DE102012020877A1

DE102012020877A1 - Optikanordnung und Lichtmikroskop

Info

Publication number: DE102012020877A1
Application number: DE201210020877
Authority: DE
Inventors: Daniel Schwedt; Tiemo Anhut; Ralf Netz
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2012-10-17
Filing date: 2012-10-17
Publication date: 2014-04-17
Also published as: US20150248015A1; US10663749B2; WO2014060270A2; WO2014060270A3

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Optikanordnung zum Positionieren in einem Strahlengang eines Lichtmikroskops mit Mitteln zum Bereitstellen von strukturiertem Beleuchtungslicht in einer Probenebene des Lichtmikroskops, wobei strukturiertes Beleuchtungslicht in unterschiedlichen Orientierungen erzeugbar ist. Die Optikanordnung ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, dass verstellbare Umlenkmittel vorhanden sind zum auswählbaren Umlenken eines auftreffenden Lichtbündels auf einen von mehreren Strahlengängen, dass in den Strahlengängen Strahlteilungsmittel vorhanden sind zum Aufteilen des Lichtbündels des jeweiligen Strahlengangs in räumlich voneinander getrennte Teillichtbündel, dass für jedes der Teillichtbündel Strahlführungsmittel vorhanden sind, welche die Teillichtbündel zu einer Pupillenebene führen, und dass die Strahlführungsmittel so angeordnet sind, dass die Teillichtbündel, die zu demselben Strahlengang gehören, in der Pupillenebene ein Lichtfleckmuster bilden und dass die Lichtfleckmuster verschiedener Strahlengänge in der Pupillenebene voneinander verschieden sind. Zudem betrifft die Erfindung ein Lichtmikroskop mit einer erfindungsgemäßen Optikanordnung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft in einem ersten Gesichtspunkt eine Optikanordnung zum Positionieren in einem Strahlengang eines Lichtmikroskops nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1. In einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Lichtmikroskop nach dem Oberbegriff des Anspruchs 20.
Eine gattungsgemäße Optikanordnung weist Mittel zum Bereitstellen von strukturiertem Beleuchtungslicht in einer Probenebene des Lichtmikroskops auf, wobei strukturiertes Beleuchtungslicht in unterschiedlichen Orientierungen erzeugbar ist.
Ein gattungsgemäßes Lichtmikroskop, in dessen Strahlengang eine solche Optikanordnung positionierbar ist, weist mindestens eine Lichtquelle zum Aussenden eines Lichtbündels auf. Das Lichtbündel kann in Richtung einer Probenebene geleitet werden, in welcher eine zu untersuchende Probe positionierbar ist. Durch die Optikanordnung kann dieses Lichtbündel als strukturierte Beleuchtung auf die Probe geleitet werden.
Die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (structured illumination microscopy, SIM) ist ein etabliertes Verfahren zum Untersuchen einer Probe mit hoher Auflösung. Unter strukturiertem Beleuchtungslicht kann prinzipiell beliebiges Licht mit einer räumlich variablen Intensitätsverteilung über den Strahlquerschnitt verstanden werden. Insbesondere kann Licht mit einer periodischen Intensitätsverteilung über den Querschnitt eingesetzt werden.
Herkömmliche Mittel zum Bereitstellen von strukturiertem Beleuchtungslicht umfassen mindestens ein Gitter, das in einer Zwischenbildebene positioniert wird, also in einer zur Probenebene konjugierten Ebene. Dadurch wird das Gitter in die Probenebene abgebildet. Die strukturierte Beleuchtung wird folglich entsprechend der Gitterstruktur durch ein Linienmuster mit beleuchteten und nicht beleuchteten Linien gebildet.
In der Probenebene soll die strukturierte Beleuchtung in verschiedenen Orientierungen, das heißt unterschiedlichen Drehwinkeln um eine optische Achse, erzeugt werden können. Zudem sollen für jede Orientierung mehrere Phasen der strukturierten Beleuchtung einstellbar sein. Hierzu kann die strukturierte Beleuchtung in der Probenebene in einer Richtung quer zu den Linien des Linienmusters verschoben werden. Für die verschiedenen Orientierungen und Phasen wird jeweils ein Probenbild aufgenommen, woraus schließlich ein Probenbild mit erhöhter Auflösung berechnet wird.
Diese erhöhte Auflösung stellt einen erheblichen Vorteil gegenüber der herkömmlichen Aufnahme von Weitfeldbildern ohne strukturierte Beleuchtung dar. Der Zeitaufwand zur Bilderzeugung ist bei der Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung jedoch höher. Ein grundlegendes Ziel kann deshalb darin gesehen werden, die benötigte Zeit zur Aufnahme der verschiedenen Probenbilder gering zu halten. Der apparative Aufbau soll dabei einfach und kostengünstig sein.
Diese Anforderungen werden von herkömmlichen Optikanordnungen nicht erfüllt.
So ist es bekannt, zum Abbilden verschiedener Gitterorientierungen ein einziges Gitter einzusetzen und dieses in verschiedene Orientierungen zu drehen. Auch kann hinter dem Gitter ein optischer Bildfelddreher eingesetzt werden, beispielsweise ein Abbe-König-Prisma. Dadurch kann eine Bildfelddrehung und somit eine Drehung der Gitterabbildung in der Probenebene erzeugt werden. Die Drehung eines Gitters oder eines Bildfelddrehers ist aber verhältnismäßig zeitaufwändig. Zudem können störende Reflexe von Beugungslicht auftreten.
Alternativ kann eine optische Strahlteilung zur Erzeugung der interferierenden Strahlen umgesetzt werden, was apparativ jedoch kompliziert ist und im Hinblick auf die Stabilität problematisch sein kann.
Zudem kann strukturierte Beleuchtung durch ein Muster aus Lichtpunkten in der Pupillenebene erzeugt werden. Ein solches Punktmuster führt über die Fourier-Transformation zu einem Streifenmuster in der Probenebene. Dies wird mit einer Anordnung erreicht, die in DE 10 2007 047 466 A1 beschrieben ist. Zwischen verschiedenen Lichtpunktmustern kann durch selektives Blockieren von Licht geschaltet werden.
Weiterhin ist es bekannt, superponierte unterschiedlich ausgerichtete Gitter auf einem Substrat vorzusehen. Licht einer gewünschten Beugungsordnung wird zur Probe geleitet, während andere Beugungsordnungen ausgeblendet werden. Der Intensitätsverlust ist dadurch jedoch hoch.
Auch können mehrere unterschiedlich ausgerichtete Gitter nacheinander durch motorische Gitterwechsler ausgewählt werden. Der Zeitaufwand zum Wechseln zwischen den Gittern ist hier jedoch ebenfalls hoch.
Im Gesamten weisen daher bekannte Optikanordnungen eine hohe Totzeit beim Wechseln zwischen verschiedenen Orientierungen des strukturierten Beleuchtungslichts auf und/oder stellen hohe mechanische Anforderungen, beispielsweise hinsichtlich einer hohen Positioniergenauigkeit von beweglichen optischen Komponenten. Zudem kann es zu unterwünschten Intensitätsverluste des Beleuchtungslichts kommen.
Als eine Aufgabe der Erfindung kann angesehen werden, eine Optikanordnung und ein Lichtmikroskop bereitzustellen, mit denen ein schneller Wechsel zwischen strukturiertem Beleuchtungslicht verschiedener Orientierungen bei einem möglichst einfachen Aufbau ermöglicht wird.
Diese Aufgabe wird durch die Optikanordnung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und das Lichtmikroskop mit den Merkmalen des Anspruchs 20 gelöst.
Bevorzugte Ausführungsvarianten der erfindungsgemäßen Optikanordnung und des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche und werden in der folgenden Beschreibung erläutert, insbesondere im Zusammenhang mit den Figuren.
Eine Optikanordnung der oben genannten Art ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, dass verstellbare Umlenkmittel vorhanden sind zum auswählbaren Umlenken eines auftreffenden Lichtbündels auf einen von mehreren Strahlengängen, dass in den Strahlengängen Strahlteilungsmittel vorhanden sind zum Aufteilen des Lichtbündels des jeweiligen Strahlengangs in räumlich voneinander getrennte Teillichtbündel, dass für jedes der Teillichtbündel Strahlführungsmittel vorhanden sind, welche das zugehörige Teillichtbündel zu einer Pupillenebene führen, und dass die Strahlführungsmittel so angeordnet sind, dass die Teillichtbündel, die zu demselben Strahlengang gehören, in der Pupillenebene ein Lichtfleckmuster bilden und dass die Lichtfleckmuster unterschiedlicher Strahlengänge in der Pupillenebene voneinander verschieden sind.
