeugung implementieren, damit jeweils zwei Vorrichtungen unabhängig voneinander ein erstes und ein zweites Schwebungsbeleuchtungsmuster erzeugen, die zueinander kreuzweise oder senkrecht ausgerichtet sind. Diese beiden Schwebungsbeleuchtungsmuster können eine gleiche oder unterschiedliche Modulationsortsfrequenzen fm1 und fm2 besitzen. Dadurch kann man ein bildgebendes Verfahren mit einer (flächigen) Auflösung in zwei Raumdimensionen umsetzen.
Bei einer Installation von sechs Vorrichtungen zur streifenförmigen Beleuchtungsmustererzeugung können dann drei Schwebungsbeleuchtungsmuster erzeugt werden, die dann ein dreidimensional (räumlich) aufgelöstes Bild der Probe erzeugen können.
In einer zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Gegenstandes kann man dispersive Elemente wie Prismen, SLM (Spatial Light Modulator), optische Gitterstrukturen (Amplituden- oder Phasengitter) oder Einfach- oder Mehrfachspalte zur Erzeugung eines streifenförmigen Beleuchtungsmusters verwenden. Dabei besteht die erste Vorrichtung zur Erzeugung eines streifenförmigen Beleuchtungsmusters aus einem ersten dispersiven Element DE1, beispielsweise aus einem ersten Gitter G1, und die zweite Vorrichtung zur Erzeugung eines streifenförmigen Beleuchtungsmusters besteht aus einem zweiten dispersiven Element DE2, beispielsweise aus einem zweiten Gitter G2. Alternativ kann das erste dispersive Element DE1 aber auch ein Prisma oder ein Mehrfachspalt sein, d.h. beide dispersive Elemente DE1 und DE2 können technisch unterschiedlich realisiert werden. Aber auch, wenn es sich bei beiden dispersiven Elementen DE1 und DE2 um Gitterstrukturen G1 und G2 handelt, können diese auch unterschiedliche Eigenschaften besitzen wie beispielsweise unterschiedliche Gitterkonstanten ga und gb. Als Gitter G1 und G2 können Amplitudengitter (bspw. in Form von Rowland-Gitter oder Grauwertgitter) oder auch Phasengitter oder Kombinationen hiervon wie ein Halbtonphasengitter verwendet werden. Dabei können beide Gitter G1 und G2 als Amplituden - oder Phasengitter oder das erste Gitter G1 als Amplitudengitter und das zweite Gitter G2 als Phasengitter oder umgekehrt ausgebildet werden. Beide dispersive Elemente DE1 und DE2 können fest oder beweglich implementiert werden, um enstprechende Translations- und/oder Rotationsbewegungen durchführen zu können, so dass sich die Peridenlänge P1 und P2 bzw. die dazugehörigen Ortsfrequenzen f1 und f2 vor und/oder während des Messvorganges verändert werden können. Bei einem dispersiven Element wie dem SLM kann dies auch ohne mechanische Bewegung umgesetzt werden.
Werden die beiden dispersiven Elemente DE1 und DE2, beispielsweise in Form von (gleichartigen) Gittern G1 und G2, an (leicht) unterschiedlichen räumlichen Positionen mit (leicht) unterschiedlichen Abständen zur Probenoberfläche positioniert, so entstehen streifenförmige Beleuchtungsmuster mit unterschiedlichen Periodenlängen P1 und P2 bzw. unterschiedlichen Ortsfrequenzen f1 und f2. Wie bereits oben diskutiert ist dies die Voraussetzung zur Erzeugung eines Schwebungsfeldes.
Die Positionierungen der beiden dispersiven Elemente DE1 und DE2 und deren Stellung zueinander kann entweder vor und/oder während des Messvorgangs stattfinden, so dass entweder vor Messbeginn die periodische Nullstellenverteilung gezielt statisch eingestellt oder während des Messvorganges die periodische Nullstellenverteilung zeitabhängig und dynamisch geändert werden kann. In beiden Fällen kann somit die Probenoberfläche in mindestens eine Raumdimension abgescannt werden.
