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Die
Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum optischen Abbilden einer
Probe mit mindestens einer Lichtquelle für Anregungslicht,
um einen Fluoreszenzfarbstoff in einer Probe, die von einem Probenhalter
gehalten ist, während eines begrenzten Zeitraums in einem
räumlichen Bereich zur spontanen Emission von Fluoreszenzlicht
anzuregen, und für Abregungslicht, um den Fluoreszenzfarbstoff
bis auf einen gegenüber dem räumlichen Bereich
verkleinerten Restbereich wieder abzuregen. Dabei kann beispielsweise
von der Probe ausgehendes Licht, das eine andere Wellenlänge
aufweist als das Anregungslicht und das Abregungslicht, der spontanen Emission
von Fluoreszenzlicht aus dem Restbereich des räumlichen
Bereichs zugeordnet werden. Weiters betrifft die Erfindung Verfahren
zur Verbesserung der axialen Auflösung bei der STED-Mikroskopie.
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Im
Folgenden ist mit einem „Chromophor” oder einem „Fluoreszenzfarbstoff” jedes
Molekül, jeder Teil eines Moleküls und jede andere
Materie (beispielsweise auch Farbzentren in Kristallen) gemeint, die
Fluoreszenz oder andere Lumineszenz mit einer geeigneten Lebensdauer
zeigt, und zwar unabhängig davon, ob der Chromophor oder
der Fluoreszenzfarbstoff nur zum Zweck der Abbildung der Probe in die
Probe eingebracht wird oder nicht. Fluoreszenzfarbstoffe sind beispielsweise
natürlich vorhandene oder künstlich in die Probe
eingebrachte Fluoreszenzmarker. Mit Licht ist jede geeignete elektromagnetische
Strahlung gemeint, unabhängig davon, ob diese für
das menschliche Auge sichtbar ist oder nicht.
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Ein
grundsätzliches Problem gleich welcher lichtmikroskopischen
Technik ist der mangelnde Kontrast von Zellbestandteilen. Schon
lange benutzt man deshalb fluoreszente Moleküle, die z.
B. mit gentechnischen Methoden oder mittels Antikörpern
selektiv an bestimmte Moleküle einer Zelle geheftet werden können.
Man kann zum Beispiel Farbstoffe selektiv an Mitochondrien anbauen.
Beleuchtet man nun eine Stelle der so präparierten Zelle
mit einem fokussierten Laserstrahl und erhält man von dort
Fluoreszenz, so waren an genau dieser Stelle Farbstoffmoleküle und
damit auch Mitochondrien. Um ein vollständiges Bild zu
erhalten, wird die Probe Punkt für Punkt gescannt bzw.
abgerastert.
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Die
WO 95/21393 A2 und
die
WO 2006/114247
A1 zeigen und beschreiben Fluoreszenzmikroskope, welche
auf dem STED-Verfahren (Akronym für STimulted Emission
Depletion) oder dem allgemeineren RESOLFT-Verfahren (Akronym für
REversible Saturable OpticaL Fluorescence Transitions) nach Dr.
Stefan Hell basieren. Hierbei werden mit einem Anregungslichtstrahl
fluoreszente Partikel angeregt und mit einem Abregungslichtstrahl
wieder ”gequencht” bzw. in der Anregung behindert.
Beide Lichtstrahlen sind nach den Gesetzen der Optik nicht schärfer
zu fokussieren als das Abbe-Gesetz vorschreibt.
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Im
Bereich der Mikroskopie und insbesondere der Ultramikroskopie galt
lange Zeit die allgemeine Annahme, dass es mit optischen Verfahren
unmöglich sei Größen abzubilden, welche
unterhalb der Abbeschen Beugungsgrenze liegen.
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Als
Abregungsvorgang kommt bei STED die stimulierte Emission zum Einsatz.
Das STED-Mikroskop basiert grundsätzlich auf dem Phänomen
der Fluoreszenz. Bei dem allgemeineren RESOLFT-Verfahren eignen
sich grundsätzlich alle optisch sättigbaren Übergänge,
die an der Fluoreszenz beteiligt sind, zum transienten Versetzen
eines Fluoreszenzmoleküls in einen nichtfluoreszierenden
Zustand.
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Der
Anregungslichtstrahl kann aufgrund der Abbeschen Beugungsgrenze
nicht beliebig klein fokussiert werden. Man regt also immer alle
Moleküle, die sich gerade im Brennfleck befinden, an und
kann daher nicht entscheiden, von welchem Molekül die Fluoreszenz
gerade kommt. Somit können Strukturen, die kleiner sind
als die Ausdehnung des Laserfokus, nicht unterschieden werden.