Bei einem Lichtmikroskop der oben genannten Art ist gemäß der Erfindung eine erfindungsgemäße Optikanordnung vorhanden und so anordenbar, dass Lichtbündel der Lichtquelle zu den verstellbaren Umlenkmitteln leitbar sind. Hierbei können Lichtbündel auch über weitere Komponenten der Optikanordnung auf die Umlenkmittel geführt werden. Von der Optikanordnung wird ausgehendes Licht weiter zu einer Probenebene geführt, wo es als strukturierte Beleuchtung auf eine Probe trifft.
Als ein erster grundlegender Gedanke der Erfindung kann erachtet werden, dass zum Wechseln zwischen verschiedenen Orientierungen des strukturierten Beleuchtungslichts eine Änderung des ausgewählten, das heißt beleuchteten, Strahlengangs erfolgt. Hierzu ist allein eine Bewegung der verstellbaren Umlenkmittel erforderlich. Bevorzugt müssen keine weiteren Komponenten mechanisch verstellt werden. Eine Bewegung der Umlenkmittel kann wesentlich schneller erfolgen als beispielsweise das Ein- und Ausfahren von Gittern in den Strahlengang, wie es bei zahlreichen herkömmlichen Optikanordnungen der Fall ist. Strukturiertes Beleuchtungslicht verschiedener Orientierungen kann nacheinander in der Probenebene erzeugt werden, indem die verstellbaren Umlenkmittel der Erfindung nacheinander die unterschiedlichen Strahlengänge auswählen.
Ein kostengünstiger Aufbau bei gleichzeitig sehr geringen Lichtverlusten wird durch die besondere Erzeugung des strukturierten Beleuchtungslichts sowie durch die Weise erreicht, in der die verschiedenen Strahlengänge, über die strukturiertes Beleuchtungslicht verschiedener Orientierungen bereitgestellt wird, zusammengeführt werden.
Im Gegensatz zu herkömmlichen Optikanordnungen benötigt die Erfindung als Mittel zum Bereitstellen von strukturiertem Beleuchtungslicht keine Gitter oder anderen strukturierten Objekte, die in einer zur Probenebene konjugierten Ebene positioniert werden. Vielmehr können unterschiedliche Lichtfleckmuster in einer Pupillenebene erzeugt werden. Die Pupillenebene soll eine solche Ebene sein, in welcher die Lichtintensitätsverteilung durch eine Fouriertransformation mit der Lichtintensitätsverteilung in der Probenebene zusammenhängt. Bevorzugt sind Befestigungsmittel vorhanden zum Positionieren der Optikanordnung in einem Strahlengang eines Lichtmikroskops, so dass die Lichtverteilung in der Pupillenebene durch eine Fouriertransformation der Lichtverteilung in der Probenebene bestimmt ist.
Ein Lichtfleckmuster in der Pupillenebene führt daher zu einem Linienmuster oder einem anderen periodischen Muster in der Probenebene. Dadurch können die gleichen Muster in der Probenebene erzeugt werden, wie mit einem Gitter in einer Zwischenbildebene. Ein Lichtfleckmuster kann beispielsweise einen zentralen beleuchteten Bereich umfassen, welcher einer nullten Beugungsordnung von einem Gitter entspricht. Zudem kann das Lichtfleckmuster zwei äußere beleuchtete Bereiche aufweisen, welche der +1. und der –1. Beugungsordnung eines Gitters entsprechen.
Die Mittel zum Bereitstellen von strukturiertem Beleuchtungslicht umfassen bei der erfindungsgemäßen Optikanordnung daher die Strahlteilungsmittel und die Strahlführungsmittel, durch welche ein Lichtbündel von einem der Strahlengänge in mehrere Teillichtbündel geteilt wird und ein Lichtfleckmuster in der Pupillenebene bildet.
Eine weitere wesentliche Idee kann darin gesehen werden, dass in jedem der auswählbaren Strahlengänge Strahlteilungsmittel vorhanden sind. Hiermit ist eine große Anzahl räumlich getrennter Teillichtbündel auswählbar, ohne dass eine gleich große Anzahl an Strahlengängen, die über die Umlenkmittel auswählbar sind, vorhanden ist. Dadurch können die verstellbaren Umlenkmittel in besonders kurzer Zeit eines der Lichtfleckmuster auswählen. Im Gegensatz zu bekannten Faserschalteinheiten, bei denen Licht schaltbar zu mehreren Lichtleitfasern gekoppelt wird, erfolgt zudem die Aufteilung in Teillichtbündel separat von der Auswahl über die Umlenkmittel. Dadurch kann die Aufteilung in Teillichtbündel vorteilhafterweise ohne Bewegungen oder Schaltvorgänge erfolgen, womit eine bessere Stabilität einhergeht.
Die Lichtbündel verschiedener Strahlengänge werden als unterschiedliche Lichtfleckmuster in die Pupillenebene geführt. Das heißt, die Lichtfleckmuster überlappen sich in der Pupillenebene nicht oder zumindest nicht vollständig.
Unter einem Lichtfleckmuster kann ein beliebiges Muster mit räumlich voneinander beabstandeten beleuchteten Bereichen verstanden werden. Diese Bereiche sind bevorzugt kreisförmig, können aber auch jede andere Form aufweisen.
Die Strahlteilungsmittel können beliebige Mittel umfassen, durch welche ein auftreffendes Lichtbündel gleichzeitig in zwei oder mehr räumlich voneinander getrennte Teillichtbündel aufgeteilt wird. Die Teillichtbündel können sodann durch Strahlführungsmittel in die Pupillenebene geleitet werden. Der Querschnitt der Teillichtbündel bildet dort ein Lichtfleckmuster.
Unter einem Lichtbündel ist das abgestrahlte Licht oder der Lichtstrahl einer Lichtquelle zu verstehen. Dieses Licht soll optisch kohärent sein. Indem jedes Lichtfleckmuster aus den Teillichtbündeln eines einzelnen Lichtbündels gebildet wird, kann erreicht werden, dass die Teillichtbündel desselben Lichtfleckmusters optisch kohärent zueinander sind. Dadurch können die Teillichtbündel in der Probenebene miteinander interferieren und zu dem gewünschten strukturierten Beleuchtungslicht führen.
Eine Zusammenführung der zuvor getrennten Strahlengänge wird dadurch erreicht, dass die Teillichtbündel aller Strahlengänge nebeneinander in die Pupillenebene geführt werden. Diese Zusammenführung der Strahlengänge führt vorteilhafterweise zu keinen oder nur geringen Lichtverlusten. Zudem erfordert die Zusammenführung keine beweglichen Komponenten, ist vergleichsweise unempfindlich gegen äußere Einflüsse und kann kostengünstig ausgeführt werden.
Eine Wechselzeit zwischen den verschiedenen Orientierungen der strukturierten Beleuchtung kann allein durch eine Schaltzeit der verstellbaren Umlenkmittel bestimmt sein. Diese weisen bevorzugt einen Umlenkspiegel auf, der drehbar und/oder verschiebbar ist. Die Auswahl eines bestimmten Strahlengangs erfordert bei dieser Ausführung bloß eine geringe Drehung oder Verschiebung des Umlenkspiegels. Im Vergleich zu dem Ein- und Ausfahren einer gesamten optischen Komponente, beispielsweise eines Gitters, ist die erforderliche Bewegung klein und kann schnell erfolgen. Zudem kann ein Umlenkspiegel kleinere Abmessungen und ein geringeres Gewicht als ein Gitter zum Erzeugen von strukturiertem Beleuchtungslicht aufweisen. Dadurch kann ein Verstellen des Umlenkspiegels bereits innerhalb weniger Millisekunden erfolgen. Prinzipiell kann an Stelle eines Umlenkspiegels auch ein drehbares und/oder verschiebbares Prisma eingesetzt werden.
Eine sichere Strahlführung auf den verschiedenen Strahlengängen kann erreicht werden, wenn zum Leiten von Lichtbündeln von den Umlenkmittel zu den Strahlteilungsmitteln eine erste Gruppe von optischen Fasern vorhanden ist. Diese erste Gruppe weist bevorzugt für die verschiedenen Strahlengänge jeweils eine optische Faser auf. Vorzugsweise erfolgt die Strahlführung von den Umlenkmitteln zu den Strahlteilungsmitteln ohne Spiegel oder Prismen, wodurch die Stabilität steigt und Anforderungen an die Positioniergenauigkeit der vorhandenen Komponenten leichter zu erfüllen sind.
