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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Mikroskop, insbesondere
Laser-Raster-Fluoreszenzmikroskop,
zur räumlich
hochauflösenden
Untersuchung von Proben, wobei die zu untersuchende Probe eine Substanz
umfasst, die wiederholt von einem ersten Zustand in einen zweiten
Zustand überführbar ist,
wobei sich die ersten und die zweiten Zustände in mindestens einer optischen
Eigenschaften voneinander unterscheiden, umfassend die Schritte,
dass die Substanz in einem zu erfassenden Probenbereich zunächst in
den ersten Zustand gebracht wird und dass mittels eines optischen
Signals der zweite Zustand induziert wird, wobei innerhalb des zu
erfassenden Probenbereichs räumlich
begrenzte Teilbereiche gezielt ausgespart werden.
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Verfahren
und Mikroskope der eingangs genannten Art sind aus der Praxis bekannt.
Grundsätzlich
ist gemäß dem Abbe'schen Gesetz der
räumlichen
Auflösung
abbildender optischer Verfahren durch die Beugungsgrenze eine theoretische
Grenze gesetzt, wobei die Beugungsgrenze von der Wellenlänge des
verwendeten Lichts abhängt.
Mit den hier in Rede stehenden Verfahren und Mikroskopen lassen
sich allerdings räumliche
Auflösungen
erzielen, die über
die nach Abbe bekannte theoretische Beugungsgrenze hinaus verbessert
sind.
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Bei
den bekannten Verfahren werden hierzu in zu untersuchenden Proben
Substanzen bereitgestellt, die wiederholt von einem ersten Zustand
in einen zweiten Zustand überführbar sind,
wobei sich die ersten und die zweiten Zustände in mindestens einer optischen
Eigenschaft voneinander unterscheiden. Bei den meisten bekannten
Verfahren handelt es sich bei dem ersten Zustand um einen fluoreszenzfähigen Zustand
(im Folgenden Zustand A genannt) und bei dem zweiten Zustand um
einen nicht fluoreszenzfähigen
Zustand (im Folgenden Zustand B). Nachdem die Substanz in einem
zu erfassenden Probenbereich mittels eines Schaltsignals in den
fluoreszenzfähigen
Zustand A gebracht worden ist, wird mittels eines optischen Signals
in räumlich
begrenzten Teilbereichen des zu erfassenden Probenbereichs Zustand
B induziert und somit eine Unterdrückung der Fluoreszenz von Fluoreszenzmolekülen erzeugt.
Der physikalische Prozess der Fluoreszenzunterdrückung kann dabei sehr unterschiedlicher
Natur sein. So ist bspw. die stimulierte Emission aus dem zuvor angeregten
Zustand oder eine optisch induzierte Strukturänderung der Fluoreszenzmoleküle bekannt.
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Entscheidend
ist, dass der durch ein optisches Signal induzierte Übergang
von dem ersten in den zweiten Zustand im Probenvolumen in großen Bereichen
gesättigt,
d.h. vollständig,
stattfindet, und in mindestens einem Teilbereich des Probenvolumens
gerade nicht stattfindet, indem dort das optische Schaltsignal gezielt
nicht eingestrahlt wird. Dieser Effekt kann durch das Erzeugen einer
Intensitätsnullstelle
des optischen Signals erreicht werden. An der Nullstelle und in
deren unmittelbarer Umgebung findet kein Übergang in den zweiten Zustand
(im Allgemeinen der nicht fluoreszierende Zustand B) statt, so dass
der erste Zustand (im Allgemeinen der fluoreszierende Zustand A)
erhalten bleibt. Eine Sättigung
des Übergangs
A -> B durch das optische
Signal führt
in den beleuchteten Bereichen des zu erfassenden Probenbereichs
bereits in naher Umgebung der Intensitäts-Nullstellen zu einem (nahezu) vollständigen Transfer
in den Zustand B. Je stärker
der Prozess in die Sättigung
getrieben wird, d.h. je mehr Energie durch das optische Signal in
die Bereiche um die Nullstelle herum eingebracht wird, desto kleiner wird
der Bereich mit Fluoreszenzmolekülen
im fluoreszenzfähigen
Zustand A bzw. allgemein in einem „leuchtfähigen" Zustand. In Abhängigkeit vom Sättigungsgrad
in der unmittelbaren Nullstellen-Umgebung kann dieser Bereich prinzipiell
beliebig klein gemacht werden. Folglich lassen sich Regionen des
Zustands A markieren, die beliebig viel kleiner sind als die kleinsten
aufgrund der Beugungsgrenze möglichen
Regionen eines aufgebrachten optischen Signals. Wird der Bereich
des Zustands A anschließend ausgelesen,
z.B. durch Einstrahlen eines Testsignals, so stammt das (Fluoreszenz-)Messsignal
aus einem definierten Bereich, der kleiner sein kann als es die
Beugungsgrenze zulässt.
