DE102012211780B4

DE102012211780B4 - Vorrichtung zur Halterung und Beleuchtung von Proben für ein Mikroskop

Info

Publication number: DE102012211780B4
Application number: DE102012211780.6A
Authority: DE
Inventors: Stefan Richter; Michael Kempe; Gerhard Krampert
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2012-07-05
Filing date: 2012-07-05
Publication date: 2023-12-07
Anticipated expiration: 2032-07-06
Also published as: DE102012211780A1

Abstract

Vorrichtung zur Halterung und Beleuchtung von Proben (2) für ein Mikroskop, umfassend- eine Probeneinfassung (1) zur Aufnahme einer in Flüssigkeit eingebetteten Probe (2), wobei die Probeneinfassung (1) auf einem Objektträger (3) angeordnet ist und zur Verhinderung des Austretens von Flüssigkeit aus der Probeneinfassung (1) einen seitlich umlaufenden Rand (4) aufweist,- Mittel zur Beleuchtung der Probe (2) mit einem Lichtblatt mit einer senkrecht zu einer Detektionsrichtung orientierten Ausbreitungsrichtung,- Mittel zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen Probe (2) und Lichtblatt, dadurch gekennzeichnet, dass- die Mittel zur Beleuchtung der Probe (2) einen die Probeneinfassung (1) in der Ebene senkrecht zur Detektionsrichtung mindestens teilweise umschließenden Beleuchtungsgürtel (5) umfassen,- der Beleuchtungsgürtel (5) mindestens eine Lichteintrittsöffnung (6) zur Abstrahlung von Licht in Form eines Lichtblatts entlang einer Abstrahlrichtung in den von dem Beleuchtungsgürtel (5) umschlossenen Raum hinein aufweist, wobei an die Lichteintrittsöffnung (6) ein Ende einer Lichtleitfaser (7) angekoppelt ist, und- die Mittel zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen Probe (2) und Lichtblatt eine Relativbewegung zwischen Beleuchtungsgürtel (5) und Probe (2) erzeugend ausgestaltet sind.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Halterung und Beleuchtung von Proben für ein Mikroskop. Eine solche Vorrichtung umfasst eine Probeneinfassung zur Aufnahme einer in Flüssigkeit eingebetteten Probe, wobei die Probeneinfassung auf einem Objektträger angeordnet ist und zur Verhinderung des Austretens von Flüssigkeit aus der Probeneinfassung einen seitlich umlaufenden Rand aufweist. Die Vorrichtung umfasst weiter Mittel zur Beleuchtung der Probe mit einem Lichtblatt mit einer senkrecht zur Detektionsrichtung orientieren Ausbreitungsrichtung, sowie Mittel zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen Probe und Lichtblatt.
Zur Untersuchung und dreidimensionalen Abbildung von Proben wird oft die konfokale Mikroskopie eingesetzt. Damit ist es möglich, dreidimensionale Bildinformationen mit hohem Kontrast und guter Auflösung zu gewinnen. Üblicherweise wird dabei eine Punktlichtquelle auf die zu untersuchende Probe abgebildet. Das von der Probe emittierte Licht, welches detektiert werden soll, wird mit einer Punktblende räumlich gefiltert, bevor es auf einen Detektor fällt. Die Bilderzeugung erfolgt hier punktweise sequentiell, indem die Probe relativ zum optischen System bewegt wird. Dies kann entweder durch die Bewegung der Probe selbst oder durch Abtasten der ruhenden Probe, wie es beispielsweise mit Laserscanmikroskopen durchgeführt wird, erreicht werden.
Das sequentielle Abtasten der Probe ist jedoch mit einigen Nachteilen verbunden. So ist beispielsweise die Zeit, die zur Aufnahme und zur anschließenden Erzeugung eines Bildes benötigt wird, relativ hoch, da für jeden Punkt, der beleuchtet wird, im für die Bildaufnahme verwendeten Detektor ausreichend lange integriert werden muss, um ein akzeptables Signal-RauschVerhältnis zu erzielen, welches eine sichere Bildauswertung erlaubt. Dies ist insbesondere bei solchen Proben relevant, die nur begrenzte Beleuchtungszeiten erlauben, da beispielsweise das von ihnen emittierbare Licht limitiert ist, wie es beispielsweise bei Proben der Fall ist, die vorab mit Fluoreszenzmarkern versehen wurden. Die durch die Fluoreszenz-Lebensdauer grundlegend beschränkte Emissionsrate erfordert oft Integrationszeiten im Bereich mehrerer Mikrosekunden, was beispielsweise bei einem Raster von 500x500 Bildpunkten (Pixeln) zu Bilderzeugungszeiten im Sekunden-Bereich führt. Bei solchen Proben ist außerdem die Lichtmenge, mit der die Probe bestrahlt werden kann, begrenzt, da die zur Markierung verwendeten Fluorophore durch die Bestrahlung mit Anregungslicht nicht nur Licht emittieren, sondern durch das Anregungslicht auch photochemisch zerstört werden, wodurch sie ihre Fähigkeit zur Fluoreszenz verlieren (Photobleichen). Da die Beleuchtungsbelastung der Probe oft nicht nur von der Dosis, d.h. von der Gesamtzahl aller Photonen, sondern auch von der Intensität, d.h. der Anzahl von Photonen pro Zeit- und Flächeneinheit abhängt, ergibt sich hier ein weiterer, schwerwiegender Nachteil der sequentiellen und punktweisen Abtastung zur Bildgebung. Von allen Bildgebungsverfahren ist das punktweise Abtasten mit den größten Intensitäten und daher in der Regel auch mit den größten Bleicheffekten verbunden.
