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Die Erfindung bezieht sich auf die Lumineszenzmikroskopie und insbesondere auf die auflösungsgesteigerte Lumineszenzmikroskopie.
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Ein klassisches Anwendungsgebiet der Lichtmikroskopie zur Untersuchung von biologischen Präparaten ist die Lumineszenzmikroskopie. Lumineszenz wird hier, wie allgemein üblich, als Oberbegriff für Phosphoreszenz und Fluoreszenz verstanden, erfaßt also beide Prozesse. Da in der Mikroskopie überwiegend Fluoreszenz zur Anwendung kommt, wird in dieser Beschreibung oft der Begriff Fluoreszenz verwendet, ist aber, soweit technisch sinnvoll, nur als Beispiel für allgemein Lumineszenz ausnützende Vorgänge gemeint.
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In der Lumineszenzmikroskopie werden bestimmte Lumineszenz-Farbstoffe (sogenannte Phosphore oder Fluorophore) zur spezifischen Markierung von Proben, z. B. von Zellteilen, eingesetzt. Auch kann man Proben vermessen, die per se, also ohne Markierungsstoffzugabe lumineszieren. Die Probe wird mit Strahlung zur Lumineszenz angeregt (durch sog. Anregungsstrahlung) und das angeregte Lumineszenzlicht mit geeigneten Detektoren erfaßt. Üblicherweise ist dazu im Lichtmikroskop ein dichroitischer Strahlteiler in Kombination mit Blockfiltern vorgesehen, die die Lumineszenzstrahlung von der Anregungsstrahlung abspalten und eine getrennte Beobachtung ermöglichen. Durch dieses Vorgehen ist die Darstellung einzelner, verschieden gefärbter Zellteile im Lichtmikroskop möglich. Natürlich können auch mehrere Teile eines Präparates gleichzeitig mit verschiedenen, sich spezifisch an unterschiedliche Strukturen des Präparates anlagernden Farbstoffen eingefärbt werden. Dieses Verfahren bezeichnet man als Mehrfachlumineszenz.
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Für die Auflösung in der klassischen Lichtmikroskopie ist die Wellenlänge der verwendeten Strahlung eine bestimmende Größe, da nach Ernst Abbe im Rahmen einer Abbildung die verwendete Wellenlänge (zusammen mit der numerischen Apertur der abbildenden Optik) die Beugungsgrenze und damit die Auflösung vorgibt.
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Für Auflösungen jenseits der Beugungsgrenze wurden in der letzten Zeit verschiedene Ansätze entwickelt. Diese Mikroskopieverfahren zeichnen sich dadurch aus, daß sie im Vergleich zum klassischen Mikroskop dem Anwender eine höhere laterale und/oder axiale optische Auflösung zur Verfügung stellen. In dieser Beschreibung wird ein Mikroskop als hochauflösend bezeichnet, wenn es eine Auflösung jenseits der optischen Beugungsgrenze erreicht. Beugungsbegrenzte Mikroskope werden hingegen als klassische Mikroskope bezeichnet. Sie realisieren bekannte optische Weitfeldmikroskopie oder Laser-Scanning-Mikroskopie.
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Im Rahmen der Lumineszenzmikroskopie versuchen verschiedene hochauflösende Verfahren dafür zu sorgen, daß möglichst nur ein Volumen luminesziert, das geringer ist, als ein durch die Beugungsgrenze vorgegebenes Mindestvolumen. Kennt man das Ausmaß der Volumenreduzierung, z. B. aufgrund der optischen Parameter der Einstrahlung, weiß man, daß aufgenommene Fluoreszenzstrahlung unabhängig von ihrer beugungsbedingten Verbreiterung bei der Detektion, aus einem unter die Beugungsgrenze reduzierten Volumen stammt, und kann so ein hoch aufgelöstes Bild erzeugen.