Wird die Probe auf die beschriebene Art Punkt für Punkt abgerastert, so entsteht
ein Bild mit einer Auflösung
die besser ist, als es die Beugungstheorie erlaubt.
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Verfahren,
der hier beschriebenen Art, bei denen als Unterschied zwischen zwei
Zuständen
die optische Eigenschaft fluoreszenzfähig/nicht fluoreszenzfähig ausgenutzt
wird, sind bspw. aus der
DE 103
25 459 A1 und der
DE
103 25 460 A1 bekannt. Bei diesen Verfahren werden Fluoreszenzmoleküle mit Hilfe
eines optischen Signals von einem Zustand A (fluoreszenzfähig) in
einen Zustand B (nicht fluoreszenzfähig) gebracht, wobei bei dem Übergang
A -> B die Sättigung
erreicht wird. Die in dem fluoreszenzfähigen Zustand A verbleibenden
Bereiche der Probe resultieren jeweils aus einem eine Nullstelle aufweisenden
Intensitätsminimum
des eingestrahlten optischen Signals. Die Intensitätsminima
sind Teil eines Interferenzmusters. Das Abrastern der Probe erfolgt
durch Verschiebung der Intensitätsminima
des optischen Signals, wobei die Verschiebung durch Phasenverschiebung
der interferierenden Strahlen bewirkt wird.
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Bei
den bekannten Verfahren ist nachteilig, dass durch die interferierenden
Strahlen ein Interferenzmuster mit lokalen punktförmigen Intensitätsminima
ausgebildet wird. Ein Abrastern der Probe erfordert dementsprechend
einen punktuellen Scannvorgang in mindestens zwei Dimensionen, was
den Scannvorgang äußerst zeitaufwendig
macht.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt nunmehr die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren
sowie ein Mikroskop der eingangs genannten Art anzugeben, wonach
mit konstruktiv einfachen und kostengünstigen Mitteln und gleichzeitig
kompakter Bauform ein schnelles Abrastern einer Probe ermöglicht ist.
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Erfindungsgemäß ist die
voranstehende Aufgabe durch ein Verfahren mit den Merkmalen des
Patentanspruchs 1 gelöst.
Danach ist das Verfahren derart ausgestaltet und weitergebildet,
dass das optische Signal in Form einer Fokuslinie mit einem Querschnittsprofil
mit mindestens einer Intensitätsnullstelle
mit seitlich benachbarten Intensitätsmaxima bereitgestellt wird.
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Die
voranstehende Aufgabe ist des Weiteren durch ein Mikroskop mit den
Merkmalen des Patentanspruchs 25 gelöst. Danach ist das Mikroskop
derart ausgestaltet und weitergebildet, dass das optische Signal
in Form einer Fokuslinie mit einem Querschnittsprofil mit mindestens
einer Intensitätsnullstelle
mit seitlich benachbarten Intensitätsmaxima bereitstellbar ist.
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In
erfindungsgemäßer Weise
ist zunächst
erkannt worden, dass die Bildaufnahmegeschwindigkeit bekannter hochauflösender Abbildungsverfahren für diverse
Anwendungen, bspw. im Bereich der Echtzeit-Mikroskopie biologischer
Proben, nicht ausreichend ist. In weiter erfindungsgemäßer Weise
ist sodann erkannt worden, dass ein im Vergleich zu einem Punkt-Scann
deutlich schnellerer Linien-Scann möglich ist,
wenn der zweite Zustand entlang einer (prinzipiell beliebig) schmalen
Linie induziert werden kann. Erfindungsgemäß wird hierzu das optische
Signal in Form einer Fokuslinie bereitgestellt, wobei die Fokuslinie
ein Quer schnittsprofil mit mindestens einer Intensitätsnullstelle – zur Konservierung
des ersten Zustands entlang einer (prinzipiell beliebig) schmalen
Linie – mit
seitlich benachbarten Intensitätsmaxima – zur Induzierung
des zweiten Zustands in Sättigung – aufweist.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
und das erfindungsgemäße Mikroskop
lassen sich in besonders vorteilhafter Weise in Verbindung mit sehr
langlebigen oder zeitlich sogar dauerhaft stabilen ersten und zweiten
Zuständen
einsetzen. In diesem Fall kann für
die Sättigung
des Übergangs
vom ersten in den zweiten Zustand ein vergleichsweise langer Zeitraum
gewählt
werden, innerhalb dessen die zur Sättigung notwendige Energie
des optischen Signals eingestrahlt wird. Die lokalen Intensitäten zur Übergangssättigung
können
dadurch sehr gering gewählt werden.