Ein Ausweg besteht beispielsweise darin, die Beleuchtung der Probe in einer Bildebene mit einem Lichtblatt im wesentlichen orthogonal zur Beobachtungsrichtung so zu realisieren, dass die beleuchtete Ebene der Fokusebene des Objektivs im Beleuchtungsstrahlengang entspricht. Da nur die im Fokus befindliche Ebene beleuchtet wird, erhält man eine quasi-konfokale Bildgebung dieser Ebene, wenn man sie mit einer im Detektionsstrahlengang angeordneten Kamera mit einem entsprechend hoch auflösenden Detektor aufnimmt. Um die Probe dreidimensional abzutasten und ein dreidimensionales Bild zu erzeugen, wird nun die beleuchtete Ebene relativ zum Objekt bewegt, so dass die Probe vollständig abgetastet wird. Der Vorteil dieses Verfahrens, welches auch als SPIM (selective plane illumination microsopy) bezeichnet wird, liegt u.a. darin, dass die Bildinformationen mit einer höheren Geschwindigkeit erfasst werden können, biologische Proben einer geringeren Gefahr des Ausbleichens ausgesetzt sind, sowie in einer erweiterten Eindringtiefe des Fokus in die Probe.
Ein Nachteil des SPIM-Verfahrens besteht darin, dass die geforderte Beleuchtung der Probe mit einem Lichtblatt, welches senkrecht zur Detektionsachse annähernd flächig ausgedehnt ist, nicht kompatibel mit einem konventionellen Mikroskopaufbau ist, was die Systeme sehr aufwendig macht, da eine für den Benutzer modulare Bauweise nicht möglich ist. Ein damit zusammenhängendes Problem stellt die Präparation der Proben und ihre Handhabung in einem speziell auf die Beleuchtungsgeometrie von SPIM angepassten System dar.
In der DE 10 2004 034 957 A1 wird eine spezielle Objektivanordnung beschrieben, bei der eine Einspiegelung des Lichtblattes am Rand außerhalb des eigentlichen Beobachtungsobjektivs erfolgt, beispielsweise über abbildende Spiegel mit geringer numerischer Apertur. Der das Objektiv umschließende abbildende Spiegel ist mechanisch ein Teil des Objektives um eine möglichst homogene Auflösung zu erzielen, die Einspiegeloptik kann beispielsweise ringförmig ausgestaltet sein. Die Beleuchtung erfolgt über das Mikroskop.
In dem Artikel „Light Sheet Microscopy for single molecule tracking in living tissue" von J. B. Ritter et al., erschienen in PLoS ONE 5(7) (2010), e11639, wird ein solcher Aufbau beschrieben, der auf der Verwendung eines kommerziell erhältlichen, inversen Mikroskops basiert. Der Aufbau umfasst unter anderem eine speziell angefertigte Probenkammer mit einem transparenten Boden, unterhalb dessen ein Immersionsobjektiv angeordnet ist. Die Probenkammer verfügt außerdem über transparente Seitenwände, über die aus horizontaler Richtung Licht in Form eines Lichtblattes zur Beleuchtung der Probe eingekoppelt wird. Die Probe kann dann relativ zum Lichtblatt in senkrechter Richtung durch Bewegung des entsprechenden Probentischs, der die Probenkammer trägt, bewegt werden. Die Beleuchtungseinrichtung ist relativ zum Mikroskopkörper fixiert. Diese Anordnung ist jedoch sehr aufwendig und benötigt verglichen mit der Größe des Mikroskopkörpers sehr viel Platz. Das Lichtblatt wird mit Hilfe eines elliptischen Laserstrahls, der über ein Beleuchtungsobjektiv in die Probenkammer fokussiert wird, erzeugt. Während sich die Probenkammer bzw. die Probenhalterung gut in ein solches kommerzielles, inverses Mikroskop integrieren lässt, ist dies für die Beleuchtung, die entgegen dem konventionellen Aufbau senkrecht und nicht parallel zur Detektionsrichtung erfolgt, bei einem solchen Mikroskop wesentlich aufwendiger zu realisieren und sprengt die räumlichen Dimensionen des zugrundeliegenden Mikroskops.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine Vorrichtung der eingangs beschriebenen Art, wie sie auch in dem genannten Fachartikel beschrieben ist, dahingehend weiterzuentwickeln, dass die Kompatibilität mit konventionellen Mikroskopen hinsichtlich der Beleuchtung und Probenhalterung verbessert wird und auch der zur Beleuchtung der Probe notwendige Platzbedarf am Mikroskop verringert werden kann.
Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, dass die Mittel zur Beleuchtung der Probe einen die Probeneinfassung in der Ebene senkrecht zur Detektionsrichtung mindestens teilweise umschließenden Beleuchtungsgürtel umfassen, wobei der Beleuchtungsgürtel mindestens eine Lichteintrittsöffnung zur Abstrahlung von Licht in Form eines Lichtblatts entlang einer Abstrahlrichtung in den von dem Beleuchtungsgürtel umschlossenen Raum hinein aufweist, wobei an die Lichteintrittsöffnung ein Ende einer Lichtleitfaser angekoppelt ist, und dass die Mittel zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen Probe und Lichtblatt eine Relativbewegung zwischen Beleuchtungsgürtel und Probe erzeugend ausgestaltet sind.
Diese insbesondere für kleine Proben geeignete Lösung erlaubt zum einen eine der Mikroskopie ähnliche Probenpräparation und Probenhandhabung und zum anderen die Nutzung des SPIM-Verfahrens in einem konventionellen, aufrechten oder inversen Stativ, da die Beleuchtung der Probe mit einem konventionellen Objektträger kompatibel realisiert werden kann. Der Beleuchtungsgürtel, der die Probeneinfassung mindestens teilweise umschließt, kann dabei transparent oder lichtundurchlässig ausgestaltet sein, wesentlich ist, dass er mindestens eine Lichteintrittöffnung aufweist, an die das eine Ende einer Lichtleitfaser angekoppelt ist, die das zur Erzeugung des Lichtblatts notwendige Licht aus einer Beleuchtungsquelle in den von dem Beleuchtungsgürtel umschlossenen Raum, in dem sich auch die Probenkammer befindet, leitet. Die Verwendung von Lichtleitfasern erlaubt es, zum einen auf einen komplexen Aufbau mit einem Beleuchtungsobjektiv in unmittelbarer Nähe zur Probenkammer zu verzichten, was eine kompaktere Bauweise erlaubt, da die Lichtleitfasern nicht gerade verlegt werden müssen. Zum anderen erhält man durch die Verwendung eines Beleuchtungsgürtels mit daran angekoppelten Lichtleitfasern auch mehr Möglichkeiten, die Relativbewegung zwischen Beleuchtungsgürtel und Probe zu erzeugen. So können die Mittel zur Erzeugung einer Relativbewegung in diesem Fall nicht nur in üblicher Weise so ausgestaltet sein, dass der Beleuchtungsgürtel fest angeordnet ist und die Probe auf einem entsprechenden Träger in vertikaler Richtung verfahren wird, sondern es ist ohne großen Aufwand auch möglich, die Probe gegenüber dem Stativ des Mikroskops nicht zu bewegen, sondern stattdessen den Beleuchtungsgürtel.
Um das abgestrahlte Licht in eine Lichtblattform zu ziehen, gibt es verschiedene Möglichkeiten. In einer vorteilhaften Ausgestaltung, die mit besonders wenig Bauteilen auskommt, ist ein Ende einer Lichtleitfaser mit einem elliptischen Kern direkt in die mindestens eine Lichteintrittsöffnung des Beleuchtungsgürtels eingesetzt und dort fixiert. Die Hauptachse der Ellipse sollte dabei parallel zur optischen Achse des Detektionsobjektivs ausgerichtet sein, das Lichtblatt wird dann senkrecht zu dieser Achse erzeugt. Alternativ kann in die mindestens eine Lichteintrittsöffnung auch ein Ende einer Lichtleitfaser, die einen üblichen Kern mit rundem Querschnitt aufweisen kann, mit einem in Abstrahlrichtung vorgeschalteten Kollimator in Kombination mit einer Zylinderlinse eingesetzt sein. Diese drei Elemente lassen sich beispielsweise in einen entsprechenden Stecker oder eine Ferrule integrieren, die dann in die Lichteintrittsöffnung eingesetzt wird. Auch kann die Zylinderlinse selbst in die Öffnung eingesetzt sein und mit dieser bündig abschließen, wobei dann auf andere Weise dafür gesorgt werden muss, dass das Ende der Lichtleitfaser und der Kollimator in ihren Positionen relativ zur Zylinderlinse fixiert sind.
