DE102006038647B4

DE102006038647B4 - Verfahren und Fluoreszenzlichtmikroskop zum räumlich hoch aufgelösten Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur

Info

Publication number: DE102006038647B4
Application number: DE200610038647
Authority: DE
Inventors: Prof. Dr. Hell Stefan
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2006-08-17
Filing date: 2006-08-17
Publication date: 2012-05-03
Anticipated expiration: 2026-08-18
Also published as: DE102006038647A1

Abstract

Verfahren zum räumlich hoch aufgelösten Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur einer Probe, – wobei der Fluoreszenzfarbstoff mit Anregungslicht in einen fluoreszierenden angeregten Zustand angeregt wird; – wobei wechselnde Anteile des Fluoreszenzfarbstoffs mit einem eine Polarisation aufweisenden optischen Signal selektiert werden, so dass von dem in dem fluoreszierenden angeregten Zustand befindlichen Fluoreszenzfarbstoff spontan emittiertes Fluoreszenzlicht nur von einer Teilmenge der Farbstoffmoleküle des Fluoreszenzfarbstoffs stammt, die mit dem Anregungslicht beaufschlagt wurden; und – wobei der Fluoreszenzfarbstoff eine von einer räumlichen Ausrichtung jedes seiner Farbstoffmoleküle einerseits und der Polarisation des optischen Signals andererseits abhängige Übergangswahrscheinlichkeit in Folge des optischen Signals aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass ein weiteres optisches Signal (12) mit einer anderen Polarisation (14) als die Polarisation (11) des optischen Signals (5) auf die Probe (3) gerichtet wird, um Fluoreszenzlicht (9) von Farbstoffmolekülen (4) in der Probe (3), die eine weniger als maximale Übergangswahrscheinlichkeit in Folge des optischen Signals (5) aufweisen, zu diskriminieren.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum räumlich hoch aufgelösten Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur einer Probe, wobei der Fluoreszenzfarbstoff mit Anregungslicht in einen fluoreszierenden angeregten Zustand angeregt wird und wobei wechselnde Anteile des Fluoreszenzfarbstoffs mit einem eine Polarisation aufweisenden optischen Signal selektiert werden, so dass von dem in dem fluoreszierenden angeregten Zustand befindlichen Fluoreszenzfarbstoff spontan emittiertes Fluoreszenzlicht nur von einer Teilmenge der Farbstoffmoleküle des Fluoreszenzfarbstoffs stammt, die mit dem Anregungslicht beaufschlagt wurden. Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf ein Fluoreszenzlichtmikroskop zur Durchführung dieses Verfahrens mit den Merkmalen des Oberbegriffs des Patentanspruchs 15.
Bei der Erfindung kann die Hochauflösung beim Abbilden der Struktur auf unterschiedlichen Wegen erreicht werden. Auf jedem dieser Wege wird zu einem bestimmten Zeitpunkt immer nur solches Fluoreszenzlicht beobachtet, das von einer Teilmenge der Farbstoffmoleküle des Fluoreszenzfarbstoffs stammt, die mit dem Anregungslicht beaufschlagt wurden. Dabei kann diese Teilmenge räumlich eingeschränkt werden, d. h. z. B. dass der Fluoreszenzfarbstoff bis auf einen räumlichen Teilbereich in einen Dunkelzustand, aus dem durch das Anregungslicht keine Anregung in den fluoreszierenden angeregten Zustand erfolgt, überführt oder aus dem fluoreszierenden angeregten Zustand wieder abgeregt wird oder dass der Fluoreszenzfarbstoff nur in einem solchen räumlichen Teilbereich aus einem Dunkelzustand, aus dem durch das Anregungslicht keine Anregung in den fluoreszierenden angeregten Zustand erfolgt, in einen Zustand überführt wird, aus dem heraus der Fluoreszenzfarbstoff durch das Anregungslicht in den fluoreszierenden angeregten Zustand anregbar ist. So kann das Fluoreszenzlicht nur aus diesem Teilbereich stammen und dessen Ort mit höherer Ortsauflösung zugeordnet werden kann, als sie durch abbildende Verfahren aufgrund der Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Fluoreszenzlichts möglich ist.
Die Teilmenge der Farbstoffmoleküle des Fluoreszenzfarbstoffs kann auch eine prozentuale Teilmenge sein, in der die leuchtenden Farbstoffmoleküle eine so geringe Konzentration aufweisen, dass sich innerhalb jedes getrennt abbildbaren, beugungsbegrenzten Bereichs immer nur ein Farbstoffmolekül in dem fluoreszierenden Zustand befindet und Fluoreszenzlicht aussendet. Die Lage eines solchen einzelnen Farbstoffmoleküls kann aufgrund der räumlichen Intensitätsverteilung in der Abbildung ebenfalls mit einer über die Beugungsgrenze hinausgehenden Ortsauflösung bestimmt werden.
Das Selektieren der Teilmenge der Farbstoffmoleküle des Fluoreszenzfarbstoffs, von der das registrierte Fluoreszenzlicht stammt, kann, wie bereits oben angedeutet wurde, auf unterschiedliche Weisen erfolgen, bei denen jedoch immer ein optisches Signal verwendet wird. In einem Fall wird der Fluoreszenzfarbstoff bis auf die zu selektierende Teilmenge mit dem optischen Signal in einen Dunkelzustand überführt, aus dem durch das Anregungslicht keine Anregung in den fluoreszierenden angeregten Zustand erfolgt. Hierzu kann der Grundzustand des Fluoreszenzfarbstoffs entvölkert werden, was als so genannte ground state depletion (GSD) bekannt ist. Bei Farbstoffmolekülen mit unterschiedlichen Konformationszuständen, die nicht alle gleichermaßen fluoreszierend sind, kann der Fluoreszenzfarbstoff bis auf die zu selektierende Teilmenge mit dem optischen Signal auch in einen der Konformationszustände überführt werden, der nicht fluoresziert oder in dem das Fluoreszenzlicht eine andere Wellenlänge als das an sich beobachtete Fluoreszenzlicht aufweist.
Alternativ kann der Fluoreszenzfarbstoff bis auf die zu selektierende Teilmenge mit dem optischen Signal aus dem fluoreszierenden angeregten Zustand wieder abgeregt werden. Dies kann durch stimulierte Emission erfolgen, was als stimulated emission depletion (STED) bekannt ist. Es ist aber auch denkbar, dass mit Hilfe des optischen Signals unmittelbar der Konformationszustand eines anderen Moleküls oder eines anderen Bestandteils eines Fusionsmoleküls als das fluoreszierende Farbstoffmolekül mit dem optischen Signal in seinen Konformationszustand geändert wird. Dies kann z. B. zur Folge haben, dass der Fluoreszenzfarbstoff in dem Bereich, in dem die anderen Moleküle mit dem optischen Signal in einen bestimmten Konformationszustand geschaltet wurden, jeweils durch einen dunklen Energietransfer zu diesem anderen Molekül hin automatisch wieder abgeregt wird. Die beiden vorgenannten Verfahren zur Auflösungserhöhung sind auch unter dem Namen RESOLFT bekannt.
