DE102018113208A1 - Verfahren zum Betreiben eines Lichtmikroskops mit strukturierter Beleuchtung und Optikanordnung - Google Patents

Abstract

Ein Verfahren zum Betreiben eines Lichtmikroskops mit strukturierter Beleuchtung umfasst: Bereitstellen von Beleuchtungsmustern mit Hilfe einer Strukturierungsvorrichtung (91), welche auftreffendes Licht in mindestens drei kohärente Teilstrahlen aufspaltet, die einer -1., 0. und +1. Beugungsordnung von Licht entsprechen. Beleuchtungsmuster unterschiedlicher Phase werden erzeugt, indem mit Phasenschiebern (144, 146) verschiedene Phasenänderungen für die Teilstrahlen eingestellt werden. Jeweils mindestens ein Mikroskopbild wird zu jedem der Beleuchtungsmuster aufgenommen und die Mikroskopbilder werden anschließend zu einem Hochauflösungsbild verrechnet. Erfindungsgemäß sind Phasenschieber (144, 146) nicht nur für die Teilstrahlen der -1. und +1. Beugungsordnung vorgesehen, vielmehr ist auch mindestens ein Phasenschieber (145) für den Teilstrahl zur 0. Beugungsordnung vorgesehen. Zum Bereitstellen mehrerer Beleuchtungsmuster unterschiedlicher Phase werden zumindest zwei verschiedene Phasenwerte (Φ) mit dem Phasenschieber (145) zur 0. Beugungsordnung eingestellt.

Description

• Die vorliegende Erfindung bezieht sich in einem ersten Aspekt auf ein Verfahren zum Betreiben eines Lichtmikroskops mit strukturierter Beleuchtung nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1. In einem zweiten Gesichtspunkt betrifft die Erfindung eine Optikanordnung zur strukturierten Beleuchtung bei einem Lichtmikroskop nach dem Oberbegriff des Anspruchs 13.
• Bei einem gattungsgemäßen Verfahren zum Betreiben eines Lichtmikroskops mit strukturierter Beleuchtung werden Beleuchtungsmuster mit Hilfe einer Strukturierungsvorrichtung bereitgestellt. Die Strukturierungsvorrichtung spaltet auftreffendes Licht in mindestens drei kohärente Teilstrahlen auf, die einer -1., 0. und +1. Beugungsordnung von Licht entsprechen.
• Die Strukturierungsvorrichtung kann beispielsweise ein Gitter (Phasen-Beugungsgitter) in einer Zwischenbildebene des Beleuchtungsstrahlengangs umfassen. Am Gitter wird das Licht gebeugt, womit unter anderem Teilstrahlen einer -1., 0. und +1. Beugungsordnung entstehen. In der Probenebene interferieren die Teilstrahlen und erzeugen so eine strukturierte Beleuchtung. Ein solches Beleuchtungsmuster in der Probenebene kann eine Gitterstruktur, beispielsweise eine Linienstruktur aus abwechselnd hellen und dunklen Bereichen sein. Es werden mehrere Probenbilder mit unterschiedlich gedrehtem Gittervektor des Gitters in der Zwischenbildebene aufgenommen. Dazu kann beispielsweise das Gitter gedreht werden oder es werden nacheinander verschieden ausgerichtete Gitter beleuchtet. Zudem werden mehrere Mikroskopbilder mit unterschiedlicher Phase der Beleuchtungsmodulation aufgenommen. Zur Phasenänderung kann beispielsweise das Gitter in der Zwischenbildebene verschoben werden, oder eine planparallele Wackelplatte wird zwischenbildnah gekippt.
• Alternativ kann die Strukturierungsvorrichtung anstelle eines Gitters auch einen Wellenleiterchip umfassen. Ein Wellenleiterchip wird auch als photonisch-integrierter Schaltkreis (englisch: Photonic Integrated Circuit, PIC) bezeichnet und umfasst ein Substrat, in dem Lichtleitkanäle gebildet sind. Diese Lichtleitkanäle sind in der Regel keine Hohlräume, sondern unterscheiden sich im Material vom umgebenden Substrat. Der Wellenleiterchip umfasst mindestens einen Eingang für Licht, an dem auftreffendes Licht weitergeleitet und im Wellenleiterchip auf mindestens drei Pfadabschnitte (Lichtleitkanäle), die zu mindestens drei Ausgängen führen, aufgespalten wird. Aus einem auftreffenden Lichtstrahl können so drei kohärente Teilstrahlen gebildet werden, die an den Ausgängen austreten und in der Probenebene zur Interferenz gebracht werden können. Die mindestens drei Ausgänge und ihre zugehörigen Pfadabschnitte entsprechen einer -1., 0. und +1. Beugungsordnung von Licht, das heißt, die Ausgänge können so angeordnet sein, dass sie in einer Pupillenebene des Beleuchtungsstrahlengangs ein Punktmuster bilden, das gerade dem Punktmuster entspricht, das in einer Pupillenebene durch ein in einer Zwischenbildebene angeordnetes Gitter erzeugt würde. Alternativ müssen nicht die Ausgänge in diesem Punktmuster angeordnet sein; stattdessen kann auch eine Lichtweiterleitung von den Ausgängen über beispielsweise optische Fasern so erfolgen, dass in einer Pupillenebene das genannte Punktmuster erzeugt wird. Die nullte Beugungsordnung befindet sich hierbei in einem Querschnitt des Beleuchtungslichts zwischen der +1. und -1. Beugungsordnung und kann insbesondere den gleichen räumlichen Abstand zur +1. wie zur -1. Beugungsordnung haben.
• Bei dem gattungsgemäßen Verfahren werden mehrere Beleuchtungsmuster unterschiedlicher Phase nacheinander erzeugt. Dazu werden mit Phasenschiebern verschiedene Phasenänderungen für die Teilstrahlen eingestellt. Es wird nun jeweils mindestens ein Mikroskopbild zu jedem der Beleuchtungsmuster aufgenommen und sodann werden die Mikroskopbilder zu einem Hochauflösungsbild verrechnet.
• Über verschiedene Eingänge des Wellenleiterchips können verschieden orientierte Beleuchtungsmuster erzeugt werden, wobei jeweils über die Phasenschieber verschiedene Phasen des Beleuchtungsmusters eingestellt werden.
• Das berechnete Hochauflösungsbild soll als ein Bild verstanden werden, welches aus den mehreren Mikroskopbildern berechnet wird. Da es Informationen aus allen Mikroskopbildern enthält, wird es als hochauflösend bezeichnet, wobei hierunter keine Spezifizierung einer Bildauflösung verstanden werden soll.
• In entsprechender Weise weist eine gattungsgemäße Optikanordnung zur strukturierten Beleuchtung eine Strukturierungsvorrichtung auf, welche auftreffendes Licht in mindestens drei kohärente Teilstrahlen aufspaltet, die einer -1., 0. und +1. Beugungsordnung von Licht entsprechen. Insbesondere kann die Strukturierungsvorrichtung einen Wellenleiterchip aufweisen, umfassend mindestens einen Eingang mit einem darauffolgenden Lichtleitpfad, der sich in mindestens drei Pfadabschnitte teilt, die zu mindestens drei Ausgängen des Wellenleiterchips führen. Zwei äußere der Ausgänge und ihre zugehörigen Pfadabschnitte werden abkürzend als „einer -1. und +1. Beugungsordnung von Licht (entsprechend)“ bezeichnet. Dies soll veranschaulichen, dass Lichtstrahlen, welche aus den äußeren Ausgängen austreten, der -1. und +1. Beugungsordnung von an einem Gitter gebeugten Licht entsprechen kann. Ein jeweils zwischen den beiden äußeren Ausgängen liegender mittiger Ausgang und der zugehörige Pfadabschnitt wird aufgrund der mittigen Anordnung des Ausgangs als einer 0. Beugungsordnung entsprechend bezeichnet. Der Wellenleiterchip umfasst außerdem jeweils einen Phasenschieber an jedem Pfadabschnitt zum Schieben einer Phase von Licht in diesen Pfadabschnitten.
• Gattungsgemäße Verfahren und Optikanordnungen zur strukturierten Beleuchtung sind von der Anmelderin in DE 10 2017 109 645.0 beschrieben. Eine ähnliche Optikanordnung mit Wellenleiterchip ist zudem von der Anmelderin in WO2014/060270A2 beschrieben.
• Eine Schwierigkeit liegt darin, genügend große Phasenänderungen stabil, präzise und effizient einzustellen. Insbesondere bei Phasenschiebern, die an einem Wellenleiterchip angeordnet sind, sind diese Herausforderungen schwer zu erfüllen. Bei beispielsweise thermischen Phasenschiebern müssen genügend große Temperaturunterschiede an den Pfadabschnitten des Wellenleiterchips eingestellt werden können. Selbst wenn dies gelingt, besteht das Problem, dass unter Umständen die beträchtlichen Temperaturänderungen zu keiner stabilen Phasenvariation einer gewünschten Größe führen. Auch bei anderen Phasenschiebern, beispielsweise piezoelektrischen Phasenschiebern, treten Schwierigkeiten auf, insbesondere im Materialstress, der durch die verhältnismäßig starke piezoelektrische Dehnung und Kompression entsteht, und in der hierbei eventuell auftretenden Hysterese, bei welcher das Material teilweise verformt bleibt, auch wenn die Ansteuerung auf einen Ursprungswert zurückgestellt wird.
• Eine weitere Optikanordnung zum Bereitstellen einer strukturierten Beleuchtung ist zudem in US2013/0335819A1 beschrieben. Auf Unterschiede hierzu wird später näher eingegangen.
• Als eine Aufgabe der Erfindung kann angesehen werden, ein Verfahren und eine Optikanordnung anzugeben, welche eine strukturierte Beleuchtung für ein Lichtmikroskop bereitstellen, wobei eine Phase des Beleuchtungsmusters in einfacher Weise und besonders effizient variiert werden kann.
• Diese Aufgabe wird durch das Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und durch die Optikanordnung mit den Merkmalen des Anspruchs 13 gelöst. Vorteilhafte Varianten der erfindungsgemäßen Optikanordnung und des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche und werden außerdem in der folgenden Beschreibung erläutert.
• Ein Schwerpunkt der Erfindung liegt darin, wie die Phasenänderungen der verschiedenen Teilstrahlen, die in der Probenebene zu einem Beleuchtungsmuster interferieren, eingestellt werden. Die Strukturierungsvorrichtung, die Licht in die kohärenten Teilstrahlen auspaltet, kann in prinzipiell beliebiger Weise gestaltet sein. Als Strukturierungsvorrichtung können beispielsweise Gitter eingesetzt werden. Am Gitter wird das Licht in mehrere Beugungsordnungen gebeugt, wobei diese Teilstrahlen in oder im Bereich einer Pupillenebene räumlich voneinander getrennt sind und dort unabhängig voneinander modifiziert werden können. Als Teilstrahl wird vorliegend eine Beugungsordnung von Licht angesehen beziehungsweise ein Lichtstrahl, der einer Beugungsordnung entspricht. Letzteres liegt vor, wenn die Strukturierungsvorrichtung anstelle eines beugenden Elements mindestens einen Lichtteiler (Splitter) umfasst, welcher auftreffendes Licht in mehrere Teilstrahlen spaltet. Diese Teilstrahlen können so weitergeleitet werden, dass sie in ihrer Anordnung in einer Pupillenebene ein Muster erzeugen, dass gerade den Teilstrahlen der -1., 0. und +1. Beugungsordnung eines Gitters (das in einer Zwischenbildebene angeordnet wäre) entspricht. Beispielsweise kann die Strukturierungsvorrichtung einen Wellenleiterchip umfassen, der wie eingangs beschrieben gestaltet sein kann. In dem Wellenleiterchip kann mindestens ein Splitter integriert sein, nach welchem die Teilstrahlen über jeweilige Pfadabschnitte im Wellenleiterchip weitergeleitet werden. Eine Optikanordnung mit Wellenleiterchip bietet eine besonders kompakte Bauweise mit einer geringen Komponentenanzahl beziehungsweise einer geringen Anzahl zueinander bewegbarer Komponenten. Es können jedoch auch ohne Wellenleiterchip Splitter eingesetzt werden, wobei die Teilstrahlen sodann durch beispielsweise optische Fasern und/oder Spiegel in ein gewünschtes Beleuchtungspunktmuster weitergeleitet werden. Auch können als Strukturierungsvorrichtungen Phasenmodulatoren eingesetzt werden, wie sie von der Anmelderin in den noch unveröffentlichten Anmeldungen DE 102018110072 , DE 102018110083 , DE 102018110109 und DE 10 2018110117 beschrieben sind. Bei diesen Phasenmodulatoren wird über den Querschnitt eines Lichtstrahls die Phase pixelweise verschoben. Dies kann beispielsweise mit einer Flüssigkristallmatrix oder mit einer Hubspiegelmatrix erfolgen. Im Bereich einer Pupillenebene liegen hierdurch räumlich voneinander getrennte Teilstrahlen vor, die mit Phasenschiebern unabhängig voneinander modifiziert werden können. Es können je nach Art der Strukturierungsvorrichtung auch Teilstrahlen höherer Beugungsordnungen entstehen, wobei es vorgesehen sein kann, dass diese ausgeblendet werden und allein die Teilstrahlen, die der -1., 0. und +1. Beugungsordnung entsprechen, zur Probenebene weitergeleitet werden.
• Zum leichteren Verständnis wird in den nachstehenden Erläuterungen häufig beispielhaft ein Wellenleiterchip genannt. Hierbei ist zu verstehen, dass diese Erfindungsvarianten auch abgewandelt werden können, indem die Strukturierungsvorrichtung ohne Wellenleiterchip gebildet sein kann, beispielsweise mit Gittern, den oben genannten Phasenmodulatoren oder mit Splittern und optischen Fasern.
• Damit die Wirkungen der Erfindung besser verständlich werden, wird zunächst eine mathematische Beschreibung des Beleuchtungsmusters gegeben. Mit Hilfe des Wellenleiterchips oder einer anders gestalteten Strukturierungsvorrichtung werden mehrere Teilstrahlen erzeugt, welche in einer Probenebene miteinander interferieren und so das Beleuchtungsmuster bilden. Die Teilstrahlen entsprechen damit einer -1., 0. und +1. Beugungsordnung, welche entstünden, wenn ein Gitter in einer Zwischenbildebene beleuchtet würde. Es wird hergeleitet, dass das Beleuchtungsmuster durch einen Modulationskontrast erster Ordnung und einen Modulationskontrast zweiter Ordnung beschrieben wird, wobei der Modulationskontrast zweiter Ordnung angibt, dass sich eine periodische Intensitätsschwankung (eine Cosinus-Funktion) mit einer doppelt so hohen Frequenz räumlich ändert wie der Modulationskontrast erster Ordnung. Die Phase des Modulationskontrasts zweiter Ordnung wird bestimmt durch einen Phasenwert Φ₁ , der am Teilstrahl der +1. Beugungsordnung eingestellt wird, und durch einen Phasenwert Φ_-1 , der am Teilstrahl der -1. Beugungsordnung eingestellt wird. Die Phase des Modulationskontrasts erster Ordnung wird nicht nur durch die Phasenwerte Φ₁ und Φ-₁ bestimmt, sondern auch durch einen Phasenwert Φ₀ , der am Teilstrahl der 0. Beugungsordnung eingestellt wird. Um die Phase des Beleuchtungsmusters zu schieben, wird erfindungsgemäß auch eine bestimmte Änderung des Phasenwerts Φ₀ genutzt. Dadurch müssen Φ₁ und Φ_-1 nur weniger stark variiert werden. Somit brauchen die Phasenschieber bei der Erfindung nur kleinere Phasenänderungen einzustellen als bei konventionellen Verfahren. Trotzdem wird die gleiche Phasenänderung des Beleuchtungsmusters erreicht, wie in einem nicht erfindungsgemäßen Fall, bei dem Φ₁ und Φ_-1 sehr stark geändert würden aber Φ₀ für alle Messungen kontant bliebe.
• Für die mathematische Beschreibung werden zunächst die elektrischen Feldstärkevektoren E₀ , E₁ und E₂ der drei Teilstrahlen zur 0., +1. und -1. Beugungsordnung definiert. Die Vektorpfeile sind im Fließtext weggelassen. In der folgenden Beschreibung steht der Index 2 stets für die -1. Beugungsordnung: $${\overrightarrow{E}}_1=\frac{1}{2}{\text{e}}^{\text{i}\left({\overrightarrow{k}}_1\cdot \overrightarrow{r}+{\varphi }_1\right)}\left\{c\cdot {\overrightarrow{e}}_{p,y}+a\cdot {\overrightarrow{e}}_{p,z,x\mathrm{,1}}\cdot {\text{e}}^{\text{i}{\delta }_1}\right\}+conj.comp.={\tilde{\overrightarrow{E}}}_1+{\tilde{\overrightarrow{E}}}_1*$$