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Die
Funktionsweise der STED-Mikroskopie ist nun folgende: Zunächst
wird, genau wie bei konventioneller Raster-Mikroskopie, ein kleiner
Bereich mittels eines fokussierten Lichtstrahls angeregt, der im
Folgenden auch als Anregungslichtstrahl bezeichnet wird. Aufgrund
der erwähnten Abbeschen Beugungsgrenze liegt der minimale
erreichbare Durchmesser eines fokussierten Lichtstrahls bei Wellenlängen
im sichtbaren Bereich in der Größenordnung von 200
nm.
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Ein
zweiter Lichtstrahl wird gleichzeitig oder nach dem Anregungsstrahl
auf den kleinen Bereich gerichtet. Dieser zweite Lichtstrahl wird
im Folgenden auch als Abregungslichtstrahl bezeichnet. Der Abregungslichtstrahl
weist typischerweise eine niedrigere Photonenenergie und eine längere
Wellenlänge auf als der Anregungslichtstrahl. Der Abregungslichtstrahl
trifft gleichzeitig und/oder nach dem Anregungslichtstrahl – aber
jedenfalls bevor die angeregten Farbstoffmoleküle von sich
aus fluoreszieren können – auf die Probe. Anders
ausgedrückt wird die Zeitdauer zwischen dem Auftreffen
des ersten Lichtstrahls und dem Auftreffen des zweiten Lichtstrahls auf
die Probe kleiner oder wesentlich kleiner als die Lebensdauer des
mit dem Anregungslichtstrahl bevölkerten Zustands der Farbstoffmoleküle
gewählt bzw. eingestellt. Wo der Abregungslichtstrahl auf
einen angeregten Fluoreszenzmarker trifft, regt er diesen wieder
ab.
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Indem
der zweite Strahl ringförmig um die vorher angeregte Stelle
gelegt wird, kann ein Großteil des angeregten Bereichs
(die Ränder) wieder abgeregt werden bevor es zur spontanen
Emission von Fluoreszenz kommt. Somit lässt sich der emittierende
Bereich – also das Zentrum des Rings – effektiv verkleinern.
Die Detektion von Fluoreszenz erfasst dann nur die jenigen Markermoleküle,
die nicht abgeregt wurden. Das kann theoretisch nur ein einzelnes Molekül
sein, das sich vorher in der Mitte des Anregungsflecks befand. Die
Ortsauflösung des optischen Detektors ist dabei gleichgültig.
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In
einem STED-Mikroskop lassen sich alle Präparate untersuchen,
die mit Fluoreszenzfarbstoffen oder anderen Chromophoren markierbar
sind oder bereits Fluoreszenzfarbstoffen oder andere geeignete Chromophore
enthalten. Anders als bei Elektronenmikroskopen sind kein Vakuum
und keine dünnen Schnitte erforderlich, da es sich um eine
Fernfeld-Technik handelt. Die Proben erleiden keine Strahlenschäden,
so dass sich auch lebende Zellen beobachten lassen.
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In
den Druckschriften
DE
10 2006 009 831 A1 ,
DE 202 21 635 U1 ,
DE 102 31 776 A1 ,
DE 101 05 391 A1 ,
DE 100 56 382 B4 und
US 2001/0045523 A1 beschreiben
verschiedene Raster-Mikroskope, die teilweise Weiterentwicklungen
oder Varianten der in den Druckschriften
WO 95/21393 A2 und die
WO 2006/114247 A1 genannten
Gegenstände sind. Allen ist eine hohe Auflösung
innerhalb eine Ebene aber eine geringe Auflösung in Richtung
senkrecht zu dieser Ebene sowie ein hoher Zeitaufwand zur voll ständigen
Erfassung bzw. Abbildung einer Ebene durch zweidimensionales Rastern
gemein.
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein verbessertes
Verfahren und eine verbesserte Vorrichtung zum Erfassen eines Chromophors
und insbesondere zum Abbilden einer Konzentration eines Chromophors
in einer Probe zu schaffen.
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Diese
Aufgabe wird durch die Gegenstände der unabhängigen
Ansprüche gelöst.
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Weiterbildungen
sind in den abhängigen Ansprüche definiert.