Weiterhin kann auch nur die zu selektierende Teilmenge der Farbstoffmoleküle des Fluoreszenzfarbstoffs mit dem optischen Signal aus einem Dunkelzustand, aus dem durch das Anregungslicht keine Anregung in den fluoreszierenden angeregten Zustand erfolgt, in einen Zustand überführt werden, aus dem heraus der Fluoreszenzfarbstoff durch das Anregungslicht in den fluoreszierenden angeregten Zustand anregbar ist. Hierzu kann mit Hilfe des optischen Signals der Konformationszustand der Farbstoffmoleküle der Teilmenge geändert werden.
Die Übergangswahrscheinlichkeit von Farbstoffmolekülen eines Fluoreszenzfarbstoffs aufgrund einer optischen Wechselwirkung mit jedem optischen Signal ist durch P ~ |E·M| = E²·M²·cos²θ gegeben. Dabei ist E die elektrische Feldstärke des optischen Signals, deren Richtung von der Polarisation des optischen Signals abhängt, und M ist das Übergangsdipolmoment des Farbstoffmoleküls, das bei so gut wie allen Farbstoffmolekülen ein Vektor ist. θ ist der Winkel zwischen den beiden Vektoren.
und
sind die jeweiligen Vektorbeträge, berechnet aus ihren räumlichen Komponenten, wobei x, y, und z die drei Raumrichtungen bezeichnen. Als Transversalwelle ist Licht für die kurze Zeit der Wechselwirkung mit den Farbstoffmolekülen immer polarisiert, was bedeutet, dass die Orientierung der Farbstoffmoleküle empfindlich in die Wechselwirkung mit jedem optischen Signal eingeht. Bei relativ geringer Ortsauflösung spielt die Orientierung der Farbstoffmoleküle zwar kaum eine Rolle, da das Messsignal, d. h. das Fluoreszenzlicht, von mehreren Farbstoffmolekülen stammt, deren Orientierung θ zu der Polarisation des Anregungslichts unterschiedlich ist. Dadurch mittelt sich die Auswirkung des Winkels θ über die Gesamtzahl der Farbstoffmoleküle heraus. Wenn jedoch die Ortsauflösung eines Fluoreszenzlichtmikroskops erhöht wird, werden in jedem Bildpunkt immer weniger Farbstoffmoleküle registriert, so dass sich der Winkel in Bezug auf alle von außen eingebrachten optischen Signale zunehmend auswirkt. Insbesondere entziehen sich Farbstoffmoleküle mit ungünstigem Winkel θ bei einem Verfahren der eingangs beschriebenen Art dem optischen Signal, welches die Hochauflösung beim Abbilden bewirken soll.
Um bei dem eingangs beschriebenen Verfahren die Hochauflösung beim Abbilden tatsächlich zu erreichen, muss beim negativen Selektieren mit dem optischen Signal die Sättigung erreicht werden, wenn der räumliche Teilbereich, aus dem das Fluoreszenzlicht stammt, unter die Beugungsgrenze eingeschränkt werden soll. Hierbei erweist es sich als problematisch, dass eine Übergangswahrscheinlichkeit des Fluoreszenzfarbstoffs in Folge des optischen Signals von einer räumlichen Ausrichtung jedes seiner Farbstoffmoleküle einerseits und der Polarisation des optischen Signals andererseits abhängig ist. Wenn beispielsweise das optische Signal in z-Richtung einfällt, wobei die z-Richtung die optische Achse sein soll, und dabei senkrecht zu seiner Einfallsrichtung polarisiert ist (E_x,y >> E_z), was z. B. bei einer zirkularen Polarisation des optischen Signals der Fall ist, so werden Farbstoffmoleküle, deren Übergangsdipolmoment ebenfalls senkrecht zu der z-Achse ausgerichtet ist (M_x,y >> M_z) mit hoher Übergangswahrscheinlichkeit umgeschaltet, d. h. in den Dunkelzustand überführt bzw. wieder abgeregt. Farbstoffmoleküle jedoch, deren Übergangsdipolmoment in der z-Richtung verläuft (M_x,y << M_z), werden nur mit einer sehr niedrigen Übergangswahrscheinlichkeit umgeschaltet. Dies bedeutet, dass entweder akzeptiert werden muss, dass nicht alle Farbstoffmoleküle außerhalb des räumlichen Restbereichs mit dem optischen Signal umgeschaltet werden, oder dass das optische Signal mit extremer Intensität eingestrahlt werden muss, damit E_z hinreichend groß ist, um trotz der geringen Übergangswahrscheinlichkeit auch die Farbstoffmoleküle mit in Richtung der z-Achse ausgerichteten Übergangsdipolmoment (M_x,y << M_z) umzuschalten.
Ein weiteres Problem tritt bei Erhöhung der Ortsauflösung dadurch auf, dass die hierfür benötigte Optik eines Fluoreszenzlichtmikroskops, die neben dem Registrieren des Fluoreszenzlichts regelmäßig auch für die Fokussierung des Anregungslichts und des optischen Signals, welches die Hochauflösung beim Abbilden bewirken soll, verwendet wird, eine hohe numerische Apertur aufweist. Die hohe numerische Apertur hat zur Folge, dass auch Anregungslicht mit ursprünglich perfekter zirkularer Polarisation in Teilbereichen seines Fokusbereichs eine relevante z-Komponente seiner elektrischen Feldstärke aufweist und so signifikant auch Farbstoffmoleküle mit in z-Richtung orientiertem Übergangsdipolmoment anregt. Aufgrund ihrer hohen numerischen Apertur wird von diesen Farbstoffmolekülen emittiertes Fluoreszenzlicht auch zu signifikanten Anteilen von der Optik registriert. Selbst von einem optischen Signal mit gleicher Verteilung der Polarisation wie das Anregungslicht in dem wechselseitigen Überdeckungsbereich, werden diese Farbstoffmoleküle mit in z-Richtung orientiertem Übergangsdipolmoment aber nicht mehr mit der gewünschten Sättigung umgeschaltet, sofern das optische Signal nicht sehr viel höherer Intensität eingestrahlt wird. Noch größer werden die Probleme aufgrund ungewollt angeregter Farbstoffmoleküle mit in z-Richtung orientiertem Übergangsdipolmoment, wenn das optische Signal, welches die Hochauflösung beim Abbilden bewirken soll, eine andere Verteilung der Polarisation als das Anregungslicht in dem wechselseitigen Überdeckungsbereich aufweist, weil es beispielsweise den Kernbereich des Fokusbereichs des Anregungslichts gezielt auslässt.