Zur Erreichung desselben Ziels kann man auch zwei gleichartige oder zwei unterschiedliche dispersive Elemente DE1 und DE2, beispielsweise zwei gleiche oder unterschiedliche Gitter G1 und G2 verwenden, wobei jedes dispersive Element DE1 und DE2, beispielsweise jedes Gitter G1 und G2, mit Beleuchtungslicht (leicht) unterschiedlicher Wellenlänge beaufschlagt wird, so dass die beiden sich so ergebenden streifenförmigen Beleuchtungsmuster mit (leicht) unterschiedlicher Periodenlängen P1 und P2 bzw. unterschiedlicher Ortsfrequenz f1 und f2 ausgebildet werden. Allerdings muss bei Wahl der Wellenlänge die An- oder Abschaltspektren sowie die An- oder Abregungsspektren der verwandten Fluorophore oder Luminophore berücksichtigt werden. Eventuell muss oder kann man die begrenzte Lebensdauer eines Zustandes des Fluororphors oder Luminophors berücksichtigen oder ausnutzen, da aufgrund der Unschärferelation die Linienbreite und somit die Resonanzfrequenz oder -wellenlänge innerhalb eines bestimmten Frequenz- oder Wellenlängenintervalls variiert werden kann.
Man kann auch die verschiedenen Maßnahmen gemäß des ersten und zweiten Ausführungsbeispiels (und gemäß des weiter unten stehenden dritten Ausführungsbeispiels) miteinander kombinieren, um mindestens zwei unterschiedliche streifenförmige Beleuchtungsmuster mit (leicht) unterschiedlicher Periodenlängen P1 und P2 bzw. Ortsfrequenzen f1 und f2 zu erzeugen.
Ansonsten gilt auch das bei dem ersten Ausführungsbeispiel Genannte.
In einem dritten Ausführungsbeispiel werden stehende Wellen zur Erzeugung eines streifenförmigen Beleuchtungsmusters in Form einer Art Schwebung (Schwebungsbeleuchtungsmuster) angewandt wie beipielsweise in der SU 1 374 922 A1 beschrieben. Dabei werden im einfachsten Fall die stehenden Wellen durch zwei einen optischen Resonator bildende zueinander parallel ausgerichtete wellenlängenselektive, dielektrische oder dichroitische Spiegel, im Folgenden kurz (Resonator-)spiegelsatz oder Satz von (Resonator-)spiegeln genannt, erzeugt. Es können auch andere Arten von optischen Resonatoren zur Erzeugung der stehenden Wellen verwendet werden wie beispielsweise Fabry-Pérot-Interferometer oder auch optisch stabile oder instabile Resonatoren wie aus der Lasertechnik allgemeinhin bekannt. Auch hier müssen zwei stehende Wellenfelder W1 und W2 mit leicht unterschiedlicher Wellenlänge λ1 und λ2 überlagert werden, so dass sich eine Art Schwebungsmuster als Schwebungsbeleuchtungsmuster ausbilden kann. Dabei besitzen die beiden stehenden Wellen W1 und W2 jeweils eine Periodenlänge P1 = λ1/2 und P2 = λ2/2 bzw. eine Ortsfrequenz f1 = 1/P1 und f2 = 1/P2. Bei Überlagerung der beiden stehenden Wellen W1 und W2 entsteht ein Schwebungsbeleuchtungsmuster mit einer Modulations(orts-)frequenz fm = |f1 — f2|. Hierbei sollte noch darauf hingewiesen werden, dass die Raum- oder Ortsfrequenzen f1 und f2 etwas anderes bezeichnen als die Frequenz f = c/λ der beiden entgegengesetzt laufenden elektromagnetischen Wellen, die die stehenden Wellenfelder erzeugen.