Der Beleuchtungsgürtel selbst kann dabei ebenfalls auf verschiedene Weisen realisiert werden. Eine besonders einfache Ausgestaltung besteht darin, dass der Beleuchtungsgürtel über Befestigungsmittel am Stativ des Mikroskops befestigt ist. Diese Befestigungsmittel können als einfache Stange ausgestaltet sein, die einstückig mit dem Beleuchtungsgürtel ausgebildet sein kann oder aber mit diesem auf andere Weise, beispielsweise durch Schrauben oder Kleben verbunden sein kann, und die auf ihrer anderen Seite am Stativ fixiert ist, beispielsweise ebenfalls durch eine Schraubverbindung oder durch einen Adapter, der die Verwendung des Beleuchtungsgürtels nach Art eines problemlos einsetz- und wiederentfernbaren Moduls erlaubt. Zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen Beleuchtungsgürtel und Probe kann dann beispielsweise ein üblicher, vertikal in sehr kleinen Schritten verstellbarer Probentisch bzw. Probenträger verwendet werden, auf dem der Objektträger mit der Probenkammer angeordnet ist. Es besteht jedoch auch die Möglichkeit, den Beleuchtungsgürtel selbst zu bewegen, indem beispielsweise die Stange am Stativ entlang einer Führung vertikal verfahrbar gelagert ist. Diese gegenüber der vorgenannten Lösung etwas aufwendigere Gestaltung bietet die Möglichkeit, die vertikale Verschiebung des Beleuchtungsgürtels genau an die Bedürfnisse des SPIM-Verfahrens anzupassen.
Bei der vorgenannten Anordnung wird die Probeneinfassung von dem Beleuchtungsgürtel mindestens teilweise umschlossen, ist jedoch auf allen Seiten von dem Beleuchtungsgürtel beabstandet, um eine einfache Relativbewegung zu ermöglichen. Die Beleuchtung der Probe erfolgt in diesem Fall also mit Freistrahlen.
Der Beleuchtungsgürtel kann aber auch so ausgestaltet sein, dass er die Probeneinfassung eng umschließt, also an ihr anliegt, oder er kann sogar Teil der Probeneinfassung sein, indem er den Rand der Probeneinfassung bildet. Da die Probenkammer, deren seitliche Berandung die Probeneinfassung bildet, in der Regel mit einer Flüssigkeit oder einem Gel gefüllt ist, sind hier die Anforderungen an die Abdichtung der Lichteintrittsöffnungen höher als bei der vorangehend beschriebenen Ausführung, da hier das Licht aus der Lichtleitfaser bzw. der vorgeschalteten Zylinderlinse direkt in die Probenkammer eingekoppelt wird.
In diesem Fall ist es vorteilhaft, wenn die Probeneinfassung über ein entlang der Detektionsrichtung flexibles Dichtungselement auf dem Objektträger befestigt ist. Die Mittel zur Erzeugung der Relativbewegung zwischen Beleuchtungsgürtel und Probe umfassen dann u.a. Aktuatoren zur Verschiebung der Probeneinfassung in vertikaler Richtung relativ zum Objektträger und relativ zur Probe. Durch diese Auslenkung der Probeneinfassung in vertikaler Richtung werden auch die Lichteintrittsöffnungen bewegt, damit wird die Ebene des Lichtblatts verschoben.
Eine andere Möglichkeit zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen Beleuchtungsgürtel und Probe besteht darin, dass die Mittel zur Erzeugung der Relativbewegung Mittel zur Erzeugung einer entlang der Detektionsrichtung beweglichen Lichtfalle umfassen, in der die Probe gehalten und somit bewegt wird. Dabei muss darauf geachtet werden, dass das Licht, welches zur Erzeugung dieser Lichtfallen verwendet wird, keine Fluoreszenz in der Probe auslöst oder im Detektionsbereich der Kamera liegt. Beispielsweise eignet sich Licht aus einem Wellenlängenbereich im nahen Infrarot für die Erzeugung der Lichtfalle. Der Einsatz einer Lichtfalle erlaubt es, auf mechanisch bewegte Teile an der Probenkammer oder am Beleuchtungsgürtel zu verzichten und trotzdem die notwendigen Probenbewegungen durchzuführen, wobei hier jedoch nur kleinere Proben mit einem Durchmesser von maximal etwa 150 µm untersucht werden können.