Die Strahlteilungsmittel können prinzipiell durch mehrere teildurchlässige Spiegel gebildet sein. Es kann jedoch eine besonders kompakte Bauform bei gleichzeitig hoher Stabilität gegenüber äußeren Einwirkungen erreicht werden, wenn die Strahlteilungsmittel einen Wellenleiterchip aufweisen. Dieser weist ein Substrat oder Trägersubstrat und Lichtleitpfade zum Leiten der Lichtbündel und Teillichtbündel auf. Die Lichtleitpfade sind durch ein lichtdurchlässiges Material in oder an dem Substrat gebildet. Die Herstellung der Lichtleitpfade kann beispielsweise lithographisch oder auch durch Ionenaustausch erfolgen. Der Wellenleiterchip kann eine in sich feste Struktur haben, das heißt frei von zueinander beweglichen Komponenten sein. Vorteilhafterweise ist hierdurch die Stabilität der Strahlführung höher. Eine Strahlteilung kann erreicht werden, indem die verschiedenen Lichtleitpfade sich jeweils in zwei oder mehr Lichtleitpfade aufteilen, beispielsweise in Form eines Y.
Die Lichtleitpfade des Wellenleiterchips können auch durch optische Fasern gebildet sein. Eine Aufteilung der Lichtleitpfade kann insbesondere durch Dünnschichtfilter (englisch: thin film filters, TFF) erreicht werden. Dies kann als ein Fasermultiplexer bezeichnet werden.
Es ist bevorzugt, dass der Wellenleiterchip mehrere Eingänge zum Einkoppeln von Lichtbündeln aufweist, dass jeder der Strahlengänge, die über die Umlenkmittel auswählbar sind, zu einem anderen der Eingänge führt, dass in dem Wellenleiterchip an den Eingängen jeweils ein Lichtleitpfad gebildet ist, dass in dem Wellenleiterchip an den Lichtleitpfaden jeweils ein erster Teilungspunkt gebildet ist, der den zugehörigen Lichtleitpfad in zwei oder mehr Lichtleitpfade aufteilt, dass der Wellenleiterchip mehrere Ausgänge zum Auskoppeln von Teillichtbündeln aufweist und dass jeder der Lichtleitpfade zu einem der Ausgänge führt, so dass über solche Ausgänge, die über denselben Eingang beleuchtet werden, kohärent gekoppelte Teillichtbündel ausgebbar sind.
Jede der optischen Faser der ersten Gruppe kann mit einem der Eingänge des Wellenleiterchips verbunden sein. Das lichtdurchlässige Material, das die Lichtleitpfade bildet, und das umgebende Material sind so gewählt, dass sich Licht allein entlang der Lichtleitpfade ausbreiten kann. Durch die positionsfeste Bildung der Lichtleitpfade ist der Wellenleiterchip unempfindlich gegenüber Stößen oder anderen äußeren Einwirkungen. Die Lichtleitpfade des Wellenleiterchips können auch abschnittsweise oder vollständig durch optische Fasern gebildet sein.
Vorzugsweise ist in dem Wellenleiterchip zumindest für einige der Lichtleitpfade jeweils ein zweiter Teilungspunkt gebildet, an welchem die entsprechenden Lichtleitpfade in je zwei Lichtleitpfade aufgeteilt werden. Es wird also ein Lichtleitpfad an zwei Teilungspunkten hintereinander aufgespalten, wodurch drei Lichtleitpfade entstehen. Ein Lichtbündel wird folglich in drei Teillichtbündel gespalten.
Prinzipiell kann ein Lichtbündel an einem der Teilungspunkte auf die entsprechenden Lichtleitpfade in einem beliebigen Verhältnis aufgeteilt werden. Bevorzugt wird ein Lichtleitpfad aber zu gleichen Teilen auf zwei Lichtleitpfade aufgeteilt. Diese können durch ihre Position in der Pupillenebene der +1. und der –1. Beugungsordnung eines Gitters entsprechen. Für das Licht, das der 0. Beugungsordnung entspricht, ist bereits eine geringe Lichtleistung für eine hohe Bildqualität ausreichend. Hierfür kann ein Lichtleitpfad in den Strahlteilungsmitteln in insgesamt drei Lichtleitpfade geteilt werden, wobei die Lichtleistung in einem dieser Pfade geringer ist als in den beiden anderen.
Demnach kann vorgesehen sein, dass an den ersten und den zweiten Teilungspunkten eine Lichtaufteilung so gewählt ist, dass für jeden der Eingänge zwei Ausgänge gleicher Lichtleistung bereitgestellt werden und ein Ausgang geringerer Lichtleistung, an welchem eine Lichtleistung geringer ist als die an den zwei Ausgängen gleicher Lichtleistung. Grundsätzlich kann ein Lichtfleckmuster in der Pupillenebene auch durch bloß zwei Lichtleitpfade oder durch mehr als drei Lichtleitpfade erzeugt werden. Eine große Anzahl an Lichtleitpfaden erhöht jedoch die Anforderung an die Positioniergenauigkeit hinsichtlich der Teillichtbündel eines Lichtfleckmusters. Vorzugsweise wird daher jedes Lichtfleckmuster durch genau drei Lichtleitpfade gebildet. Hierdurch kann eine hohe Bildqualität bei einem verhältnismäßig geringen apparativen Aufbau erreicht werden.
Bevorzugt sind die ersten Teilungspunkte so gestaltet, dass ein Lichtbündel zu unterschiedlichen Anteilen auf die zugehörigen zwei Lichtleitpfade aufgeteilt wird. Diese Anteile können beispielsweise in einem Verhältnis von 90:10 oder 95:5 zueinander stehen. Diejenigen Lichtleitpfade, auf welche die kleineren Anteile des Lichtbündels geleitet werden, können direkt zu den Ausgängen geringerer Lichtleistung führen. Die Lichtleitpfade, auf welche die größeren Anteile des Lichtbündels geleitet werden, können hingegen zu den zweiten Teilungspunkten führen. Diese sind bevorzugt jeweils so gestaltet, dass Licht zu gleichen Anteilen auf die zugehörigen zwei Lichtleitpfade aufgeteilt wird. Diese Lichtleitpfade können wiederum direkt, das heißt ohne auf weitere Teilungspunkte zu treffen, zu den Ausgängen gleicher Lichtleistung führen. Für eine hohe Strahlqualität des strukturierten Beleuchtungslichts in der Probenebene sollten die beiden Lichtleitpfade, die der +1. und der –1. Beugungsordnung eines Gitters entsprechen, dieselbe Lichtleistung führen. Durch die beschriebenen Teilungspunkte kann dies vorteilhafterweise unabhängig von dem genauen Teilungsverhältnis an den ersten Teilungspunkten erreicht werden. Zudem kann an den zweiten Teilungspunkten eine 50:50-Aufteilung genutzt werden, was technisch einfacher und mit einer höheren Präzision erreicht werden kann, als ungleiche Teilungsanteile.
Die Teillichtbündel, welche die Strahlteilungsmittel auf den Lichtleitpfaden des ausgewählten Strahlengangs verlässt, sollen zu der Pupillenebene geleitet werden. Bevorzugt weisen die Strahlführungsmittel zum Leiten von Teillichtbündeln von den Strahlteilungsmitteln zu der Pupillenebene eine zweite Gruppe von optischen Fasern auf. Diese zweite Gruppe weist vorzugsweise für jedes der Teillichtbündel jeweils eine optische Faser auf. Somit ist an jedem Ausgang des Wellenleiterchips eine optische Faser der zweiten Gruppe angeschlossen. Durch optische Fasern kann vorteilhafterweise eine besonders hohe Positionsstabilität erreicht werden.
Zudem ermöglichen optische Fasern ein verhältnismäßig einfaches Variieren der Positionen des austretenden Lichts in der Pupillenebene. Dazu kann eine gemeinsame Faserhalterung für die optischen Fasern der Lichtleitpfade, die zu demselben Strahlengang gehören, vorhanden sein. Alternativ kann eine Faserhalterung für alle optischen Fasern der zweiten Gruppe vorhanden sein. Durch ein Drehen oder Bewegen einer Faserhalterung kann eine Orientierung der strukturierten Beleuchtung variiert werden. Bevorzugt sind Faserhalterungen, die zu verschiedenen Strahlengängen gehören, relativ zueinander drehbar. In diesem Fall kann eine Messunterbrechungszeit reduziert werden, indem eine Faserhalterung bewegt wird, während eine strukturierte Beleuchtung über die optischen Fasern einer anderen Faserhalterung erzeugt wird.