Zur Erzeugung von zwei stehenden Wellenfelder (leicht) unterschiedlicher Wellenlänge, die einander überlagert werden sollen, um einen Schwebungsfeld zu erzeugen, müssen dann zwei unterschiedliche Sätze von zueinander parallelen Spiegeln eingesetzt werden, wobei beide Spiegelsätze entlang derselben optischen Achse angeordnet sind, und zwar entlang welcher die beiden stehenden Wellen ausgerichtet und einander überlagert werden sollen, um ein statisches oder stationäres stehendes Wellenfeld auszubilden. Dabei befindet sich der eine Spiegelsatz innerhalb des anderen Spiegelsatzes, oder die beiden Spiegelsätze sind ineinander verschachtelt. Soll nun ein stehendes (Licht-)wellenfeld mitsamt seiner Intensitätsnullstellen verschoben werden, müssen die Spiegel des entsprechenden Spiegelsatzes ihren Abstand (optische Weglänge) zueinander ändern (Phasenschieben). Durch diese Relativbewegung der beiden stehenden Wellenfelder W1 und W2 zueinander werden dann automatisch die Nullstellen der beiden stehenden Wellenfelder W1 und W2 relativ zueinander verschoben. Durch die zeitliche Veränderung mindestens eines der beiden stehenden Wellenfelder wird das durch die beiden stehenden Wellenfeldern W1 und W2 erzeugte Schwebungsfeld ort- und zeitabhängig, da sich dessen Intensitätsmaxima und - minima (Nullstellen) bewegen, wodurch ein sich zeitlich veränderndes dynamisches Schwebungsfeld entsteht.
Möglich ist auch der Einsatz von Gradientenspiegeln, die ein gesamtes Wellenlängenintervall reflektieren können, oder von zweifach beschichteten dielektrischen oder dichroitischen Spiegeln, die zwei verschiedene Wellenlängen Bragg-reflektieren können. Allerdings ist dann die Phasendifferenz zwischen den beiden stehenden Wellenfeldern nicht mehr ganz so einfach voneinander unabhängig variierbar, worauf weiter unten noch detailliert eingegangen wird.
Um die Flankensteilheit der Intensitätsnullstellen des Schwebungsfeldes abzuändern oder zu verbessern, können auch mehrere stehende Wellenfelder einander überlagert werden, um ein entsprechendes Schwebungsfeld mit gewünschten Eigenschaften zu realisieren (Fouriertransformation oder-analyse bzw. im zeitabhängigen Fall LaPlacetransformation und - analyse).
Zur Erzeugung und Überlagerung von drei oder mehreren stehenden Wellenfeldern müssen dann drei oder mehrere Spiegelsätze eingebaut werden.
Das Phasenschieben kann entweder vor und/oder während des Messvorgangs stattfinden, so dass entweder vor Messbeginn die periodische Nullstellenverteilung gezielt statisch oder stationär eingestellt oder während des Messvorganges die periodische Nullstellenverteilung zeitabhängig und dynamisch geändert werden kann. In beiden Fällen kann somit die Probenoberfläche in einer Raumdimension abgescannt werden.
Bei einer Vielzahl von stehenden Wellenfeldern, die sich gegenseitig überlagern, lässt sich auch ein Gaußsches Wellenpaket oder ein Soliton konstruieren (Fouriertransformation oder -analyse oder LaPlacetransformation oder -analyse), welches beim Phasenschieben von sich zeitlich verändernden stehenden Wellenfeldern der entsprechenden Wellenlängen sich über die Probenoberfläche hinweg bewegen kann. Im letzteren Fall („Soliton“) muss die Probe in ein dispersives und nichtlineares Medium eingelagert werden, beispielsweise muss sie innerhalb eines NLO-(Nichtlinear Optischen) Kristalls oder einem Medium mit anomaler Dispersion eingelagert sein.