Zur Erzeugung einer möglichst gleichförmigen Beleuchtung der Probe mit gleichzeitiger Minimierung von Abschattungen und Apodisierungen ist es vorteilhaft, nicht nur eine, sondere mehrere Lichteintrittsöffnungen zu verwenden. Eine ausgewogene Mischung aus Aufwand und Ergebnis erhält man beispielsweise, wenn der Beleuchtungsgürtel als Beleuchtungsring ausgestaltet ist, und mindestens drei gleichmäßig auf dem Beleuchtungsring angeordnete Lichteintrittsöffnungen aufweist. Bei einer ringförmigen Ausgestaltung des Beleuchtungsgürtels sollten die drei Lichteintrittsöffnungen also in einem Winkel von jeweils 120 zu der benachbarten Lichteintrittsöffnung angeordnet sein. Statt eines Beleuchtungsrings lassen sich auch andere Strukturen verwenden, wie beispielsweise quadratische Beleuchtungsgürtel, die u.U. einfacher herstellbar sind und bei denen für eine gleichmäßige Beleuchtung beispielsweise zwei oder vier Lichteintrittsöffnungen vorgesehen sein können.
Ist der Beleuchtungsgürtel als Beleuchtungsring ausgestaltet, so ist dieser in einer besonders bevorzugten Ausgestaltung auf seiner Innenseite verspiegelt. Dies kann dann mit der Dimension des Rings so abgestimmt werden, dass das einfallende Licht und das von den Spiegeln rückreflektierte Licht zusammen eine stehende Welle bilden, die eine hohe Strukturierungsfrequenz aufweist. Auf diese Weise ist eine strukturierte Beleuchtung der Probe möglich: Durch Verschiebung der Struktur in der Lichtblattebene und entsprechenden Bildaufnahmen lässt sich digital dann ein Gesamtbild mit einer höheren Auflösung als in den Einzelbildern erzeugen, im Stand der Technik bekannte Methoden verwendet werden können.
Anstelle eine Verspiegelung zu verwenden, kann man eine strukturierte Beleuchtung auch auf andere Weise erreichen, indem man nämlich einen Beleuchtungsgürtel verwendet, der eine gerade Anzahl von Lichteintrittsöffnungen aufweist, die sich jeweils paarweise mit einander entgegengesetzten Abstrahlrichtungen gegenüber liegen. Die Mittel zur Beleuchtung umfassen dann außerdem Mittel zur Erzeugung und Variation einer Phasendifferenz von Lichtwellen, die aus einander gegenüberliegenden Lichteintrittsöffnungen treten, so dass auf einfache Weise die Phase des Lichtmusters über die Probe geschoben werden kann. Durch eine Beleuchtung in zwei oder drei Richtungen kann eine solche Strukturierung in mehreren Raumrichtungen erreicht werden.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen:

1 ein erstes Ausführungsbeispiel der Erfindung
2 eine Ausgestaltung, die eine strukturierte Beleuchtung erlaubt,
3 eine Ausgestaltung der Probenkammer mit einem flexiblen Dichtungselement,
4 eine Ausführungsform, bei der die Vorrichtung am Mikroskopstativ angebracht ist,
5a) eine erste Möglichkeit zur Erzeugung eines Lichtblattes,
5b) eine zweite Möglichkeit zur Erzeugung eines Lichtblattes,
6a)-c) weitere Ausgestaltungsmöglichkeiten der Vorrichtung.

1 zeigt eine erste Ausgestaltung einer Vorrichtung zur Halterung und Beleuchtung von Proben für ein Mikroskop. Diese Vorrichtung umfasst eine Probeneinfassung 1 zur Aufnahme einer in Flüssigkeit eingebetteten Probe 2, wobei die Probeneinfassung 1 auf einem Objektträger 3 angeordnet ist und zur Verhinderung des Austretens von Flüssigkeit aus der Probeneinfassung 1 einen seitlich umlaufenden Rand 4 aufweist. Die Vorrichtung umfasst Mittel zur Beleuchtung der Probe 2 mit einem Lichtblatt, wobei die Ausbreitungsrichtung des Lichtblattes, also die Ebene, in der das Lichtblatt hauptsächlich liegt, senkrecht zu einer Detektionsrichtung liegt. In 1 korrespondiert die Ausbreitungsrichtung, also die Ebene des Lichtblattes, zu einer Ebene, die parallel zur Auflagefläche des Objektträgers 3 ist. Die Detektionsrichtung steht senkrecht zu dieser Auflagefläche. Die Vorrichtung umfasst außerdem Mittel zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen Probe 2 und Lichtblatt.