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Bei
einem Verfahren zum Erfassen eines Chromophors an einer Linie oder
an einer Fläche in einer Probe, insbesondere zum Abbilden
einer Konzentration des Chromophors an der Linie oder an der Fläche
in der Probe, wird zumindest die Linie bzw. die Fläche
in der Probe mit Licht mit einer ersten Photonenenergie, die einem
ersten Übergang des Chromophors in einen ersten Zustand
entspricht, bestrahlt. Zumindest ein Bereich in der Umgebung der Linie
bzw. der Fläche in der Probe wird mit Licht mit einer zweiten
Photonenenergie, die einem zweiten Übergang des Chromophors
in einen zweiten Zustand entspricht, bestrahlt, wobei die Intensität
des Lichts mit der zweiten Photonenenergie in der Linie bzw. in
der Fläche ein Minimum aufweist. Eine Teilmenge des Chromophors,
die nach dem Bestrahlen der Probe mit Licht mit der ersten Photonenenergie und
mit Licht mit der zweiten Photonenenergie sich im ersten Zustand
befindet, wird erfasst, um den Chromophor in der Fläche
zu erfassen, insbesondere die Konzentration des Chromophors in der
Fläche abzubilden. Insbesondere im Fall des Erfassens eines
Chromophors an einer Linie wird die Teilmenge des Chromophors aus
einer Richtung erfasst, die nicht parallel zu der Linie oder im
Wesentlichen senkrecht zu der Linie ist. Die Richtung des Erfassens
ist beispielsweise die Richtung in der Fluoreszenz des Chromophors
beobachtet wird bzw. die Richtung einer optischen Achse einer dazu
verwendeten Optik.
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Eine
Vorrichtung zum Erfassen eines Chromophors an einer Linie oder an
einer Fläche in einer Probe umfasst eine Bestrahlungseinrichtung
zum Bestrahlen zumindest der Linie bzw. der Fläche in der Probe
mit Licht mit einer ersten Photonenenergie, die einem ersten Übergang
des Chromophors in einen ersten Zustand entspricht, und zum Bestrahlen
zumindest eines Bereichs um die Linie bzw. um die Fläche
in der Probe mit Licht mit einer zweiten Photonenenergie, die einem
zweiten Übergang des Chromophors in einen zweiten Zustand
entspricht. Ferner umfasst die Vorrichtung eine Erfassungseinrichtung zum
Erfassen einer Teilmenge des Chromophors, die nach dem Bestrahlen
der Probe mit Licht mit der ersten Photonenenergie und mit Licht
mit der zweiten Photonenenergie sich im ersten Zustand befindet, um
den Chromophor in der Fläche zu erfassen. Die Bestrahlungseinrichtung
weist eine Einrichtung zum Erzeugen eines Minimums der Intensität
des Lichts der zweiten Photonenenergie in der Fläche auf.
Insbesondere bei einer Vorrichtung zum Erfassen eines Chromophors
an einer Linie wird die Teilmenge des Chromophors aus einer Richtung
erfasst, die nicht parallel zu der Linie oder im Wesentlichen senkrecht zu
der Linie ist. Die Richtung des Erfassens ist beispielsweise die
Richtung in der Fluoreszenz des Chromophors beobachtet wird bzw.
die Richtung einer optischen Achse einer dazu verwendeten Optik.
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Die
Fläche, an der der Chromophor erfasst bzw. seine Konzentration
abgebildet werden soll, ist eine beliebige ebene oder auch gekrümmte
Fläche im Inneren der Probe oder an der Obberfläche
der Probe. Die Fläche muss weder eine Oberfläche noch eine
Grenzfläche an oder in der Probe sein. Die Fläche
wird vielmehr durch das flächig ausgedehnte Minimum der
Intensität des Lichts mit der zweiten Photonenenergie definiert.
Die Linie, an der der Chromophor erfasst bzw. seine Konzentration
abgebildet werden soll, ist eine beliebige gerade oder auch gekrümmte
Fläche im Inneren der Probe oder an der Oberfläche
der Probe.
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Die
Intensität des Lichts mit der zweiten Photonenenergie ist
in der Linie bzw. in der Fläche minimal und nimmt in alle
Richtungen senkrecht zu der Linie bzw. zu der Fläche jeweils
zu. Es ist vorteilhaft, wenn die Intensität im Intensitätsminimum
null oder näherungsweise null beträgt oder zumindest
wesentlich kleiner als an nah benachbarten Orten ist. Das Intensitätsminimum
wird besonders vorteilhaft durch destruktive Interferenz hervorgerufen.