Bevorzugt sind die Enden der optischen Fasern so in der Pupillenebene angeordnet, dass sie das jeweils gewünschte Lichtfleckmuster definieren. Alternativ können in der Pupillenebene aber auch ein oder mehrere Spiegel angeordnet sein, auf die das Licht aus den optischen Fasern der zweiten Gruppe trifft. Prinzipiell kann auch jede der optischen Fasern der zweiten Gruppe durch jeweils einen oder mehrere Spiegel ersetzt sein, wobei durch die Spiegelanordnung die Lichtfleckmuster in der Pupillenebene erzeugt werden. Mit optischen Fasern ist jedoch der apparative Aufwand geringer und die Positionsstabilität höher.
Bei einer weiteren Alternative sind die Strahlführungsmittel durch Lichtleitpfade innerhalb des Wellenleiterchips gebildet. In diesem Fall können die Ausgänge des Wellenleiterchips in der Pupillenebene entsprechend den gewünschten Lichtfleckmustern angeordnet sein.
Es ist bevorzugt, dass solche Strahlführungsmittel, die mit einem Ausgang geringerer Lichtleistung verbunden sind, zu einem zentralen Bereich in der Pupillenebene führen, und dass solche Strahlführungsmittel, die mit einem der Ausgänge gleicher Lichtleistung verbunden sind, zu äußeren Bereichen in der Pupillenebene führen. Ein Lichtfleckmuster wird bei dieser Ausführung also durch ein Teillichtbündel im zentralen Bereich der Pupillenebene und zwei Teillichtbündel in äußeren Bereichen der Pupillenebene gebildet. Diese drei Teillichtbündel entsprechen durch ihre Position in der Pupillenebene vorzugsweise der –1., 0. und +1. Beugungsordnung eines Gitters, das in einer Ebene angeordnet ist, welche durch eine Fourier-Transformation mit der Pupillenebene zusammenhängt. Die Teillichtbündel verschiedener Lichtfleckmuster, die im zentralen Bereich angeordnet sind, können dort nebeneinander positioniert sein. Hierfür können die Enden der entsprechenden optischen Fasern der zweiten Gruppe benachbart zueinander, bevorzugt direkt nebeneinander, im zentralen Bereich der Pupillenebene angeordnet sein.
Bevorzugt sind jeweils die beiden Strahlführungsmittel, die mit einem der Ausgänge gleicher Lichtleistung verbunden sind und über denselben Strahlengang beleuchtet werden, so angeordnet, dass aus diesen Strahlführungsmitteln austretende Teillichtbündel in der Pupillenebene bezüglich des zentralen Bereichs einander gegenüberliegen. Die drei Teillichtbündel, die ein Lichtfleckmuster bilden, liegen demnach in etwa auf einer Geraden. Hierdurch wird dem Umstand Rechnung getragen, dass die –1. und die +1. Beugungsordnung eines Gitters symmetrisch zueinander in Bezug auf die 0. Beugungsordnung liegen. Geringfügige Abweichungen von dieser Symmetrie, die durch die Anordnung verschiedener optischer Fasern nebeneinander im zentralen Bereich resultieren können, haben nur einen geringen Einfluss auf das Muster der strukturierten Beleuchtung in der Probenebene.
Dennoch kann ein Kompensieren dieser Auswirkungen auf die strukturierte Beleuchtung vorgesehen sein. Dazu kann mit den verschiedenen Lichtfleckmustern jeweils ein Referenzbild aufgenommen werden. Die Intensitätsverteilungen in diesen Referenzbildern können zum Auswerten von später aufgenommenen Probenbildern genutzt werden.
Bei der Verwendung von strukturiertem Beleuchtungslicht ist die Bildqualität abhängig von der Polarisationsrichtung des erzeugten Lichts. Wird das strukturierte Beleuchtungslicht in der Probenebene durch ein Linienmuster gebildet, so sollte die Polarisationsrichtung des Lichts parallel zu der Linienrichtung des Linienmusters stehen. Dies kann erreicht werden, wenn die optischen Fasern der ersten und der zweiten Gruppe sowie die Lichtleitpfade des Wellenleiterchips polarisationserhaltend sind. Zudem sind sie bevorzugt so angeordnet, dass eine Polarisationsrichtung von Teillichtbündeln, die aus den optischen Fasern der zweiten Gruppe austreten, quer, insbesondere senkrecht, zu einer Verbindungsgeraden steht, welche in der Pupillenebene zwei Teillichtbündel desselben Strahlengangs verbindet.
Zusätzlich zu den verschiedenen Orientierungen der strukturierten Beleuchtung, welche über die unterschiedlichen Lichtfleckmuster auswählbar sind, soll auch eine Phasenschiebung der strukturierten Beleuchtung möglich sein. Dies kann durch eine Änderung der Phasenbeziehung zwischen den Teillichtbündeln, die gemeinsam eines der Lichtfleckmuster bilden, erreicht werden.
Bei einer bevorzugten Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Optikanordnung sind zum Phasenschieben einer strukturierten Beleuchtung, die durch eines der Lichtfleckmuster erzeugbar ist, Thermo-Phasenschieber vorhanden. Ein Thermo-Phasenschieber weist Mittel zur Temperaturbeeinflussung der optischen Fasern der zweiten Gruppe und/oder der Lichtleitpfade des Wellenleiterchips auf, wobei die optischen Fasern der zweiten Gruppe und/oder die Lichtleitpfade des Wellenleiterchips temperaturabhängige Brechzahlen aufweisen. Indem die verschiedenen optischen Fasern oder Lichtleitpfade unterschiedlich erhitzt werden, kann ein Phasenschieben in sehr kurzer Zeit erfolgen, beispielsweise innerhalb weniger Millisekunden. Zudem sind keine mechanischen Bewegungen erforderlich.
Alternativ oder zusätzlich kann die Phasenbeziehung zwischen den Teillichtstrahlen desselben Strahlengangs auch über eine elektrische Beeinflussung gesteuert werden. Hierzu ist bevorzugt vorgesehen, dass die optischen Fasern der zweiten Gruppe und/oder die Lichtleitpfade des Wellenleiterchips Manipulationsbereiche aufweisen, in denen eine Brechzahl spannungsabhängig ist, dass benachbart zu den Manipulationsbereichen elektrooptische Modulatoren vorhanden sind, welche die Brechzahl im benachbarten Bereich durch eine einstellbare Spannung vorgeben, und dass elektronische Steuerungsmittel vorhanden und dazu eingerichtet sind, die Brechzahlen in den Manipulationsbereichen über die elektrooptischen Modulatoren zu variieren zum Phasenschieben einer strukturierten Beleuchtung, die durch eines der Lichtfleckmuster erzeugt wird. Die Manipulationsbereiche können beispielsweise durch eine geeignete Materialdotierung gebildet sein. Eine Steuerung der Phasenbeziehung über elektrooptische Modulatoren kann ebenfalls sehr schnell erfolgen.
Zur Reduzierung einer Messunterbrechungszeit können die elektronischen Steuerungsmittel dazu eingerichtet sein, ein Phasenschieben für die Teillichtbündel von einem der Strahlengänge durchzuführen, während ein anderer der Strahlengänge über die Umlenkmittel ausgewählt ist. Die Messunterbrechungszeit zwischen den Aufnahmen zweier Probenbilder kann hierdurch insbesondere dann reduziert werden, wenn ein Umschalten der Umlenkmittel in kürzerer Zeit erfolgen kann als ein Phasenschieben.
Für eine kostengünstige Ausführung kann zum Phasenschieben der strukturierten Beleuchtung auch mindestens eine Phasenplatte vorgesehen sein. Diese ist zweckmäßigerweise zwischen den Strahlteilungsmitteln und der Probenebene angeordnet und kann beispielsweise einen lichtdurchlässigen Keil umfassen, der für eine Phasenschiebung verschoben oder gekippt wird. Alternativ kann die Phasenplatte eine lichtdurchlässige Platte mit planparallelen Oberflächen aufweisen, die zum Phasenschieben gekippt wird.
