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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur räumlich hochauflösenden Untersuchung
von Proben, wobei die Probe durch ein Objektiv beleuchtet wird und wobei
die zu untersuchende Probe eine Substanz umfasst, die wiederholt
von einem ersten Zustand in einen zweiten Zustand überführbar ist,
wobei sich die ersten und die zweiten Zustände in mindestens einer optischen
Eigenschaften voneinander unterscheiden, umfassend die Schritte,
dass die Substanz in einem zu erfassenden Probenbereich zunächst in
den ersten Zustand gebracht wird und dass mittels eines optischen
Signals der zweite Zustand induziert wird, wobei innerhalb des zu
erfassenden Probenbereichs räumlich
begrenzte Teilbereiche gezielt ausgespart werden, wobei das optische
Signal derart bereitgestellt wird, dass sich in dem zu erfassenden
Probenbereich eine Stehwelle mit definierten Intensitäts-Nullstellen
ausbildet.
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Des
Weiteren betrifft die Erfindung ein Mikroskop, insbesondere Laser-Raster-Fluoreszenzmikroskop,
zur räumlich
hochauflösenden
Untersuchung von Proben, wobei die zu untersuchende Probe eine Substanz
umfasst, die wiederholt von einem ersten Zustand in einen zweiten
Zustand überführbar ist, wobei
sich die ersten und die zweiten Zustände in mindestens einer optischen
Eigenschaften voneinander unterscheiden, umfassend ein Objektiv,
Mittel zur Bereitstellung eines Schaltsignals, mit dem die Substanz
in einem zu erfassenden Probenbereich zunächst in den ersten Zustand
verbringbar ist, sowie Mittel zur Bereitstellung eines optischen
Signals zum Induzieren des zweiten Zustandes derart, dass innerhalb
des zu erfassenden Probenbereichs räumlich begrenzte Teilbereiche
gezielt aussparbar sind und sich in dem zu erfassenden Probenbereich
eine Stehwelle mit definierten Intensitäts-Nullstellen ausbildet.
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Verfahren
und Mikroskope der eingangs genannten Art sind aus der Praxis bekannt.
Grundsätzlich
ist gemäß dem Abbe'schen Gesetz der
räumlichen
Auflösung
abbildender optischer Verfahren durch die Beugungsgrenze eine theoretische
Grenze gesetzt, wobei die Beugungsgrenze von der Wellenlänge des
verwendeten Lichts abhängt.
Mit den hier in Rede stehenden Verfahren und Mikroskopen lassen
sich allerdings räumliche
Auflösungen
erzielen, die über
die nach Abbe bekannte theoretische Beugungsgrenze hinaus verbessert
sind.
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Bei
den bekannten Verfahren werden hierzu in zu untersuchenden Proben
Substanzen bereitgestellt, die wiederholt von einem ersten Zustand
in einen zweiten Zustand überführbar sind,
wobei sich die ersten und die zweiten Zustände in mindestens einer optischen
Eigenschaft voneinander unterscheiden. Bei den meisten bekannten
Verfahren handelt es sich bei dem ersten Zustand um einen fluoreszenzfähigen Zustand
(im Folgenden Zustand A genannt) und bei dem zweiten Zustand um
einen nicht fluoreszenzfähigen
Zustand (im Folgenden Zustand B). Nachdem die Substanz in einem
zu erfassenden Probenbereich mittels eines Schaltsignals in den
fluoreszenzfähigen
Zustand A gebracht worden ist, wird mittels eines optischen Signals
in räumlich
begrenzten Teilbereichen des zu erfassenden Probenbereichs Zustand
B induziert und somit eine Unterdrückung der Fluoreszenz von Fluoreszenzmolekülen erzeugt.
Der physikalische Prozess der Fluoreszenzunterdrückung kann dabei sehr unterschiedlicher
Natur sein. So ist bspw. die stimulierte Emission aus dem zuvor angeregten
Zustand oder eine optisch induzierte Strukturänderung der Fluoreszenzmoleküle bekannt.
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Entscheidend
ist, dass der durch ein optisches Signal induzierte Übergang
von dem ersten in den zweiten Zustand im Probenvolumen in großen Bereichen
gesättigt,
d. h. vollständig,
stattfindet, und in mindestens einem Teilbereich des Probenvolumens
gerade nicht stattfindet, indem dort das optische Schaltsignal gezielt
nicht eingestrahlt wird. Dieser Effekt kann durch das Erzeugen einer
Intensitätsnullstelle
des optischen Signals erreicht werden. An der Nullstelle und in
deren unmittelbarer Umgebung findet kein Übergang in den zweiten Zustand
(im Allgemeinen der nicht fluoreszierende Zustand B) statt, so dass
der erste Zustand (im Allgemeinen der fluoreszierende Zustand A)
erhalten bleibt. Eine Sättigung
des Übergangs
A → B durch
das optische Signal führt
in den beleuchteten Bereichen des zu erfassenden Probenbereichs
bereits in naher Umgebung der Intensitäts-Nullstellen zu einem (nahezu) vollständigen Transfer
in den Zustand B. Je stärker
der Prozess in die Sättigung
getrieben wird, d. h. je mehr Energie durch das optische Signal
in die Bereiche um die Nullstelle herum eingebracht wird, desto
kleiner wird der Bereich mit Fluoreszenzmolekülen im fluoreszenzfähigen Zustand
A bzw. allgemein in einem „leuchtfähigen" Zustand. In Abhängigkeit
vom Sättigungsgrad
in der unmittelbaren Nullstellen-Umgebung kann dieser Bereich prinzipiell
beliebig klein gemacht werden. Folglich lassen sich Regionen des
Zustands A markieren, die beliebig viel kleiner sind als die kleinsten
aufgrund der Beugungsgrenze möglichen
Regionen eines aufgebrachten optischen Signals. Wird der Bereich
des Zustands A anschließend ausgelesen,
z. B. durch Einstrahlen eines Testsignals, so stammt das (Fluoreszenz-)Messsignal
aus einem definierten Bereich, der kleiner sein kann als es die
Beugungsgrenze zulässt.