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Dieses Verfahren wird beispielsweise in der
DE 10 2006 009 833 A1 verwendet, welches die sogenannte Reversible Saturable Optical Fluorescence Transition (RESOLFT) verwendet. Dieses Mikroskopieverfahren nutzt einen Markierungsstoff aus, der mit Hilfe eines Umschaltstrahls wiederholt aus einem ersten Zustand, in dem der Markierungsstoff zur Fluoreszenz anregbar ist, in einen zweiten Zustand überführbar ist, in dem keine Fluoreszenz erzeugt werden kann. Den Zustand, in dem die Markierungssubstanz zur Fluoreszenz anregbar ist, bezeichnet die genannte Druckschrift als „fluoreszierenden Zustand A”. Natürlich tritt in diesem ersten Zustand Fluoreszenz nur dann auf, wenn die Probe mit Anregungsstrahlung beleuchtet ist, d. h. per se fluoresziert die Probe nicht, ist aber dazu anregbar. In dieser Beschreibung wird deshalb zur klareren Unterscheidung von einem zur Fluoreszenz anregbaren Zustand gesprochen.
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1 der genannten
DE 10 2006 009 833 A1 zeigt in drei Teilfiguren a)–c) die drei wesentlichen Teilschritte des dort beschriebenen Mikroskopiekonzeptes. Zuerst wird die Probe mit Umschaltstrahlung bestrahlt, so daß die Probe in den fluoreszenzanregbaren Zustand A gelangt. Die Beleuchtung erfolgt dabei im Weitfeld (vgl.
1a der genannten Druckschrift). Anschließend wird die Probe mit einem Stehwellenfeld beleuchtet, das dafür sorgt, daß nur Teilbereiche der Probe im fluoreszenzfähigen Zustand A bleiben (vgl.
1b der genannten Druckschrift). Durch das Stehwellenfeld, welches durch ein Interferenzmuster erzeugt wird, erreicht dieses Konzept, daß die im fluoreszenzfähigen Zustand A verbliebenen Probenteile kleiner sind, als die Beugungsgrenze der optischen Abbildung eigentlich zuläßt. Die beiden ersten Schritte stellen also eine Probenpräparation dar, welche die Probe so vorbereitet, daß nur Teilvolumina der Probe in einem fluoreszenzfähigen Zustand A sind, wobei diese Teilbereiche aufgrund des Stehwellenfeldes für sich kleiner sind, als die beugungsbegrenzte Auflösung der optischen Abbildung eigentlich erlaubt. In einem letzten Schritt wird dann die derart präparierte Probe zur Fluoreszenz angeregt. Aufgrund der vorherigen Probenpräparation können dann nur diejenigen Teile der Probe Fluoreszenzstrahlung abgeben, die im Zustand A verblieben sind. Die
DE 10 2006 009 833 A1 bezeichnet die Anregung der präparierten Probe zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung als „Auslesen der Fluoreszenz”. Für dieses Auslesen, d. h. für die Anregung der Fluoreszenz kann gemäß
DE 10 2006 009 833 A1 auch das bekannte TIRF-Konzept zur Anwendung kommen, bei dem die Fluoreszenz des Präparates über ein evaneszentes Feld angeregt wird, indem die Anregungsstrahlung unterhalb des Totalreflexionswinkels an die Grenze von Deckglas und Probe eingestrahlt werden. Dieses dem Fachmann bekannte Prinzip ist beispielsweise in der Veröffentlichung
Thompson NL et al., „Measuring Surface Dynamics of Biomolecules by Total Internal Reflexion Fluorescence with Photobleaching Recovery or Correlation Spectroscopy", Biophys J., 33, Nr. 3, 1981, S. 435–454, beschrieben.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mikroskop bzw. ein Verfahren zur Lumineszenzmikroskopie anzugeben, das über die optische Beugungsgrenze hinaus gesteigerte Auflösung ermöglicht.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst mit einem Lumineszenzmikroskopie-Verfahren, das umfaßt: es wird eine Probe verwendet, die eine bestimmte Substanz aufweist, oder die Probe wird mit dieser bestimmten Substanz versehen, wobei die bestimmte Substanz wiederholt von einem ersten Zustand, in dem sie zur Abgabe von Lumineszenzstrahlung durch Licht einer bestimmten Wellenlänge anregbar ist, in einen zweiten Zustand überführbar ist, in dem sie nicht zur Abgabe von Lumineszenzstrahlung durch Licht einer bestimmten Wellenlänge anregbar ist, die in der Probe vorhandene bestimmte Substanz wird durch Einstrahlung von Schaltstrahlung in den ersten Zustand gebracht, die in der Probe vorhandene bestimmte Substanz wird durch Einstrahlung von Anregungsstrahlung zur Abgabe von Lumineszenzstrahlung angeregt und die Lumineszenzstrahlung abgebende Probe wird abgebildet, wobei eine hochaufgelöste Selektion von sich senkrecht zu einer Probenoberfläche erstreckenden Probenbereichen erfolgt, indem entweder die Schaltstrahlung oder die Anregungsstrahlung als strukturierte Beleuchtung der Probe eingestrahlt wird, und wobei eine hochaufgelöste Selektion der Probenoberfläche erfolgt, indem die Schaltstrahlung und/oder die Anregungsstrahlung als TIRF-Beleuchtung der Probe eingestrahlt wird.