Die Mittel zur Beleuchtung der Probe 2 umfassen einen die Probeneinfassung 1 in der Ebene senkrecht zur Detektionsrichtung mindestens teilweise umschließenden Beleuchtungsgürtel 5. Der Beleuchtungsgürtel 5 weist mindestens eine Lichteintrittsöffnung 6 zur Abstrahlung von Licht in Form eines Lichtblatts in den von dem Beleuchtungsgürtel 5 umschlossenen Raum, der die Probe 2 enthält, auf. An die Lichteintrittseintrittsöffnung 6 ist ein Ende einer Lichtleitfaser 7 angekoppelt. Das andere Ende der Lichtleitfaser 7 ist mit einer nicht gezeigten Beleuchtungsquelle verbunden, welche Licht einer bestimmten, vorgegebenen Wellenlänge oder eines vorgegebenen Wellenlängenbereichs in die Lichtleitfaser 7 einspeist. Während zur Erzeugung einer lichtblattförmigen Beleuchtung grundsätzlich eine Lichteintrittsöffnung 6 ausreichend ist, so verwendet man bevorzugt jedoch einen Beleuchtungsgürtel 5, auf dem mehrere Lichteintrittsöffnungen 6 angeordnet sind, wobei diese bevorzugt gleichmäßig auf dem Beleuchtungsgürtel 5 angeordnet sind. Im in 1 gezeigten Beispiel ist der Beleuchtungsgürtel 5 als Beleuchtungsring ausgestaltet und weist drei gleichmäßig auf dem Beleuchtungsring angeordnete Lichteintrittsöffnungen 6 auf. Auf diese Weise lässt sich eine gleichförmige Beleuchtung der Probe erreichen, bei der Abschattungen durch von der Probe gestreutes Licht und Apodisierungen minimiert werden können.
Eine Abwandlung dieser Ausführung ist in 2 gezeigt, hier ist die Innenseite des Beleuchtungsgürtels 5 verspiegelt, so dass das rückreflektierte mit dem direkt einfallenden Licht eine stehende Welle - angedeutet durch die Doppelpfeile - bildet, wobei diese stehende Welle eine hohe Strukturierungsfrequenz aufweist. Alternativ kann auch statt einer Verspiegelung auf der Gegenseite von der jeweils gegenüberliegenden Seite ein weiterer Lichtleiter eingekoppelt werden. Die Mittel zur Beleuchtung umfassen dann auch Mittel zur Erzeugung und Variation einer Phasendifferenz von Lichtwellen, die aus einander gegenüberliegenden Lichteintrittsöffnungen 6 treten. Durch die Einführung einer Phasendifferenz zwischen den Lichtfeldern in zwei einander gegenüberliegenden Lichtleitfasern 7 kann auf diese Weise die Phase des Lichtmusters mit geringem Aufwand über die Probe verschoben werden, was für die Erzielung einer erhöhten Auflösung in einem kombinierten Bild auf Basis der strukturierten Beleuchtung wesentlich ist. Durch eine Beleuchtung in zwei oder drei Richtungen kann eine entsprechende Strukturierung ebenfalls in zwei oder drei Richtungen erreicht werden. Im Falle der in 2 beschriebenen Anordnung würde man anstelle einer Verspiegelung dann beispielsweise sechs Lichtleitfasern 7 verwenden, die an sechs entsprechenden Lichteintrittsöffnungen 6 an den Beleuchtungsgürtel 5 angekoppelt werden, wobei je zwei benachbarte Lichteintrittsöffnungen 6 auf einem Kreis im Abstand von 60° zueinander anordnet sind. Der Beleuchtungsgürtel 5 weist in diesem Fall eine gerade Anzahl von Lichteintrittsöffnungen 6 auf, die sich jeweils paarweise mit einander entgegengesetzten Abstrahlrichtungen gegenüberliegen.
Um eine dreidimensionale Abbildung der Probe erzielen zu können, muss die Probe relativ zum Lichtfeld in axialer Richtung, also in Richtung der Detektion bzw. senkrecht zur Ausbreitungsrichtung des Lichtblattes abgetastet werden. Falls die Phasendifferenz nicht durch an die Lichtleitfasern 7 angekoppelte Mittel zur Erzeugung und Variation dieser Phasendifferenz erzeugt wird, ist es erforderlich, die Probe in lateraler Richtung ebenfalls zu verschieben, um eine Anzahl von Aufnahmen der Probe bei mehreren Phasen der Strukturierung zu erhalten, da ansonsten kein hochauflösendes Bild berechnet werden kann. In dem in 1 gezeigten Beispiel erfolgt die Beleuchtung mittels Lichtleitfasern, die an den Beleuchtungsring angekoppelt sind, welcher gleichzeitig den Rand 4 der Probeneinfassung 1 bildet. Damit keine Flüssigkeit aus der Probeneinfassung 1 zur Seite austritt, muss die Probeneinfassung 1 gegenüber dem Objektträger 3 abgedichtet werden. Andererseits ist die Probe 2 bevorzugt adhärent mit dem Objektträger 3 verbunden, so dass sich bei