Wird die Probe auf die beschriebene Art Punkt für Punkt abgerastert, so entsteht
ein Bild mit einer Auflösung
die besser ist, als es die Beugungstheorie erlaubt.
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Verfahren,
der hier beschriebenen Art, bei denen als Unterschied zwischen zwei
Zuständen
die optische Eigenschaft fluoreszenzfähig/nicht fluoreszenzfähig ausgenutzt
wird, sind bspw. aus der
DE 103
25 459 A1 und der
DE
103 25 460 A1 bekannt. Bei diesen Verfahren werden Fluoreszenzmoleküle mit Hilfe
eines optischen Signals von einem Zustand A (fluoreszenzfähig) in
einen Zustand B (nicht fluoreszenzfähig) gebracht, wobei bei dem Übergang
A → B die
Sättigung
erreicht wird. Die in dem fluoreszenzfähigen Zustand A verbleibenden
Bereiche der Probe resultieren jeweils aus einem eine Nullstelle aufweisenden
Intensitätsminimum
des eingestrahlten optischen Signals. Die Intensitätsminima
sind Teil eines Interferenzmusters. Das Abrastern der Probe erfolgt
durch Verschiebung der Intensitätsminima
des optischen Signals, wobei die Verschiebung durch Phasenverschiebung
der interferierenden Strahlen bewirkt wird.
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Bei
den bekannten Verfahren ist nachteilig, dass das durch die interferierenden
Strahlen erzeugte Interferenzmuster mit lokalen punktförmigen Intensitätsminima
nur sehr schwierig über
einen hinreichend langen Zeitraum in einem zur Erzielung höchster Auflösungen hinreichend
stabilen Zustand gehalten werden kann. Dies gilt insbesondere beim
Einsatz hochnumerischer Optiken. Diese können die sie passierenden Lichtstrahlen
depolarisieren und unter Umständen
auch Phasenverschiebungen zur Folge haben, was sich negativ auf
das Interferenzmuster auswirken und im Extremfall sogar zu einer
völligen Zerstörung der
Interferenzstruktur führen
kann.
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Aus
der
DE 101 18 355
B4 sind ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Mehrphotonenanregung
einer Probe bekannt, wobei ein Laserstrahl in mindestens zwei kohärente Teilstrahlen
aufgespalten wird. Die beiden Teilstrahlen werden aus verschiedenen Richtungen
auf eine Messebene ausgerichtet, so dass die Teilstrahlen in dem
Bereich der Messebenen miteinander interferieren. Eine durch die
Interferenz der Teilstrahlen hervorgerufenen Intensitätsverteilung
in der Messebene weist Bereiche maximaler Intensität neben
Bereichen minimaler Intensität
auf, wobei als Ausfluss der Nichtlinearität der der Fluoreszenz zugrundeliegende
Mehrphotonanregung durch die Interferenz der beiden Teilstrahlen
die Ausbeute an Fluoreszenzlicht von einer Mehrphotonanregung der
Probe erhöht
ist.
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Aus
der
DE 101 54 699
A1 sind ein Verfahren und eine Vorrichtung zum räumlich eng
begrenzten Anregen eines optischen Übergangs bekannt, wobei innerhalb
eines Fokusbereichs ein Anregungslichtstrahl mit einem Interferenzmuster
eines mit sich selbst zur Interferenz gebrachten Abregungslichtstrahls überlagert
wird. Dabei werden die Wellenfronten von aus entgegengesetzten Richtungen
auf den Fokuspunkt fokussierten Teilstrahlen des Abregungslichtstrahls
aberriert, so dass auf jeder der beiden Seite des Fokuspunkts die
Intensitätsmaxima
des Interferenzmusters räumlich
aufgeweitet werden, ohne das Intensitätsminimum am Fokuspunkt zu
beseitigen.
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Aus
der
EP 1 582 858 A1 ist
ein Verfahren zur Anregung der Moleküle von einem ersten Zustand
in einen zweiten Zustand mit einem optischen Signal bekannt, wobei
das optische Signal eine räumliche
Intensitätsverteilung
mit mindestens einer Nullstelle und mit an die Nullstellen angrenzenden Bereichen
aufweist, in denen die Intensität
des Signals so groß ist,
dass eine Sättigung
beim Überführen der
Probe in den zweiten Zustand erreicht wird.