Auch können Gradientenspiegel oder dielektrische Spiegel mit mindestens zwei unterschiedlichen dielektrischen Schichtsystemen verwendet werden, so dass nur ein einziger Spiegelsatz bereitgestellt werden muss, um beide stehende Wellenfelder zu erzeugen. Durch die.Verschiebung der beiden Spiegel dieses einzigen Spiegelsatzes zueinander (Phasenschieben) können die beiden stehenden Wellenfelder und somit deren Intensitätsnullstellen zueinander verschoben werden.
Als besonders elegante Ausführungsform können auch Mikrospiegelarrays / Mikrospiegelaktoren (MOMS, MOEMS), SLM (Spatial Light Modulator) anstelle der mechanisch verfahrbaren und somit beweglichen Spiegel eingebaut werden, um durch Phasenschieben beide stehende Wellenfelder W1 und W2 gegeneinander zu verschieben. Dabei werden mechanische Bewegungen von makro-optischen reflektiven Elementen und somit deren Verschleiß vermieden sowie deren Einstell-, Ansprech- oder Reaktionszeit minimiert. Hinsichtlich der verwendbaren Wellenlängen gilt das für das zweite Ausführungsbeispiel Gesagte: Die Auswahl der zu verwendeten Wellenlängen orientiert sich an den An- oder Abschaltspektren sowie an den An- oder Abregungsspektren der verwandten Fluorophore oder Luminophore. Eventuell kann oder muss man auch im dritten Ausführungsbeispiel die begrenzte Lebensdauer der Zustände der Fluororphore oder Luminophore ausnutzen oder berücksichtigen, da aufgrund der Unschärferelation die Linienbreite und somit die Resonanzfrequenz oder-wellenlänge innerhalb eines bestimmten Frequenz-oder Wellenlängenintervalls variiert werden kann.
Das dritte Ausführungsbeispiel kann auch mit Merkmalen der Interferenz- oder Differenzmikroskopie kombiniert werden.
Es liegt in der Griffweite des alltäglichen Denkens und Handelns des Durchschnittsfachmanns, einzelne Elemente der drei Ausführungsbeispiele miteinander zu kombinieren, um je nach Anwendungsfall die Ausführung des erfindungsgemäßen Gegenstands zu optimieren.
In sämtlich hier offenbarten Ausführungsbeispielen kann man verschieden polarisiertes Licht zur Erzeugung der streifenförmigen Beleuchtungsmuster bzw. Lichtgitter, insbesondere in Form von stehenden Wellenfelder, verwenden; dazu zählen linear, zirkular und elliptisch polarisiertes Licht oder Kombinationen hiervon, welche durch Einführung von Polarisationsfiltern und/oder λ/2- oder λ/4-Plättchen in den entsprechenden Lichtwegen erzeugt werden können.
Nach der Erzeugung des Moire-Musters bzw. Schwebungsfeldes mittels der Überlagerung von mindestens zwei streifenförmigen Beleuchtungsmustern / Lichtgittern, insbesondere in Form von stehenden Wellenfeldern, mit geringfügig unterschiedlichen Wellenlängen gemäß der drei oben beschriebenen Ausführungsbeispielen wird das erfindungsgemäße Messverfahren weiter fortgesetzt wie bei den bereits bekannten RESOLFT-/STED-/GSD-Verfahren, wie bereits im Stand der Technik beschrieben.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform kann die Probe anstatt in Vakuum oder Luft in ein anderes transparentes Medium eingebettet werden, beispielsweise in ein gasförmiges oder flüssiges fluides Medium, welches während des Messvorganges ruht oder fliesst, oder in ein festes Medium mit einem hohen Brechungsindex, einer hohen Doppelbrechung, anisotropen und/oder nicht-linear optischen Eigenschaften. Dies alles dient der Strahlführung und/oder - formung der Aktivierungs-, Deaktivierungs-, Anregungs-, Abregungs-, STED- und/oder emittierten Fluoreszenz-Strahlung zur Probenoberfläche hin oder von der Probenoberfläche weg.