  

  $${\overrightarrow{E}}_2=\frac{1}{2}{\text{e}}^{\text{i}\left({\overrightarrow{k}}_2\cdot \overrightarrow{r}+{\varphi }_2\right)}\left\{c\cdot {\overrightarrow{e}}_{p,y}+a\cdot {\overrightarrow{e}}_{p,z,x\mathrm{,2}}\cdot {\text{e}}^{\text{i}{\delta }_2}\right\}+conj.comp.={\tilde{\overrightarrow{E}}}_2+{\tilde{\overrightarrow{E}}}_2*$$

  

  $${\overrightarrow{E}}_0=\frac{1}{2}{\text{e}}^{\text{i}\left({\overrightarrow{k}}_0\cdot \overrightarrow{r}+{\varphi }_0\right)}\left\{b\cdot {\overrightarrow{e}}_{p,y}+d\cdot {\overrightarrow{e}}_{p,z,x\mathrm{,0}}\cdot {\text{e}}^{\text{i}{\delta }_0}\right\}+conj.comp.={\tilde{\overrightarrow{E}}}_0+{\tilde{\overrightarrow{E}}}_0*$$

  
• Hierbei ist i das imaginäre i; k₁ , k₂ , k₀ sind die Wellenzahlvektoren (räumliche Frequenzen), r ist der Raumvektor, Φ₁ , Φ₂ und Φ₀ sind die Phasen, e_p,y ist der Einheitsvektor des elektrischen Felds in y-Richtung für alle Teilstrahlen, e_p,z,x,1 , e_p,z,x,2 und e_p,z,x,0 sind die Einheitsvektoren des elektrischen Felds in der x-z-Ebene für die drei Teilstrahlen; e^iδ1, e^iδ2 und e^iδ0, geben einen Phasenversatz des E-Felds in der x-z-Ebene relativ zum E-Feld in der y-Richtung an, a, b, c, d sind Amplituden/Konstanten und conj.comp. kennzeichnet die komplex Konjugierte des jeweils gesamten vorstehenden Ausdrucks. Durch die Summenbildung mit conj.comp. und der Multiplikation mit ½ kürzt sich der Imaginärteil heraus und allein der Realteil des jeweiligen E-Felds verbleibt. Die Wellenzahlvektoren k₁ , k₂ , k₀ sind in 1 näher dargestellt. Mit 1 wird leicht veranschaulicht, dass für die Wellenzahlvektoren k₁ , k₂ , k₀ gilt: $${\overrightarrow{k}}_1=\frac{2\pi }{\lambda }\left\{\text{cos}\left(\phi \right){\overrightarrow{e}}_x+\text{sin}\left(\phi \right){\overrightarrow{e}}_z\right\}$$

  

  $${\overrightarrow{k}}_2=\frac{2\pi }{\lambda }\left\{-\text{cos}\left(\phi \right){\overrightarrow{e}}_x+\text{sin}\left(\phi \right){\overrightarrow{e}}_z\right\}$$

  

  $${\overrightarrow{k}}_0=\frac{2\pi }{\lambda }{\overrightarrow{e}}_z$$

  
• Hierbei sind e_x , e_y und e_z die Einheitsvektoren in x-, y- und z-Richtung, φ ist der Winkel des Wellenzahlvektors zur x-Achse und λ ist die Wellenlänge des Lichts im Medium. Der Winkel der Wellenzahlvektoren zur y-Achse ϑ beträgt 90° (siehe 1), womit folgt: $${\overrightarrow{e}}_{p,y}=-{\overrightarrow{e}}_y$$

  

  $${\overrightarrow{e}}_{p,z,x\mathrm{,1}}=\left(\text{sin}\left(\vartheta \right)\text{sin}\left(\phi \right){\overrightarrow{e}}_x-\text{cos}\left(\vartheta \right){\overrightarrow{e}}_y-\text{sin}\left(\vartheta \right)\text{cos}\left(\phi \right){\overrightarrow{e}}_z\right)=\text{sin}\left(\phi \right){\overrightarrow{e}}_x-\text{cos}\left(\phi \right){\overrightarrow{e}}_z$$

  

  $${\overrightarrow{e}}_{p,z,x\mathrm{,2}}=\left(\text{sin}\left(\vartheta \right)\text{sin}\left(\phi \right){\overrightarrow{e}}_x-\text{cos}\left(\vartheta \right){\overrightarrow{e}}_y+\text{sin}\left(\vartheta \right)\text{cos}\left(\phi \right){\overrightarrow{e}}_z\right)=\text{sin}\left(\phi \right){\overrightarrow{e}}_x+\text{cos}\left(\phi \right){\overrightarrow{e}}_z$$

  

  $${\overrightarrow{e}}_{p,z,x\mathrm{,0}}=\text{sin}\left(\phi \right){\overrightarrow{e}}_x-\text{cos}\left(\vartheta \right){\overrightarrow{e}}_y={\overrightarrow{e}}_x$$

  
• Die elektrische Feldintensität I ist proportional zum Quadrat der Summe der elektrischen Feldstärken E₀ , E₁ , E₂ der drei Teilstrahlen, wobei das Quadrat durch Multiplikation mit den komplex konjugierten E₀*, E₁*, E₂* gebildet wird: $$I\propto \left\{{\tilde{\overrightarrow{E}}}_1+{\tilde{\overrightarrow{E}}}_2+{\tilde{\overrightarrow{E}}}_0\right\}\cdot \left\{{\tilde{\overrightarrow{E}}}_1^{\ast }+{\tilde{\overrightarrow{E}}}_2^{\ast }+{\tilde{\overrightarrow{E}}}_0^{\ast }\right\}$$