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Aus
der
DE 100 12 462
A1 ist eine Vorrichtung zur Beleuchtung eines Objekts bekannt,
mit mindestens zwei teilweise einander überlagerbaren Beleuchtungsstrahlengängen, wobei
in einem der Beleuchtungsstrahlengänge ein optisches Bauteil zur Veränderung
des das Bauteil passierenden Lichts angeordnet ist. Die optischen
Eigenschaften des Bauteils sind derart beeinflussbar, dass sich
das Beleuchtungsmuster des Beleuchtungsstrahlengangs im Objektbereich
in seiner Form verändert.
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Aus
der
DE 100 31 458
A1 ist für
sich gesehen ein Scan-Mikroskop mit einem Zirkulator bekannt, wobei
der Zirkulator zwischen der Beleuchtungsquelle, dem Objektiv und
dem Detektor angeordnet ist und einen herkömmlichen Strahlteiler ersetzt.
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Aus
der
DE 43 31 570 A1 sind
ein Verfahren und eine Vorrichtung zum optischen Anregen eines Energiezustandes
einer Probe in einem Probenpunkt mit hoher Ortsauflösung bekannt.
Die Anregung erfolgt durch Zusammenwirken von wenigstens zwei Lichtanteilen
unterschiedlicher Lichteigenschaften, wobei die Strahlachsen der
Lichtanteile derart gegeneinander versetzt angeordnet sind, dass
die fokalen Intensitätsverteilungen
der Lichtanteile im Probenpunkt in ihren Hauptmaxima überlappend,
lateral gegeneinander verschoben sind.
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Aus
der
WO 2005/024482
A1 ist für
sich gesehen eine Lichtquelle mit einem mikrostrukturierten optischen
Element bekannt, wobei das optische Elemente das Licht einer Primärlichtquelle
empfängt
und spektral verbreitert und wobei das spektral verbreiterte Licht
zumindest ein weiteres mikrostrukturiertes optisches Element durchläuft. Die
Lichtquelle ist insbesondere in der STED-Mikroskopie einsetzbar.
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Aus
der
EP 1 584 918 A2 sind
ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Fluoreszenz-Lebensdauer-Imaging-Nanoskopie
bekannt. Dabei wird Licht eines Hochfrequenzlasers in eine Nanoskopie-Einheit eingekoppelt,
dort aufgespalten und durch zwei Objektive von gegenüberliegenden
Seiten auf die Probe gelenkt. Die emittierte Fluoreszenz bzw. das
Streulicht wird durch die Objektive gesammelt, vereint, gefiltert
und auf eine zeit- und ortssensitive Detektoreinheit gelenkt.
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In
S. Hell: „Toward
fluorescence nanoscopy", natur
biotechnology, Vol. 21, Nr. 11, S. 1347–1355, November 2003 ist das
Prinzip der STED-Mikroskopie zur Erzielung hoher axialer Auflösungen beschrieben.
Die zu untersuchende Probe umfasst Fluorophore, die wahlweise in
einen fluoreszierenden Zustand A bzw. in den Grundzustand B gebracht
werden können.
Dazu wird eine stehende Welle mit definierten Intensitätsnullstellen
eingesetzt, so dass nur innerhalb der Nullstellen lokalisierte Fluorophore
in dem fluoreszenzfähigen
Zustand A verbleiben.
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In
S. Hell: „Imaging
and writing at the nanoscale with focused visible light through
saturable optical transitions",
Appl. Phys. A 77, 859–860
(2003) ist ebenfalls das Konzept der STED-Mikroskopie beschrieben.
Der Übergang
von Zustand A in Zustand B wird mittels einer stehenden Welle realisiert,
wobei der Zustand B überall
herbeigeführt
werden kann, außer
an denjenigen Stellen, an denen die stehende Welle eine Nullstelle
aufweist. Einzelne Intensitätsminima
werden durch zwei- oder dreidimensionale fokale Doughnuts realisiert.
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In
S. Hell: „Concepts
for nanoscale resolution in fluorescence microscopy", Current Opinion
in Neurobiology 2004, 14: 599–609
werden unterschiedliche Ansätze
der RESOLFT (reversible saturable optical fluorescent transition)
Mikroskopie beschrieben, zu denen unter anderem die STED-Mikroskopie zählt. Für den eindimensionalen
Fall wird ebenfalls der Einsatz von stehende Wellen beschrieben,
wohingegen in zwei- oder dreidimensionalen Anwendungen eine Lichtintensitätsverteilung
in Form eines zwei- oder dreidimensionalen Doughnuts vorgeschlagen
wird.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt nunmehr die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren
sowie ein Mikroskop der eingangs genannten Art anzugeben, wonach
mit konstruktiv einfachen und kostengünstigen Mitteln eine hohe Auflösung sowie
eine flexible Bildaufnahme erreicht sind.
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Die
voranstehende Aufgabe ist durch ein Verfahren mit den Merkmalen
des Patentanspruchs 1 gelöst.
Danach ist das Verfahren derart ausgestaltet und weitergebildet,
dass mittels Fokussieren von vier paarweise kohärenten Lichtstrahlen in die
Pupille des Objektivs Stehwellen in zwei Richtungen überlagert werden.