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Das
Licht mit der ersten Photonenenergie und das Licht mit der zweiten
Photonenenergie können von einer einzigen oder von mehreren
Lasern oder anderen Quellen kohärenten oder inkohärenten Lichts
kontinuierlich oder gepulst erzeugt werden. Im Fall gepulsten Lichts
kann das Licht bzw. der Lichtpuls mit der zweiten Photonenenergie
gegenüber dem Licht bzw. dem Lichtpuls mit der ersten Photonenenergie
verzögert sein oder umgekehrt. Verzögerungseinrichtungen
sind in der Optik und vor Allem in Zusammenhang mit gepulsten Lasern
wohl bekannt.
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Das
Licht mit der zweiten Photonenenergie kann gegenüber dem
Licht mit der ersten Photonenenergie stokes-verschoben sein also
eine geringere Photonenenergie aufweisen. Dies gilt insbesondere, wenn
der nach Absorption des Lichts mit der ersten Photonenenergie erreichte
erste Zustand (beispielsweise nach Übergang in einen rotatorischen
oder vibratorischen Grundzu stand) durch stimulierte Emission mittels
des Lichts mit der zweiten Photonenenergie entvölkert wird.
Durch das Licht mit der zweiten Photonenenergie kann der erste Zustand
jedoch auch auf andere Weise entvölkert werden, beispielsweise
durch Absorption. Im ersten Zustand verbleibt danach nur Chromophor
am Ort des Minimums der Intensität und in dessen unmittelbarer
Nähe, also in einer dünnen Schicht um die durch
das Intensitätsminimum definierte die Linie bzw. beiderseits
der durch das Intensitätsminimum definierten Fläche.
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Die
Teilmenge des Chromophors, die nach dem Bestrahlen der Probe mit
Licht mit der ersten Photonenenergie und mit Licht mit der zweiten
Photonenenergie sich im ersten Zustand befindet, wird beispielsweise
erfasst, indem Licht erfasst wird, das der Chromophor während
des Übergangs vom ersten Zustand in den Grundzustand emittiert.
Der Übergang des Chromophors vom ersten Zustand in den Grundzustand
muss nicht in einem einzigen Emissionsprozess erfolgen. Vielmehr
kann vor und nach einem strahlenden Übergang beispielsweise
je ein Übergang in einen vibratorischen oder rotatorischen Grundzustand
erfolgen. Das erfasste Licht umfasst die bei dem strahlenden Übergang
frei werdenden Photonen.
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Alternativ
wird die Teilmenge des Chromophors, die nach dem Bestrahlen der
Probe mit Licht mit der ersten Photonenenergie und mit Licht mit
der zweiten Photonenenergie sich im ersten Zustand befindet, beispielsweise
erfasst, indem zunächst Licht mit einer dritten Photonenenergie
eingestrahlt wird. Die dritte Photonenenergie entspricht einem dritten Übergang
des Chromophors aus dem ersten Zustand in einen dritten Zustand.
Das Licht mit der dritten Photonenenergie wird von dem Chromophor
absorbiert oder stimuliert Emission an dem Chromophor soweit dieser
sich im ersten Zustand befindet. Beispielsweise wird das beim Zerfall
des dritten Zustands oder bei der stimulierten Emission frei werdende
Licht erfasst.
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Das
beim Übergang des Chromophors aus dem ersten Zustand durch
spontante Emission oder bei oder nach Einstrahlen des Lichts mit
der dritten Photonenenergie durch stimulierte oder spontante Emission
entstehende bzw. emittierte Licht kann in einer Richtung senkrecht
(90°) oder im wesentlichen senkrecht (Winkel mindestens
45°, insbesondere mindestens 60°, besonders vorteilhaft
mindestens 80°) zu der Linie bzw. zu der Fläche
erfasst werden, beispielsweise durch Abbildung der Fläche
mittels einer abbildenden Optik auf einen ortsempfindlichen Detektor.
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Das
Licht mit der ersten Photonenenergie und das Licht mit der zweiten
Photonenenergie können parallel bzw. im Wesenlichen parallel
zu der Linie bzw. zu der Fläche eingestrahlt werden, und
zwar aus der gleichen Richtung oder aus verschiedenen, insbesondere
entgegengesetzten Richtungen. Zur Einstrahlung des Lichts mit der
ersten Photonenenergie und des Lichts mit der zweiten Photonenenergie können
eine oder je eine Zylinderlinse vorgesehen bzw. verwendet werden.