einer Bewegung des Objektträgers 3 sowohl die Probeneinfassung 1 als auch die Probe 2 bewegen. Um eine axiale und/oder laterale Relativbewegung des Beleuchtungsgürtels 5 gegenüber der Probe 2 zu erreichen, ist die Probeneinfassung 1 daher bevorzugt über ein flexibles Dichtungselement 8, welches auch in 3 dargestellt ist, auf dem Objektträger 3 befestigt. Das Dichtungselement 8 ist dabei entlang der Detektionsrichtung oder in lateraler Richtung, oder auch in beiden Richtungen bis zu einem gewissen Grad flexibel. Bei einer Ausgestaltung des Beleuchtungsgürtels 5 als Beleuchtungsring lässt sich beispielsweise ein entsprechend flexibler Dichtungsring verwenden. Die Abmessung und die Elastizität des Rings ist dabei so ausgelegt, dass sich eine Relativbewegung von Beleuchtungsgürtel 5 zur Probe 2 in der Größenordnung der Probe, die hier einige Millimeter betragen kann, realisieren lässt. Die Mittel zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen Probe 2 und Lichtblatt sind dabei eine Relativbewegung zwischen Beleuchtungsgürtel 5 und Probe 2 erzeugend ausgestaltet, wobei sie Aktuatoren zum Verschieben der Probeneinfassung 1 und/oder lateraler Richtung relativ zum Objektträger 3 und der Probe 2 umfassen. Die Bewegung kann dabei mit aus dem Stand der Technik bekannten Aktuatoren in Schrittweiten im Bereich von etwa 1 µm erfolgen. Als Aktuatoren eignen sich beispielsweise piezoaktive Polymere oder auch konventionelle Keramik-Piezoversteller, die entweder am Objektträger, dem Mikroskoptisch oder dem Stativ befestigt sind.
In einer alternativen Ausgestaltung umfassen die Mittel zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen Beleuchtungsgürtel 5 und Probe 2 Mittel zur Erzeugung einer entlang der Detektionsrichtung beweglichen Lichtfalle. Die Probe wird dann in der Lichtfalle gehalten und bewegt. Das Licht, welches verwendet wird, um die Lichtfalle zu erzeugen, liegt bevorzugt im Wellenlängenbereich des nahen Infrarot, um keine Fluoreszenz in der Probe zu erzeugen und um nicht im Detektionsbereich der Kamera zu liegen.
Eine weitere Ausgestaltung der Vorrichtung ist in 4 dargestellt. Hier ist der Beleuchtungsgürtel 5 über Befestigungsmittel am Stativ 9 des Mikroskops befestigt. Die Befestigungsmittel können beispielsweise eine Stange 10 umfassen. Der Objektträger 3 mit darauf angeordneter Probeneinfassung 1 ist hier auf einem Tisch 11 angeordnet, welcher relativ zu dem am Stativ 9 befestigten Beleuchtungsgürtel 5 bewegt wird. Der Beleuchtungsgürtel 5 hat hier einen wesentlichen größeren Umfang als die Probeneinfassung 1, die Beleuchtung der Probe erfolgt also hier mittels Freistrahlen, die über den transparenten Rand 4 der Probenkammer in die Flüssigkeit eintreten. Aufgrund der verschiedenen Durchmesser von Beleuchtungsgürtel 5 und der Probeneinfassung 1 sowie aufgrund einer fehlenden mechanischen Kopplung zwischen Beleuchtungsgürtel 5 und Objektträger 3 ist eine Relativbewegung zwischen Probe 2 und dem Lichtblatt durch horizontale und / oder vertikale Verstellung des Tisches 11 möglich. Alternativ ist auch eine Ausgestaltung denkbar, in welcher der Tisch 11 fest bleibt und der Beleuchtungsring 5 relativ zur Probe 2 bewegt wird.
In 5 sind zwei Möglichkeiten dargestellt, wie mit Hilfe von Lichtleitfasern 7 eine lichtblattartige Beleuchtung erzeugt werden kann. Für die lichtblattartige Beleuchtung ist es notwendig, dass das Strahlprofil in Richtung parallel zur Detektionsachse auf eine Dicke von etwa 1 µm fokussiert ist, in der dazu orthogonalen Richtung jedoch annähernd kollimiert ist. Eine erste Möglichkeit zur Erzeugung eines solchen Beleuchtungsprofils ist in 5a gezeigt. Die Lichtleitfaser 7 weist hier einen speziell geformten Kern mit elliptischem Querschnitt, wobei die Hauptachse der Ellipse senkrecht zur Detektionsrichtung steht. Damit lässt sich das stark elliptische Modenprofil, welches in 5a gestrichelt gezeichnet ist, erzeugen, wenn die Faser außerdem eine niedrige numerische Apertur aufweist. Dieses Ende der Lichtleitfaser 7 kann dann direkt in die mindestens eine Lichteintrittsöffnung 6 des Beleuchtungsgürtel 5 eingesetzt und dort beispielsweise verklebt werden.