Die Probenbilder, die unter Nutzung verschiedener Lichtfleckmuster aufgenommen werden, sollen zu einem höher auflösenden Bild verrechnet werden. Hierfür ist es vorteilhaft, wenn verschiedene Lichtfleckmuster die gleiche Lichtleistung aufweisen. Insbesondere aufgrund von Ein- und Auskopplungsverlusten an den optischen Fasern können diese Lichtleistungen jedoch voneinander verschieden sein. Deshalb ist es erwünscht, die Lichtleistung verschiedener Punktmuster variabel einstellen zu können. Bevorzugt ist hierfür eine akustooptische Vorrichtung vor den verstellbaren Umlenkmitteln vorhanden. Elektronische Steuerungsmittel sind vorhanden und dazu eingerichtet, mit der akustooptischen Vorrichtung eine Leistung eines Lichtbündels abhängig davon zu variieren, auf welchen der Strahlengänge das Lichtbündel geleitet wird. Die elektronischen Steuerungsmittel können dazu eingerichtet sein, die akustooptische Vorrichtung so anzusteuern, dass in der Pupillenebene die Lichtfleckmuster verschiedener Strahlengänge eine gleiche Lichtleistung aufweisen. Hierfür können die Ergebnisse von Referenzmessungen genutzt werden, in welchen die Helligkeit oder Lichtleistung in der Probenebene für die verschiedenen Punktmuster gemessen wird, ohne über die akustooptische Vorrichtung die Lichtleistung variabel zu beeinflussen.
Zum Erhöhen der Anzahl verschiedener Orientierungen der strukturierten Beleuchtung kann zusätzlich ein Bildfelddreher eingesetzt werden. Hierbei ist zum Ändern einer Orientierung der strukturierten Beleuchtung, die mit einem der Lichtfleckmuster bereitgestellt wird, im Strahlengang hinter den Strahlführungsmitteln ein Bildfelddreher vorhanden. Zudem ist eine Stelleinrichtung zum Drehen des Bildfelddrehers vorhanden. Zwar ist eine Änderung der Orientierung der strukturierten Beleuchtung durch ein Umschalten der Umlenkmittel in der Regel schneller als ein Drehen des Bildfelddrehers. Durch diesen kann jedoch eine prinzipiell beliebige Anzahl verschiedener Orientierungen der strukturierten Beleuchtung ermöglicht werden.
Im Strahlengang hinter den Strahlführungsmitteln ist bevorzugt eine Zoomoptik vorhanden für eine variable Anpassung zwischen einem Lichtleitwert eines Objektivs und einem Lichtleitwert der Lichtfleckmuster in der Pupillenebene. Der Lichtleitwert der Lichtfleckmuster in der Pupillenebene wird bestimmt durch den Abstand zwischen den äußeren Teillichtbündeln und durch die numerische Apertur der Teillichtbündel, das heißt durch ihre Ausdehnung und den Öffnungswinkel, mit dem sich die Teillichtbündel von der Pupillenebene aus aufweiten. Durch die Zoomoptik wird erreicht, dass die Lichtfleckmuster vollständig über das Objektiv in eine Probenebene geführt werden. Dies wird durch die Zoomoptik vorteilhafterweise für Objektive mit unterschiedlicher numerischer Apertur gewährleistet.
Das Objektiv kann zweckmäßigerweise Bestandteil des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops sein. Es dient dem Leiten von Licht, das von der Optikanordnung ausgegeben wird. Die beschriebene Pupillenebene der Optikanordnung ist optisch konjugiert zu einer Pupillenebene des Objektivs.
Dadurch kann mit dem Objektiv Licht, das von der Optikanordnung kommt, so in die Probenebene geführt werden, dass eine Lichtintensitätsverteilung in der Probenebene durch eine Fouriertransformation mit der Lichtintensitätsverteilung in der Pupillenebene der Optikanordnung zusammenhängt. In der Probenebene, in welcher eine zu untersuchende Probe positionierbar ist, interferiert das von der Optikanordnung kommende Licht daher zu einer strukturierten Beleuchtung. Mit dem Objektiv kann zudem Detektionslicht, das von der Probe kommt, in Richtung einer Detektoreinrichtung leitbar sein.
Weitere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden mit Bezug auf die beigefügten schematischen Zeichnungen beschrieben. Hierin zeigen:
1 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops mit einer erfindungsgemäßen Optikanordnung;
2 eine vergrößerte Darstellung von Komponenten der Optikanordnung aus 1 und
3 eine schematische Darstellung von Lichtfleckmustern, die in einer Pupillenebene durch eine erfindungsgemäße Optikanordnung erzeugt werden.
Gleiche und gleich wirkende Komponenten sind in den Figuren in der Regel mit denselben Bezugszeichen versehen.
1 zeigt schematisch ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops 110 und einer erfindungsgemäßen Optikanordnung 100, die in einem Strahlengang des Lichtmikroskops 110 positioniert ist.
Durch die Optikanordnung 100 wird strukturiertes Beleuchtungslicht 16 in einer Probenebene 90 des Lichtmikroskops 110 erzeugt. Hierzu wird zunächst von einer Lichtquelle 10 des Lichtmikroskops 110 unstrukturiertes Licht 15 erzeugt. Ein solches Lichtbündel 15 wird zu der Optikanordnung 100 geleitet. Diese weist Mittel zum Bereitstellen von strukturiertem Beleuchtungslicht 16 aus dem Lichtbündel 15 auf.
Im Gegensatz zu herkömmlichen Optikanordnungen erfordern diese Mittel kein Gitter. Ein solches wird gewöhnlicherweise in einer Zwischenbildebene angeordnet, so dass in der Probenebene ein Bild des Gitters als strukturierte Beleuchtung erzeugt wird. Durch die erfindungsgemäße Optikanordnung 100 wird hingegen ein Lichtfleckmuster in einer Pupillenebene erzeugt. Unter einer Pupillenebene soll so eine Ebene verstanden werden, in der die Lichtverteilung über eine Fourier-Transformation mit der Lichtverteilung in der Probenebene zusammenhängt. Dadurch kann durch ein Lichtfleckmuster eine strukturierte Beleuchtung in der Probenebene 90 erreicht werden, die der strukturierten Beleuchtung durch ein Gitter gleicht oder ähnelt.
Die Mittel zum Bereitstellen von strukturiertem Beleuchtungslicht umfassen bei der Optikanordnung 100 insbesondere verstellbare Umlenkmittel 20, Strahlteilungsmittel 50 und Strahlführungsmittel 70.
Zunächst wird von der Lichtquelle 10 kohärentes, also interferenzfähiges Licht 15 ausgesendet. Im dargestellten Beispiel umfasst die Lichtquelle 10 mehrere Lasermodule, über welche Licht 15 der Wellenlängen 488 nm, 561 nm und 640 nm ausgesendet werden kann. Das Licht wird von den Lasermodulen über optische Fasern 11 bis 13 zu einer Spiegeltreppe 14 geführt, welche durch teildurchlässige Spiegel das Licht 15 verschiedener Lasermodule auf einen gemeinsamen Strahlengang vereint.
Sodann trifft das Licht oder Lichtbündel 15 auf eine akustooptische Vorrichtung 18. Mit dieser kann insbesondere Licht einer gewünschten Wellenlänge ausgewählt und weiter zu den verstellbaren Umlenkmitteln 20 geleitet werden.
Die Umlenkmittel 20 umfassen einen drehbaren Umlenkspiegel. Dieser kann über einen Galvanometer-Scanner oder einen anderen Motor schnell drehbar sein. Der Umlenkspiegel 20 kann auch eine oder mehrere nebeneinander angeordnete Spiegelflächen umfassen, welche jeweils durch ein mikroelektromechanisches System (MEMS) in ihrer Ausrichtung verstellt werden können. Hierdurch kann das Lichtbündel 15 auswählbar auf einen von mehreren räumlich getrennten Strahlengängen 21 bis 23 geleitet werden. Über die verschiedenen Strahlengänge 21 bis 23 wird strukturiertes Beleuchtungslicht in unterschiedlichen Orientierungen erzeugt, wie im Folgenden beschrieben.
Die Strahlengänge 21 bis 23 werden über eine erste Gruppe von optischen Fasern 30 zu den Strahlteilungsmitteln 50 geführt. Hierzu wird auf 2 Bezug genommen, welche die optischen Fasern 30, die Strahlteilungsmittel 50 und die darauf folgenden Strahlführungsmittel 70 vergrößert zeigt.
Die Strahlteilungsmittel 50 sind hier mit einem Wellenleiterchip 50 gebildet. Dieser weist mehrere Eingänge 51 bis 53 zum Einkoppeln von Lichtbündeln 15 auf. Die erste Gruppe von optischen Fasern 30 umfasst mehrere optische Fasern 31 bis 33, von denen jede einen der Strahlengänge 21 bis 23 zu einem der Eingänge 51 bis 53 führt. Die optischen Fasern 31 bis 33 weisen Endkappen auf, die mit Anschlussmitteln an den Eingängen 51 bis 53 so verbunden werden, dass kein Luftspalt zwischen diesen entsteht.