Auch wenn die prozentuale Teilmenge der zur Fluoreszenz fähigen Farbstoffmoleküle des Fluoreszenzfarbstoffs mit dem optischen Signal gezielt so weit reduziert werden soll. dass sich in jedem getrennt abbildbaren Bereich jeweils nur noch ein fluoreszierendes Farbstoffmolekül befindet, wirkt sich die unterschiedliche Orientierung der Farbstoffmoleküle bzw. ihrer Übergangsdipolmomente nachteilig aus. Hier kommt hinzu, dass je nach Ausrichtung der Farbstoffmoleküle auch die räumliche Verteilung des von einem einzelnen Farbstoffmolekül abgestrahlten Fluoreszenzlichts variiert. Von nicht optimal orientierten Farbstoffmolekülen werden bei gleicher Anregungsintensität nur geringere Intensitäten an Fluoreszenzlicht registriert. Dies kann zur Folge haben, dass von zwei nicht optimal orientierten Farbstoffmolekülen genauso viel Fluoreszenzlicht registriert wird, wie von einem optimal registrierten Farbstoffmolekül, so dass diese beiden Fälle nicht mehr einfach unterschieden werden können. Eine Unterscheidung ist aber wichtig, weil nur dann, wenn jeweils nur das Fluoreszenzlicht von einem einzelnen Farbstoffmolekül in einem trennbaren Bereich beobachtet wird, eine die Beugungsgrenze unterschreitende Auflösung ohne räumliche Eingrenzung des fluoreszenzfähigen Fluoreszenzfarbstoffs möglich ist.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffs des Patentanspruchs 1 und ein Fluoreszenzlichtmikroskop mit dem Merkmalen des Oberbegriffs des Patentanspruchs 15 aufzuzeigen, mit denen die Probleme aufgrund unterschiedlicher Orientierung der Farbstoffmoleküle bzw. ihrer Übergangsdipolmomente beherrscht und vorzugsweise ganz beseitigt werden können.
Aus der WO 2006/058187 A2 ist eine so genannte ”Optical Lattice”-Mikroskopie bekannt, bei der Anregungslicht zur Anregung eines Fluoreszenzfarbstoffs in einer Probe zu einem Bravais-Gitter mit lokalisierten Intensitätsmaxima geformt wird. Dabei wird auch die Möglichkeit einer ”Optical Lattice STED”-Mikroskopie angesprochen. Daneben wird im Zusammenhang mit der bei der ”Optical Lattice”-Mikroskopie erfolgenden Abbildung des von dem Fluoreszenzfarbstoff emittierten Fluoreszenzlichts die Möglichkeit angesprochen, das emittierte Fluoreszenzlicht in orthogonale Polarisationszustände aufzuteilen, bevor es einem oder mehreren Objektiven zugeführt wird. Dies erlaubt es, Fluoreszenzanisotropiemessungen durchzuführen, einschließlich möglicherweise von Messungen der Dipolorientierung einzelner Fluoreszenzfarbstoffmoleküle.
Aus der US 2002/0064789 A1 ist ein Verfahren zur gemeinsamen Lokalisierung von zwei oder mehreren Fluoreszenzfarbstoffen in einer Probe bekannt, wobei die Fluoreszenzfarbstoffe mit Anregungslicht einer einzigen Wellenlänge zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt werden, dass sich zwischen den einzelnen Fluoreszenzfarbstoffen unterscheidet. Aus den sich beim Abtasten der Probe mit dem Anregungslicht ergebenden unterschiedlichen Intensitätsverteilungen des Fluoreszenzlichts von den einzelnen Fluoreszenzfarbstoffen kann auf die relative Lage der Fluoreszenzfarbstoffe in der Probe geschlossen werden. Als eine Möglichkeit, wie sich das Fluoreszenzlicht von den einzelnen Fluoreszenzfarbstoffen unterscheiden kann, ist die Polarisation, d. h. die Orientierung des Vektors seines elektrischen Felds oder das Absorptions-/Emissionsübergangsdipolmoment der Fluoreszenzfarbstoffe angesprochen.
Die Erfindung wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 und ein Fluoreszenzlichtmikroskop mit den Merkmalen des Patentanspruchs 15 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen des neuen Verfahrens, die auch bevorzugten Ausführungsformen des neuen Fluoreszenzmikroskops entsprechen, sind in den abhängigen Patentansprüchen 2 bis 14 definiert.
Bei dem neuen Verfahren wird ein weiteres optisches Signal mit einer anderen Polarisation als das des optischen Signals auf die Probe gerichtet, um Fluoreszenzlicht von Farbstoffmolekülen in der Probe, die eine weniger als maximale Übergangswahrscheinlichkeit in Folge des optischen Signals aufweisen, zu diskriminieren. Mit den eine weniger als maximale Übergangswahrscheinlichkeit in Folge des optischen Signals aufweisenden Farbstoffmolekülen sind zumindest alle Farbstoffmoleküle gemeint, bei denen aufgrund der räumlichen Orientierung ihres Übergangsdipolmoments M zur elektrischen Feldstärke E des optischen Signals der Faktor cos²θ der Übergangswahrscheinlichkeit kleiner als 0,1 ist. Vorzugsweise werden bei dem neuen Verfahren alle Farbstoffmoleküle bis zu einem Faktor cos²θ von 0,3 diskriminiert, mehr bevorzugt bis zu einem Faktor cos²θ von 0,5 und am meisten bevorzugt bis zu einem Faktor cos²θ von 0,7. Mit dem weiteren optischen Signal wird gezielt auf diese zu diskriminierenden Farbstoffmoleküle eingewirkt; dazu ist der Faktor cos²θ' der Übergangswahrscheinlichkeit dieser Farbstoffmoleküle in Folge des weiteren optischen Signals, wobei θ' der Winkel zwischen der elektrische Feldstärke des weiteren optischen Signals und dem Übergangsdipolmoment des einzelnen Farbstoffmoleküls ist, möglichst groß zu machen, während er für die nicht zu diskriminierenden Farbstoffmoleküle möglichst klein zu halten ist, so dass er für Farbstoffmoleküle mit einem Übergangsdipolmoment M genau in Richtung der elektrischen Feldstärke E des optischen Signals vorzugsweise weniger als 0,5, mehr bevorzugt weniger als 0,3 und am meisten weniger als 0,1 beträgt. Die sich in der Folge ergebende Diskriminierung des von diesen Farbstoffmolekülen stammenden oder zumindest potenziell stammenden Fluoreszenzlichts kann auf unterschiedliche Weise und in unterschiedlichem Ausmaß erfolgen. Beispiele hierfür werden im Folgenden angegeben. Grundsätzlich kann zwischen solchen Fällen unterschieden werden, (i) in denen dieses Fluoreszenzlicht gemessen wird, um es bei der Auswertung anderer Fluoreszenzlichtintensitäten zu berücksichtigen, (ii) in denen dieses Fluoreszenzlicht durch vorübergehendes Einwirken auf die Farbstoffmoleküle beim Registrieren des eigentlich interessierenden Fluoreszenzlichts unterdrückt wird, und (iii) in denen die Farbstoffmoleküle, von denen dieses Fluoreszenzlicht potenziell stammen könnte, bereits im Vorfeld langfristig ausgeschaltet, oder gar ganz zerstört, d. h. gebleicht werden.