Bei Verwendung einer Zylinderlinse können zumindest entweder
die optische Achse oder die Richtung der Translationsinvarianz der
Zylinderlinse parallel zu der Fläche angeordnet sein.
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Wenn
eine Linie mit Licht mit der ersten Photonenenergie bestrahlt wird,
zumindest ein Bereich in der Umgebung der Linie mit Licht mit der
zweiten Photonenenergie bestrahlt wird, und die Intensität des
Lichts der zweiten Photonenenergie in der Linie ein Minimum aufweist,
kann die Linie kontinuierlich oder diskontinuierlich entlang einer
Fläche verschoben wird, um den Chromophor an der Fläche
zu erfassen. In diesem Fall können der Schritt des Bestrahlens
der Linie mit Licht der ersten Photonenenergie und der Schritt des
Bestrahlens zumindest eines Bereichs in der Umgebung der Linie mit
Licht der zweiten Photonenenergie gleichzeitig oder innerhalb eines
Zeitintervalls, in dem die Linie nicht verschoben wird, erfolgen.
Alternativ kann das Produkt aus der Geschwindigkeit, mit der die
Linie verschoben wird, und dem zeitlichen Abstand zwischen dem Bestrahlen
der Linie mit Licht der ersten Photonenenergie und dem Bestrahlen
zumindest eines Bereichs in der Umgebung der Linie mit Licht der
zweiten Photonenenergie kleiner oder gleich oder nicht wesentlich
größer (insbesondere nur um den Faktor 1,5 oder
den Faktor 2,0 größer) als die Lebensdauer des
ersten Zustands sein. Zum Verschieben der Linie können ein
um eine Achse rotierbarer Spiegel und ein abbildendes optisches
Element (beispielsweise eine Linse, ein Beugungsgitter oder ein
gekrümmter Spiegel) vorgesehen sein, wobei ein Fokus des
abbildenden optischen Elements auf der Achse des rotierbaren optischen
Spiegels liegt.
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Durch
alternierendes Wiederholen von einem der oben genannten Verfahren
und einer Translation und/oder Rotation der Probe kann die Konzentration
des Chromophors in der Probe in drei Dimensionen erfasst bzw. abgebildet
werden.
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Eine
Vorrichtung zum optischen Abbilden einer Probe umfasst mindestens
eine Lichtquelle für Anregungslicht (Licht mit einer ersten
Photonenenergie), um einen Fluoreszenzfarbstoff (oder einen anderen
Chromophor) in einer Probe, die von einem Probenhalter gehalten
ist, während eines begrenzten Zeitraums in einem räumlichen
Bereich zur spontanen Emission von Fluoreszenzlicht anzuregen, und für
Abregungslicht (Licht mit einer zweiten Photonenenergie), um den
Fluoreszenzfarbstoff bzw. Chromophor bis auf einen gegenüber
dem räumlichen Bereich ver kleinerten Restbereich wieder
abzuregen, wobei Licht von der Probe mit anderen Wellenlängen als
denjenigen des Anregungslichts und des Abregungslichts der spontanen
Emission von Fluoreszenzlicht aus dem Restbereich des räumlichen
Bereichs zuordenbar ist. Die Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet,
dass das Abregungslicht in zwei parallelen Ebenen, welche von einem
Spalt getrennt sind, aussendbar ist.
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Dadurch
wird erreicht, dass nicht bloß einzelne Punkte sequentiell
gescannt werden können, sondern ganze Ebenen bzw. Schichten
auf einmal, was in einer Verringerung des Zeitaufwandes zum Scannen
einer Probe resultiert. Unter Abregungslicht ist hierbei jede Art
von Strahlung zu verstehen, welche es den Teilchen, die von diesem
Licht beleuchtet werden, nicht erlaubt zu fluoreszieren obwohl sie
auch vom Anregungslicht beleuchtet werden.