  

  $$I\propto {\left|{\tilde{\overrightarrow{E}}}_1\right|}^2+{\left|{\tilde{\overrightarrow{E}}}_2\right|}^2+{\left|{\tilde{\overrightarrow{E}}}_0\right|}^2+{\tilde{\overrightarrow{E}}}_2{\tilde{\overrightarrow{E}}}_1^{\ast }+{\tilde{\overrightarrow{E}}}_1{\tilde{\overrightarrow{E}}}_2^{\ast }+{\tilde{\overrightarrow{E}}}_0{\tilde{\overrightarrow{E}}}_1^{\ast }+{\tilde{\overrightarrow{E}}}_1{\tilde{\overrightarrow{E}}}_0^{\ast }+{\tilde{\overrightarrow{E}}}_0{\tilde{\overrightarrow{E}}}_2^{\ast }+{\tilde{\overrightarrow{E}}}_2{\tilde{\overrightarrow{E}}}_0^{\ast }$$

  
• Die quadratischen Terme E₀ ² , E₁ ² , E₂ ² sind Konstanten: $${\left|{\tilde{\overrightarrow{E}}}_1\right|}^2={\left|{\tilde{\overrightarrow{E}}}_2\right|}^2=c^2+a^2$$

  

  $${\left|{\tilde{\overrightarrow{E}}}_0\right|}^2=b^2+d^2$$

  
• Mit diesen Konstanten kann der obige Ausdruck für die elektrische Feldintensität I umgeformt werden zu: $$\begin{array}{l}I\propto 2\left\{\left[c^2+a^2\right]+\text{cos}\left[2k_{1x}\cdot x+\left({\varphi }_1-{\varphi }_2\right)\right]\cdot \left(c^2+a^2\left[{\text{sin}}^2\left(\phi \right)-{\text{cos}}^2\left(\phi \right)\right]\right)\right\}\\ +2\left\{\frac{\left[b^2+d^2\right]}{2}+2\cdot \text{cos}\left[-\left(k_{1x}x+\frac{{\varphi }_1-{\varphi }_2}{2}\right)\right]\cdot \text{cos}\left[\left(\left|{\overrightarrow{k}}_0\right|-k_{1z}\right)\cdot z+\frac{2{\varphi }_0-{\varphi }_1-{\varphi }_2}{2}\right]\left(b\cdot c+d\cdot a\text{ sin}\left(\varphi \right)\right)\right\}\end{array}$$

  
• Wird nun die Darstellung des Wellenzahlvektors k gemäß 1 genutzt, so ergibt sich hieraus: $$\boxed{\begin{array}{l}I\propto 2\left\{\left[c^2+a^2\right]+\text{cos}\left[2\frac{2\pi }{\lambda }\text{cos}\left(\phi \right)\cdot x+\left({\varphi }_1-{\varphi }_2\right)\right]\cdot \left(c^2+a^2\left[{\text{sin}}^2\left(\phi \right)-{\text{cos}}^2\left(\phi \right)\right]\right)\right\}\\ +2\left\{\frac{\left[b^2+d^2\right]}{2}+2\cdot \text{cos}\left[\frac{2\pi }{\lambda }\text{cos}\left(\phi \right)\cdot x+\frac{{\varphi }_1-{\varphi }_2}{2}\right]\cdot \text{cos}\left[\frac{2\pi }{\lambda }\left(\text{1}-\text{sin}\left(\phi \right)\right)\cdot z+\frac{2{\varphi }_0-{\varphi }_1-{\varphi }_2}{2}\right]\left(b\cdot c+d\cdot a\text{ sin}\left(\varphi \right)\right)\right\}\end{array}}$$

  
• Die Beleuchtungsintensität I umfasst demnach zwei summierte Modulationsterme (cosinus-Funktionen). Der Modulationsterm $\text{cos}\left[2\frac{2\pi }{\lambda }\text{cos}\left(\phi \right)\cdot x+\left({\varphi }_1-{\varphi }_2\right)\right]$

  

  in der ersten Zeile wird Modulationsterm zweiter Ordnung genannt, weil er die zweifache räumliche Frequenz des anderen Modulationsterms hat, das heißt des Modulationsterms erster Ordnung, der in der zweiten Zeile steht und $\text{cos}\left[\frac{2\pi }{\lambda }\text{cos}\left(\phi \right)\cdot x+\frac{{\varphi }_1-{\varphi }_2}{2}\right]$

  

  umfasst.
• Für die Aufnahme mehrerer Mikroskopbilder mit unterschiedlicher Phase der strukturierten Beleuchtung müssen die Phasen der obigen Wellenausdrücke variiert werden. Für den Modulationskontrast zweiter Ordnung muss daher der Phasenversatz (Φ₁ - Φ₂) variiert werden. Für den Modulationskontrast erster Ordnung ist zu berücksichtigen, dass hier zwei cosinus-Funktionen multipliziert sind: $$\text{cos}\left[\frac{2\pi }{\lambda }\text{cos}\left(\phi \right)\cdot x+\frac{{\varphi }_1-{\varphi }_2}{2}\right]\cdot \text{cos}\left[\frac{2\pi }{\lambda }\left(1-\text{sin}\left(\phi \right)\right)\cdot z+\frac{2{\varphi }_0-{\varphi }_1-{\varphi }_2}{2}\right]$$

  
• Dadurch kann ein Phasenschieben nicht nur durch Verändern von Φ₁ und Φ₂ erreicht werden, vielmehr kann auch Φ₀ variiert werden, um eine Phasenänderung des Intensitätsmusters zu erreichen.
• Durch ein geeignetes Verändern von Φ₀ müssen die Veränderungen von Φ₁ und Φ₂ weniger groß sein, als wenn Φ₀ für alle Bildaufnahmen den gleichen Wert hätte.
• Diese Erkenntnis wird bei der Erfindung genutzt.
• Bei dem Verfahren der oben genannten Art sind erfindungsgemäß Phasenschieber nicht nur jeweils für die Teilstrahlen der -1. und +1. Beugungsordnung vorgesehen. Vielmehr ist auch je mindestens ein Phasenschieber für den Teilstrahl der 0. Beugungsordnung vorhanden. Zum Bereitstellen mehrerer Beleuchtungsmuster unterschiedlicher Phase werden zumindest zwei verschiedene Phasenwerte für Φ₀ mit dem Phasenschieber zur 0. Beugungsordnung eingestellt.
• Die Optikanordnung der oben genannten Art umfasst erfindungsgemäß eine Steuereinheit, welche dazu eingerichtet ist, nicht nur mit den Phasenschiebern, die zu den Teilstrahlen der -1. und +1. Beugungsordnung gehören, verschiedene Phasenänderungen einzustellen. Vielmehr werden auch mit dem oder den Phasenschiebern, die zur 0. Beugungsordnung gehören, zumindest zwei verschiedene Phasenwerte eingestellt, insbesondere genau zwei voneinander um π beabstandete Phasenwerte.
• Vorteilhafterweise sind durch die Verwendung verschiedener Phasenwerte Φ₀ nur kleinere Veränderungen von Φ₁ und Φ₂ erforderlich.
• Auch bei bekannten Systemen, die als Strukturierungsvorrichtung keinen Wellenleiterchip und integrierte Phasenschieber verwenden, wird Φ₀ nicht wie bei der Erfindung verstellt. Beispielsweise beschreibt US2013/0335819A1 einen Aufbau zur strukturierten Beleuchtung, bei dem drei Teilstrahlen erzeugt werden, die einer -1., 0. und 1. Beugungsordnung von Licht entsprechen. Als Phasenschieber werden hier drehbare transparente Plättchen verwendet. Die Teilstrahlen, die der -1. und 1. Beugungsordnung entsprechen, werden gemäß 7A von US2013/0335819A1 durch Phasenschieber phasenverschoben. Für die 0. Beugungsordnung wird hingegen, im Gegensatz zur Erfindung, nicht beschrieben, die Phase so zu variieren, dass bereits kleinere Phasenvariationen für die -1. und 1. Beugungsordnung genügen, um das Beleuchtungsintensitätsmuster in der Probenebene wie gewünscht in der Phase zu schieben. Erfindungsgemäß werden die Mikroskopbilder, die zum Berechnen desselben Hochauflösungsbilds benutzt werden, mit mindestens zwei verschiedenen Phasenwerten für den Teilstrahl der 0. Beugungsordnung aufgenommen. Beim vorgenannten Stand der Technik wird allenfalls genannt, dass für die Teilstrahlen mehrere Phasenschieber vorhanden sein können, nicht aber, dass in der Messreihe zum Erstellen eines Hochauflösungsbilds (das heißt in der Messreihe für ein einziges Bild und nicht etwa in verschiedenen Messreihen zu unterschiedlichen Hochauflösungsbildern) zwei oder mehr verschiedene Einstellungen mit einem Phasenschieber für die 0. Beugungsordnung eingestellt werden.
• Bei Erfindungsvarianten können Mikroskopbilder aufgenommen werden, bei denen mit dem Phasenschieber zur 0. Beugungsordnung zwei verschiedene Phasenwerte Φ₀ eingestellt werden, die sich um π unterscheiden. Wie aus dem obigen Ausdruck für den Modulationskontrast erster Ordnung ersichtlich, führt eine Änderung von Φ₀ um π dazu, dass sich das Vorzeichen des Ausdrucks $\text{cos}\left[\frac{2\pi }{\lambda }\left(1-\text{sin}\left(\phi \right)\right)\cdot z+\frac{2{\varphi }_0-{\varphi }_1-{\varphi }_2}{2}\right]$

  

  ändert, da bekanntermaßen eine cosinus-Funktion durch eine Verschiebung um π den gleichen Betrag behält, aber ein anderes Vorzeichen bekommt. Soll für den Modulationskontrast erster Ordnung der gesamte Phasenbereich durchgeschoben werden, müsste bei konstantem Φ₀ der Phasenausdruck (Φ₁ - Φ₂)/2 in $\text{cos}\left[\frac{2\pi }{\lambda }\text{cos}\left(\phi \right)\cdot x+\frac{{\varphi }_1-{\varphi }_2}{2}\right]$

  