Typischerweise weisen bei der vorliegenden Erfindung das optische Signal und das weitere optische Signal orthogonal zueinander verlaufende Polarisationen auf. So wirkt das weitere optische Signal gerade auf die Farbstoffmoleküle in der Probe mit hoher Übergangswahrscheinlichkeit ein, die die weniger als maximale Übergangswahrscheinlichkeit in Folge des optischen Signals aufweisen.
Um die unterschiedlichen Polarisationen des optischen Signals und des weiteren optischen Signals zu erreichen, können das optische Signal und das weitere optische Signal aus zueinander senkrechten Richtungen auf die Probe gerichtet werden, wobei sie jeweils gleiche Grundpolarisationen, in der Regel senkrecht zu ihrer Ausbreitungsrichtung aufweisen. Es ist aber auch möglich und vielfach bevorzugt, das weitere optische Signal aus derselben Richtung wie das optische Signal auf die Probe zu richten. In diesem Fall müssen dann das optische Signal und das weitere optische Signal unterschiedliche Grundpolarisationen aufweisen.
Es ist auch möglich und wird vielfach der Fall sein, dass zusätzlich zu dem optischen Signal und dem optischen Signal auch das Anregungslicht aus derselben Richtung auf die Probe gerichtet und das interessierende Fluoreszenzlicht in der Gegenrichtung registriert wird.
Wenn das weitere optische Signal aus derselben Richtung wie das optische Signal auf die Probe gerichtet wird, ist es bevorzugt, dass das weitere optische Signal in seiner Ausbreitungsrichtung linear polarisiert ist. Das optische Signal kann dann in herkömmlicher Weise senkrecht zu seiner Ausbreitungsrichtung polarisiert sein. Dabei ist es dann bevorzugt, wenn das optische Signal zirkular polarisiert ist, um beide Komponenten E_x,y seiner elektrischen Feldstärke gleich stark auszubilden, wohingegen das andere optische Signal, das auch aus der gleichen Richtung (optische Achse) kommt, im Fokus eine starke Komponente E_z entlang der optischen Achse, d. h. entlang seiner Ausbreitungsrichtung, aufweist.
Optische Signale mit linearer Polarisation in ihrer Ausbreitungsrichtung sind grundsätzlich nicht unbekannt. Dem Fachmann sind vielmehr verschiedene Möglichkeiten zur Ausbildung solcher optischer Signale geläufig. Vielfach wird hierzu ein Objektiv hoher numerischer Apertur verwendet, wie es bei einem erfindungsgemäßen Verfahren sowieso zum Einsatz kommt, wobei die Polarisationsverteilung des optischen Signals in der Eintrittspupille des Objektivs modifiziert wird. So ist bekannt, dass sich mithilfe einer radialen Polarisationsverteilung in der Eintrittspupille eine primär z-orientierte elektrische Feldstärke E_z im Fokus realisieren lässt. Eine radiale Polarisationsverteilung lässt sich durch entsprechende Modifikationen der Phasenverteilung in der Eintrittspupille erzeugen. Eine noch einfachere Möglichkeit, ein optisches Signal mit einer starken Komponente E_z im Fokus eines Objektivs mit hoher numerischer Apertur zu realisieren, besteht darin, eine linear polarisierte Wellenfront in der Eintrittspupille des Objektivs mit einem Phasensprung von 180° zu beaufschlagen, und zwar so, dass die lineare Polarisationsrichtung und die Linie, die den Phasensprung demarkiert, senkrecht aufeinander stehen. In beiden Fällen überlagern sich die Anteile des optischen Signals mit unterschiedlicher Polarisation im Fokus des Objektivs derart, dass eine Polarisation in der Ausbreitungsrichtung (z-Richtung) des optischen Signals resultiert. Vorrichtungen zur Ausbildung von optischen Signalen mit linearer Polarisation in ihrer Ausbreitungsrichtung sind auch kommerziell erhältlich (z. B. von Nanophoton Corp., Osaka, Japan, siehe www.nanophoton.jp).
In einer konkreten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das weitere optische Signal die Wellenlänge des Anregungslichts auf und wird vor oder nach den Anregungslicht und dem optischen Signal auf die Probe gerichtet. Dabei wird ein Fluoreszenzlichthintergrund von den Farbstoffmolekülen in der Probe, die die weniger als maximale Übergangswahrscheinlichkeit in Folge des optischen Signals aufweisen, nach Anregung mit dem weiteren optischen Signal in der Richtung aufgezeichnet, in der auch das interessierende Fluoreszenzlicht registriert wird. Dieser Fluoreszenzlichthintergrund kann dann zur Korrektur der Intensitäten verwendet werden, die bei der eigentlichen Messung des Fluoreszenzlichts in Folge des Anregungslichts registriert werden.
Bei einer weiteren, noch mehr bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das weitere optische Signal ebenfalls die Wellenlänge des Anregungslichts auf und wird vor dem Anregungslicht und dem optischen Signal auf die Probe gerichtet. Dabei wird die Intensität des weiteren optischen Signals so hoch gesetzt, dass die Farbstoffmoleküle in der Probe, die die weniger als maximale Übergangswahrscheinlichkeit in Folge des optischen Signals aufweisen, mit dem weiteren optischen Signal gebleicht werden. Die Intensität des weiteren optischen Signals muss so hoch gesetzt werden, dass beim Bleichen der Farbstoffmoleküle, die die weniger als maximale Übergangswahrscheinlichkeit in Folge des optischen Signals aufweisen, eine Sättigung eintritt. Dann bleiben ungebleicht nur die günstigen, eine maximale Übergangswahrscheinlichkeit in Folge des optischen Signals aufweisenden Farbstoffmoleküle zurück.
An dieser Stelle sei angemerkt, dass sich die Übergangsdipolmomente der Farbstoffmoleküle in Bezug auf das optische Signal und das Anregungslicht typischerweise nicht oder nur wenig hinsichtlich ihrer räumlichen Orientierung unterscheiden. Dies gilt insbesondere dann. wenn das optische Signal und das Anregungslicht sich nicht sehr weit unterscheidende Wellenlängen aufweisen.