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In
bevorzugter Weise ist die Vorrichtung so weitergebildet, dass das
Abregungslicht bzw. das Licht mit der zweiten Photonenenergie durch
Zwischenschaltung einer Lambda-Halbe-Platte oder einer anderen Einrichtung
zur Erzeugung einer destruktiven Interferenz in der Fläche
destruktiv interferiert, im Sinne einer vollständigen oder
teilweisen Auslöschung in der Fläche. Dadurch
wird erreicht, dass die Dicke der Schicht, in der die Intensität
des Abregungslichts null ist oder unter einem vorbestimmten (kleinen)
Wert liegt, möglichst gering gehalten wird. Durch Bildung
dieser hohlen Lichtebene mit der zweiten Photonenenergie mittels
einer Lambda-Halbe-Platte oder auf andere Weise kann die Dicke der
Schicht, in welcher die Fluoreszenzemission stattfindet, gegenüber
Methoden aus dem Stand der Technik ohne Weiteres auf ein Zehntel
oder weniger verringert werden. Dies liegt daran, dass die hohle Lichtebene
eine zentrale Nullstelle der Intensität aufweist. Durch
Erhöhen der In tensität der Abregungsstrahlung
kann die Schicht, in der noch Fluoreszenz stattfindet, fast beliebig
dünn gemacht werden. Dies resultiert in einer Verbesserung
der axialen Auflösung.
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In
vorteilhafter Weise ist die Vorrichtung so weitergebildet, dass
das Anregungslicht im Wesentlichen die durch das flächige
Intensitätsminimum des Abregungslichtes definierte Linie
bzw. Fläche und an diese unmittelbar angrenzende Bereiche
bestrahlt. Dies wird beispielsweise dadurch erreicht, dass Anregungs-
und Abregungsstrahlengang sich überlappen oder zumindest
im Bereich der Probe im Wesentlichen deckungsgleich sind. Anders
ausgedrückt sind Anregungs- und Abregungsstrahlengang so
zentriert bzw. ausgerichtet, dass der hohle Abregungsstrahlengang
den Abregungsstrahlengang einschließt. Zur Bildung der
Lichtebene des Anregungslichtstrahls ist lediglich eine Zylinderlinse
vonnöten, und die Ausstrahlungsebene wird von der Ausrichtung
der Zylinderlinse bestimmt. Die Ausrichtung des An- und Abregungslichtes
ist mit einem Laser einfach zu erreichen, und die Ebenen können
durch Rotation der Zylinderlinse bzw. der Zylinderlinse in Kombination
mit der Lambda-Halbe Platte definiert werden.
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Bei
einer Variante ist die Vorrichtung so weitergebildet, dass das Abregungslicht
und das Anregungslicht aus unterschiedlichen Richtungen eingestrahlt
werden. Hierbei müssen zwar die Strahlengänge
ausgerichtet werden, aber bei Verwendung von zwei unterschiedlichen
Quellen können diese so angeordnet werden, dass sie sich
nicht im Weg stehen.
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Die
Vorrichtung kann so weitergebildet sein, dass der Probenhalter in
einer Richtung, welche im wesentlichen senkrecht auf der Beleuchtungsebene des
An- bzw. Abregungslichtes steht, translatorisch verfahrbar ist.
Einzelne Ebenen oder Schichten der Probe können in einfacher
Weise wie oben beschrieben abgebildet werden, was den Zeitaufwand
eines kompletten dreidimensionalen Scans gering hält.
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Mit
Vorteil ist die Vorrichtung so weitergebildet, dass der Probenhalter
um wenigstens eine, vorzugsweise zwei, Achse(n) schwenkbar ist.
Dadurch wird (optional in Kombination mit der translatorischen Verfahrbarkeit
des Probenhalters) in einfacher Weise ein Scan einer Probe in verschiedenen
Ebenen ermöglicht. Insbesondere kann die Probe nach einem ersten
Scan zwei mal um zwei normal aufeinander stehende Achsen um je 90
Grad gedreht werden, wobei die Probe in jeder der drei Orientierungen
translatorisch durch die Beleuchtungsebene gefahren wird. Durch
die Verschwenkbarkeit um zwei Achsen lassen sich so einfach drei
orthogonale Abbildungsrichtungen in x, y und z festlegen, welche
dann translatorisch Ebene für Ebene abgescannt werden.
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Vorzugsweise
ist die Vorrichtung so weitergebildet, dass ein Computer zur Aufzeichnung
und Korrelation der optischen Daten vorgesehen ist. Die Aufzeichnungen
in einer Scanrichtung werden in Stapeln gespeichert und können
in weiterer Folge von dem Computer zu einem 3D-Bild verrechnet werden, wofür
ein von der Daten- bzw. der Probengröße abhängiger
Rechenaufwand erforderlich ist. Durch diese Aufbereitung von in
drei Dimensionen vorliegenden Daten kann aber in weiterer Folge
auch die Auflösung in jeder einzelnen Ebene erhöht
werden. Durch Simulation der Probe auf dem Computer ergibt sich
für den Betrachter in einfacher Weise die Möglichkeit
die Probe auch aus Richtungen zu betrachten, in welchen gar keine
Daten aufgenommen wurden. Es ist dabei auch möglich mehr
als 3 Stapel von Abbildungsebenen miteinander rechnerisch zu kombinieren.