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Die Aufgabe wird weiter gelöst mit einem Mikroskop zur Lumineszenzmikroskopie einer Probe, die eine bestimmte Substanz aufweist oder mit dieser bestimmten Substanz versehen ist, wobei die bestimmte Substanz wiederholt von einem ersten Zustand, in dem sie zur Abgabe von Lumineszenzstrahlung anregbar ist, in einen zweiten Zustand überführbar ist, in dem sie nicht zur Abgabe von Lumineszenzstrahlung anregbar ist, wobei das Mikroskop aufweist: Eine Strahlungsquelle und einen Strahlengang zum Einstrahlen von Schaltstrahlung auf die Probe, um die in der Probe vorhandene bestimmte Substanz in den ersten Zustand zu bringen, eine Anregungsstrahlungsquelle und einen Anregungsstrahlengang zum Einstrahlen von Anregungsstrahlung auf die Probe, um in der Probe die Abgabe von Lumineszenzstrahlung anzuregen und die in der Probe vorhandene bestimmte Substanz in den zweiten Zustand zu bringen, und einen Detektor und einen Detektionsstrahlengang zur Abbildung der Lumineszenzstrahlung abgebenden Probe, wobei zur hochaufgelösten Selektion von sich senkrecht zu einer Probenoberfläche erstreckenden Probenbereichen der Schaltstrahlengang zum Einstrahlen der Schaltstrahlung und/oder der Anregungsstrahlengang zum Einstrahlen der Anregungsstrahlung eine strukturierte Beleuchtung der Probe bewirken, und wobei zur hochaufgelösten Selektion der Probenoberfläche entweder der Schaltstrahlengang zum Einstrahlen der Schaltstrahlung oder der Anregungsstrahlengang zum Einstrahlen der Anregungsstrahlung eine TIRF-Beleuchtung der Probe bewirken.
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Das erfindungsgemäße Konzept schaltet also die Probe in einem ersten Schaltprozeß in einen lumineszenzfähigen Zustand. In einem zweiten Schaltprozeß wird die Probe zur Lumineszenz angeregt und dann dadurch in einen nicht lumineszenzfähigen Zustand überführt. In einem optionalen dritten Schaltprozeß wird die Probe wieder in den lumineszenzfähigen Zustand gebracht. Die Erfindung sieht nun vor, daß ein oder beide Schaltprozesse eine TIRF-Beleuchtung sind, und daß genau einer der beiden Schaltprozesse mit einer strukturierten Beleuchtung, also mit einer strukturierten Weitfeld- oder einer strukturierten TIRF-Beleuchtung ausgeführt wird. Damit ergeben sich folgende Möglichkeiten:
| Variante | Schaltprozeß 1 | Schaltprozeß 2 |
| 1 | strukturiert TIRF | Weitfeld |
| 2 | strukturiert TIRF | TIRF |
| 3 | TIRF | strukturiert Weitfeld |
| 4 | TIRF | strukturiert TIRF |
| 5 | Weitfeld | strukturiert TIRF |
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Die Erfindung sieht also eine Selektion von Probenbereichen, die sich längs der optischen Achse erstrecken durch eine strukturierte Beleuchtung vor, die entweder beim Schaltprozeß 1 oder beim Schaltprozeß 2 zur Anwendung kommt. Eine separate aufwendige Probenpräparation ist damit nicht mehr erforderlich. Das Mikroskopieverfahren kann damit schneller ausgeführt werden, was insbesondere bei der Beobachtung biologischer Prozesse von Vorteil ist. Auch vereinfacht sich das entsprechende Mikroskop, da ein separates Beleuchtungsfeld zur Probenpräparation nicht mehr erzeugt werden muß.