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Die
voranstehende Aufgabe ist des Weiteren durch ein Mikroskop mit den
Merkmalen des Patentanspruchs 18 gelöst. Danach ist das Mikroskop
derart ausgestaltet und weitergebildet, dass Mittel zur Bereitstellung
von vier paarweise kohärenten
Lichtstrahlen vorgesehen sind, sowie Mittel zum Fokussieren der
vier paarweise kohärenten
Lichtstrahlen in die Pupille des Objektivs zur Erzeugung von in
zwei Richtungen überlagerten
Stehwellen.
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Erfindungsgemäß wird eine Überlagerung der
Stehwellen in zwei Richtungen erreicht, indem vier paarweise kohärente Lichtstrahlen
in die Pupille des Objektivs fokussiert werden. Durch die Überlagerung
bildet sich ein 2D-Gittermuster, wobei im Hinblick auf eine leichte
Auswertbarkeit eine orthogonale Überlagerung
der Stehwellen bevorzugt wird, so dass ein Schachbrettmuster entsteht.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
und das erfindungsgemäße Mikroskop
lassen sich in besonders vorteilhafter Weise in Verbindung mit sehr
langlebigen oder zeitlich sogar dauerhaft stabilen ersten und zweiten
Zuständen
einsetzen. In diesem Fall kann für
die Sättigung
des Übergangs
vom ersten in den zweiten Zustand ein vergleichsweise langer Zeitraum
gewählt
werden, innerhalb dessen die zur Sättigung notwendige Energie
des optischen Signals eingestrahlt wird. Die lokalen Intensitäten zur Übergangssättigung
können
dadurch sehr gering gewählt werden.
Vor allem kann die von einer Strahlquelle des optischen Signal zur
Verfügung
stehende Gesamtenergie auf großräumige Bereiche
im Probenraum verteilt und mehrere Intensitätsnullstellen oder eine ausgedehnte
Nullstelle erzeugt werden. Trotz der daraus resultierenden geringen
lokalen Intensitäten
in der Umgebung der Nullstelle(n) im Vergleich zur Auftragung des
Gesamtsignals um nur eine punktförmige
Nullstelle herum kann die Sättigung
erreicht werden. Dazu muss das Signal nur genügend lange eingestrahlt werden,
bis schließlich
alle Moleküle
in Umgebung der Nullstellen im zweiten Zustand sind. Dies ist ein
entscheidender Unterschied zum Fall eines kurzlebigen Zustandes
(z. B. im STED-Verfahren mit typischen Lebenszeit von ~1 ns für einen fluoreszenzfähigen Zustand
A), wo die zur Sättigung notwendige
Energie in so kurzer Zeit eingestrahlt werden muss (deutlich schneller
als die Rate A → B), dass
die Gesamtleistung der Strahlquelle nur für die Erzeugung einer (oder
maximal einiger weniger) lokalen Nullstellen ausreicht. Es lässt sich
für konkrete Systeme
zeigen, dass im Falle stabiler Zustände (z. B. photochrome Farbstoffe)
oder langlebiger Zustände
(z. B. Transfer in das Tripletsystem beim GSD-Verfahren, GSD = Ground
State Depletion = Grundzustandsentvölkerung) die Leistung preiswerter
und kommerzieller Lasersysteme auf so große Bereiche verteilt werden
kann, dass mehrere punktförmige
Intensitäts-Nullstellen
(>> 10) oder ganze Streifen verschwindender
Intensität
in der Probe erzeugt werden können,
in deren unmittelbarer Umgebung nach wie vor die Sättigung
erreicht werden kann. Dies ermöglicht
eine parallelisierte Bildaufnahme, wenn die Probe mit der Vielzahl
von Punkt-Nullstellen oder mit Nullstellen-Linien gleichzeitig abgerastert
wird und die Signale gleichzeitig für jede Nullstelle getrennt
von einem Detektor erfasst werden. Auf diese Weise lassen sich Mikroskope
mit Auflösungen
unterhalb der klassischen Beugungsgrenze konstruieren, deren Bildaufnahmegeschwindigkeit im Bereich
STED basierter Verfahren liegt und im Vergleich zu Systemen mit
einer einzigen lokalen Nullstelle deutlich erhöht ist.
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Im
Hinblick auf eine besonders einfache Konstruktion ist vorgesehen,
dass die kohärenten Lichtstrahlen
mit mindestens einer Linse in ein Zwischenbild der Eintrittspupille
des Objektivs fokussiert werden.
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Im
Rahmen einer weiteren Ausführungsform ist
der Einsatz von Lichtleitfasern vorgesehen, über die die kohärenten Lichtstrahlen
bereitgestellt werden. Im einfachsten Fall kann es sich dabei beispielsweise
um Glasfasern handeln. Die kohärenten
Lichtstrahlen lassen sich besonders einfach in die Eintrittspupille
des Objektivs fokussieren, wenn die Austrittsflächen der Lichtleitfasern beispielsweise
in einem Zwischenbild der Eintrittspupille des Objektivs positioniert
sind. In besonders vorteilhafter Weise werden polarisationserhaltende
Lichtleitfasern eingesetzt, wobei die Vorteile einer derartigen
Ausführung weiter
unten im Detail erläutert
werden.