  über einen Bereich von π variiert werden; hingegen sorgt der Vorzeichenwechsel bei einer Änderung Φ₀ um π dafür, dass der Phasenausdruck (Φ₁ - Φ₂)/2 nur über einen Bereich von 1π variiert werden muss, um den gesamten Phasenbereich abzudecken.
• Es können nun zu jedem der beiden Phasenwerte Φ₀ des Phasenschiebers zur 0. Beugungsordnung, welche sich um π unterscheiden, (das heißt zu den beiden Werten für Φ₀ ) jeweils mit den Phasenschiebern zur -1. und +1. Beugungsordnung mehrere verschiedene Phasenänderungen (bzw. Phasenwerte/Phaseneinstellungen) eingestellt werden, also verschiedene Paare von Φ₁ , Φ₂ , wobei jeweils ein Mikroskopbild aufgenommen wird. Beispielsweise können zwei oder mehr Mikroskopbilder mit gleichem Φ₀ und unterschiedlichen Paaren von Φ₁ , Φ₂ aufgenommen werden, und zusätzlich werden zwei oder mehr Mikroskopbilder mit einem um π veränderten Φ₀ und unterschiedlichen Paaren von Φ₁ , Φ₂ aufgenommen.
• Als Phasenschieber können prinzipiell beliebige Elemente verwendet werden, die dazu eingerichtet sind, eine Phase von auftreffendem Licht variabel zu verändern. Beispielsweise können bewegbare/drehbare transparente Plättchen in den Strahlengängen der verschiedenen Teilstrahlen angeordnet sein. Die Phasenschieber können auch in dem Wellenleiterchip integriert sein. In diesem Fall sind Phasenschieber an den jeweiligen Pfadabschnitten, die zu den Teilstrahlen der -1, 0. und +1. Beugungsordnung gehören, vorgesehen. Es können auch an einem Pfadabschnitt mehrere Phasenschieber hintereinander angeordnet sein, um besser genügend große Phasenänderungen erzeugen zu können. Insbesondere bei Integration in einem Wellenleiterchip können thermische Phasenschieber, piezoelektrische Phasenschieber, elektrooptische Phasenschieber oder akustooptische Phasenschieber verwendet werden. Ein thermischer Phasenschieber verändert die Temperatur eines zugehörigen Pfadabschnitts. Temperaturabhängig ändert sich die optische Weglänge, so dass die Phase geschoben wird. Bei einem piezoelektrischen Phasenschieber wird durch eine angelegte elektrische Spannung das Material des zugehörigen Pfadabschnitts gedehnt oder gestaucht, womit sich ebenfalls die optische Weglänge variieren lässt. Bei einem elektrooptischen Phasenschieber kann über Elektroden, welche am Wellenleiterchip benachbart zu einem Pfadabschnitt angeordnet sind, eine elektrische Spannung angelegt werden, welche ein elektrisches Feld im zugehörigen Pfadabschnitt erzeugt. Dadurch wird der Brechungsindex im Pfadabschnitt geändert, so dass im Pfadabschnitt laufendes Licht eine Phasenänderung erfährt. Ein akustooptischer Phasenschieber kann eine akustische Welle im zugehörigen Pfadabschnitt erzeugen, durch welche eine optische Weglänge der Lichtwelle verändert wird.
• Zum Bereitstellen der verschiedenen Beleuchtungsmuster können die beiden Phasenschieber, die zur -1. und +1. Beugungsordnung gehören, von einem Arbeitspunkt ausgehend in entgegengesetzte Richtungen verstellt werden. Bei einem thermischen Phasenschieber wird also von einem Arbeitspunkt ausgehend, beispielsweise von 200°C ausgehend, der Pfadabschnitt zur +1. Beugungsordnung erwärmt und der Pfadabschnitt zur -1. Beugungsordnung abgekühlt. Dadurch ändern sich Φ₁ und Φ₂ in entgegengesetzte Richtungen. Da sowohl die Phase des Modulationskontrasts 1. Ordnung als auch die Phase des Modulationskontrasts 2. Ordnung von der Differenz (Φ₁ - Φ₂) abhängen, kann durch diese entgegengesetzte Änderung eine effiziente Phasenverstellung erreicht werden, ohne dass einer der beiden Werte Φ₁ und Φ₂ übermäßig stark geändert werden müsste.
• Die Phasenschieber zur -1. und +1. Beugungsordnung können auch vom Arbeitspunkt ausgehend so in entgegengesetzte Richtungen verstellt werden, dass die beiden erzeugten Phasenänderungen für Φ₁ und Φ₂ zur -1. und +1. Beugungsordnung denselben Betragswert aber verschiedene Vorzeichen haben, dass also insbesondere Φ₁=-Φ₂ gilt, beziehungsweise ΔΦ₁ = -ΔΦ₂ gilt, wobei ΔΦ₁ und ΔΦ₂ die Phasenänderungen ausgehend von Phasenwerten Φ₁ und Φ₂ , zu denen ein Mikroskopbild aufgenommen wird, angeben. Hierdurch wird nicht nur das Problem vermieden, dass bei ungleicher Betragsänderung von Φ₁ und Φ₂ einer von beiden Werten verhältnismäßig stark variiert werden müsste, um den gesamten Phasenbereich abzudecken. Vielmehr bringt Φ₁ = -Φ₂ auch den wesentlichen Vorteil, dass im Ausdruck $\text{cos}\left[\frac{2\pi }{\lambda }\left(1-\text{sin}\left(\phi \right)\right)\cdot z+\frac{2{\varphi }_0-{\varphi }_1-{\varphi }_2}{2}\right]$

  

  des Modulationskontrasts erster Ordnung der Anteil (-Φ₁ - Φ₂)/2 stets konstant bzw. null ist, also insbesondere $\frac{2{\varphi }_0-{\varphi }_1-{\varphi }_2}{2}$

  

  gelten kann, und somit dieser cosinus-Term allein durch Φ₀ variiert wird; die übrigen Parameter dieses Ausdrucks bleiben zusammen betrachtet konstant, während die verschiedenen Phasen eingestellt und die Mikroskopbilder aufgenommen werden. Wird nun Φ₀ auf wahlweise einen von zwei Werten eingestellt, die sich um π unterscheiden, so ändert dies das Vorzeichen dieses Ausdrucks, wobei Φ₁ und Φ₂ allein im ersten cosinus-Term des Ausdrucks des Modulationskontrasts erster Ordnung: $$\text{cos}\left[\frac{2\pi }{\lambda }\text{cos}\left(\phi \right)\cdot x+\frac{{\varphi }_1-{\varphi }_2}{2}\right]\cdot \text{cos}\left[\frac{2\pi }{\lambda }\left(1-\text{sin}\left(\phi \right)\right)\cdot z+\frac{2{\varphi }_0-{\varphi }_1-{\varphi }_2}{2}\right]$$

  

  eine Rolle spielen.
• An diesem Ausdruck kann gut erkannt werden, dass die Phase (Φ₁ - Φ₂)/2 um nicht mehr als 1π variiert werden muss, um den gesamten Phasenbereich abzudecken, wenn zusätzlich Φ₀ um π verändert wird.
• So ist bei einer Erfindungsvariante vorgesehen, dass zum Bereitstellen der verschiedenen Beleuchtungsmuster die Phasenschieber zur -1. und +1. Beugungsordnung in einem Intervall verstellt werden, welches höchstens eine Phasenänderung (Φ₁ - Φ₂)/2 eines Modulationskontrasts erster Ordnung von π umspannt, also insbesondere 0 ≤ (Φ₁ - Φ₂)/2 ≤ π; zum Bereitstellen von Phasenänderungen eines Modulationskontrasts erster Ordnung von größer als π wird nun zusätzlich mit dem Phasenschieber zur 0. Beugungsordnung die Phasenänderung Φ₀ verändert, insbesondere wird Φ₀ um π verändert.
• Sämtliche Mikroskopbilder, aus denen ein Hochauflösungsbild berechnet wird, können somit aufgenommen werden, während verschiedene Beleuchtungsmuster erzeugt werden, für die die Phasenschieber zur -1. und +1. Beugungsordnung so verstellt werden, dass stets 0π ≤ (Φ₁ - Φ_-1)/2 ≤ 1π gilt. Wie zuvor angemerkt, werden Φ_-1 und Φ₂ synonym für die Phasenänderung am Pfadabschnitt zur -1. Beugungsordnung verwendet. Zum Bereitstellen einer Phasenänderung des Modulationskontrasts erster Ordnung, welche einem Intervall von 1π bis 2π entspricht, werden nun nicht etwa Φ₁ und Φ_-1 so verändert, dass 1π ≤ (Φ₁ - Φ_-1)/2 ≤ 2π gelten würde. Vielmehr wird der Phasenwert Φ₀ zur 0. Beugungsordnung um π verändert, während die Phasenschieber zur -1. und +1. Beugungsordnung weiterhin so verstellt werden, dass stets 0π ≤ (Φ₁ - Φ_-1)/2 ≤ 1π gilt.
• Durch die Änderung von Φ₀ genügt es, wenn eine Maximaldifferenz zwischen Einstellungen der Phasenschieber zur -1. und +1. Beugungsordnung, das heißt
• - eine maximale Temperaturdifferenz zwischen zwei thermischen Phasenschiebern,
• - eine maximale Spannungsdifferenz zwischen zwei piezoelektrischen oder elektrooptischen Phasenschiebern oder
• - ein maximaler Frequenzunterschied zwischen zwei akustooptischen Phasenschiebern,
höchstens so groß ist, dass bei der Maximaldifferenz noch (Φ₁ - Φ_-1)/2 ≤ 1π erfüllt ist.
• Nachfolgend wird an Hand einer Tabelle veranschaulicht, wie die Phasenänderungen gemäß einer Ausführung der Erfindung eingestellt werden können, um ein Phasenschieben über den gesamten Phasenbereich zu ermöglichen und trotzdem Φ₁ und Φ_-1 nicht zu stark zu verändern. Bei diesem Beispiel wird der Gesamtphasenbereich von 2π durch fünf Schritte abgedeckt, das heißt durch die Phasenschritte: 0·2π/5, dann 1·2π/5, dann 2·2≤/5, dann 3≤2π/5 und schließlich 4·2π/5.
• In diesen Schritten soll die Phase des Modulationskontrasts erster Ordnung verstellt werden. Gemäß der obigen Formel ändert sich für den Modulationskontrast zweiter Ordnung die Phase doppelt so stark (nämlich um (Φ₁ - Φ-₁) anstelle von (Φ₁ - Φ_-1)/2), so dass nachstehend für den Modulationskontrast zweiter Ordnung die Phasenschritte für ein Durchlaufen von 4π angegeben sind.

  Modulationskontrast 1. Ordnung: $$\text{cos}\left[\frac{2\pi }{\lambda }\text{cos}\left(\phi \right)\cdot x+\frac{{\varphi }_1-{\varphi }_2}{2}\right]\cdot \text{cos}\left[\frac{2\pi }{\lambda }\left(1-\text{sin}\left(\phi \right)\right)\cdot z+\frac{2{\varphi }_0-{\varphi }_1-{\varphi }_2}{2}\right]$$

  	1. Phasenschritt: 0·2π/5 = 0•π	2. Phasenschritt: 1·2π/5 = 0,4•π		3. Phasenschritt: 2·2π/5 = 0,8•π		4. Phasenschritt: 3·2π/5 = 1,2•π	5. Phasenschritt: 4·2π/5 = 1,6•π
  Einstellung für Φ0	0	0		0		π	π
  Einstellung für $\frac{{\varphi }_1-{\varphi }_2}{2}$	0•π	0,4•π		0,80•π		0,20•π	0,60•π
  	Modulationskontrast 2. Ordnung: $$\text{cos}\left[2\frac{2\pi }{\lambda }\text{cos}\left(\phi \right)\cdot x+\left({\varphi }_1-{\varphi }_2\right)\right]$$

  	1. Phasenschritt: 0·4π/5 = 0•π	2. Phasenschritt: 1·4π/5 = 0,8•π		3. Phasenschritt: 2·4π/5 = 1,6•π		4. Phasenschritt: 3·4π/5 = 2,4•π = 2π+0,4π	5. Phasenschritt: 4·4π/5 = 3,2•π= 2π+1,2π
  Einstellung für (ϕ1-ϕ2)	0•π	0,8•π		1,6•π		0,4•π	1,2•π

• Hierbei können wieder, wie oben beschrieben, Φ₁ und Φ₂ in entgegengesetzter Richtung und betragsgleich variiert werden, also gemäß Φ₁ = -Φ₂.
• Wie angegeben, wird für eine Phasenänderung des Modulationskontrasts erster Ordnung um z.B. 1,2•π der Ausdruck $\frac{{\varphi }_1-{\varphi }_2}{2}$

  

  nicht um 1,2•π, sondern bloß um 0,2•π verändert. Dafür wird aber gleichzeitig Φ₀ um π verändert. Hierbei muss betont werden, dass Φ₀ und der Ausdruck $\frac{{\varphi }_1-{\varphi }_2}{2}$