Der Wellenleiterchip 50 weist ein Substrat auf, auf dem mit einem lichtdurchlässigen Material Lichtleitpfade 41 bis 49 gebildet sind. Prinzipiell können diese auch durch optische Fasern gebildet sein, die an einem oder mehreren Chips gehalten sind. Der Wellenleiterchip 50 kann dadurch auch als Fasermultiplexer bezeichnet werden.
Jeder der Eingänge 51 bis 53 ist mit einem Lichtleitpfad verbunden, welcher jeweils zu einem ersten Teilungspunkt 54 bis 56 führt. An jedem dieser ersten Teilungspunkte 54 bis 56 wird der zugehörige Lichtleitpfad in zwei räumlich voneinander getrennte Lichtleitpfade 41 und 43, 44 und 46, 47 und 49 aufgeteilt. Hierfür können auch Dünnschichtfilter (Thin Film Filters, TFF) genutzt werden. Ein Lichtbündel wird an einem der ersten Teilungspunkte 54 bis 56 somit in zwei Teillichtbündel aufgeteilt.
An den ersten Teilungspunkten 54 bis 56 wird Licht zu ungleichen Anteilen auf die beiden Lichtleitpfade 41, 43, 44, 46, 47, 49 aufgeteilt. Die Lichtleitpfade 43, 46, 49, auf die der jeweils kleinere Lichtanteil gelangt, führt direkt zu jeweils einem Ausgang 63, 66, 69 des Wellenleiterchips 50. Auf diese Lichtleitpfade 43, 46, 49 wird bevorzugt weniger als 20% des Lichts, das auf den entsprechenden ersten Teilungspunkt 54 bis 56 trifft, geleitet, beispielsweise 5% oder 10%. Die Ausgänge 63, 66, 69 können auch als Ausgänge geringerer Lichtleistung bezeichnet werden.
Das übrige Licht gelangt auf den Lichtleitpfaden 41, 44, 47 jeweils zu einem zweiten Teilungspunkt 57, 58, 59. An diesen erfolgt jeweils eine weitere Teilung in zwei Lichtleitpfade 41 und 42, 44 und 45, 47 und 48. Dabei erfolgt an den zweiten Teilungspunkten 57 bis 59 eine Aufteilung des Lichts bevorzugt zu gleichen Anteilen auf die zugehörigen zwei Lichtleitpfade. Diese Lichtleitpfade führen schließlich ebenfalls zu Ausgängen 61, 62, 64, 65, 67 und 68 des Wellenleiterchips 50. Diese Ausgänge können auch Ausgänge gleicher Lichtleistung genannt werden.
Für jeden der Strahlengänge 21 bis 23 wird ein Lichtbündel somit in drei Teillichtbündel aufgeteilt, die miteinander interferenzfähig sind.
Die Strahlführungsmittel 70 umfassen eine zweite Gruppe von optischen Fasern 71 bis 79, die jeweils mit einem der Ausgänge 61 bis 69 verbunden sind. Über die optischen Fasern 71 bis 79 werden die Teillichtbündel zu einer Pupillenebene 80 geführt, welche in 1 eingezeichnet und in 3 vergrößert dargestellt ist.
3 zeigt schematisch Lichtflecken, das heißt Querschnitte der Teillichtbündel 81 bis 89, in der Pupillenebene 80. Die Anordnung der Teillichtbündel 81 bis 89 wird durch die Anordnung der optischen Fasern 71 bis 79 vorgegeben. Insbesondere können die optischen Fasern 71 bis 79 in der Pupillenebene 80 enden, so dass deren Anordnung mit der Anordnung der Teillichtbündel 81 bis 89, die in 3 gezeigt ist, übereinstimmt.
Die Teillichtbündel 81 bis 83, die zu dem Strahlengang 21 gehören, bilden in der Pupillenebene 80 ein Lichtfleckmuster aus drei beleuchteten, voneinander beabstandeten Bereichen. In entsprechender Weise erzeugen die drei Teillichtbündel 84 bis 86 und die Teillichtbündel 87 bis 89 ein zweites und ein drittes Lichtfleckmuster. Von den verschiedenen Lichtfleckmustern wird zu jeder Zeit über die Umlenkmittel nur eines erzeugt. Indem die verschiedenen Lichtfleckmuster nicht oder zumindest nicht vollständig überlappen, unterscheidet sich die in der Probenebene jeweils erzeugte strukturierte Beleuchtung.
Jedes Lichtfleckmuster umfasst einen Lichtfleck in einem zentralen Bereich der Pupillenebene 80, das heißt im Bereich um eine optische Achse, welche zentral durch ein Sehfeld verläuft. Diese Lichtflecken werden durch die Teillichtbündel 83, 86, 89 erzeugt, welche über die Ausgänge geringerer Leistung 63, 66, 69 von dem Wellenleiterchip 50 zu der Pupillenebene 80 geführt wurden.
Die Teillichtbündel 83, 86, 89 im zentralen Bereich entsprechen räumlich der 0. Beugungsordnung eines Gitters, das sich in einer Zwischenbildebene befindet. Die beiden äußeren Teillichtbündel oder -strahlen 81, 82, 84, 85, 87, 88 entsprechen räumlich der –1. und der +1. Beugungsordnung eines Gitters in einer Zwischenbildebene. Daher liegen zwei Teillichtstrahlen desselben Strahlengangs, beispielsweise die Teillichtstrahlen 81 und 82, einander gegenüberliegend in Bezug auf den zentralen Bereich. Insbesondere können sie in Bezug auf die optische Achse einander gegenüberliegen oder in Bezug auf das zugehörige Teillichtbündel 83, das im zentralen Bereich angeordnet ist.
Idealerweise sollten die Teillichtbündel 83, 86, 89, welche zu verschiedenen Strahlengängen gehören und jeweils in den zentralen Bereich geführt werden, übereinander liegen. Hierfür können zwei oder mehr der Teillichtbündel 83, 86, 89 zunächst in eine gemeinsame optische Faser zusammengeführt werden und sodann in den zentralen Bereich geleitet werden (nicht dargestellt). Bevorzugt werden zwei oder mehr der Teillichtbündel 83, 86, 89 im Wellenleiterchip vereint. Bei einer Vereinigung von zwei der Teillichtbündel 83, 86, 89 im Wellenleiterchip 50 können alle Lichtleitpfade 41 bis 49 in einer Ebene verlaufen.
Wenn drei Teillichtbündel 83, 86, 89 im Wellenleiterchip 50 vereint werden, können die zugehörigen Lichtleitpfade 43, 46, 49 dreidimensional verlaufen, das heißt, sie liegen nicht in einer Ebene. Sollen alternativ alle Lichtleitpfade in einer Ebene verlaufen, muss ein Durchkreuzen verschiedener Lichtleitpfade vermieden werden. Dies kann erreicht werden, wenn die Ausgänge 61 bis 69 am Wellenleiterchip 50 zueinander in einer Richtung versetzt sind, die von den Eingängen 51 bis 53 zu den Ausgängen 61 bis 69 zeigt. Dann können die Lichtleitpfade 43, 46, 49 hinter den Ausgängen der übrigen Lichtleitpfade 41, 42, 44, 45, 47, 48 zusammengeführt werden, ohne dass es zu einem Durchkreuzen verschiedener Lichtleitpfade kommt.
Die verschiedenen Lichtfleckmuster können sich durch eine Rotationsausrichtung um die optische Achse unterscheiden. So können im dargestellten Beispiel die Teillichtstrahlen 81 bis 83 durch eine Drehung von 120° um die optische Achse in die Teillichtstrahlen 84 bis 86 überführt werden. Indem sich die Lichtfleckmuster allein in ihrer Orientierung unterscheiden, unterscheiden sich auch die strukturierten Beleuchtungen in der Probenebene allein in der Orientierung.
Für ein Phasenschieben der strukturierten Beleuchtung bleiben die Positionen und Anordnungen der Lichtfleckmuster unverändert. Vielmehr wird die Phasenbeziehung zwischen den Teillichtbündeln desselben Lichtfleckmusters zueinander variiert. Dies beeinflusst die Lage der Bereiche in der Probenebene, in welcher die drei Teillichtbündel eines Lichtfleckmusters miteinander konstruktiv interferieren. Folglich wird die Phase der strukturierten Beleuchtung geändert.