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Alternativ
können
die kohärenten
Lichtstrahlen mittels eines im Strahlengang angeordneten vorzugsweise
holographischen Gitters oder mittels eines im Strahlengang angeordneten
vorzugsweise programmierbaren Phasenmodulators erzeugt werden. Zur
Erzeugung von höchstauflösenden Bildern wird
als Objektiv in idealer Weise eine hochnumerische Optik verwendet,
die von vornherein kleinstmögliche
Lichtstrukturen im Rahmen der Beugungsgrenze erzeugt. In Verbindung
mit hochnumerischen Systemen lässt
sich ein Maximum an Auflösung
erreichen.
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Im
Rahmen einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform sind die kohärenten Lichtstrahlen
nur in Tangentialrichtung der Pupille des Objektivs polarisiert.
Durch diese Maßnahme
können
unerwünschte
Veränderungen
des Polarisationszustandes des Lichts verhindert werden, die auftreten
können,
wenn (linear) polarisiertes Licht durch eine Optik hoher numerischer
Apertur fokussiert wird. Wenn x- und y-Richtungen die Ebene der
Eintrittspupille und z die optische Achse definieren, so kann ein
im Allgemeinen ursprünglich
zum Beispiel in x-Richtung
polarisierter Lichtstrahl nach Durchlaufen der Optik auch Polarisationskomponenten
in y- und z-Richtung aufweisen. Dies gilt im Allgemeinen auch für Nullstellen einer
Stehwelle im Fokusraum. Ein ursprünglich in x-Richtung polarisierter
Lichtstrahl wird daher an den Positionen der Nullstellen der x- Komponente des Lichts
unter Umständen
Licht in y- und z-Richtung aufweisen. Dies hängt unter anderem von der Position,
der relativen Phase und vom Polarisationszustand der in die Eintrittspupille
fokussierten Lichtstrahlen ab. Mittels einer Polarisation der Lichtstrahlen
ausschließlich
in Tangentialrichtung der Pupille des Objektivs werden die Nullstellen
der Stehwelle auch durch die beschriebenen Depolarisationseffekte
hochnumerischer Objektive nicht oder nur unbedeutend beeinflusst,
so dass die Nullstellen der Stehwellen auch beim Abrastern der Probe
ständig
erhalten bleiben.
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Zum
Abrastern des gesamten zu erfassenden Probenbereichs kann vorgesehen
sein, dass die Intensitäts-Nullstellen
der Stehwelle schrittweise verschoben werden. Eine derartige Verschiebung
kann insbesondere durch Veränderungen
der relativen Phasenlagen der einzelnen kohärenten Lichtstrahlen zueinander
erreicht werden. In besonders einfach zu handhabender Weise können die Änderungen
der relativen Phasen der einzelnen kohärenten Lichtstrahlen realisiert
werden, indem die optische Weglänge
in mindestens einem der kohärenten
Lichtstrahlen verändert
wird. Zum Nachweis des von der Probe ausgehenden Messsignals ist
ein Detektor vorgesehen, der beispielsweise als CCD-Detektor, als
EMCCD-Detektor oder als APD-Array (Avalanche Photodiode) ausgeführt ist.
Der Auslesevorgang des Detektors ist in vorteilhafter Weise mit
dem Rastervorgang synchronisiert, beispielsweise derart, dass der Detektor
nach jedem Rasterschritt ausgelesen wird.
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Zur
Erzeugung der Lichtstrahlen können
beispielsweise Laserlichtquellen eingesetzt werden. Alternativ ist
der Einsatz von Weißlichtquellen
denkbar, wobei in diesem Fall die Kohärenzlänge der Lichtquelle hinreichend
kurz sein muss. Im Falle von Weißlichtquellen werden in vorteilhafter
Weise verstellbare Retroreflektoren eingesetzt, mit denen ein Wellenlängenabgleich
zwischen paarweise kohärenten
Lichtstrahlen durchgeführt
werden kann.
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Im
Hinblick auf ein hohes Maß an
Flexibilität ist
der Einsatz zusätzlicher
Lichtquellen vorgesehen, deren Licht einerseits zum Rückschalten
der Substanz aus dem zweiten Zustand in den ersten Zustand und/oder
zum Auslesen der ersten Zuständen in
den Strahlengang einkoppelbar ist. Im Gegensatz zu der punktförmigen Ausleuchtung,
die bei dem optischen Signal zur Realisierung einer Stehwelle ge wählt wird,
werden die zusätzlichen
Lichtquellen bevorzugt so eingesetzt, dass sie das Gesichtsfeld großräumig ausleuchten.
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Im
Rahmen konkreter Anwendungen, beispielsweise bei der Untersuchung
lebender Zellen, die der Abbildung biologischer Vorgänge in der
Nähe der
Zellmembran dienen, kann das Auslesen der ersten Zustände im TIRF-Modus
(Total Internal Reflectance Fluorescence) erfolgen. Dazu können die Stehwellen
als evaneszente Felder ausgebildet werden, so dass aufgrund der
in Folge von Totalreflexion begrenzten Eindringtiefe die Stehwelle
nur in einer sehr dünnen
Schicht der Probe wirksam ist. Auf diese Weise lassen sich Prozesse
in der Nähe
der Zellmembran lebender Zelle mit höchster räumlicher Auflösung visualisieren.