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Die Selektion senkrecht zur Probenoberfläche erfolgt üblicherweise durch ein in die Probe angebildetes Beugungsmuster. Die Breite der sich senkrecht zur Probenoberfläche erstreckten Bereiche, die dadurch selektiert werden, ist dann beugungsbegrenzt. Durch die erwähnten Nichtlinearitäten ergibt sich eine Schärfung über die Beugungsgrenze hinaus. Orthogonal dazu erfolgt eine Selektion der Probenoberfläche durch die Einstrahlung eines evaneszenten Feldes beim Schaltprozeß 1 und/oder beim Schaltprozeß 2. Die orthogonalen Selektionen durch die strukturierte Beleuchtung und das evaneszente Feld, das in dieser Beschreibung als TIRF-Beleuchtung bezeichnet wird, selektiert insgesamt ein Probenvolumen, das sowohl längs der optischen Achse der Abbildung der Probe als auch quer dazu kleiner sein kann, als die Beugungsgrenze es erlaubt. Damit ist eine Hochauflösung in zwei Raumrichtungen erreicht.
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Ein weiterer Schaltprozeß 3 ist erforderlich, wenn die Probe nicht von selbst nach Abgabe der Fluoreszenzstrahlung in den fluoreszenzfähigen Zustand zurückkehrt. Allerdings können die Schaltprozesse 1 und 3 zusammenfallen, wie noch erläutert werden wird. Die für diese Schaltprozesse erforderliche Strahlung wird deshalb hier als „Schaltstrahlung” bezeichnet.
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Die Hochauflösung wird durch die TIRF-Beleuchtung verbessert. Diese selektiert die Probenoberfläche durch die Beleuchtung mit einem evaneszenten Feld. Die strukturierte Beleuchtung steigert die Auflösung durch selektive Anregung senkrecht zur Probenoberfläche. Die Erfindung setzt Selektionsmechanismen ein, die orthogonal wirkend und sich dadurch optimal ergänzen.
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Das hochauflösende Mikroskopieverfahren der Erfindung kann vorteilhafterweise mit dem aus der
EP 1157297 B1 bekannten Prinzip kombiniert werden. Dabei werden mittels strukturierter Beleuchtung nichtlineare Prozesse ausgenützt. Als Nichtlinearität dient die Sättigung der Fluoreszenz durch die strukturierte Beleuchtung in Schaltprozeß 1 oder 2. Dadurch erfolgt eine Verschiebung des Objektraumspektrums relativ zur Übertragungsfunktion des optischen Systems. Konkret bedeutet die Verschiebung des Spektrums, daß Objektraumfrequenzen ω
0 bei einer Raumfrequenz ω
0 ± ω
g, wobei ω
g die Frequenz der strukturierten Beleuchtung ist, übertragen werden. Bei gegebener, durch das System maximal übertragbarer Raumfrequenz ermöglicht dies den Transfer von um die Verschiebefrequenz ω
g über der maximalen Frequenz der Übertragungsfunktion liegender Raumfrequenzen des Objektes. Dieser Ansatz erfordert einen Rekonstruktionsalgorithmus zur Bilderzeugung und die Verwertung mehrerer Aufnahmen für ein Bild. Die bezüglich der entsprechenden Beschreibung des auflösenden Mikroskopieverfahrens ebenfalls voll einbezogene
EP 1157297 B1 verwendet also eine strukturierte Weitfeldbeleuchtung der Probe, wobei, beispielsweise durch ein Amplituden/Phasen-Gitter, eine streifenförmige Modulation aufgeprägt wird. Fluoreszenz in der Probe wird ebenfalls weitfelddetektiert. Die Modulation wird nun in mindestens drei verschiedene Drehlagen gebracht, z. B. 0°, 120° und 240°, und in jeder Drehlage wird die Modulation lateral in mind. drei verschiedene Positionen verschoben. In jeder Verschiebung der Drehlagen (insgesamt also mind. 9 Bildpositionen) wird die Probe weitfelddetektiert. Weiter hat das Gitter Frequenzen möglichst nahe der Grenzfrequenz, zu deren Übertragung die verwendete optische Anordnung in der Lage ist. Unter Verwendung einer Fourieranalyse erfolgt dann die erwähnte Spektrumverschiebung, wobei insbesondere die 0. und +/–1. Beugungsordnung in den Bildern ausgewertet wird. Dieses Mikroskopieprinzip wird auch als SIM-Verfahren (structured illumination microscopy) bezeichnet.