In einer weiteren bevorzugten konkreten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das weitere optische Signal die Wellenlänge des optischen Signals auf, und es wird während des Anregungslichts und/oder des optischen Signals oder zwischen dem Anregungslicht und dem optischen Signal auf die Probe gerichtet. Das weitere optische Signal kann dabei grundsätzlich dieselbe Funktion wie das optische Signal haben, aber gezielt einen anderen Anteil der Farbstoffmoleküle abdecken. Überdies muss das weitere optische Signal nicht in demselben Maße wie das optische Signal lokalisiert werden. Es kann bei vielen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung auch über einen größeren Bereich auf die Probe aufgebracht werden. Ebensowenig ist eine zeitliche Konzentration erforderlich, selbst wenn das weitere optische Signal und das Anregungslicht z. B. aus Pulsen bestehen. So kann das weitere optische Signal z. B. von einer Dauerstrichlichtquelle kommen, d. h. durchgängig auf die Probe gerichtet werden. Das weitere optische Signal kann auch mehrere Bereich der Probe gleichzeitig abdecken, in denen der Fluoreszenzfarbstoff mit dem Anregungslicht getrennt angeregt wird, wozu beispielsweise ein so genanntes Mikrolinsenarray oder -rad zum Aufteilen des Anregungslichts in die einzelnen Bereiche eingesetzt wird.
Das weitere optische Signal kann auch darauf abgestimmt sein, eine Multiphotonenanregung der Farbstoffmoleküle mit der weniger als maximalen Übergangswahrscheinlichkeit in Folge des optischen Signals zu bewirken. Das hat den besonderen Vorteil, dass die Übergangswahrscheinlichkeit in Folge des weitern optischen Signals proportional zu cos⁴θ ist, was zu einer stärkeren Diskriminierung der Moleküle mit der weniger als maximalen Übergangswahrscheinlichkeit in Folge des optischen Signals führt. Hinzu kommt, dass Multiphotonenprozesse das Bleichen von Molekülen besonders begünstigen, insbesondere wenn sie mit sehr kurzen Pulsen hoher Lichtleistung angeregt werden.
Ein erfindungsgemäßes Fluoreszenzmikroskop zur Durchführung des neuen Verfahrens zeichnet sich primär dadurch aus, dass neben der Anregungslichtquelle für das Anregungslicht und der Signalquelle für das optische Signal eine weitere Signalquelle vorhanden ist, die das weitere optische Signal mit einer anderen Polarisation als das optische Signal auf die Probe richtet, um Fluoreszenzlicht von Farbstoffmolekülen in der Probe, die die weniger als maximale Übergangswahrscheinlichkeit in Folge des optischen Signals aufweisen, zu diskriminieren. Bei der weiteren Signalquelle für das weitere optische Signal muss es sich nicht um eine zusätzliche Lichtquelle, z. B. einen weiteren Laser neben einem Laser für das optische Signal handeln, vielmehr kann ein weiterer optischer Pfad von einer bereits vorhandenen Lichtquelle für die Ausbildung der weiteren Signalquelle ausreichend sein.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibungseinleitung genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile zwingend von erfindungsgemäßen Ausführungsformen erzielt werden müssen. Weitere Merkmale sind den Zeichnungen – insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung – zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen der Erfindung entfallen.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand in den Figuren dargestellter bevorzugter Ausführungsbeispiele weiter erläutert und beschrieben.
1 zeigt ein Prinzipschaubild zu einer ersten Ausführungsform des neuen Verfahrens;
2 bis 4 zeigen weitere Prinzipschaubilder zu weiteren Ausführungsformen des neuen Verfahrens;
5 zeigt in stark vergrößerte Darstellung einen Bereich einer Probe zur Erläuterung des Verfahrens in der Ausführungsform gemäß dem Prinzipschaubild in 3;
6 und 7 erläutern die Ausführungsform des neuen Verfahrens gemäß dem Prinzipschaubild in 2;
8 und 9 illustrieren jeweils eine Polarisationsverteilung über eine Eintrittspupille eines Objektivs, die im Fokus eines Objektivs mit hoher numerischer Apertur zu einer linearen Polarisation in z-Richtung führt;
10 zeigt die aus den Polarisationsverteilungen gemäß den 8 und 9 im Fokus des Objektivs mit hoher numerischer Apertur resultierende lineare Polarisation in z-Richtung; und
11 illustriert die Orientierung eines Übergangsdipolmoments eines Farbstoffmoleküls relativ zu den zueinander orthogonalen Polarisationen eines optischen Signals und eines weiteren optischen Signals.
In 1 ist sehr schematisch das neue Verfahren zum räumlich hoch auflösenden Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff 1 markierten Struktur 2 einer Probe 3 skizziert. Die einzelnen Farbstoffmoleküle 4 des Fluoreszenzfarbstoffs 1 weisen dabei hier nicht hervorgehobene räumliche Orientierungen auf, die in unterschiedliche Ausrichtungen von Übergangsdipolmomenten der Farbstoffmoleküle bei externer Anregung resultieren. Dabei ist das Übergangsdipolmoment jedes Moleküls 4 in Bezug auf ein optisches Signal 5 von besonderem Interesse. Das optische Signal 5 wird von einer Signalquelle 6 in derselben Richtung wie Anregungslicht 7 von einer Anregungslichtquelle 8 auf die Probe 3 gerichtet. Mit dem optischen Signal 5 wird ein Anteil der Farbstoffmoleküle 4 in einen nicht fluoreszenzfähigen Zustand geschaltet, um die räumliche Auflösung beim Abbilden der Struktur 2 durch ortsabhängiges Registrieren von Fluoreszenzlicht 9 von der Probe 3 mit einem Detektor 10 über die Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Fluoreszenzlichts 9 hinweg zu erhöhen. Des optische Signal 5 weist eine Polarisation 11 senkrecht zu seiner Ausbreitungsrichtung auf. Obwohl die Polarisation 11 des optischen Signals 5 hier als sich in einer Richtung von seiner Ausbreitungsrichtung weg erstreckender Vektor angedeutet ist, weist das optische Signal 5 in aller Regel eine zirkulare Polarisation auf. Farbstoffmoleküle 4, deren Übergangsdipolmoment senkrecht zu der Polarisation 11 ausgerichtet ist, weisen eine nur sehr geringe Übergangswahrscheinlichkeit in Folge des optischen Signals 5 auf. Maximal ist diese Übergangswahrscheinlichkeit nur bei solchen Farbstoffmolekülen 4, deren Übergangsdipolmomente in der Polarisation 11 orientiert sind. Wenn mit dem optischen Signal 5 Farbstoffmoleküle 4 in bestimmten räumlichen Bereichen der Probe 3 gezielt in einen nicht fluoreszierenden Dunkelzustand überführt werden sollen, so dass das verbleibende Fluoreszenzlicht nur aus einem kleinen räumlichen Teilbereich stammen kann, so sind dabei die Farbstoffmoleküle, die eine weniger als maximale Übergangswahrscheinlichkeit in Folge des optischen Signals 5 aufweisen, sehr störend, weil sie selbst mit extrem hohen Intensitäten des optischen Signals 5 nicht vollständig in den Dunkelzustand überführbar sind. Zur Beseitigung dieses Problems wird in der in 1 skizzierten Ausführungsform des neuen Verfahrens ein weiteres optisches Signal 12 von einer weiteren Signalquelle 13 auf die Probe 3 gerichtet. Dieses weitere optische Signal 12 kommt aus einer zu der Ausbreitungsrichtung des optischen Signals 5 senkrechten Richtung und weist eine lineare Polarisation 14 in der Ausbreitungsrichtung des optischen Signals 5 auf. Mit dem weiteren optischen Signal 12 werden so alle Farbstoffmoleküle 4 gezielt in den Dunkelzustand umgeschaltet, die die weniger als maximale Übergangswahrscheinlichkeit in Folge des optischen Signals 5 aufweisen. Dies kann ausschließlich. In den Bereichen geschehen, die auch mit dem optischen Signal 5 beaufschlagt werden. Es ist aber auch möglich, das weitere optische Signal 12 auf die gesamte Probe 3 oder jedenfalls einen größeren Teilbereich der Probe 3 zu richten und dort alle Farbstoffmoleküle, die nicht mit hoher Übergangswahrscheinlichkeit auf das optische Signal 5 ansprechen, in den Dunkelzustand zu schalten. Diese Farbstoffmoleküle 4 weisen Üblicherweise auch in Bezug auf das Anregungslicht 7, das ebenfalls senkrecht zu seiner Ausbreitungsrichtung polarisiert sein kann, eine ungünstige Übergangawahrscheinlichkeit für die Überführung in einen angeregten Zustand auf, aus dem heraus das Fluoreszenzlicht 9 emittiert wird.