  

  in unterschiedlichen Termen wirken und nicht einfach als Summe wirken (siehe obige Formeln zum Modulationskontrast erster Ordnung). Als Ergebnis des Phasensprungs von Φ₀ um π können beliebige Phasenänderungen über den gesamten Phasenbereich von 2π eingestellt werden, ohne dass hierfür von den Phasenschiebern extreme Änderungen eingestellt werden müssten. Insbesondere kann vorgesehen sein, dass Φ₀ für alle aufgenommenen Mikroskopbilder nur zwischen genau zwei Werten verstellt wird, die sich um π unterscheiden.
• Gemäß der obigen Tabelle wird somit für den Modulationskontrast 1. Ordnung eine Phasenänderung, die zwischen 1π und 2π liegt, mit Hilfe einer Phasenänderung von Φ₀ eingestellt, ohne dass $\frac{{\varphi }_1-{\varphi }_2}{2}$

  

  um mehr als 1π geändert würde.
• Die Lehre aus obiger Tabelle kann für eine beliebige Anzahl von n Schritten anstelle von 5 Schritten verallgemeinert werden. Hierbei wird der Phasenbereich von 2π für den Modulationskontrast erster Ordnung beziehungsweise der Phasenbereich von 4π für den Modulationskontrast zweiter Ordnung in n Schritte mit insbesondere gleichem Abstand eingeteilt.
• Die Mikroskopbilder, die zu einem Hochauflösungsbild verrechnet werden, können mit zwei (insbesondere genau zwei) verschiedenen Phasenwerten Φ₀ zur 0. Beugungsordnung aufgenommen werden, welche sich um π unterscheiden. Darüber hinaus können auch die Absolutwerte von Φ₀ geeignet gewählt werden. So wird durch Φ₀ die z-Ebene bestimmt, in welcher das Beleuchtungsmuster einen maximalen Modulationskontrast hat, das heißt einen maximalen Helligkeitsunterscheid zwischen einem hellsten und dunkelsten Bereichen des Musters. Der Modulationskontrast hat also eine z-Abhängigkeit, die durch Φ₀ beeinflusst wird. Die beiden Absolutwerte von Φ₀ , zu denen Mikroskopbilder aufgenommen werden, können nun so gewählt werden, dass ein z-abhängiger Modulationskontrast des Beleuchtungsmusters ein Maximum in einer Detektionsebene hat. Die Detektionsebene bezeichnet hierbei eine Ebene, welche scharf auf einen Detektor / eine Kamera abgebildet wird. Ganz allgemein können Absolutwerte von Φ₀ verwendet werden, bei welchen der Modulationskontrast zumindest kein Minimum hat; geeignet sind auch Absolutwerte von Φ₀, bei denen der z-abhängige Modulationskontrast näher an seinem Maximum als an seinem Minimum liegt.
• Während die beschriebenen Varianten auf drei Beugungsordnungen eingehen, soll diese Anzahl nicht als Obergrenze aufgefasst werden. Es können auch weitere Pfadabschnitte vorhanden sein, die anderen, beispielsweise einer -2. und +2. Beugungsordnung entsprechen. Die gemachten Aussagen sind auch für solche Fälle anwendbar. Werden weitere Beugungsordnungen verwendet, können ideale Zahlenwerte etwas von den hier angegebenen Werten abweichen, wobei gleichwohl durch die angegebenen Werte Vorteile erreicht werden.
• Die Beschreibungen zu den Teilstrahlen der -1, 0. und +1. Beugungsordnung betreffen die Phasenänderungen für ein Beleuchtungsmuster einer bestimmten Orientierung. Zum Berechnen des Hochauflösungsbilds werden auch Beleuchtungsmuster in anderer Orientierung aufgenommen. Hierbei werden ebenfalls die beschriebenen verschiedenen Phasenänderungen eingestellt. Die Aussagen zu den Phasenänderungen zum Teilstrahl/Pfadabschnitt der 0. Beugungsordnung beziehen sich also auf Beleuchtungsmuster derselben Orientierung und werden in analoger Weise auch für andere Beleuchtungsmusterorientierungen durchgeführt.
• Die Erfindung betrifft auch ein Lichtmikroskop mit einer Optikanordnung, die wie vorliegend beschrieben gestaltet ist. Die beschriebenen Verfahrensvarianten sind auch als Varianten der erfindungsgemäßen Optikanordnung anzusehen. Hierbei kann insbesondere eine Steuereinheit der Optikanordnung dazu eingerichtet sein, die Phasenschieber so anzusteuern, dass die zu den Verfahrensvarianten beschriebenen Ergebnisse erreicht werden. Bei weiteren Ausführungsbeispielen kann von den angegebenen Zahlenwerten abgewichen werden; insbesondere können Abweichungen von bis zu 10% oder bis zu 20% der angegebenen Werte umgesetzt werden, womit die beschriebenen Vorteile der Erfindung zumindest noch teilweise erreicht werden.
• Weitere Merkmale der Erfindung werden nachstehend mit Bezug auf die beigefügten schematischen Figuren beschrieben:
• 1 ist eine schematische Veranschaulichung der Wellenzahlvektoren von drei Lichtstrahlen, die einer 0., -1. und +1. Beugungsordnung entsprechen und miteinander interferieren sollen;
• 2 zeigt schematisch eine Ausführungsform eines Lichtmikroskops mit einer Optikanordnung gemäß der Erfindung;
• 3 zeigt schematisch eine Ausführungsform der Optikanordnung aus 2;
• 4 zeigt schematisch eine beispielhafte Gestaltung eines Teils der Optikanordnung aus 2 oder 3; und
• 5 zeigt schematisch die Positionen und Polarisationsrichtungen von Lichtstrahlen an oder hinter einem Wellenleiterchip eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops.
• Gleiche Komponenten sind in allen Figuren mit denselben Bezugszeichen versehen.
• 2 zeigt schematisch eine Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops 1, welches eine erfindungsgemäße Optikanordnung 95 umfasst.
• Das Mikroskop 1 umfasst eine Lichtquelle 4, welche Licht 5 aussendet, das über eine Eingangsauswahlvorrichtung 8 zu verschiedenen Eingängen eines Wellenleiterchips 90 der Optikanordnung 95 geleitet werden kann. Der Wellenleiterchip 90 oder die Kombination aus Wellenleiterchip 90 und Eingangsauswahlvorrichtung 8 stellen eine Strukturierungsvorrichtung 91 dar, durch welche Licht, das den Wellenleiterchip 90 verlässt, für die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (SIM) geeignet ist.
• Die Eingangsauswahlvorrichtung 8 ist hier durch einen Scanner 8 mit einem oder mehreren drehbaren Spiegeln oder anderen drehbaren lichtablenkenden Elementen gebildet. In der folgenden Beschreibung kann jedoch der Scanner 8 auch ersetzt werden durch andere variable Strahlumlenkeinrichtungen, die insbesondere akustooptisch arbeiten.
• Die Lichtquelle 4 kann, wie in 2 angegeben, mehrere Laser umfassen. Zwischen der Lichtquelle 4 und dem Scanner 8 kann optional eine Spiegeltreppe 6 mit mehreren teildurchlässigen Spiegeln verwendet werden, um die Strahlengänge von allen Lasern auf einen gemeinsamen Strahlengang zu vereinen. Außerdem können optional ein akustooptischer einstellbarer Filter (AOTF) 7 und Linsen 23 oder ein Strahlaufweiter 23 vorgesehen sein.
• Abhängig von der Ablenkrichtung des Scanners 8 können verschiedene Eingänge des Wellenleiterchips 90 ausgewählt werden. 2 zeigt als eine optionale Gestaltung mehrere optische Fasern 11.1, 11.2 und 11.3, welche Licht von dem Scanner 8 zu den verschiedenen Eingängen des Wellenleiterchips 90 führen.
• Jeder Eingang des Wellenleiterchips 90 führt zu mehreren Ausgängen, die in einem Punktmuster angeordnet sind. Licht, das über einen Eingang eintritt, verlässt daher den Wellenleiterchip 90 in einem Punktmuster. Ein Punktmuster besteht aus kohärenten Lichtstrahlbündeln, die in einer Probenebene 20 zu einem Beleuchtungsmuster interferieren können. Da jeder Eingang des Wellenleiterchips 90 mit verschiedenen Ausgängen verbunden ist, ist es möglich, zwischen verschiedenen Punktmustern zu schalten.
• Die Ausgänge des Wellenleiterchips 90 können in einer Pupillenebene angeordnet sein. Daher führt ein Punktmuster in der Pupillenebene zu einem strukturierten Intensitätsmuster von beispielsweise Streifen in der Probenebene 20.
• Strukturiertes Licht 15, welches den Wellenleiterchip 90 verlässt, wird über verschiedene optische Komponenten zu der Probenebene 20 geführt, welche ein optisches Element 18, beispielsweise eine Tubuslinse oder eine Zoom-Anordnung 18, und ein Objektiv 19 neben weiteren Komponenten umfassen können.
• Wie in 2 gezeigt, kann das Mikroskop 1 auch einen bewegbaren Deflektor 27 umfassen, welcher zwischen dem Scanner 8 und dem Wellenleiterchip 90 angeordnet ist. Abhängig von einer Position des Deflektors 27 wird Licht entweder zu Wellenleiterchip 90 geleitet oder um den Wellenleiterchip 90 herum direkt zur Probenebene 20.
• Der Deflektor 27 kann zwei reflektierende Oberflächen 9 und 16 umfassen, welche miteinander starr verbunden sind. Die reflektierende Oberfläche 9 reflektiert Licht vom Scanner 8 zu einer der optischen Fasern 11.1, 11.2, 11.3. Die reflektierende Oberfläche 16 reflektiert Licht 15 von den Ausgängen des Wellenleiterchips 90 zum optischen Element 18 und dem Objektiv 19.
• Von der Probe kommendes Licht wird mit einem Detektor oder einer Kamera 28 detektiert. Beispielsweise kann ein (dichroitischer) Strahlteiler 24 verwendet werden, um von der Probe kommendes Licht zu dem Detektor/der Kamera 28 zu leiten (und nicht zu dem Wellenleiterchip 90). Ein weiterer Detektor 22 kann für einen Laser-Scanning-Vorgang vorgesehen sein, in welchem der Deflektor 27 so angeordnet ist, dass sich Licht 5 nicht über den Wellenleiterchip 90 ausbreitet. Vor dem Detektor 22 und der Kamera 28 können optional jeweils Linsen und Filter 26 verwendet werden.
• Eine Steuereinheit 21 kann dazu eingerichtet sein, die später näher beschriebenen Phasenschieber des Wellenleiterchips 90 zu steuern.
• Mit Bezug auf 3 wird das Design eines beispielhaften Wellenleiterchips 90 weiter beschrieben. Der Wellenleiterchip 90 umfasst ein Substrat 70, welches beispielsweise Quarzglas sein kann. Innerhalb des Substrats 70 sind Pfade gebildet, welche einen anderen Brechungsindex als das Substrat 70 haben. Es ist dadurch möglich, Licht entlang dieser Pfade zu leiten. Der Wellenleiterchip 90 umfasst mehrere Eingänge 31, 41, 51, welche jeweils mit einem Pfad verbunden sind, welche im Folgenden als Lichtleitpfade 32, 42, 52 bezeichnet werden. Optische Fasern 11.1, 11.2, 11.3 können optional verwendet werden, um Licht zu den verschiedenen Eingängen 31, 41, 51 zu leiten.
• Jeder Lichtleitpfad 32, 42, 52 führt zu einem jeweiligen Teiler (englisch: Splitter) 33, 43, 53, welcher den Lichtleitpfad 32, 42, 52 in mehrere Teile aufspaltet, welche als Pfadabschnitte 34-36, 44-46, 54-56 bezeichnet werden. Jeder Pfadabschnitt führt zu einem jeweiligen Ausgang 37-39, 47-49, 57-59, wo Licht den Wellenleiterchip 90 verlässt.
• In dem dargestellten Beispiel gibt es einen ersten, zweiten und dritten Eingang 31, 41, 51. Die Ausgänge 37 bis 39, die mit dem ersten Eingang 31 verbunden sind, bilden ein erstes Punktmuster. Entsprechend bilden die Ausgänge 47 bis 49 des zweiten Eingangs 41 und die Ausgänge 57 bis 59 des dritten Eingangs 51 ein zweites beziehungsweise drittes Punktmuster.
• Der Wellenleiterchip 90 definiert eine Ebene P, welche in oder parallel zu einer Pupillenebene angeordnet sein kann. In anderen Worten spannen die (Haupt-) Richtungen der Lichtleitpfade 32, 42, 52 eine Ebene P auf, welche parallel zu der Pupillenebene stehen kann und in dem Bereich von der Pupillenebene oder in der Pupillenebene angeordnet sein kann. Alle Ausgänge 37-39, 47-49, 57-59 sind somit in dem Bereich oder in der Pupillenebene angeordnet.
• Ein Punktmuster in der Pupillenebene entspricht räumlich den Strahlbündeln von verschiedenen Beugungsordnungen eines Gitters, welches herkömmlicherweise in einer Zwischenbildebene angeordnet ist. Die Beugungsordnungen umfassen insbesondere eine nullte Beugungsordnung, welche ein mittiger Strahlteil ist, und eine -1. und +1. Beugungsordnung, welche den gleichen Abstand zur 0. Beugungsordnung haben können. In einer Pupillenebene können diese 0., -1. und +1. Beugungsordnung drei Punkte bilden, die in etwa entlang einer Linie angeordnet sind.
• Ein mittiger Pfadabschnitt 45 mit zugehörigen Ausgang 48 entspricht der 0. Beugungsordnung, wobei sich der Ausgang 48 an oder in dem Bereich einer optischen Achse des Lichtmikroskops befinden kann. Die beiden äußeren Pfadabschnitte 44, 46 mit zugehörigen Ausgängen 47, 49 entsprechen der -1. und +1. Beugungsordnung. Die Lichtanteile der 0., -1. und +1. Beugungsordnung interferieren in der Probenebene und bilden dort ein Beleuchtungsmuster. Um ein Hochauflösungsbild zu berechnen, werden nacheinander mehrere Probenbilder mit verschiedenen Beleuchtungsmustern aufgenommen. Hierbei werden einerseits verschieden orientierte Beleuchtungsmuster erzeugt, indem nacheinander die verschiedenen Eingänge 31, 41, 51 beleuchtet werden. Zudem werden mit jeder Beleuchtung eines bestimmten Eingangs mehrere Mikroskopbilder aufgenommen, die sich in der Phase des Beleuchtungsmusters unterscheiden.
• Um die Phase des Beleuchtungsmusters zu variieren, werden Phasenschieber 144, 145, 146 an den Pfadabschnitten 44, 45, 46 zur 0., -1. und +1. Beugungsordnung verwendet, um eine optische Weglänge in diesen Pfadabschnitten 44, 45, 46 zu variieren. Die Phasenschieber 144, 145, 146 sind in den Wellenleiterchip 90 integriert und können beispielsweise thermoelektrische, piezoelektrische, akustooptische oder elektrooptische Phasenschieber sein. Beispielsweise verändert ein thermoelektrischer Phasenschieber die Temperatur des zugehörigen Pfadabschnitts und dadurch die optische Weglänge. In dieser Weise verändert der Phasenschieber 145 einen Phasenwert Φ₀ für Licht der 0. Beugungsordnung; der Phasenschieber 144 verändert einen Phasenwert Φ_-1 (oder auch als Φ₂ bezeichnet) für Licht der -1. Beugungsordnung; und der Phasenschieber 146 stellt eine Änderung des Phasenwerts Φ₁ für Licht der +1. Beugungsordnung ein. Hierbei wird abkürzend mit beispielsweise „Licht der +1. Beugungsordnung“ das Licht bezeichnet, dass durch den Pfadabschnitt läuft, dessen Ausgang so angeordnet ist oder von dessen Ausgang das Licht so weitergeleitet wird, dass es bei einer Interferenz in der Probenebene einer +1. Beugungsordnung eines (hier nicht verwendeten) Gitters in einer Zwischenbildebene entspricht.
• Wie eingangs näher beschrieben, erzeugen die interferierenden Teilstrahlen der 0., -1. und +1. Beugungsordnung ein Beleuchtungsmuster, dessen Intensität mit einem Modulationskontrast erster Ordnung und einem Modulationskontrast zweiter Ordnung oszilliert. Um die Phase des Beleuchtungsmusters zu variieren, müssen die Phasen des Modulationskontrasts erster und zweiter Ordnung variiert werden. Für den Modulationskontrast erster Ordnung, der proportional ist zu: $$\text{cos}\left[\frac{2\pi }{\lambda }\text{cos}\left(\phi \right)\cdot x+\frac{{\varphi }_1-{\varphi }_2}{2}\right]\cdot \text{cos}\left[\frac{2\pi }{\lambda }\left(1-\text{sin}\left(\phi \right)\right)\cdot z+\frac{2{\varphi }_0-{\varphi }_1-{\varphi }_2}{2}\right]$$