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Eine Weiterbildung des SIM-Verfahrens kann mit einer linienförmigen Beleuchtung erreicht werden, die senkrecht zur Streifenrichtung der Modulation liegt. Man hat dann eine Linienbeleuchtung, wobei längs der Linie sich die Streifenstruktur wiederfindet. Die linienförmige Beleuchtung ist ihrerseits durch die Modulation strukturiert. Die linienförmige Beleuchtung erlaubt eine konfokale Schlitzdetektion und damit nochmals eine Auflösungssteigerung. Dieses Prinzip wird auch als SLIM (structured line illumination microscopy) bezeichnet.
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Eine nochmalige Steigerung der Auflösung erhält man, wenn die Beleuchtungsstrahlungsmodulation an Beleuchtungsstrahlung ausgeführt wird, die derart intensiv ist, daß die Fluoreszenz der Probe in den hellen Bereich der strukturierten Beleuchtung eine Sättigung erreicht. Dann hat die Modulation auf der Probe bezüglich der Fluoreszenz keine Sinusverteilung mehr, sondern aufgrund der Sättigungseffekte noch höhere Harmonische jenseits der optischen Grenzfrequenz. Dieses Verfahren wird auch als saturated pattern excitation microscopy (SPEM) bezeichnet. Bei schaltbaren Lumineszenz-Farbstoffen, wie sie für die erfindungsgemäße Mikroskopie zur Anwendung kommen, kann diese Sättigung bei sehr viel geringeren Leistungen und reversibel erreicht werden als bei konventionellen Farbstoffen. Diese drei Varianten einer Mikroskopie, die mittels einer strukturierten Beleuchtung hochauflösend ist, können als Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. des erfindungsgemäßen Mikroskops realisiert werden.
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In dieser Weiterbildung ist es bevorzugt, die Einstrahlung der Umschaltstrahlung und die Einstrahlung der Anregungsstrahlung unter Verschiebung und/oder Drehung und/oder Veränderung der Struktur der strukturierten Beleuchtung zu wiederholen und die bei der Wiederholung erhaltenen Bilder dann zu einem hochaufgelösten Bild zusammenzufassen. Das Mikroskop sieht dazu Mittel zum Verschieben und/oder Drehen der Struktur der strukturierten Beleuchtung relativ zur Probe vor.
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In einer besonders einfach zu realisierenden Ausführung wird die fluoreszierende Probe in einer Weitfelddetektion erfaßt.
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Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
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Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen:
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1 ein Termschema einer Substanz, bzw. eines Probenbestandteils, die bzw. der für die Ausführung der Erfindung geeignet ist,
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2 den Effekt eines sinusförmig modulierten Beleuchtungsfeldes im Orts- sowie Frequenz-Raum,
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3 eine Schemadarstellung eines Mikroskops zur hochauflösenden Lumineszenzmikroskopie gemäß einer ersten Ausführungsform,
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4 eine Schemadarstellung eines Mikroskops zur hochauflösenden Lumineszenzmikroskopie gemäß einer zweiten Ausführungsform und
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5 eine Schemadarstellung eines Mikroskops zur hochauflösenden Lumineszenzmikroskopie gemäß einer dritten Ausführungsform.
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1 zeigt das Termschema eine Substanz, die in einer Probe vorgesehen oder dort vorhanden sein kann und deren Lumineszenz-, im konkreten Fall Fluoreszenz-Eigenschaften für die Mikroskopie ausgenutzt werden. Ein Beispiel für eine solche Substanz, die als Farbstoff bezeichnet wird, ist die Substanz DRONPA, die in der
DE 10 2005 034 443 A1 erwähnt und hinsichtlich ihrer Fluoreszenz-Eigenschaften beschrieben ist (dort auch mit weiteren Nachweisen). Ausgehend von einem Grundzustand 0 wird die Probe durch einen Umschaltvorgang, in dem Umschaltstrahlung
1 eingestrahlt wird, in einen Zustand A geschaltet, in dem sie fluoreszenzanregbar ist. Dies stellt eine Phase (1) dar. Im Zustand A kann durch Anregungsstrahlung
2 ein angeregter Zustand A* erreicht werden. Dies stellt eine Phase (2) dar.