Vor allem kann die von einer Strahlquelle des optischen Signal zur
Verfügung
stehende Gesamtenergie auf großräumige Bereiche
im Probenraum verteilt und mehrere Intensitätsnullstellen oder eine ausgedehnte
Nullstelle erzeugt werden. Trotz der daraus resultierenden geringen
lokalen Intensitäten
in der Umgebung der Nullstelle(n) im Vergleich zur Auftragung des
Gesamtsignals um nur eine punktförmige
Nullstelle herum kann die Sättigung
erreicht werden. Dazu muss das Signal nur genügend lange eingestrahlt werden,
bis schließlich
alle Moleküle
in Umgebung der Nullstellen im zweiten Zustand sind. Dies ist ein
entscheidender Unterschied zum Fall eines kurzlebigen Zustandes
(z.B. im STED-Verfahren mit typischen Lebenszeit von ~ 1 ns für einen fluoreszenzfähigen Zustand
A), wo die zur Sättigung notwendige
Energie in so kurzer Zeit eingestrahlt werden muss (deutlich schneller
als die Rate A -> B), dass
die Gesamtleistung der Strahlquelle nur für die Erzeugung einer (oder
maximal einiger weniger) lokalen Nullstellen ausreicht. Es lässt sich
für konkrete Systeme
zeigen, dass im Falle stabiler Zustände (z.B. photochrome Farbstoffe)
oder langlebiger Zustände
(z.B. Transfer in das Tripletsystem beim GSD-Verfahren, GSD = Ground
State Depletion = Grundzustandsentvölkerung) die Leistung preiswerter
und kommerzieller Lasersysteme auf so große Bereiche verteilt werden
kann, dass mehrere punktförmige
Intensitäts-Nullstellen
(>> 10) oder ganze Streifen verschwindender
Intensität
in der Probe erzeugt werden können,
in deren unmittelbarer Umgebung nach wie vor die Sättigung
erreicht werden kann. Dies ermöglicht
eine parallelisierte Bildaufnahme, wenn die Probe mit der Vielzahl
von Punkt-Nullstellen oder mit Nullstellen-Linien gleichzeitig abgerastert
wird und die Signale gleichzeitig für jede Nullstelle getrennt
von einem Detektor erfasst werden. Auf diese Weise lassen sich Mikroskope
mit Auflösungen
unterhalb der klassischen Beugungsgrenze konstruieren, deren Bildaufnahmegeschwindigkeit
im Bereich STED basierten Verfahren liegt und im Vergleich zu Systemen
mit einer einzigen lokalen Nullstelle deutlich erhöht ist.
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Im
Rahmen einer konkreten Ausführungsform
ist vorgesehen, dass die Fokuslinie generiert wird, indem in das
Mikroskop ein optisches Bauteil integriert wird, das zunächst eine
Beleuchtungslinie in einer zur Pupille des Mikroskopobjektivs konjugierten Puppillenebene
erzeugt. Des Weiteren ist ein phasenmodulierendes Element vorgesehen,
mit dem eine zur Erzeugung des Querschnittsprofils der Fokuslinie
geeignete Phasenmodulation entlang der Pupillenlinie durchgeführt wird.
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Im
Rahmen der Phasenmodulation kann vorgesehen sein, dass entlang der
Pupillenlinie ein oder mehrere Phasensprünge eingeführt werden. Besonders bevorzugt
ist die Einführung
eines Phasensprunges im Pupillenmittelpunkt. Dieser Phasensprung
wird in weiter vorteilhafter Weise so gewählt, dass er der Länge eines
halben Wellenzugs entspricht, so dass die eine Hälfte der Linie um einen halben
Wellenzug verzögert
wird. Auf diese Weise entsteht in der Fokalebene eine Fokuslinie
mit einem Querschnittsprofil, das sich aus einer Intensitätsnullstelle
mit seitlich benachbarten Intensitätsmaxima zusammensetzt. Alternativ
ist es möglich,
entlang der Pupillenlinie mehrere Phasensprünge um vorzugsweise jeweils
einen halben Wellenzug einzuführen, so
dass im Ergebnis ebenfalls die Hälfte
der Gesamtlinie, d.h. die Hälfte
der Lichtmenge, die durch die Pupille gestrahlt wird, im Vergleich
zur anderen Hälfte um
einen halben Wellenzug verzögert
ist.