  

  erfolgt dies, indem die Phasenschieber 144-146 die Phasen Φ₀ , Φ₁ und Φ₂ variieren.
• Die Phasen Φ₁ und Φ₂ werden von einem Arbeitspunkt ausgehend in verschiedene Richtungen variiert. Bei einem thermoelektrischen Phasenschieber wird beispielsweise von einer Anfangstemperatur ausgehend, die höher als die Umgebungstemperatur ist und insbesondere für beide Pfadabschnitte 44, 46 gleich sein kann, einer der Pfadabschnitte 44, 46 erwärmt und der andere der Pfadabschnitte 44, 46 wird weniger oder nicht erhitzt, so dass seine Temperatur sinkt. Vorzugsweise werden die Temperaturen der beiden Pfadabschnitte 44, 46 so geändert, dass Φ₁ und Φ₂ gerade um den gleichen Betrag geändert werden beziehungsweise betragsgleich sind. Je nachdem, ob noch ein konstanter Phasenunterschied zwischen Φ₁ und Φ₂ vorliegt und in den Gleichungen berücksichtigt wird oder nicht, können daher die Phasenschieber 144, 146 so angesteuert werden, dass stets Φ₁ = -Φ₂ oder Φ₁ = -Φ₂ + const. erfüllt ist, wobei const. eine Konstante bezeichnet, die für die verschiedenen Phaseneinstellungen, zu denen die Mikroskopbilder aufgenommen werden, konstant ist.
• Aus dem obigen Ausdruck zum Modulationskontrast erster Ordnung sieht man für den Fall, dass die Phasen der +1. und -1. Beugungsordnung gemäß Φ₁ = -Φ₂ geändert werden, und wenn Φ₀ nicht verändert würde (was nicht Teil der Erfindung ist), dass:
• - der Phasenausdruck $\frac{2{\varphi }_0-{\varphi }_1-{\varphi }_2}{2}$
  
  im zweiten cosinus-Term für die verschiedenen Phaseneinstellungen konstant ist und demnach nicht zum Phasenschieben beiträgt,
• - der Phasenausdruck $\frac{{\varphi }_1-{\varphi }_2}{2}$
  
  im ersten cosinus-Term über einen Bereich von 2π variiert werden müsste, damit die Phasenschiebungen eine gesamte Periode abdecken.
• Damit $\frac{{\varphi }_1-{\varphi }_2}{2}$

  

  einen Bereich von 2π abdeckt, müssen Φ₁ und Φ₂ um jeweils 2π variiert werden, also insbesondere Werte innerhalb von 0π bis 2π annehmen. Hierzu sind nachteilig große Temperaturänderungen erforderlich.
• Im Gegensatz hierzu werden bei einer Ausführungsform der Erfindung Φ₁ und Φ₂ nur um jeweils 1π (oder weniger) variiert, womit $\frac{{\varphi }_1-{\varphi }_2}{2}$

  

  einen Bereich von π abdeckt. Damit dennoch Variationen über den gesamten Phasenbereich möglich sind, kann Φ₀ um π verstellt werden. Dadurch ändert sich das Argument des hinteren cosinus-Terms im obigen Ausdruck um π, womit sich das Vorzeichen +/- dieses cosinus-Terms ändert.
• Durch den Vorzeichenwechsel entspricht die genannte Variation von $\frac{{\varphi }_1-{\varphi }_2}{2}$

  