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Es
gibt nun verschiedene Möglichkeiten,
die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten
und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die nachgeordneten Ansprüche, andererseits
auf die nachfolgende Erläuterung
bevorzugter Ausführungsbeispiele
des erfindungsgemäßen Verfahrens
und des erfindungsgemäßen Mikroskops zur
räumlich
hochauflösenden
Untersuchung von Probe zu verweisen. In Verbindung mit Erläuterungen
der bevorzugten Ausführungsbeispiele
anhand der Zeichnungen werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen
und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigen
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1 in
einer schematischen Darstellung ein zyklisches Beleuchtungsschema
eines Verfahrens zur räumlich
hochauflösenden
Untersuchung von Proben,
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2 in
einer schematischen Darstellung ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops
und
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3 in
einer schematischen Darstellung unterschiedliche Varianten der Fokussierung
kohärenter
Lichtstrahlen in die Eintrittspupille des Objektivs zusammen mit
verschiedenen Polarisationszuständen
und
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4 in
einer schematischen Darstellung ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens
mit insgesamt vier paarweise kohärenten Lichtstrahlen.
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1 zeigt
schematisch einen zyklischen Beleuchtungsvorgang, wie er zur räumlich hochauflösenden Untersuchung
von Proben jenseits der beugungslimitierten Auflösungsgrenze eingesetzt wird. Gemäß 1a wird zunächst im gesamten zu erfassenden
Probenraum P eine in der Probe 1 bereitgestellte Substanz,
die wiederholt von einem ersten Zustand Z1 in einen zweiten Zustand
Z2 überführbar ist, wobei
sich die ersten und die zweiten Zustände Z1, Z2 in mindestens einer
optischen Eigenschaften voneinander unterscheiden, mittels eines
Schaltsignals 2 in den ersten Zustand Z1 gebracht. In dem
konkret dargestellten Beispiel handelt es bei dem ersten Zustand
Z1 um einen fluoreszierenden Zustand A und bei dem zweiten Zustand
Z2 um einen nicht fluoreszierenden Zustand B. Bei der in der Probe 1 bereitgestellten
Substanz handelt es sich in dem konkret dargestellten Beispiel um
eine photochrome Substanz, deren Moleküle durch Bestrahlung mit Licht
einer ersten Wellenlänge,
dem Schaltsignal 2, in den fluoreszenzfähigen Zustand A gebracht werden.
Dies geschieht in idealer Weise, indem die Probe 1 im gesamten
Probenraum P durch Beleuchtung durch ein Objektiv 3 mit
dem Schaltsignal 2 bestrahlt wird.
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Im
Falle der Grundzustands-Entvölkerung (Ground
State Depletion, GSD) findet der Übergang in den fluoreszenzfähigen (Singlet)-Zustand üblicherweise
spontan statt. Das Einstrahlen optischer Schaltsignale erübrigt sich
somit in diesem Fall, es müssen
lediglich Wartezeiten von typischerweise 1 bis 100 μs (teilweise
auch ein wenig länger)
berücksichtigt
werden.
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In
einem nächsten
Schritt – dargestellt
in 1b – wird Licht einer anderen
Wellenlänge,
das sogenannte optische Signal 4, auf den zu erfassenden
Probenbereich P aufgebracht. Dies geschieht in Form einer Lichtstruktur
mit definierten Intensitäts-Nullstellen 5.
Das optische Signal 4 induziert gesättigt den Übergang A → B in allen mit Licht des optischen
Signals 4 beleuchteten Bereichen 6. Mit anderen
Worten verbleiben lediglich in unmittelbarer Umgebung der Intensitäts-Nullstellen 5 eng
definierte Bereiche der Substanz im Zustand A. Die verbleibenden
Bereiche A1, A2, A3, ... der Substanz in Zustand A können viel
kleiner sein als die Dimensionen der Lichtstruktur des optischen
Signals 4 selbst, d. h. konkret viel kleiner als beugungslimitierte
Strukturen. Die Größe der im
Zustand A verbleibenden Bereiche A1, A2, A3, ... der Substanz
hängt ganz
maßgeblich von
der Qualität
der Intensitätsminima 5 und
damit vom erreichten Sättigungsgrad
des Übergangs
A → B ab.
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In 1c ist schematisch der Auslesevorgang
des Zustands A dargestellt. Dazu wird ein optisches Testsignal 7 so
in den zu erfassenden Probebereich P eingestrahlt, dass diejenigen
gemäß 1b präparierten
Bereiche, in denen die Substanz in Zustand A verblieben ist, erfasst
werden. Eventuell noch existierende Bereiche der Substanz im Zustand A,
die außerhalb
des zu erfassenden Probenbereichs P liegen, dürfen dabei nicht erfasst werden.
Das von der Substanz im Zustand A ausgehende Fluoreszenzlicht wird
als Messsignal 8 von einem Detektor (nicht gezeigt) erfasst,
wobei eine eindeutige Zuordnung der detektierten Messsignale 8 zu
den Einzelbereichen A1, A2,
A3, ... vorgenommen wird.