2 skizziert eine Ausführungsform des neuen Verfahrens, die sich von derjenigen gemäß 1 dadurch unterscheidet, dass das weitere optische Signal 12 aus derselben Richtung auf die Probe 3 gerichtet wird, wie das optische Signal 5 und das Anregungslicht 7. Hierfür kann ein einziges (hier nicht dargestelltes) Objektiv verwendet werden, das in umgekehrter Richtung auch das Fluoreszenzlicht 9 von der Probe 3 auf den Detektor 10 abbildet. Die Polarisation 14 des weiteren optischen Signals 12 verläuft auch hier senkrecht zu der Polarisation 11 des optischen Signals 5, aber in der Ausbreitungsrichtung des weiteren optischen Signals 12. Dem Fachmann sind optische Techniken bekannt, mit denen er ein optisches Signal mit einer Polarisation. In seiner Ausbreitungsrichtung ausbilden kann. Zwei Beispiele dieser Techniken werden anhand der folgenden 8 bis 10 erläutert werden. Weiterhin ist gemäß 2 vorgesehen, vor dem Aufbringen des optischen Signals 5 oder des Anregungslichts 7 auf die Probe und damit vor dem Messen des Fluoreszenzlichts 9 mit dem Detektor 10 sämtliche Farbstoffmoleküle 4, deren Übergangsdipolmoment in Bezug auf das optische Signal 5 ungünstig ausgerichtet sind, so dass ihre Übergangswahrscheinlichkeit in Folge des optischen Signals 5 nur gering ist, mit dem weiteren optischen Signal 12 zu bleichen. Des weitere optische Signal weist dazu die Wellenlänge des Anregungslichts 7 aber eine darüber hinaus gehende Intensität oder Dauer auf. Nach diesem ersten Schritt des neuen Verfahrens liegen in der Probe 3 nur noch solche Farbstoffmoleküle 4 vor, deren Übergangsdipolmoment in Bezug auf das optische Signal 5 günstig ausgereichtet ist.
Bei der in 3 skizzierten Ausführungsform des neuen Verfahrens soll einen andere Anordnung der Signalquellen 6 und 13 sowie der Anregungslichtquelle 8 eine andere zeitliche Abfolge des Anregungslichts 9 und der optischen Signale 7 und 12 andeuten. Zunächst wird der Fluoreszenzfarbstoff 1, mit dem die Struktur 2 markiert ist, mit dem Anregungslicht 9 angeregt. Dann wird ein Anteil des Fluoreszenzfarbstoffs 1 mit dem optischen Signal 7 wieder abgeregt. Die dabei von dem optischen Signal 7 nicht effektiv erfassten Farbstoffmoleküle 4 werden mit dem weiteren optischen Signal 12 abgeregt. Erst dann wird das Fluoreszenzlicht 9 von der Probe mit dem Detektor 10 registriert. Bei dieser Vorgehensweise ist auch eine zeitliche Überdeckung der optischen Signale 5 und 12 untereinander sowie mit dem Anregungslicht 7 möglich. Zudem muss das weitere optische Signal 12 nicht dieselbe Lokalisierung aufweisen wie das optische Signal 5. Vielmehr kann das weitere optische Signal 12 auch solche Bereich der Probe 3 abdecken, aus denen das Fluoreszenzlicht 9 später registriert werden soll, weil die von dem weiteren optischen Signal 12 effektiv abgeregten Farbstoffmoleküle 4 eine solche räumliche Orientierung aufweisen, dass sie zu dem Fluoreszenzlicht 9 sowieso nur wenig beitragen.
4 deutet wieder eine andere zeitliche Abfolge der optischen Signale 5 und 12 in Bezug auf das Anregungslicht 7 an. Hier wird zunächst das optische Signal 12 auf die Probe gerichtet, das her anders als in den Ausführungsformen des neuen Verfahrens gemäß den 1 und 3, wo die Wellenlängen der beiden optischen Signale 5 und 12 gleich waren, aber wie bei der Ausführungsform gemäß 2 die Wellenlänge des Anregungslichts 7 aufweist. Die Polarisation 14 des weiteren optischen Signals 12 verläuft auch hier wieder in der Ausbreitungsrichtung des weiteren optischen Signals 12, die identisch mit der Ausbreitungsrichtung des Anregungslichts 7 ist. Da das Anregungslicht 7 eine Polarisation 15 senkrecht zu seiner Ausbreitungsrichtung aufweist, verläuft die Polarisation 14 des weiteren optischen Signals 12 auch senkrecht zu der Polarisation 15 des Anregungslichts 7. Das in Folge des weiteren optischen Signals 12 von der Probe 3 spontan emittierte Fluoreszenzlicht 9' wird mit dem Detektor 10 registriert, um einen Fluoreszenzlichtuntergrund für die anschließende Messung aufzuzeichnen. Bei der sich anschließenden, eigentlichen Messung wird der Fluoreszenzfarbstoff 1 in der Probe 3 mit dem Anregungslicht 7 angeregt, bis auf räumliche Restbereiche mit dem optischen Signal 5 wieder abgeregt, und das damit primär aus den räumlichen Restbereichen stemmende Fluoreszenzlicht 9 wird mit dem Detektor 10 registriert. Von diesen registrierten Intensitäten des Fluoreszenzlichts 9 wird der zuvor registrierte Untergrund des Fluoreszenzlichts 9' abgezogen.