Da bei gasförmigen Medien der Druck und die Temperatur usw. die (isotropen oder anisotropen) optischen Eigenschaften wie Brechzahl und Doppelbrechung nur minimal beeinflussen, können bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung die gasförmigen fluiden Medien zusätzlich andere Funktionen wie Reinigung oder Spülung besitzen oder zumindest unterstützen oder auch andere Funktionen wie bspw. chemische Aktivierung oder Katalyse von oberflächenchemischen Reaktionen übernehmen. Auch kann durch das fluide Medium die Umgebung der Fluorophore / Luminophore entsprechend geändert werden, so dass es zu einem „chemical shift“ der Wellenlänge des emittierten Fluoreszenzlichts kommen kann. Eventuell lassen sich dann umgekehrt auch Rückschlüsse von dem „chemical shift“ auf physikalische / chemische Eigenschaften des fluiden Mediums vornehmen, beispielsweise die Analyse oder Identifikation von zu untersuchenden Gasproben.
Als flüssiges Fluidum können die in der Lithographie bekannten Immersionsflüssigkeiten verwendet werden. Beispielsweise lässt sich durch eine Mischung aus Parraffin und α-BromNaphthalin je nach Mischungsverhältnis jeder beliebige Wert zwischen 1,479 und 1,6576 einstellen.
Als festes Medium können Materialien mit einem hohen Brechungsindex wie Quarzglas, Calciumfluorid, Diamant, Kronglas und/oder Flintglas oder eine Kombination hiervon, um den Farbfehler auszugleichen, eingesetzt werden. Auch doppelbrechende und/oder anisotrope Kristalle (wie bspw. Kalkspat, Lithiumniobat, Quarzglas, Rubin, Saphir, Topas etc.) oder nicht-linear optische Materialien mit Frequenzverviervielfachung, Frequenzmixen (addition, -subtraktion) und/oder (nicht-)linear optisch ramanaktive Materialien (geeignet für SERS-, SRS-, CARS-, Hyper-Raman-Untersuchungen) sowie (hoch-)dispersive Materialien mit normaler oder anomaler Dispersion zur Impulsverbreiterung oder -einengung können eingesetzt werden.
Ausblick:
Es muss noch untersucht werden, ob das hier vorgeschlagenen und offenbarte Verfahren nur zur Mikro- oder Nanoskopie oder auch zur Mikro- oder Nanostrukturierung von Probenoberflächen sowie zur Mikro- oder Nanoaktorik geeignet ist (wie beispielsweise in DE 10 2015 015 497 A1 , DE 10 2015 016 353 A1 , DE 10 2016 007 839 A1 , DE 10 2017 004 247 A1 und DE 10 2017 011843 A1 beschrieben), wobei das erfindungsgemäße Verfahren durch dem Durchschnittsfachmann bekannte Maßnahmen der Mikro- oder Nanotechnik ggf. entsprechend modifiziert werden müsste, bevor es zur Mikro- oder Nanostrukturierung oder Mikro- oder Nanoaktorik verwendet werden kann.
Literaturliste:

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

RESOLFT-Verfahren, bei dem die Intensitätsnullstellen durch die Überlagerung von mindestens zwei periodisch strukturierten Beleuchtungsmustern, insbesondere von streifenförmigen Beleuchtungsmustern in Form von Lichtgittern bestehend aus periodisch und zueinander parallel angeordneten Streifen mit leicht unterschiedlicher Periodenlänge P1 und P2 bzw. Raum- oder Ortsfrequenzen f1 und f2, erzeugt werden, so dass ein Moire-Muster in Form einer Art Schwebung entsteht, bei dem der Abstand zwischen den Streifen periodisch mit der Modulationsortsfrequenz fm = |f1 - f2| moduliert wird.
RESOLFT-Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die periodisch strukturierten Beleuchtungsmuster, insbesondere streifenförmige Beleuchtungsmuster in Form von Lichtgittern, mit aus der SIM-Mikroskopie-Verfahren bekannten Techniken oder mittels dispersiven Komponenten und/oder mittels stehenden Wellen realisiert werden.