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Aus dem anregten Zustand A* relaxiert die Probe unter Abgabe von Fluoreszenzstrahlung 3 in einen Zustand B, in dem keine Anregung zur Fluoreszenz möglich ist. Durch Einstrahlung von Rücksetzstrahlung 4 gelangt die Probe dann in einer Phase (3) über einen Zwischenstatus wieder in den Grundzustand O mittels einer Rücksetzrelaxation 5.
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Die Termstruktur der 1 ist nur exemplarisch zu verstehen. Die Erfindung ist auch mit Substanzen möglich, die beispielsweise nur die Grundzustände A und B aufweisen, so daß die Phasen (1) und (3) identisch sind. Die Probe gelangt dann durch Einstrahlung der Rücksetzstrahlung 4 vom Zustand B direkt in den Zustand A, aus dem sie zur Abgabe der Fluoreszenzstrahlung 3 anregbar ist. Die Abgabe der Fluoreszenzstrahlung 3 bringt die Probe dann wieder in den Zustand B.
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Zur auflösungsgesteigerten Mikroskopie wird nun entweder die Anregungsstrahlung 2 oder die Umschaltstrahlung 1 (bzw. die Rücksetzstrahlung 4 bei Systemen, in denen die Phasen (1) und (3) identisch sind) mit einer strukturierten Beleuchtung durchgeführt. In der linken Teilfigur der 2 ist dies durch ein moduliertes Anregungsfeld 6 verdeutlicht, das exemplarisch in seiner Intensität über der x-Achse aufgetragen ist. Damit tragen jene Bereiche, in denen keine Fluoreszenz beim Übergang von A* nach B erzeugt wird, nicht zur Aufnahme der Fluoreszenzstrahlung, die z. B. in einem Weitfeldbild erfolgt, bei. Das entsprechende Fluoreszenzstrahlungsfeld 7 ist in 2 eingetragen. Es ist deutlich zu sehen, daß es an den Nullstellen des Anregungsfeldes 6 ebenfalls Nullstellen aufweist. Aufgrund einer Nichtlinearität, wie sie z. B. durch Sättigung der Fluoreszenz durch den Schaltprozess entsteht, sind die Nullstellen des Fluoreszenzstrahlungsfeldes 7 schmaler, als die Nullstellen des modulierten Anregungsfeldes 6. Erzeugt man dieses beispielsweise durch ein Differenzmuster, erhält man im Fluoreszenzstrahlungsfeld 7 Nullstellen, die schmaler sind, als es die optische Auflösung eigentlich erlaubt. Die Steilheit des Übergangs von hell nach dunkel bestimmt dabei, welche Modulationsfrequenzen höherer Ordnung im Fourier-transformierten Bild, das im rechten Teilbild der 2 dargestellt ist, sichtbar sind. Unter höheren Ordnungen wird dabei die zweite sowie noch höhere Ordnungen verstanden. Wie das rechte Teilbild der 2 zeigt, welches die Intensität I im Ortsfrequenz-(K-)Raum in einer Dimension, nämlich entlang der Kx-Achse darstellt, ist die Breite der effektiven optischen Transferfunktion 9 (hier schematisch veranschaulicht) durch die höheren Modulationsfrequenzen, welche durch die Stützstellen 8 gegeben sind, gesteigert. Mit der Breite der Transferfunktion wachst auch die potentielle optische Auflösung der Abbildung.
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Für diesen auflösungssteigernden Effekt ist es natürlich nicht zwingend erforderlich, das strukturierte Feld in Form eines Anregungsfeldes 6 aufzubringen. Natürlich kann das strukturierte Feld auch für die Strahlung eingesetzt werden, welche die Probe in den fluoreszenzanregbaren Zustand A bringt. Dies kann je nach Termschema der verwendeten Substanz entweder die Umschaltstrahlung 1 oder die Rücksetzstrahlung 4 sein. In dieser Beschreibung wird allerdings der Einfachheit halber davon ausgegangen, daß die Anregungsstrahlung 2 moduliert ist.
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Ein entsprechendes Mikroskop 10 zeigt die 3 in schematischer Darstellung. Das Mikroskop umfaßt einen Schaltstrahlengang 11, welcher den Umschaltvorgang (oder die Rücksetzeinleitung 4) durch Einstrahlung von optischer Schaltstrahlung als TIRF-Beleuchtung bewirkt. Weiter weist das Mikroskop einen Anregungsstrahlengang 12 auf, der das modulierte Anregungsfeld 6 auf eine Probe P einstrahlt. Auch diese Einstrahlung erfolgt in TIRF-Beleuchtung. Schließlich weist das Mikroskop auch einen Detektionsstrahlengang 13 auf, welcher die von der Probe P ausgehende Fluoreszenzstrahlung in einer Weitfelddetektion erfaßt.