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Die
Erfindung betrifft weiters ein Verfahren zur Verwendung der erfindungsgemäßen
Vorrichtung und ein Verfahren zur Verbesserung der axialen Auflösung
bei der Abbildung einer Probe unter Verwendung von einer der oben
beschriebenen Vorrichtungen. Dabei können die aufgezeichneten
Daten von einem Computer korreliert und zu einen 3D-Bild zusammengesetzt
werden. Dabei wird beispielsweise bei Überlagerung der
drei mit Verschiebung in x, y und z aufgenommenen Datenstapel die
jeweils geringere Auflösung in axialer Richtung kompensiert.
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Das
Verfahren wird in bevorzugter Weise so durchgeführt, dass
weitere Verfahren zur Erhöhung der lateralen Auflösung,
wie bspw. PALM kombiniert und/oder eingesetzt werden. Bei dem PALM
Verfahren (Betzig E, Science 313: 1642–45 (2006);
auch als PALMIRA oder STORM bezeichnet) wird in zwei Richtungen
(beispielsweise in x- und y-Richtung) eine 10-fach höhere
Auflösung erreicht, was mit der hier erreichten verbesserten
z-Auflösung kombiniert werden kann. Dabei werden die fluoreszierenden Teilchen
mit einem kurzen, intensiven Puls von Anregungslicht bestrahlt,
wobei aber jedes Mal nur wenige fluoreszierende Teilchen, welche
noch dazu weit auseinanderliegen, beginnen Licht zu emittieren. Nachdem
diese Teilchen aufgehört haben Licht zu emittieren kann
ein weiterer Puls von Anregungslicht ausgesendet werden. Da der Übergang
von Nicht-Fluoreszieren zu Fluoreszieren stochastisch ist, werden
aber jedes Mal andere fluoreszierende Teilchen aktiviert und die
Position der leuchtenden Teilchen kann bei jeder Abbildung durch
Rückrechnung der Point-Spread-Function, bspw. durch Überlagerung
der Bildpunkte mit einer Gausschen Kurve, sehr gut approximiert
werden. Dadurch dass diese Bildpunkte jeweils separat aufgenommen
werden, kann die Auflösung gegenüber einer Aufnahme,
welche durch Beugung in der Auflösung begrenzt ist, erhöht
werden.
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Dieses
Verfahren kann auf einer Vielzahl von Gebieten eingesetzt werden,
beispielsweise in der Pathologie oder aber auch zur Überprüfung
bzw. Darstellung von Halbleitertopologien.
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Die
Erfindung wird nachfolgend anhand von in der Zeichnung schematisch
dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Dabei zeigen 1 ein Blockdiagramm des Aufbaus
des Fluoreszenzmikroskops, 2 einen
weiteren räumlichen Aufbau für die Ebenen des
An- und Abregungslichtes und 3 eine vergrößerte
Darstellung des zentralen Bereichs in welchem sich die Ebenen schneiden.
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In 1 ist
mit 1 ein Laser, beispielsweise ein modengekoppelter oder
auf andere Weise gepulster Laser, bezeichnet, der als gepulste oder
kontinuierliche (cw) Lichtquelle für das Anregungslicht (Licht
mit einer ersten Photonenenergie) 2 und Abregungslicht
(Licht mit einer zweiten Photonenenergie, die insbesondere von der
ersten Photonenenergie verschieden ist) 3 dient. Beispielsweise
erzeugt der Laser gleichzeitig einen Puls des Anregungslichts 2 und
einen Puls des Abregungslichts 3. Beide Pulse werden gemeinsam
in einen Verzögerungsgenerator 4 geleitet, in
welchem durch von der Photonenenergie abhängige unterschiedliche
Laufzeiten bzw. zeitliche Verzögerungen ein zeitlicher
Abstand zwischen den Pulsen des Anregungslichtes 2 und
den Pulsen des Abregungslichtes 3 hergestellt wird. Im
Anschluss daran wird sowohl das Abregungslicht 3 als auch
das Anregungslicht 2 durch eine Zylinderlinse 5 geleitet
um jeweils eine Lichtebene auszubilden. Für das Abregungslicht 3 ist
z. B. eine Lambda-Halbe-Platte 6 zwischen den Verzögerungsgenerator 4 und
die Zylinderlinse 5 geschaltet, um eine hohle Lichtebene
auszubilden. Abweichend von 1 können
mittels Strahlteilern das Anregungslicht 2 und das Abregungslicht 3 im Bereich
der Lambda-Halbe-Platte 6 verschiedene Wege zurücklegen,
wobei eine Hälfte des Abregungslichts, nicht aber das Anregungslicht
durch die Lambda-Halbe-Platte tritt. Alternativ kann die Lambda-Halbe-Platte
so ausgebildet sein, dass die Verzögerung des durch die
Lambda-Halbe-Platte tretenden Teils des Strahls gegenüber
dem nicht durch die Lambda-Halbe-Platte tretenden Teil für
das Anregungslicht ein ganzes Vielfaches einer Wellenlänge
und für das Abregungslicht ein ganzes Vielfaches einer
Wellenlänge plus eine halbe Wellenlänge beträgt.