Eine andere, in 5b) gezeigte Möglichkeit zur Erzeugung des entsprechenden Strahlprofils besteht darin, in die mindestens eine Lichteintrittsöffnung 6 ein Ende einer Lichtleitfaser 7 mit einem vorgeschalteten Kollimator 13 in Kombination mit einer Zylinderlinse 14 einzusetzen. Hier lassen sich dann konventionelle Lichtleitfasern 7 mit rundem Kernquerschnitt verwenden.
Die Form des Beleuchtungsgürtels 5 ist dabei nicht auf die Ringform beschränkt, auch andere Formen, wie sie in den 6a) bis 6c) gezeigt sind, lassen sich verwenden, wenn auf eine strukturierte Beleuchtung verzichtet werden kann.
Die vorangehend beschriebene Vorrichtung lässt sich ohne großen Aufwand in konventionelle, aufrechte oder inverse Mikroskope integrieren und bildet eine relativ kostengünstige und unkomplizierte Nachrüstmöglichkeit, um auch mit solchen Mikroskopsystemen Untersuchungen nach dem SPIM-Verfahren vorzunehmen.
Bezugszeichenliste

1: Probeneinfassung
2: Probe
3: Objektträger
4: Rand
5: Beleuchtungsgürtel
6: Lichteintrittsöffnung
7: Lichtleitfaser
8: Dichtungselement
9: Stativ
10: Stange
11: Tisch
12: elliptischer Kern
13: Kollimator
14: Zylinderlinse

Claims

Vorrichtung zur Halterung und Beleuchtung von Proben (2) für ein Mikroskop, umfassend - eine Probeneinfassung (1) zur Aufnahme einer in Flüssigkeit eingebetteten Probe (2), wobei die Probeneinfassung (1) auf einem Objektträger (3) angeordnet ist und zur Verhinderung des Austretens von Flüssigkeit aus der Probeneinfassung (1) einen seitlich umlaufenden Rand (4) aufweist, - Mittel zur Beleuchtung der Probe (2) mit einem Lichtblatt mit einer senkrecht zu einer Detektionsrichtung orientierten Ausbreitungsrichtung, - Mittel zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen Probe (2) und Lichtblatt, dadurch gekennzeichnet, dass - die Mittel zur Beleuchtung der Probe (2) einen die Probeneinfassung (1) in der Ebene senkrecht zur Detektionsrichtung mindestens teilweise umschließenden Beleuchtungsgürtel (5) umfassen, - der Beleuchtungsgürtel (5) mindestens eine Lichteintrittsöffnung (6) zur Abstrahlung von Licht in Form eines Lichtblatts entlang einer Abstrahlrichtung in den von dem Beleuchtungsgürtel (5) umschlossenen Raum hinein aufweist, wobei an die Lichteintrittsöffnung (6) ein Ende einer Lichtleitfaser (7) angekoppelt ist, und - die Mittel zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen Probe (2) und Lichtblatt eine Relativbewegung zwischen Beleuchtungsgürtel (5) und Probe (2) erzeugend ausgestaltet sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in die mindestens eine Lichteintrittsöffnung (6) ein Ende einer Lichtleitfaser (7) mit elliptischem Kern (12) eingesetzt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in die mindestens eine Lichteintrittsöffnung (6) ein Ende einer Lichtleitfaser (7) mit einem vorgeschalteten Kollimator (13) in Kombination mit einer Zylinderlinse (14) eingesetzt ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Beleuchtungsgürtel (5) über Befestigungsmittel an einem Stativ (9) des Mikroskops befestigt ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Beleuchtungsgürtel (5) den Rand (4) der Probeneinfassung (1) bildet.
Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Probeneinfassung (1) über ein flexibles Dichtungselement (8) auf dem Objektträger (3) befestigt ist und die Mittel zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen Beleuchtungsgürtel (5) und Probe (2) Aktuatoren zum Verschieben der Probeneinfassung (1) in vertikaler und / oder lateraler Richtung relativ zum Objektträger (3) und zur Probe (2) umfassen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen Beleuchtungsgürtel (5) und Probe (2) Mittel zur Erzeugung einer entlang der Detektionsrichtung beweglichen Lichtfalle umfassen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Beleuchtungsgürtel (5) als Beleuchtungsring ausgestaltet ist und mindestens drei gleichmäßig auf dem Beleuchtungsring angeordnete Lichteintrittsöffnungen (6) aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Innenseite des Beleuchtungsrings verspiegelt ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, - dass der Beleuchtungsgürtel (5) eine gerade Anzahl von Lichteintrittsöffnungen (6) aufweist, die sich jeweils paarweise mit einander entgegengesetzten Abstrahlrichtungen gegenüberliegen, und - dass die Mittel zur Beleuchtung Mittel zur Erzeugung und Variation einer Phasendifferenz von Lichtwellen, die aus einander gegenüberliegenden Lichteintrittsöffnungen (6) treten, umfassen.