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Der
in den 1a bis c dargestellte Zyklus wird
wiederholt, wobei das Stehwellenmuster bei jeder Wiederholung etwas
weiter geschoben wird. Auf diese Weise lässt sich der gesamte zu erfassende Probenbereich
mit einer Auflösung
im Subdiffraktionsbereich abbilden.
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2 zeigt
schematisch ein Mikroskop mit einer Stehwelle 9 im Probenbereich
P. Gemäß der Darstellung
in 2a werden dazu zwei kohärente Lichtstrahlen 10, 11 mittels
einer Linse 12 in ein Zwischenbild ZB der Eintrittspupille
EP des Objektivs 13 fokussiert. Aus Gründen der Übersichtlichkeit ist einer
der beiden kohärenten
Lichtstrahlen 10 mit einer durchgezogenen Linie und der
andere Lichtstrahl 11 mit einer gestrichelten Linie dargestellt.
Mit anderen Worten ist in dem dargestellten Beispiel die Fokussierung
der kohärenten
Lichtstrahlen 10, 11 so gewählt, dass im Zwischenbild ZB
die Brennpunkte P1', P2' gebildet sind. Prinzipiell
kann die Fokussierung nicht nur in das Zwischenbild ZB, sondern
auch unmittelbar in das Bild oder in eine beliebige dazu konjugierte
Ebene erfolgen. Über
einen Strahlteiler 14 werden die beiden kohärenten Lichtstrahlen 10, 11 in den
Strahlengang des Mikroskops eingekoppelt. Über das Scann-Okular 15 und
die Tubuslinse 16 werden die beiden Strahlen 10, 11 in
die Eintrittspupille EP abgebildet, so dass dort die beiden Brennpunkte
P1, P2 entstehen.
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Wie
in 2a angedeutet, kann über den Strahlteiler 14 das
Licht weiterer Lichtquellen eingekoppelt werden, bspw. das Schaltsignal 2 oder
das Testsignal 7. Auch die Messsignale 8 können über den
Strahlteiler 14 zu einem nicht gezeigten Detektor geführt werden.
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Wie
in 2b im Detail dargestellt, hat die beschriebene
Fokussierung der beiden kohärenten Lichtstrahlen 10, 11 in
der Eintrittspupille EP des Objektivs 13 zur Folge, dass
sich im Probenbereich P zwei ebene Wellen 17, 18 ausbilden.
Durch Interferenz der beiden ebenen Wellen 17, 18 bildet
sich in der Fokalebene FE die in 2b dargestellte
Stehwelle 9 mit definierten Intensitäts-Nullstellen aus.
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3 zeigt
schematisch unterschiedliche Polarisationszustände der in die Pupillenebene
PE fokussierten kohärenten
Lichtstrahlen 10, 11 sowie die daraus jeweils
resultierenden Polarisationszustände
der Stehwellen 9 im Probenbereich P. Wie bereits ausgeführt wird
ein Rastern der Probe 1 durch ein Verschieben der Stehwelle 9 senkrecht
zu ihrer Verlaufsrichtung dadurch erreicht, dass die relative Phase
der beiden Lichtstrahlen 10, 11 in den Brennpunkten
P1 und P2 variiert wird. in den 3a und
b ist der Fall linear polarisierten Lichts in y-Richtung dargestellt,
wobei die Punkte P1 und P2 in y-Richtung versetzt sind. 3c und d zeigen den Fall linear polarisierten
Lichts in x-Richtung, wobei die Punkte P1 und P2 in y-Richtung versetzt
sind. Dabei sind jeweils die gleichphasigen Fälle (3a und
c), in denen die Wellenpakete im gleichen Takt schwingen, und die
gegenphasigen Fälle
(3b und d) dargestellt, in denen die
Wellenpakete im Gegentakt schwingen. Die unterschiedlichen Polarisationszustände werden
im Folgenden nur am Beispiel dieser beiden konkreten Phasenlagen
beschrieben. Für
ein kontinuierliches Verschieben der Intensitäts-Nullstellen der Stehwelle 9 in
der Fokusebene FE müssen dagegen
in diskreten Schritten auch weitere Phasenlagen dazwischen generiert
werden.
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Beim
Durchlaufen der kohärenten
Lichtstrahlen 10, 11 durch stark fokussierende
Objektive/Linsen 13 werden die Polarisationsrichtungen
der Lichtwellen gekippt. Dies ist jeweils in den rechten Teilbildern
der 3 dargestellt. Im Falle des in y-Richtung polarisierten
Lichts (3a, b) entstehen Polarisationskomponenten
in z-Richtung. Diese
sind in dem in 3a gezeigten Fall gegenphasig,
d. h. sie interferieren negativ, und es entsteht effektiv kein Licht
mit z-Polarisation. Für
Strahlen, die nicht auf der optischen Achse liegen, entsteht im
Allgemeinen aber bereits hier eine z-Komponente. Das bedeutet, dass die
Intensitäts-Nullstellen
zwar bezüglich
der ursprünglichen
Polarisation (in y-Richtung) eine Nullstelle aufweisen, im Allgemeinen
aber einen endlichen Anteil an z-polarisiertem Licht enthalten.