5 skizziert die räumliche Verteilung der verschiedenen optischen Signale und des Anregungslichts bei der Ausführungsform des Verfahrens gemäß 3. Des Anregungslicht 7 wird in der hier dargestellten senkrecht zu der Ausbreitungsrichtung des Anregungslichts 7 verlaufenden Ebene der Probe 3 über eine mit ansteigenden engen Linien schraffierte Kreisfläche 7 auf die Probe 3 aufgebracht. Das optische Signal 5 wird hingegen über eine Ringfläche auf die Probe 3 aufgebracht, deren Außenumfang über den Außenumfang der Kreisfläche hinausgeht. Das weitere optische Signal 12 wird über die gesamte dargestellte Fläche der Probe 3 aufgebracht. Fluoreszenzlicht 9 von der Probe 3 kann so nur von einer Teilmenge der Farbstoffmoleküle des Fluoreszenzfarbstoffs stammen, die sich in einem räumlichen Teilbereich befinden, der von der Ringfläche 9 des optischen Signals 5 umschlossen ist. Der Fluoreszenzfarbstoff in dem darüber hinausgehenden Bereich des Anregungslichts 7 ist sowohl durch das optische Signal 5 als auch das weitere optische Signal 12 z. B. durch stimulierte Emission wieder abgeregt, bevor das Fluoreszenzlicht 9 registriert wird. Auch in dem Bereich, aus dem das Fluoreszenzlicht 9 noch stammt, ist ein Anteil des Fluoreszenzfarbstoffs durch das weitere optische Signal 12 abgeregt worden, doch dieser tragt, wie bereits erwähnt wurde, zu dem Fluoreszenzlicht 9, welches in der Rückwärtsrichtung zu dem Anregungslicht 7 aufgefangen wird, sowieso wenig bei.
8 und 7 skizzieren, wie auch mit einem räumlich nicht lokalisierten optischen Signal 5 bei der Fluoreszenzlichtmikroskopie die räumliche Auflösung über die Beugungsgrenze gesteigert werden kann. Hierzu wird ein prozentualer Anteil der Farbstoffmoleküle 4 des Fluoreszenzfarbstoffs 1 in der Probe 3 mit dem optischen Signal 5 flächendeckend in einen Dunkelzustand überführt. Dadurch nimmt die Dichte der Farbstoffmoleküle 4, die in 8 skizziert ist, soweit ab, dass sich in jedem angesichts der Beugungsgrenze noch getrennt abbildbaren Bereich der Probe 3 jeweils nur noch ein fluoreszenzfähiges Farbstoffmolekül 4 befindet. Aufgrund des von diesem Farbstoffmolekül 4 stammenden Fluoreszenzlichts kann die Lage des einzelnen Farbstoffmoleküls 4 mit einer über die Beugungsgrenze hinausgehenden Ortsauflösung bestimmt werden. Dies beruht auf der Randbedingung, dass das Fluoreszenzlicht, das jeweils getrennt registriert wird, aus einem kleineren Bereich stammt, als er durch die Beugungsgrenze definiert ist. Damit das Umschalten jeweils eines definierten Anteils der Farbstoffmoleküle 4 mit dem optischen Signal 5 effektiv erfolgen kann und damit die Ausbeute an Fluoreszenzlicht von jedem Farbstoffmolekül 4 des fluoreszierenden Restantelis des Fluoreszenzfarbstoffs 1 maximal ist, wird das weitere optische Signal 12 eingesetzt, das alle Farbstoffmoleküle 4, die keine optimale Übergangswahrscheinlichkeit in Bezug auf das optische Signal 5 und keine optimale Abstrahlcherakteristik des Fluoreszenzlichts 9 in Bezug auf den hier nicht dargestellten Detektor 10 aufweisen (wobei beide Kriterien auf dieselben Farbstoffmoleküle zutreffen) in einen nicht fluoreszenzfähigen Dunkelzustand überführt. Diese Überführung kann im Sinne eines Bleichens der Farbstoffmoleküle vorab und dauerhaft erfolgen. Sie kann aber auch, ohne diese Farbstoffmoleküle 4 zu zerstören, kontinuierlich, d. h. z. B. auch während der Messung des Fluoreszenzlichts 9 von dem Licht mit dem optischen Signal 5 in den Dunkelzustand geschalteten Farbstoffmolekülen 4 vorgenommen werden. Bei dem in den 8 und 7 skizzierten Verfahren wird auch das Anregungslicht 9 nicht auf einen kleinen Teilbereich der Probe 3 fokussiert. Die Lokalisierung erfolgt hier ausschließlich über die geringe Konzentration der jeweils fluoreszierenden Farbstoffmoleküle 4 des Fluoreszenzfarbstoffs 1.
8 und 9 skizzieren jeweils eine Polarisationsverteilung des weiteren optischen Signals 12 über eine Eintrittspupille 16 eines in 10 gezeigten Objektivs 17, das auch für die Fokussierung des Anregungslichts 7 und des optischen Signals 5 auf einen Messpunkt in der hier nicht dargestellten Probe 3 verwendet wird. Beide Polarisationsverteilungen führen in der Überlagerung der verschieden polarisierten Anteile des weiteren optischen Signals 12 im Fokus 23 des Objektivs 17, das einen großen Akzeptanzwinkel α und entsprechend eine hohe numerische Apertur aufweist, zu der gewünschten linearen Polarisation 14 in der Ausbreitungsrichtung des weiteren optischen Signals 12. Bei der Polarisationsverteilung gemäß 8 weisen die einzelnen Anteile des weiteren optischen Signals 12 radial zu seiner Ausbreitungsrichtung verlaufende Polarisationen 18 auf. Bei der Polarisationsverteilung gemäß 9 weisen zwei gleich große Aneile des weiteren optischen Signals 12 auf den beiden Seiten einer Linie 19 zwar jeweils senkrecht zu der Linie 19 verlaufende aber einander entgegen gerichtete Polarisationen 20 und 21 auf, was einem Phasensprung von 180° über die Linie 19 hinweg entspricht.