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Die drei Strahlengänge 11, 12, 13 sind über entsprechende Strahlteiler auf die Probe P eingekoppelt. Die Probe P befindet sich auf einem Deckglas 14, welches auf einem Probentisch 15 liegt, so daß die Probe P gegenüber dem Strahlengang des Mikroskops verschoben werden kann. Die Probe P wird mit einem Objektiv 16 erfaßt, das eine optische Achse 17 aufweist. Längs dieser optischen Achse 17 sind Strahlteiler 18 und 19 angeordnet, welche den Schaltstrahlengang 11 (Strahlteiler 18) bzw. den Anregungsstrahlengang 12 (Strahlteiler 19) einspiegeln. Der Schaltstrahlengang 11 umfaßt eine Schaltbeleuchtungseinheit 20, welche durch eine Optik 21 die Strahlung für den Umschaltvorgang 1 (oder die Rücksetzeinleitung 4) einstrahlt. Die Strahlung aus dem Schaltstrahlengang 11 wird dabei entlang einer optischen Achse 17t parallel versetzt zur optischen Achse 17 des Objektivs 16 eingekoppelt, so daß die Strahlung schräg auf die Probe P einfällt. Der Einfallswinkel ist dabei über den Abstand zwischen der optischen Achse 17t und der optischen Achse 17 so gewählt, daß eine Totalreflexion am Deckglas stattfindet, wodurch die Probe P mit einem evaneszenten Feld beleuchtet wird, wie dies aus der TIRF-Mikroskopie dem Fachmann bekannt ist.
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Zur Einstellung des Abstandes zwischen der optischen Achse 17t und der optischen Achse 17 umfaßt der Schaltstrahlengang 11 eine Verschiebemechanik 22, die in 3 lediglich durch einen Doppelpfeil, d. h. durch ihre Funktion, symbolisiert ist. Die Verschiebemechanik 22 erlaubt es, die Schaltbeleuchtungseinheit 20 so zu verschieben, daß die optische Achse 23, entlang der die Strahlung aus der Schaltbeleuchtungseinheit 20 ausfällt, gegenüber der optischen Achse 24 der Optik 21 parallel wandert. Der Parallelversatz zwischen den optischen Achsen 23 und 24 entspricht unter der Berücksichtigung der Schrägstellung des Strahlteilers 18 dem Parallelversatz zwischen den optischen Achsen 17t und 17 und stellt damit den Einfallswinkel der Strahlung auf die Probe ein. Die Verschiebemechanik 22 ermöglicht es damit auf einfache Art und Weise, die TIRF-Bedingung einzustellen.
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Die Schaltbeleuchtungseinheit 20 erzeugt die Strahlung für den Umschaltvorgang 1 (oder für die Rücksetzeinleitung 4) mittels eines Lasers 24, dem ein Kollimator 25 sowie eine Blende 26 nachgeordnet sind. So ist ein paralleles Strahlenbündel bewirkt, das dann von der Optik 21 auf das Objektiv 16 hin gebündelt wird.
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Der Anregungsstrahlengang 12 ist auf ähnliche Weise aufgebaut. Die Anregungsstrahlung wird von einem Laser 28 bereitgestellt, dem ein Kollimator 29 folgt. Im parallelen Strahlenbündel nach dem Kollimator 29 befindet sich ein Mustergenerator 30, dessen Muster nachfolgend in die Probe abgebildet wird. Der Mustergenerator 30 liegt also in einer Zwischenbildebene der Abbildung. Die Abbildung erfolgt dabei divergierend zur optischen Achse 32, so daß die Anregungsstrahlung nicht längs der optischen Achse 17 einfällt, sondern auf zwei seitlich versetzt dazu liegenden Achsen 33a, 33b. Mit Hilfe einer nachfolgenden Optik 31 ist somit insgesamt eine TIRF-Beleuchtung der Probe P bewirkt, die das Muster des Mustergenerators 30 in die Probe abbildet und dort Fluoreszenz anregt.