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Deutlicher
wird dies in dem in 3b dargestellten
Fall. Hier führt
das Kippen der Polarisationsvektoren und die gegenphasige Lage der
kohärenten Lichtstrahlen 10, 11 zu
einer Depolarisation in z-Richtung, wobei die kohärenten Lichtstrahlen 10, 11 in z-Richtung
positiv interferieren und daher eine deutlich ausgeprägte z-Komponente haben.
Diese ist umso stärker,
je größer der
Fokussierwinkel des Objektivs 13 ist. Da die Lichtstrahlen 10, 11 zur
Erzeugung einer Stehwelle 9 mit engen Minima unter möglichst
großem
Winkel abgelenkt werden sollen, ist diese Anordnung unbrauchbar.
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Zu
bevorzugen ist eine Anordnung, wie sie in den 3c und
d dargestellt ist. In diesen Fällen
sind die Brennpunkte P1 und P2 in y-Richtung versetzt, und die Polarisation
ist in x-Richtung gewählt.
Beim Fokussieren – selbst
mittels einer hochnumerischen Optik 13 – findet hier keine Depolarisation
statt, d. h. auch im Fokusraum ist das Licht weiterhin in x-Richtung
polarisiert. Eine Zerstörung
der Intensitäts-Nullstellen
der Stehwelle 9 durch andere Polarisationen findet nicht
statt. Dies gilt für
alle Phasenlagen und damit für
eine beliebige Position der Nullstellen im Fokusraum. Demzufolge
sind die in den 3c und d dargestellten
Verhältnisse
ganz besonders geeignet, als optisches Signal 4 für den gesättigten Übergang
von dem ersten Zustand A in den zweiten Zustand B zu dienen. Entscheidend
ist jedenfalls, dass in der Eintrittspupille EP nur Polarisationsvektoren mit
reiner Tangentialkomponente auftreten und Radialkomponenten, die
stark in z-Richtung depolarisieren, vermieden werden. Die Intensitäts-Nullstellen bleiben
dann in allen Polarisationsrichtungen erhalten, auch wenn das Stehwellenmuster 9 beliebig durch
die Probe 1 gerastert wird.
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Für Lichtstrahlen,
die nicht auf der optischen Achse liegen, sind die Verhältnisse
demgegenüber etwas
komplizierter. In diesen Fällen
treten auch bei reiner Tangential-Polarisation leichte Depolarisationseffekte
auf. Es lässt
sich jedoch durch Rechnungen für
realistische Verhältnisse
zeigen, dass der Anteil des de polarisierten Lichts in derartigen
Fällen
bei einer Anordnung gemäß den 3c und d in der Größenordnung 10–3 bis
10–2 liegt,
was ausreichend gering ist. Im Falle einer Anordnung gemäß der 3a und b liegt demgegenüber insbesondere
der z-Anteil der Polarisation typischerweise in der gleichen Größenordnung
wie die ursprüngliche
Polarisation und ist teilweise sogar größer, wodurch die Nullstellen
vollständig
zerstört
würden.
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4 zeigt
ein Ausführungsbeispiel
mit insgesamt vier Lichtstrahlen, von denen jeweils zwei paarweise
kohärent
sind. Konkret gezeigt ist die Eintrittspupille EP mit den vier Brennpunkten
P1 bis P4. Die Lichtstrahlen 19–22 weisen ausschließlich Polarisationsvektoren
mit Tangentialkomponenten auf, was durch die dargestellten Pfeile
angedeutet ist. Die beiden in x-Richtung versetzten Brennpunkte
P1 und P3, d. h. die Lichtstrahlen 19 und 21,
sind zueinander kohärent
und weisen eine Polarisation in y-Richtung auf. Daraus resultiert
ein 2D-Linienmuster in der Fokalebene FE mit gut erhaltenen Intensitäts-Nullstellen.
Die beiden Lichtstrahlen 20 und 22 mit den Brennpunkten
P2 und P4 sind ebenfalls zueinander kohärent und weisen eine Polarisation
in x-Richtung auf, so dass das resultierende Linienmuster um 90° gedreht
und in x-Richtung polarisiert ist. Dementsprechend interferieren
die beiden resultierenden Linienmuster nicht miteinander, vielmehr
kommt es zu einer einfachen Addition der Intensitätswerte.
Das Resultat ist dementsprechend ein zweidimensionales Gittermuster
mit periodisch auftretenden Intensitäts-Nullstellen. Diese können im
Rahmen eines Probenscanns in x-Richtung verschoben werden, indem die
relativen Phasen der kohärenten
Lichtstrahlen 19, 21 mit den Brennpunkten P1 und
P3 variiert werden. Eine Verschiebung der Nullstellen in y-Richtung ist durch
Variation der relativen Phase der kohärenten Lichtstrahlen 20, 22 mit
den Brennpunkten P2 und P4 möglich.
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Hinsichtlich
weiter vorteilhafter Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens
und des erfindungsgemäßen Mikroskops
wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil der
Beschreibung sowie auf die beigefügten Patentansprüche verwiesen.
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Schließlich sei
ausdrücklich
darauf hingewiesen, dass die voranstehend beschriebenen Ausführungsbeispiele
lediglich zur Erörterung
der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele
einschränken.