In diesem Fall hat die Lambda-Halbe-Platte auf das Anregungslicht
keine Wirkung während sie auf das Abregungslicht die beabsichtigte
Wirkung einer destruktiven Interferenz in der Mitte des Strahls
hat. Es können dazu aber auch andere geeignete optische
Mittel wie digitaloptische, holographische oder solche, die zur
Erzeugung eines hohlen Besselstrahls dienen, verwendet werden.
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Die
An- und Abregungsstrahlung kann – wie bereits angedeutet – auch
mittels eines dichroitischen Spiegels überlagert werden.
Die aufgrund der destruktiven Interferenz in oder nahe der Strahlmitte hohle
Lichtebene des Abregungslichtes 3 und die Lichtebene des
Anregungslichtes 2 werden auf die Probe 8 gerichtet.
Die Einkoppeleinrichtung ist schematisch mit 10 bezeichnet.
Sowohl das Anregungslicht 2 als auch das Abregungslicht 3 werden
von der Einkoppeleinrichtung 10 auf die Probe 8 gelenkt.
Von der Probe 8 strahlt nun neben den gestreuten Anteilen
des Anregungslichtes 2 und des Abregungslichtes 3 auch
das Fluoreszenzlicht 11 der Probe 8 aus. Das von
der Probe ausgehende Licht wird durch eine Filtereinrichtung 13 gefiltert,
sodass nur oder fast nur das Fluoreszenzlicht 11 den Fotodetektor 9 erreicht.
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In 2 ist
ein anderer räumlicher Aufbau gezeigt, bei welchem das
Abregungslicht 3 und das Anregungslicht 2 aus
entgegengesetzten Richtungen auf die Probe 8 gerichtet
sind. Die Probe 8 ist, ebenso wie das abweichend von der
Darstellung in 1 auch bei der dort gezeigten
Vorrichtung der Fall sein kann, in Richtung des Doppelpfeiles 14 senkrecht
zur Beleuchtungsebene verfahrbar. Ferner kann die Probe 8 in
Richtung der beiden Doppelpfeile 15 und 16 verschwenkbar
sein.
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3 zeigt
die Geometrie der Beleuchtungsebene. Vereinfachend ist das Abregungslicht 3 als aus
zwei Schichten zusammengesetzt dargestellt. Tatsächlich
nimmt die Intensität im Fall einer destruktiven Interferenz
bis zu einem Minimum kontinuierlich ab, wobei die Intensität
im Minimum null sein kann. Die Grenzen der in 3 dargestellten
Lichtschichten können als die Grenzflächen verstanden
werden, außerhalb derer die Intensität einen vorbestimmten (niedrigen)
Schwellenwert unterschreitet. Besonders vorteilhaft ist es, wenn
der größte Durchmesser der Probe kleiner als die
Länge L des Bereichs ist, innerhalb dessen die beiden Lichtschichten
des Abregungslichts annähernd parallel sind und vor Allem
einen annähernd konstanten Abstand von einander haben.
Alternativ wird die Konzentration des Farbstoffs bzw. Chromophors
nur innerhalb des Bereichs mit der Länge L erfasst.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - WO 95/21393
A2 [0004, 0012]
- - WO 2006/114247 A1 [0004, 0012]
- - DE 102006009831 A1 [0012]
- - DE 20221635 U1 [0012]
- - DE 10231776 A1 [0012]
- - DE 10105391 A1 [0012]
- - DE 10056382 B4 [0012]
- - US 2001/0045523 A1 [0012]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Betzig E,
Science 313: 1642–45 (2006) [0037]