  dem Bereich von 1π bis 2π. Vorteilhafterweise kann daher erfindungsgemäß eine Phasenänderung über den gesamten Phasenbereich der Intensitätsmodulation erfolgen, wobei Φ₁ und Φ₂ nur verhältnismäßig wenig variiert werden müssen und demnach nur moderate Temperaturänderungen an den Pfadabschnitten 44 und 46 nötig sind.
• Die obigen Beschreibungen zu den Pfadabschnitten 44-46 und ihren zugehörigen Phasenschiebern 144-146 gelten gleichermaßen für die übrigen Pfadabschnitte 34-36 und 54-56 mit jeweiligen Phasenschiebern 134-136 und 154-156.
• Anstelle der beschriebenen Phasenschieber, die in den Wellenleiterchip integriert sind, können auch im Strahlengang hinter dem Wellenleiterchip separate Phasenschieber angeordnet sein, beispielsweise transparente Wackelplatten, die je nach Kippwinkel eine unterschiedlich lange optische Weglänge für durchlaufendes Licht bereitstellen.
• Ein Hochauflösungsbild kann nun aus mehreren Mikroskopbildern berechnet werden, wobei jeweils ein Mikroskopbild aufgenommen wird zu n verschiedenen Phaseneinstellungen pro beleuchtetem Wellenleiterchip-Eingang. Mit den drei Eingängen werden also 3n Mikroskopbilder aufgenommen und zu einem Hochauflösungsbild verrechnet. Für alle dieser Phaseneinstellungen werden die Phasenschieber vorzugsweise so angesteuert, dass Φ₁ und Φ₂ jeweils auf mehrere verschiedene Werte in einem Intervall mit einer Intervall breite von jeweils 1π eingestellt werden (beziehungsweise so, dass (Φ₁ - Φ₂)/2 auf mehrere Werte in einem Intervall mit einer Breite von 1π verstellt wird), und zusätzlich wird Φ₀ auf zwei Werte eingestellt, die voneinander um π beabstandet sind. Vorteilhafterweise müssen hierdurch die Phasenschieber nur über verhältnismäßig kleine Intervalle verstellt werden.
• Für einen besonders guten Kontrast in einem Interferenzmuster sind die relativen Lichtintensitäten der Ausgänge 47 bis 49 wichtig. Der Modulationskontrast erster Ordnung liefert eine z-Modulation und führt somit zu einer axialen Auflösungssteigerung (das heißt in z-Richtung / entlang der optischen Achse). Der Modulationskontrast zweiter Ordnung liefert die laterale Auflösungssteigerung. Vorzugsweise ist der Teiler 43 so gestaltet, dass die Intensität in dem mittleren Ausgang 48 niedriger ist als bei den übrigen Ausgängen 47, 49. Zum Beispiel kann die Intensität in dem mittleren Ausgang 48 zwischen 2% und 25% der Lichtintensität betragen, die den Teiler 43 erreicht. Die übrige Lichtintensität wird in gleichen Teilen auf die zwei übrigen Ausgänge 47, 49 verteilt. Diese Beschreibungen gelten wiederum gleichermaßen auch für die übrigen Pfadabschnitte und Ausgänge.
• Die Gruppen an Ausgängen 37-39, 47-49 und 57-59 unterscheiden sich in der Anordnung der hierdurch erzeugten Punktmuster. Jeder Eingang 31, 41, 51 ist mit einem zentralen Ausgang 38, 48, 58 verbunden, welche nebeneinander in einem zentralen Bereich gebildet sind, welcher einer optischen Achse des Mikroskops entsprechen kann. Abstände zwischen den zentralen Ausgänge 38, 48, 58 sind kleiner als zu den übrigen Ausgängen 37, 39, 47, 49, 57, 59, die auf einem kreisförmigen Band um diese zentrale Region herum angeordnet sind. Da die mittigen Ausgänge 38, 48, 58 bloß nebeneinander und nicht an exakt derselben Position sein können, sind die übrigen Ausgänge 37, 39, 47, 49, 57, 59 insbesondere nicht auf exakt einem Kreis angeordnet, sondern vielmehr auf einem kreisförmigen Band, wobei die Ausgänge 37 und 39 denselben Abstand zum Ausgang 38 haben und gleichermaßen die Ausgänge 47 und 49 denselben Abstand zum Ausgang 48 haben und die Ausgänge 57 und 59 denselben Abstand zum Ausgang 58 haben.
• Verschiedene Punktmuster, die relativ zueinander gedreht sind, entsprechen in der Probenebene strukturierten Intensitätsmustern, welche relativ zueinander gedreht sind.
• Zusätzlich zu den dargestellten Pfadabschnitten kann Licht von einem Eingang auch auf weitere Pfadabschnitte verteilt werden. Die Ausgänge dieser Pfadabschnitte können so angeordnet sein, dass sie weiteren Beugungsordnungen entsprechen, oder können auch andere Muster bilden.
• Alle Ausgänge des Wellenleiterchips 90 können in einer gemeinsamen Ebene P angeordnet sein, welche in oder an einer Pupillenebene liegt. Dies wird erreicht, indem Licht aus dem Wellenleiterchip 90 unter einem Winkel relativ zu den Richtungen der Lichtleitpfade 32, 42, 52 ausgekoppelt wird. Der Winkel kann beliebige Werte haben, die von 0 verschieden sind, insbesondere kann der Winkel zur Ebene P ungefähr 90° oder allgemeiner zwischen 20° und 90° betragen.
• Dies wird weiter mit Bezug auf 4 erläutert, welche schematisch Details des Wellenleiterchips 90 aus 3 zeigt. 4 ist eine Querschnittsansicht des Wellenleiterchips 90, womit diese Ansicht senkrecht zur Ansicht aus 3 ist.
• 4 zeigt den Pfadabschnitt 34, der durch das Substrat 70 zum Ausgang 37 führt. Zum Umlenken und Auskoppeln von Licht ist eine Vertiefung 72 in dem Substrat 70 vorgesehen, welche eine Oberfläche 71 oder Schnittstelle 71 bildet, die an den Pfadabschnitt 34 angrenzt. Licht aus dem Pfadabschnitt 34 wird daher an der Schnittstelle 71 abgelenkt, beispielsweise durch totale interne Reflexion, durchläuft sodann den Wellenleiterchip 90 und verlässt diesen an einer Seite gegenüberliegend zur Vertiefung 72 und gegenüberliegend zur Schnittstelle 71. Ein Reflexionswinkel an der Schnittstelle 71 ist ungefähr 90°. 4 zeigt in gestrichelten Linien einen aufgeweiteten Lichtstrahl, wobei eine zentrale gestrichelte Linie 95 des aufgeweiteten Lichtstrahls eine Ausgangsrichtung 75 des Lichts angibt. Die Ausgangsrichtung steht in einem Winkel von (etwa) 90° zur Ebene des Wellenleiterchips. Ein Bereich, in welchem Licht, das von der Schnittstelle 71 reflektiert wird, den Wellenleiterchip 90 verlässt, wird als Ausgang 37 bezeichnet. Solch ein Bereich kann eine Schnittstelle zwischen dem Substrat 70 und einem umgebenden Medium, typischerweise Luft, sein.
• Ist die Oberfläche 71 eine Schnittstelle zwischen Luft und dem Substrat/dem jeweiligen Pfadabschnitt, so dringt ein evaneszentes Lichtfeld in die Luft ein. Für typischerweise verwendete Lichtwellenlängen kann dieses evaneszente Feld beispielsweise ungefähr 100 nm betragen. Aufgrund von Wechselwirkungen mit Luftmolekülen kann das evaneszente Feld zu einer Beeinträchtigung der Oberfläche 71 führen. Um solche Nachteile zu vermeiden, kann die Oberfläche 71 beschichtet sein (beispielsweise mit einem Metall oder dichroitisch beschichtet), damit Wechselwirkungen eines evaneszenten Feldes mit Luft vermieden werden. Alternativ kann die Vertiefung 72 mit einer Abdeckung versehen und mit einem Schutzgas wie beispielsweise Argon gefüllt sein. Die Oberfläche 71 kontaktiert dann das Schutzgas, welches nicht mit dem evaneszenten Feld wechselwirkt.
• An Stelle von totaler interner Reflexion ist es auch möglich, einen Spiegel an der Oberfläche 71 zu verwenden.
• Nach der Reflexion an der Schnittstelle 71 weitet sich ein Lichtstrahl auf und verlässt daher den Wellenleiterchip 90 mit einem größeren Querschnitt verglichen mit einem Fall, in welchem der Lichtstrahl den Wellenleiterchip 90 an der Schnittstelle 71 verlassen würde, ohne vorher das Substrat zu durchqueren. Durch den größeren Querschnitt ist eine Spitzenintensität über den Querschnitt verringert. Diese reduzierte Spitzenintensität stellt sicher, dass keine Schäden an der Oberfläche 37, an welcher das Licht den Wellenleiter verlässt, entstehen. Vorteilhafterweise sind daher keine weiteren Elemente (wie zum Beispiel Endkappen, die an optischen Fasern verwendet werden) notwendig, um Licht aus dem Wellenleiterchip 90 auszukoppeln. Stattdessen kann Licht einfach aus dem Substrat 70 austreten, ohne dass weitere Elemente erforderlich wären.
• Zusätzliche optische Elemente, wie zum Beispiel eine Mikrolinse oder eine Halbwellenplatte, können direkt an dem Ausgang (das heißt, an dem Ort des Substrats, wo reflektiertes Licht austritt) angebracht werden. Solch eine effiziente Anordnung und Befestigung von Mikrolinsen oder anderen Komponenten wäre nicht möglich, wenn Licht den Wellenleiterchip an der Seite der Schnittstelle/des Spiegels 71 verlassen würde.
• Die Effizienz von jedem Teiler hängt von der Polarisation von einkommendem Licht ab. Vorzugsweise ist das Licht linear polarisiert in einer Richtung, in welcher die Teilung erfolgt (wie durch die Pfeile in 3 dargestellt). SIM erfordert jedoch eine Polarisation, welche vorzugsweise senkrecht zu dieser Orientierung steht. Es ist daher vorteilhaft, die Polarisation des Lichts hinter den Teilern zu drehen.
• Dies wird näher mit Bezug auf 5 erläutert, welche im linken Teil die drei Punktmuster zeigt. Ein erstes Punktmuster umfasst die Lichtpunkte 81, 82, 83 in einer Pupillenebene, welche den Ausgängen 37 bis 39 entsprechen. Ein zweites Punktmuster umfasst die Lichtpunkte 84 bis 86, welche den Ausgängen 47 bis 49 entsprechen. Ein drittes Punktmuster schließlich umfasst die Lichtpunkte 87 bis 89, welche den Ausgängen 57 bis 59 entsprechen. Die Polarisationsrichtung von jedem Lichtpunkt 81 bis 89 ist durch einen Pfeil gekennzeichnet.
• Zwei Halbwellenplatten können zum Drehen der Polarisationsrichtung um stets 90° verwendet werden. Solche Halbwellenplatten 25 sind in 2 zwischen dem Wellenleiterchip 90 und der Probenebene 20 gezeigt. Vorzugsweise sind die Halbwellenplatten 25 direkt an den Ausgängen des Wellenleiterchips 90 angeordnet. In dieser Weise genügen kleinere Querschnitte der Platten 25. Die Polarisationsrichtungen der Lichtpunkte/Lichtflecken 81-89 vor und hinter der ersten Halbwellenplatte sind in dem mittleren Bereich von 5 durch Pfeile dargestellt. Dieser mittlere Bereich zeigt auch die Orientierung der schnellen Achse 96 der ersten Halbwellenplatte. Es ist zu beachten, dass nur der Winkel zwischen den Achsen der zwei Halbwellenplatten wichtig ist, aber nicht ihre absolute Ausrichtung. Der rechte Teil von 5 zeigt die Polarisationsrichtungen der Lichtflecken 81-89 vor und hinter der zweiten Halbwellenplatte. Angegeben ist auch die schnelle Achse 97 der zweiten Halbwellenplatte. Wie in dem rechten Teil von 5 dargestellt, ist die Polarisationsrichtung von jedem Lichtpunkt um 90° gedreht und steht nun senkrecht zu einer Linie, welche die Punkte 81-83 desselben Punktmusters miteinander verbindet.
• Mit Bezug auf 3 kann die Oberfläche von dem Substrat an jedem Ausgang 37 auch mit einer Struktur versehen sein, welche als eine Halbwellenplatte wirkt, womit eine der zwei Halbwellenplatten ersetzt wird.
• Mit der beschriebenen Optikanordnung, die einen Wellenleiterchip umfasst, kann zwischen verschiedenen Beleuchtungsmustern, die sich in ihrer Orientierung und Phase unterscheiden, schnell gewechselt werden. Hierbei kann die Optikanordnung raumsparend und mit einer geringen Anzahl beweglicher Komponenten gestaltet sein. Durch die vorteilhafte Phasenvariation an Lichtleitpfaden, die einer 0. Beugungsordnung entsprechen, können die Beleuchtungsmuster unterschiedlicher Phase besonders effizient bereitgestellt werden. Die in den Figuren dargestellten Ausführungsbeispiele können auch so modifiziert werden, dass die Strukturierungsvorrichtung ohne Wellenleiterchip gestaltet ist. Beispielsweise können anstelle des Wellenleiterchips Splitter und optische Fasern genutzt werden, mit denen dieselben Punktmuster erzeugt werden, die zu den Figurenbeispielen beschrieben wurden. Auch ist es möglich, ein Gitter oder Phasenmodulatoren anstelle des Wellenleiterchips zu verwenden, um mehrere kohärente Teilstrahlen zu erzeugen. Für jeden Teilstrahl, der bis zur Probenebene geleitet wird, kann mindestens ein eigener Phasenschieber vorhanden sein, so dass alle Teilstrahlen unabhängig voneinander phasengeschoben werden können. Durch ein Gitter erzeugte Teilstrahlen, für die keine Phasenschieber vorhanden sind, werden vorzugsweise ausgeblendet, bevor sie die Probenebene erreichen.
• Bezugszeichenliste