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Die derart zur Fluoreszenz gebrachte Probe P wird im Detektionsstrahlengang 13 über eine Optik 34 auf einen Flächendetektor 35 abgebildet. Zur Ausblendung von Strahlung aus der Schaltbeleuchtungseinheit bzw. von Anregungsstrahlung ist dabei im Detektionsstrahlengang ein Filter 36 vorgesehen, das diese Strahlungsanteile abblockt.
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Durch den Mustergenerator
30 (z. B. eine Amplituden- und/oder Phasenmaske) wird beispielsweise ein streifenförmiges Muster in der Probe erzeugt. Indem dieses Muster unter verschiedenen Winkeln und in verschiedenen Lateralpositionen auf die Probe angewandt wird, z. B. durch entsprechende Ansteuerung des Probentisches
15 oder durch Drehung/Verschiebung des Musters im Mustergenerator
30, kann unter Verwendung mathematischer Rekonstruktionsalgorithmen, wie sie beispielsweise aus der
EP 1157297 B1 für das SIM-Verfahren bekannt sind, ein zweidimensionales, hochaufgelöstes Bild erzeugt werden.
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Je nach benötigter Strahlungsleistung kann bei der Bildaufnahme ein Teil des Bildfeldes oder das gesamte Bildfeld beleuchtet werden. Dies kann über ein (nicht dargestelltes) Zoom-System im Anregungsstrahlengang 12 oder im Schaltstrahlengang 11 realisiert werden.
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4 zeigt eine weitere Bauweise eines Mikroskops 10, das in vielen Elementen dem der 3 entspricht. Insoweit sind in 4 für strukturell oder funktionell der Bauweise der 3 entsprechende Bauteile identische Bezugszeichen verwendet und deren Beschreibung wird nicht wiederholt.
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In der Bauweise der 4 sind der Schaltstrahlengang 11 und der Anregungsstrahlengang 12 über den Strahlteiler 19 auf den Detektionsstrahlengang 13 aufgefädelt. Dabei erfolgt die strukturierte Beleuchtung mit Anregungsstrahlung nicht im TIRF-Modus, sondern als Weitfeldbeleuchtung, d. h. die Anregungsstrahlung fällt auf einer optischen Achse 33 ein, die mit der optischen Achse 17 des Objektivs 16 in Übereinstimmung gebracht wird. Der Mustergenerator 30 steht dabei im Zwischenbild des Anregungsstrahlenganges. Die Strahlung aus der Schaltbeleuchtungseinheit 20 wird hingegen in TIRF-Beleuchtung aufgebracht, die nach der Totalreflexion an einer Blende 37 absorbiert wird.
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Die strukturierte Beleuchtung, die für den in den bislang beschriebenen Mikroskopen 10 ausgenutzten RESOLFT-Prozeß verwendet wird, kann auch durch eine geeignete Amplitude- und/oder Phasenmaske 40, welche in einer Pupille des Objektivs 16, bzw. einer dazu konjugierten Pupille steht, erzeugt werden. Diese Variante ist in 5 dargestellt. Auch hier sind Elemente, die funktionell oder strukturell Elementen bereits geschilderter Bauweisen entsprechen, mit den selben Bezugszeichen versehen, so daß ihre Erläuterung nicht wiederholt werden muß. Im Mikroskop 10 der 5 wird das Element zur strukturierten Beleuchtung 40 über eine 4f-Anordnung in die Pupille des Objektivs 16 abgebildet, wozu eine Optik 41 nach der Maske 40 angeordnet ist, die ein Zwischenbild 42 erzeugt. Über eine Optik 43 wird sowohl das Zwischenbild 42 in die Probe P abgebildet, als auch das Bild der fluoreszierenden Probe auf den Detektor 35 gebracht. Wie bei der Bauweise der 4 auch, fällt die Anregungsstrahlung in Weitfeldbeleuchtung auf die Probe P ein.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- DE 102006009833 A1 [0007, 0008, 0008, 0008]
- EP 1157297 B1 [0017, 0017, 0040]
- DE 102005034443 A1 [0029]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Thompson NL et al., „Measuring Surface Dynamics of Biomolecules by Total Internal Reflexion Fluorescence with Photobleaching Recovery or Correlation Spectroscopy”, Biophys J., 33, Nr. 3, 1981, S. 435–454 [0008]