Zur Phasenänderung der Teillichtbündel kann eine Variation der Brechzahl in einem Material durchgeführt werden, durch welches sich das jeweilige Teillichtbündel fortbewegt. So können Mittel zum Ändern der Brechzahlen der optischen Fasern 71 bis 79 und/oder der Lichtleitpfade 41 bis 49 im Wellenleiterchip 50 vorhanden sein. Diese Mittel können beispielsweise einen elektrooptischen Modulator zum Ändern einer Brechzahl über eine angelegte Spannung umfassen. Alternativ können Thermo-Phasenschieber eingesetzt werden, welche die Brechzahl über eine Temperaturänderung beeinflussen.
Die Qualität einer Probenbildaufnahme hängt auch von der Polarisierung des strukturierten Beleuchtungslichts ab. Um eine Polarisationsrichtung der Teillichtbündel 81 bis 89 vorgeben zu können, sind die optischen Fasern 31 bis 39 und 71 bis 79 sowie die Lichtleitpfade 41 bis 49 polarisationserhaltend. Die optischen Fasern sind in ihrer Rotationsausrichtung so positioniert, dass die Polarisationsrichtung von zwei Teillichtbündeln desselben Strahlengangs senkrecht zu einer Verbindungsgeraden zwischen diesen Teillichtbündeln in der Pupillenebene 80 steht. Für das Teillichtbündel 81 steht demnach eine Polarisationsrichtung senkrecht zu einer Verbindungsgeraden, die in der Pupillenebene 80 das Teillichtbündel 81 mit dem Teillichtbündel 82 und/oder mit dem Teillichtbündel 83 verbindet.
In 1 ist schematisch gezeigt, dass die Teillichtbündel, die durch Aufteilung eines unstrukturierten Lichtbündels 15 erzeugt werden, in einer Zwischenbildebene miteinander interferieren und so strukturiertes Beleuchtungslicht 16 erzeugen. Dieses wird mit optischen Abbildungsmitteln 91, 93 über eine optische Schnittstelle des Lichtmikroskops 110 in dieses eingekoppelt und trifft dort auf einen Farbteiler 94. Der Farbteiler 94 weist eine Grenzwellenlänge zwischen Transmission und Reflexion auf. Die Grenzwellenlänge ist so gewählt, dass von der Optikanordnung 100 kommendes strukturiertes Beleuchtungslicht 16 in Richtung eines Objektivs 95 und weiter zur Probenebene 90 geleitet wird.
Die numerische Apertur des Objektivs 95 bestimmt, ob das strukturierte Beleuchtungslicht 16 vollständig oder nur teilweise in die Probenebene 90 geleitet werden kann. Um sicherzustellen, dass die Teillichtstrahlen eines Lichtfleckmusters vollständig von dem Objektiv 95 weitergeleitet werden, umfassen die optischen Abbildungsmittel 91 bevorzugt eine Zoomoptik.
Durch die Bestrahlung mit strukturiertem Beleuchtungslicht 16 sendet eine Probe 92, die sich in der Probenebene 90 befindet, Detektionslicht 17 aus. Bei diesem kann es sich insbesondere um Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzlicht handeln. Das Detektionslicht 17 gelangt über das Objektiv 95 und den Farbteiler 94 zu einer Detektoreinrichtung 96, die zweckmäßigerweise eine räumlich auflösende Kamera ist.
Um die Orientierung der strukturierten Beleuchtung zu ändern, ist vorteilhafterweise allein eine Bewegung des Umlenkspiegels 20 erforderlich. Dies kann bereits innerhalb weniger Millisekunden erfolgen. Die durch den Umlenkspeigel 20 auswählbaren Strahlengänge 21 bis 23 werden mit nur geringen Lichtverlusten in der Pupillenebene 80 zusammengeführt. Die dafür erforderlichen Mittel sind verhältnismäßig kostengünstig und stabil gegenüber äußeren Einflüssen wie beispielsweise Erschütterungen. Gegenüber herkömmlichen Optikanordnungen und Lichtmikroskopen können daher mit der Erfindung Probenbilder hoher Qualität in kürzerer Zeit aufgenommen werden.
Bezugszeichenliste

10: Lichtquelle
11 bis 13: optische Fasern zum Leiten von Licht der Lichtquelle
14: Spiegeltreppe
15: Lichtbündel
16: strukturiertes Beleuchtungslicht
17: Detektionslicht
18: akustooptische Vorrichtung
20: verstellbare Umlenkmittel, Umlenkspiegel
21 bis 23: Strahlengänge, die über die Umlenkmittel auswählbar sind
30: erste Gruppe von optischen Fasern
31 bis 33: optische Fasern der ersten Gruppe 30
41 bis 49: Lichtleitpfade
50: Strahlteilungsmittel, Wellenleiterchip
51 bis 53: Eingänge des Wellenleiterchips
54 bis 56: erste Teilungspunkte des Wellenleiterchips
57 bis 59: zweite Teilungspunkte des Wellenleiterchips
61 bis 69: Ausgänge des Wellenleiterchips
70: Strahlführungsmittel, zweite Gruppe von optischen Fasern
71 bis 79: optische Fasern der zweiten Gruppe 70
80: Pupillenebene
81 bis 89: Teillichtbündel
90: Probenebene
91: optische Abbildungsmittel
92: Probe
93: optische Abbildungsmittel
94: Farbteiler
95: Objektiv
96: Detektoreinrichtung
100: Optikanordnung
110: Lichtmikroskop

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

DE 102007047466 A1 [0011]

Claims

Optikanordnung zum Positionieren in einem Strahlengang eines Lichtmikroskops mit Mitteln zum Bereitstellen von strukturiertem Beleuchtungslicht (16) in einer Probenebene (90) des Lichtmikroskops, wobei strukturiertes Beleuchtungslicht (16) in unterschiedlichen Orientierungen erzeugbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass verstellbare Umlenkmittel (20) vorhanden sind zum auswählbaren Umlenken eines auftreffenden Lichtbündels (15) auf einen von mehreren Strahlengängen (21–23), dass in den Strahlengängen (21–23) Strahlteilungsmittel (50) vorhanden sind zum Aufteilen des Lichtbündels (15) des jeweiligen Strahlengangs (21–23) in räumlich voneinander getrennte Teillichtbündel (81–89), dass für jedes der Teillichtbündel (81–89) Strahlführungsmittel (70, 71–79) vorhanden sind, welche das zugehörige Teillichtbündel (81–89) zu einer Pupillenebene (80) führen, und dass die Strahlführungsmittel (70, 71–79) so angeordnet sind, dass die Teillichtbündel (81–83, 84–86, 87–89), die zu demselben Strahlengang (21, 22, 23) gehören, in der Pupillenebene (80) ein Lichtfleckmuster bilden und dass die Lichtfleckmuster unterschiedlicher Strahlengänge (21–23) in der Pupillenebene (80) voneinander verschieden sind.
Optikanordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Umlenkmittel (20) einen Umlenkspiegel (20) aufweisen, der drehbar und/oder verschiebbar ist.
Optikanordnung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zum Leiten von Lichtbündeln (15) von den Umlenkmitteln (20) zu den Strahlteilungsmitteln (50) eine erste Gruppe von optischen Fasern (30) vorhanden ist und dass die erste Gruppe von optischen Fasern (30) für die verschiedenen Strahlengänge (21–23) jeweils eine optische Faser (31–33) aufweist.
Optikanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlteilungsmittel (50) einen Wellenleiterchip (50) aufweisen, welcher ein Substrat und Lichtleitpfade (41–49) zum Leiten der Lichtbündel und Teillichtbündel (81–89) aufweist, wobei die Lichtleitpfade (41–49) durch ein lichtdurchlässiges Material in oder an dem Substrat gebildet sind.
Optikanordnung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Wellenleiterchip (50) mehrere Eingänge (51–53) zum Einkoppeln von Lichtbündeln (15) aufweist, dass jeder der Strahlengänge (21–23), die über die Umlenkmittel (20) auswählbar sind, zu einem anderen der Eingänge (51–53) führt, dass in dem Wellenleiterchip (50) an den Eingängen (51–53) jeweils ein Lichtleitpfad gebildet ist, dass in dem Wellenleiterchip (50) an den Lichtleitpfaden jeweils ein erster Teilungspunkt (54–56) gebildet ist, der den zugehörigen Lichtleitpfad in zwei Lichtleitpfade (41, 43, 44, 46, 47, 49) aufteilt, dass der Wellenleiterchip (50) mehrere Ausgänge (61–69) zum Auskoppeln von Teillichtbündeln (81–89) aufweist und dass jeder der Lichtleitpfade (41, 43, 44, 46, 47, 49) zu einem der Ausgänge (61–69) führt, so dass über solche Ausgänge (61–69), die über denselben Eingang (51–53) beleuchtet werden, kohärent gekoppelte Teillichtbündel (81–89) ausgebbar sind.