1

Lichtmikroskop

4

Lichtquelle

5

Licht

6

Spiegeltreppe zum Kombinieren der Strahlpfade

7

AOTF

8

Scanner

9, 16

reflektierende Oberflächen des bewegbaren Deflektors

10

dichroitischer Strahlteiler

11.1, 11.2, 11.3

optische Fasern

15

strukturiertes Licht, das den Wellenleiterchip verlässt

18

Zoom-Anordnung

19

Objektiv

20

Probenebene

21

Steuereinheit

22

Detektor

23

Linsen

24

dichroitischer Strahlteiler

25

Ausgangspolarisationseinheit mit Halbwellenplatten

26

Filter

27

bewegbarer Deflektor

28

Kamera

31, 41, 51

Eingänge des Wellenleiterchips

32, 42, 52

Lichtleitpfad

33, 43, 53

in Wellenleiterchip gebildeter Teiler

34, 35, 36; 44, 45, 46; 54, 55, 56

Pfadabschnitte des Wellenleiterchips

37, 38, 39; 47, 48, 49; 57, 58, 59

Ausgänge des Wellenleiterchips

70

Substrat des Wellenleiterchips

71

Schnittstelle zum Ablenken von Licht aus dem Wellenleiterchip heraus

72

Vertiefung in dem Substrat des Wellenleiterchips

75

Austrittsrichtung von Licht aus den Ausgängen

81 bis 89

Lichtpunkte in einer Pupillenebene

90

Wellenleiterchip

91

Strukturierungsvorrichtung

95

Optikanordnung

96, 97

schnelle Achsen der Halbwellenplatten

134, 135, 136

Phasenschieber zu den Pfadabschnitten 34, 35, 36

144, 145, 146

Phasenschieber zu den Pfadabschnitten 44, 45, 46

154, 155, 156

Phasenschieber zu den Pfadabschnitten 54, 55, 56

P

durch den Wellenleiterchip definierte Ebene.

• ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
• Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
• Zitierte Patentliteratur
• DE 102017109645 [0009]
• WO 2014/060270 A2 [0009]
• US 2013/0335819 A1 [0011, 0032]
• DE 102018110072 [0014]
• DE 102018110083 [0014]
• DE 102018110109 [0014]
• DE 102018110117 [0014]

Claims (15)

1. Verfahren zum Betreiben eines Lichtmikroskops mit strukturierter Beleuchtung, umfassend: - Bereitstellen von Beleuchtungsmustern mit Hilfe einer Strukturierungsvorrichtung (91), welche auftreffendes Licht in mindestens drei kohärente Teilstrahlen aufspaltet, die einer -1., 0. und +1. Beugungsordnung von Licht entsprechen, - wobei unterschiedliche Phasen der Beleuchtungsmuster erzeugt werden, indem mit Phasenschiebern (134, 136, 144, 146, 154, 156) verschiedene Phasenwerte für die Teilstrahlen eingestellt werden, und - Aufnehmen von jeweils mindestens einem Mikroskopbild zu jedem der Beleuchtungsmuster und Verrechnen der Mikroskopbilder zu einem Hochauflösungsbild, dadurch gekennzeichnet, - dass Phasenschieber (134, 136, 144, 146, 154, 156) nicht nur für die Teilstrahlen der -1. und +1. Beugungsordnung vorgesehen sind, sondern dass auch mindestens ein Phasenschieber (135, 145, 155) für den Teilstrahl der 0. Beugungsordnung vorgesehen ist, - dass zum Bereitstellen mehrerer Beleuchtungsmuster unterschiedlicher Phase zumindest zwei verschiedene Phasenwerte (Φ₀) mit dem mindestens einen Phasenschieber (135, 145, 155) zur 0. Beugungsordnung eingestellt werden und die hiermit aufgenommenen Mikroskopbilder zu dem Hochauflösungsbild verrechnet werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem mit dem Phasenschieber (145) zur 0. Beugungsordnung zwei verschiedene Phasenwerte (Φ₀) eingestellt werden, die sich um π unterscheiden und jeweils mindestens ein Mikroskopbild aufgenommen wird, die zu dem Hochauflösungsbild verrechnet werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem zu jedem der beiden Phasenwerte (Φ₀) des Phasenschiebers (145) zur 0. Beugungsordnung, welche sich um π unterscheiden, jeweils mit den Phasenschiebern (144, 146) zur -1. und +1. Beugungsordnung mehrere verschiedene Phasenwerte (Φ₁, Φ₂) eingestellt werden und zu jedem eingestellten Phasenwert jeweils mindestens ein Mikroskopbild aufgenommen wird, die zu dem Hochauflösungsbild verrechnet werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem zum Bereitstellen der verschiedenen Beleuchtungsmuster die beiden Phasenschieber (144, 146), die zur -1. und +1. Beugungsordnung gehören, von einem Arbeitspunkt ausgehend in entgegengesetzte Richtungen verstellt werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Phasenschieber (144, 146) zur -1. und +1. Beugungsordnung vom Arbeitspunkt ausgehend so in entgegengesetzte Richtungen verstellt werden, dass die beiden erzeugten Phasenwerte (Φ₁, Φ₂) zur -1. und +1. Beugungsordnung um denselben Betragswert aber mit verschiedenen Vorzeichen geändert werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem zum Bereitstellen der verschiedenen Beleuchtungsmuster die Phasenschieber (144, 146) zur -1. und +1. Beugungsordnung in einem Intervall verstellt werden, welches höchstens eine Phasenänderung eines Modulationskontrasts erster Ordnung von π umspannt, und bei dem zum Bereitstellen von Phasenänderungen eines Modulationskontrasts erster Ordnung, die einer Phasenänderung von größer π entsprechen, zusätzlich mit dem Phasenschieber (145) zur 0. Beugungsordnung eine Änderung des Phasenwerts (Φ₀), insbesondere eine Phasenänderung um π, eingestellt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem zum Bereitstellen der verschiedenen Beleuchtungsmuster die Phasenschieber (144, 146) zur -1. und +1. Beugungsordnung so verstellt werden, dass stets $$0\pi \le \left({\Phi }_1-{\Phi }_{-1}\right)\text{/}2\le 1\pi$$

   

   gilt, wobei (Φ₁ - Φ_-1)/2 einen Phasenwert des Modulationskontrasts erster Ordnung angibt, Φ₁ den Phasenwert zur 1. Beugungsordnung angibt, und Φ_-1 den Phasenwert zur-1. Beugungsordnung angibt, wobei zum Bereitstellen einer Phasenänderung des Modulationskontrasts erster Ordnung, welche in einem Intervall von 1π bis 2π liegt, der Phasenwert (Φ₀) zur 0. Beugungsordnung um π verändert wird und die Phasenschieber (144, 146) zur -1. und +1. Beugungsordnung nach wie vor so verstellt werden, dass stets $$0\pi \le \left({\Phi }_1-{\Phi }_{-1}\right)\text{/}2\le 1\pi$$

   

   gilt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem die Strukturierungsvorrichtung (91) einen Wellenleiterchip (90) umfasst, in dem auftreffendes Licht aufgespalten wird auf mindestens drei Pfadabschnitte (34-36, 44-46, 54-56), die zu mindestens drei Ausgängen (37-39, 47-49, 57-59) führen, wobei die mindestens drei Ausgänge (37-39, 47-49, 57-59) und ihre zugehörigen Pfadabschnitte (34-36, 44-46, 54-56) der -1., 0. und +1. Beugungsordnung von Licht entsprechen.
9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die Phasenschieber (134-136, 144-146, 154-156) am Wellenleiterchip (90) an den Pfadabschnitten (34-36, 44-46, 54-56) zur -1., 0. und +1. Beugungsordnung vorgesehen sind.
10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem als Phasenschieber (134-136, 144-146, 154-156) entweder thermische Phasenschieber, piezoelektrische Phasenschieber, elektrooptische Phasenschieber oder akustooptische Phasenschieber verwendet werden.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, bei dem eine Maximaldifferenz zwischen Einstellungen der Phasenschieber (134, 136; 144, 146; 154, 156) zur -1. und +1. Beugungsordnung, das heißt - eine maximale Temperaturdifferenz zwischen zwei thermischen Phasenschiebern, - eine maximale Spannungsdifferenz zwischen Einstellungen zweier piezoelektrischer oder elektrooptischer Phasenschieber oder - ein maximaler Frequenzunterschied zwischen Einstellungen zweier akustooptischer Phasenschieber, höchstens so groß ist, dass bei der Maximaldifferenz noch (Φ₁ - Φ_-1)/2 ≤ 1π gilt, wobei Φ₁ - Φ_-1 die Differenz zwischen den Phasenänderungen zur -1. und +1. Beugungsordnung angibt, die bei der Maximaldifferenz erreicht wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem die Mikroskopbilder, die zu einem Hochauflösungsbild verrechnet werden, mit zwei verschiedenen Phasenwerten (Φ₀) zur 0. Beugungsordnung aufgenommen werden, welche sich um π unterscheiden und deren Absolutwerte so gewählt sind, dass ein z-abhängiger Modulationskontrast des Beleuchtungsmusters ein Maximum in einer Detektionsebene hat, welche scharf auf einen Detektor abgebildet wird, wobei z die Ausbreitungsrichtung des Lichts angibt.
13. Optikanordnung zur strukturierten Beleuchtung bei einem Lichtmikroskop, mit einer Strukturierungsvorrichtung (91), welche auftreffendes Licht in mindestens drei kohärente Teilstrahlen aufspaltet, die einer -1., 0. und +1. Beugungsordnung von Licht entsprechen, - mit mehreren Phasenschiebern (144-146), die dazu eingerichtet sind, die Phasen der Teilstrahlen zu ändern, um unterschiedliche Phasen der Beleuchtungsmuster einzustellen, dadurch gekennzeichnet, dass die Optikanordnung eine Steuereinheit (21) umfasst, welche dazu eingerichtet ist, nicht nur mit den Phasenschiebern (134, 136, 144, 146, 154, 156), die zur -1. und +1. Beugungsordnung gehören, verschiedene Phasenänderungen einzustellen, sondern auch mit dem oder den Phasenschiebern (135, 145, 155), die zur 0. Beugungsordnung gehören, zumindest zwei verschiedene Phasenwerte einzustellen, insbesondere genau zwei voneinander um π beabstandete Phasenwerte, und die hierbei aufgenommenen Mikroskopbilder zu dem Hochauflösungsbild zu verrechnen.
14. Optikanordnung nach Anspruch 13, wobei die Strukturierungsvorrichtung (91) einen Wellenleiterchip (90) umfasst, in dem auftreffendes Licht aufgespalten wird auf mindestens drei Pfadabschnitte (34-36, 44-46, 54-56), die zu mindestens drei Ausgängen (37-39, 47-49, 57-59) führen, wobei die mindestens drei Ausgänge (37-39, 47-49, 57-59) und ihre zugehörigen Pfadabschnitte (34-36, 44-46, 54-56) der -1., 0. und +1. Beugungsordnung von Licht entsprechen.
15. Lichtmikroskop mit einer Optikanordnung nach Anspruch 13 oder 14, wobei die Steuereinheit (21) insbesondere zum Ausführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12 eingerichtet ist.

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