11 erläutert die die Übergangswahrscheinlichkeiten eines Farbstoffmoleküls in Folge des optischen Signals und des weiteren optischen Signals bestimmenden Winkel θ und θ'. θ ist der Winkel zwischen dem Übergangsdipolmoment 22 des Farbstoffmoleküls und der Polarisation 11 des optischen Signals, während θ' der Winkel zwischen dem Übergangsdipolmoment 22 und der Polarisation 14 des weiteren optischen Signets ist. Wenn das optische Signal zirkular polarisiert ist und die Polarisation 14 des weiteren optischen Signals orthogonal zu dieser zirkularen Polarisation 11 verläuft, gilt θ' = 90° – θ, so dass für die unmittelbar in die Übergangswahrscheinlichkeiten eingehenden Faktoren cos²θ und cos²θ' die Beziehung cos²0' = 1 – cos²θ gilt. Die Übergangswahrscheinlichkeit in Folge des weiteren Signals mit der Polarisation 14 ist also genau für die Farbstoffmoleküle groß (cos²θ' > 0,5), für die die Übergangswahrscheinlichkeit in Folge des optischen Signals klein ist (cos²θ < 0,5), und umgekehrt.
Bezugszeichenliste

1: Fluoreszenzfarbstoff
2: Struktur
3: Probe
4: Farbstoffmolekül
5: optisches Signal
8: Signalquelle
7: Anregungslicht
8: Anregungslichtquelle
9: Fluoreszenzlicht
10: Detektor
11: Polarisation
12: weiteres optisches Signal
13: weitere Signalquelle
14: Polarisation
15: Polarisation
18: Eintrittspupille
17: Objektiv
18: Polarisation
19: Linie
20: Polarisation
21: Polarisation
22: Polarisation
23: Fokus

Claims

Verfahren zum räumlich hoch aufgelösten Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur einer Probe, – wobei der Fluoreszenzfarbstoff mit Anregungslicht in einen fluoreszierenden angeregten Zustand angeregt wird; – wobei wechselnde Anteile des Fluoreszenzfarbstoffs mit einem eine Polarisation aufweisenden optischen Signal selektiert werden, so dass von dem in dem fluoreszierenden angeregten Zustand befindlichen Fluoreszenzfarbstoff spontan emittiertes Fluoreszenzlicht nur von einer Teilmenge der Farbstoffmoleküle des Fluoreszenzfarbstoffs stammt, die mit dem Anregungslicht beaufschlagt wurden; und – wobei der Fluoreszenzfarbstoff eine von einer räumlichen Ausrichtung jedes seiner Farbstoffmoleküle einerseits und der Polarisation des optischen Signals andererseits abhängige Übergangswahrscheinlichkeit in Folge des optischen Signals aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass ein weiteres optisches Signal (12) mit einer anderen Polarisation (14) als die Polarisation (11) des optischen Signals (5) auf die Probe (3) gerichtet wird, um Fluoreszenzlicht (9) von Farbstoffmolekülen (4) in der Probe (3), die eine weniger als maximale Übergangswahrscheinlichkeit in Folge des optischen Signals (5) aufweisen, zu diskriminieren.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Farbstoffmoleküle, die nicht zu der Teilmenge der Farbstoffmoleküle gehören, von denen das spontan emittierte Fluoreszenzlicht stammt, obwohl sie mit dem Anregungslicht beaufschlagt wurden, mit dem optischen Signal entweder – in einen Dunkelzustand überführt werden, aus dem durch das Anregungslicht keine Anregung in den fluoreszierenden angeregten Zustand erfolgt, oder – aus dem fluoreszierenden angeregten Zustand wieder abgeregt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Farbstoffmoleküle, die zu der Teilmenge der Farbstoffmoleküle gehören, von denen das spontan emittierte Fluoreszenzlicht stammt, mit dem optischen Signal aus einem Dunkelzustand, aus dem durch das Anregungslicht keine Anregung in den fluoreszierenden angeregten Zustand erfolgt, in einen Zustand überführt werden, aus dem heraus sie durch das Anregungslicht in den fluoreszierenden angeregten Zustand anregbar sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Signal (5) und das weitere optische Signal (12) orthogonal zueinander verlaufende Polarisationen (11, 14) aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Signal (5) und das weitere optische Signal (12) aus zueinander senkrechten Richtungen auf die Probe (3) gerichtet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das weitere optische Signal (12) aus derselben Richtung wie das optische Signal (5) und das Anregungslicht (7) auf die Probe (3) gerichtet wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das weitere optische Signal (12) eine lineare Polarisation (14) in der Richtung aufweist, in der es auf die Probe (3) gerichtet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das weitere optische Signal (12) die Wellenlänge des Anregungslichts (7) aufweist und vor oder nach dem Anregungslicht (7) und dem optischen Signal (5) auf die Probe (3) gerichtet wird und dass ein Fluoreszenzlichtuntergrund von den Farbstoffmolekülen in der Probe (3), die die weniger als maximale Übergangswahrscheinlichkeit in Folge des optischen Signals (5) aufweisen, nach Anregung mit dem weiteren optischen Signal (12) aufgezeichnet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das weitere optische Signal (12) die Wellenlange des Anregungslichts aufweist und vor dem Anregungslicht (7) und dem optischen Signal (5) auf die Probe (3) gerichtet wird und dass die Farbstoffmoleküle (4) in der Probe (3), die die weniger als maximale Übergangswahrscheinlichkeit in Folge des optischen Signals (5) aufweisen, mit dem weiteren optischen Signal (12) gebleicht werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das weitere optische Signal (12) die Wellenlänge des optischen Signals (5) aufweist und während des Anregungslichts (7) und/oder des optischen Signals (5) oder zwischen dem Anregungslicht (7) und dem optischen Signal (5) auf die Probe (3) gerichtet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das weitere optische Signal (12) durchgängig auf die Probe gerichtet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das weitere optische Signal (12) in Pulsen auf die Probe gerichtet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass mit dem weiteren optischen Signal (12) ein Übergang des Fluoreszenzfarbstoffs (1) mittels Mehrphotonenanregung angeregt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das weitere optische Signal (12) mehrere Bereiche der Probe (3) abdeckt, in denen der Fluoreszenzfarbstoff (1) mit dem Anregungslicht (7) getrennt angeregt wird.
Fluoreszenzlichtmikroskop zur Durchführung des Verfahrens zum räumlich hoch aufgelösten Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur einer Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 14, mit einer Anregungslichtquelle für das Anregungslicht, mit einer Signalquelle für das optische Signal und mit einem Sensor für das Fluoreszenzlicht, dadurch gekennzeichnet, dass eine weitere Signalquelle (13) vorhanden ist, die das weitere optische Signal (12) mit einer anderen Polarisation (14) als die Polarisation (11) des optischen Signals (5) auf die Probe (3) richtet, um Fluoreszenzlicht (9) von Farbstoffmolekülen (4) in der Probe (3), die eine weniger als maximale Übergangswahrscheinlichkeit in Folge des optischen Signals (5) aufweisen, zu diskriminieren.