Optikanordnung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Wellenleiterchip (50) zumindest für einige der Lichtleitpfade (41, 44, 47) jeweils ein zweiter Teilungspunkt (57–59) gebildet ist, an welchen die entsprechenden Lichtleitpfade (41, 44, 47) in je zwei Lichtleitpfade (41, 42, 44, 45, 47, 48) aufgeteilt werden.
Optikanordnung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass an den ersten und den zweiten Teilungspunkten (54–59) eine Lichtaufteilung so gewählt ist, dass für jeden der Eingänge (51–53) zwei Ausgänge gleicher Lichtleistung (61, 62, 64, 65, 67, 68) bereitgestellt werden und ein Ausgang geringerer Lichtleistung (63, 66, 69), an welchem eine Lichtleistung geringer ist als die an den zwei Ausgängen gleicher Lichtleistung (61, 62, 64, 65, 67, 68).
Optikanordnung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die ersten Teilungspunkte (54–56) so gestaltet sind, dass ein Lichtbündel (15) zu unterschiedlichen Anteilen auf die zugehörigen zwei Lichtleitpfade (41, 43, 44, 46, 47, 49) aufgeteilt wird, dass diejenigen Lichtleitpfade, auf welche die kleineren Anteile des Lichtbündels (15) geleitet werden, direkt zu den Ausgängen geringerer Lichtleistung (63, 66, 69) führen, dass die Lichtleitpfade, auf welche die größeren Anteile des Lichtbündels (15) geleitet werden, zu den zweiten Teilungspunkten (57–59) führen, dass die zweiten Teilungspunkte (57–59) jeweils so gestaltet sind, dass ein Teillichtbündel zu gleichen Anteilen auf die zugehörigen zwei Lichtleitpfade (41, 42, 44, 45, 47, 48) aufgeteilt wird und diese Lichtleitpfade direkt zu den Ausgängen gleicher Lichtleistung (61, 62, 64, 65, 67, 68) führen.
Optikanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlführungsmittel (70, 71–79) zum Leiten von Teillichtbündeln (81–89) von den Strahlteilungsmittel (50) zu der Pupillenebene (80) eine zweite Gruppe von optischen Fasern (70, 71–79) aufweisen und dass die zweite Gruppe von optischen Fasern (70, 71–79) für jeden der Teillichtbündel (81–89) jeweils eine optische Faser (71–79) aufweist.
Optikanordnung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass solche Strahlführungsmittel (73, 76, 79), die mit einem Ausgang geringerer Lichtleistung (63, 66, 69) verbunden sind, zu einem zentralen Bereich in der Pupillenebene (80) führen, und dass solche Strahlführungsmittel (71, 72, 74, 75, 77, 78), die mit einem der Ausgänge gleicher Lichtleistung (61, 62, 64, 65, 67, 68) verbunden sind, zu äußeren Bereichen in der Pupillenebene (80) führen.
Optikanordnung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass jeweils die beiden Strahlführungsmittel (71, 72, 74, 75, 77, 78), die mit einem der Ausgänge gleicher Lichtleistung (61, 62, 64, 65, 67, 68) verbunden sind und über denselben Strahlengang (21, 22, 23) beleuchtet werden, so angeordnet sind, dass aus diesen Strahlführungsmitteln (71, 72, 74, 75, 77, 78) austretende Teillichtbündel (81–89) in der Pupillenebene (80) bezüglich des zentralen Bereichs einander gegenüberliegen.
Optikanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die optischen Fasern der ersten und der zweiten Gruppe (30, 31–33, 70, 71–79) polarisationserhaltend sind und so angeordnet sind, dass eine Polarisationsrichtung von Teillichtbündeln (81–89), die aus den optischen Fasern der zweiten Gruppe (70, 71–79) austreten, senkrecht zu einer Verbindungsgeraden steht, welche in der Pupillenebene (80) zwei Teillichtbündel (81–89) desselben Strahlengangs (21–23) verbindet.
Optikanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass Thermo-Phasenschieber zum Phasenschieben einer strukturierten Beleuchtung, die durch eines der Lichtfleckmuster erzeugbar ist, vorhanden sind, dass ein Thermo-Phasenschieber Mittel zur Temperaturbeeinflussung der optischen Fasern der zweiten Gruppe (70, 71–79) und/oder der Lichtleitpfade (41–49) des Wellenleiterchips (50) aufweist, wobei die optischen Fasern der zweiten Gruppe (70, 71–79) und/oder die Lichtleitpfade (41–49) des Wellenleiterchips (50) temperaturabhängige Brechzahlen aufweisen.
Optikanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die optischen Fasern der zweiten Gruppe (70, 71–79) und/oder die Lichtleitpfade (41–49) des Wellenleiterchips (50) Manipulationsbereiche aufweisen, in denen eine Brechzahl spannungsabhängig ist, dass benachbart zu den Manipulationsbereichen elektrooptische Modulatoren vorhanden sind, welche die Brechzahl im benachbarten Bereich durch eine einstellbare Spannung vorgeben, und dass elektronische Steuerungsmittel vorhanden und dazu eingerichtet sind, die Brechzahlen in den Manipulationsbereichen über die elektrooptischen Modulatoren zu variieren zum Phasenschieben einer strukturierten Beleuchtung, die durch eines der Lichtfleckmuster erzeugt wird.
Optikanordnung nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die elektronischen Steuerungsmittel dazu eingerichtet sind, zur Reduzierung einer Messunterbrechungszeit ein Phasenschieben für die Teillichtbündel (81–89) von einem der Strahlengänge (21, 22) durchzuführen, während ein anderer der Strahlengänge (23) über die Umlenkmittel (20) ausgewählt ist.
Optikanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass eine akustooptische Vorrichtung (18) vor den verstellbaren Umlenkmitteln (20) vorhanden ist und dass elektronische Steuerungsmittel vorhanden und dazu eingerichtet sind, mit der akustooptischen Vorrichtung (18) eine Leistung eines Lichtbündels (15) abhängig davon zu variieren, auf welchen der Strahlengänge (21–23) das Lichtbündel (15) geleitet wird.
Optikanordnung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die elektronischen Steuerungsmittel dazu eingerichtet sind, die akustooptische Vorrichtung (18) so anzusteuern, dass in der Pupillenebene (80) die Lichtfleckmuster verschiedener Strahlengänge (21–23) eine gleiche Lichtleistung aufweisen.
Optikanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass zum Ändern einer Orientierung der strukturierten Beleuchtung, die mit einem der Lichtfleckmuster bereitgestellt wird, im Strahlengang hinter den Strahlführungsmitteln (70, 71–79) ein Bildfelddreher vorhanden ist und dass eine Stelleinrichtung zum Drehen des Bildfelddrehers vorhanden ist.
Optikanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass im Strahlengang hinter den Strahlführungsmitteln (70, 71–79) eine Zoomoptik (91) vorhanden ist für eine variable Anpassung zwischen einem Lichtleitwert eines Objektivs (65) und einem Lichtleitwert der Lichtfleckmuster in der Pupillenebene (80).
Lichtmikroskop mit mindestens einer Lichtquelle (10) zum Aussenden eines Lichtbündels (15), dadurch gekennzeichnet, dass eine Optikanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 19 vorhanden und so anordenbar ist, dass Lichtbündel (15) der Lichtquelle (10) zu den verstellbaren Umlenkmitteln (20) leitbar sind.
Lichtmikroskop nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass ein Objektiv (95) vorhanden ist zum Leiten von Licht (16), das von der Optikanordnung ausgegeben wird, und dass die Pupillenebene (80) der Optikanordnung optisch konjugiert zu einer Pupillenebene des Objektivs (95) ist.
Lichtmikroskop nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass eine Probenebene (90) vorhanden ist, in welcher eine zu untersuchende Probe (92) positionierbar ist, dass mit dem Objektiv (95) Detektionslicht (17), das von der Probe (92) kommt, in Richtung einer Detektoreinrichtung (96) leitbar ist, dass mit dem Objektiv (95) Licht (16), das von der Optikanordnung kommt, so in die Probenebene (90) führbar ist, dass eine Lichtintensitätsverteilung in der Probenebene (90) durch eine Fouriertransformation mit der Lichtintensitätsverteilung in der Pupillenebene (80) der Optikanordnung zusammenhängt.