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Im
Hinblick auf eine konstruktiv einfache Ausführung kann vorgesehen sein,
dass die Phasenmodulation entlang der Pupillenlinie mittels eines
in einem Zwischenbild der Pupille angeordneten räumlichen Phasenmodulators auf
Flüssigkeitsbasis
realisiert wird. Alternativ ist die Einfügung eines optischen Bauteils
mit einer phasenverzögernden
optischen Beschichtung denkbar. Prinzipiell können alle phasenverzögernden
Elemente, wie Substrate mit dielektrischen Beschichtungen, Phasenmodulatoren
auf Basis von Flüssigkristallen
oder achromatische Phasenfilter eingesetzt werden. Idealerweise
ist die Optik mit der phasenverzögernden
Eigenschaft in oder nahe einer Pupillenebene angeordnet.
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Im
Hinblick auf eine konstruktiv einfache Bauform kann vorgesehen sein,
dass die Pupillenlinie durch Fokussieren eines Beleuchtungslichtstrahls
einer Beleuchtungslichtquelle mit einer Zylinderlinse oder einer
Powell-Linse erzeugt wird. Alternativ kann die Pupillenlinie durch
Abbilden einer Spaltblende in die Pupillenebene erzeugt werden. Denkbar
ist auch der Einsatz holographischer Elemente.
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In
besonders vorteilhafter Weise wird die Pupillenlinie mittels eines
Achrogate-Filters
in den Strahlengang eingekoppelt. In bevorzugter Weise könnte die
Phasenmodulation entlang der Pupillenlinie dann mittels zusätzlich phasenverzögernder Schichten
auf dem Filter, beispielsweise in Form von dielektrischen Beschichtungen,
realisiert werden.
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Im
Hinblick auf eine besonders kompakte Bauform könnten das optische Bauteil
zur Erzeugung der Pupillenlinie und das phasenmodulierende Element
als bauliche Einheit ausgeführt
sein. Im Hinblick auf eine hohe Flexibilität können das optische Bauteil zur
Erzeugung der Pupillenlinie und das phasenmodulierende Element auch
jeweils als separate Einheiten an unterschiedlichen Positionen im
Beleuchtungsstrahlengang angeordnet sein.
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Zur
Sicherstellung einer kohärenten
linienförmigen
Beleuchtung der Pupille des Mikroskopobjektivs ist die Beleuchtungslichtquelle
zur Erzeugung des optischen Signals bevorzugt als Laserlichtquelle ausgeführt.
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In
besonders vorteilhafter Weise ist das Licht des optischen Signals
senkrecht zur Pupillenlinie polarisiert, um auf diese Weise Depolarisierungseffekte weitestgehend
auszuschließen.
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Im
Rahmen einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Fokuslinie
nacheinander in unterschiedlichen Raumrichtungen erzeugt. Dabei kann
es sich beispielsweise um orthogonal zueinander orientierte Raumrichtungen
handeln. Entsprechend kann vorgesehen sein, dass das gesamte zu erfassende
Probevolumen nacheinander in jeder der Raumrichtungen abgerastert
wird. Anschließend können die
aufgenommenen Einzelbilder mathematisch zu einem Gesamtbild zusammengeführt werden,
wodurch eine Auflösungserhöhung in
mehr als einer Richtung realisiert ist.
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Es
kann vorgesehen sein, dass der Übergang
von dem ersten Zustand in den zweiten Zustand mittels Mehr-Photonen-Absorption
realisiert wird. Alternativ oder zusätzlich kann das Auslesen eines
von der Probe ausgehenden Messsignals mittels Mehr-Photonen-Anregung
realisiert werden. Eine derartige Ausgestaltung bietet sich insbesondere
bei speziellen Anwendungen an, beispielsweise wenn es gilt, ein
Bleichen der Probe zu verhindern.
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Im
Rahmen einer weiter bevorzugten Ausführung ist vorgesehen, dass
das optische Signal und ein Testsignal zum Auslesen der ersten Zustände jeweils
mittels gepulster Lichtquellen erzeugt werden. Dabei erweist sich
eine Synchronisation der gepulsten Lichtquellen als vorteilhaft.
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Die
Beleuchtungslichtquelle zum Erzeugen des optischen Signals kann
mit mindestens einer weiteren Lichtquelle kombiniert sein, wobei
die weitere Lichtquelle zum Auslesen des von der Probe ausgehenden
Messsignals und/oder zur Erzeugung eines Schaltsignals zum Induzieren
des ersten Zustandes dienen könnte.
Insbesondere könnte
die weitere Lichtquelle die Probe ganz oder teilweise ausleuchten,
wobei eine linienförmige
Ausleuchtung bevorzugt ist.
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Zudem
könnte
die Fokuslinie des optischen Schaltsignals mit einer weiteren Linie
räumlich überlagert
sein. In besonders vorteilhafter Weise ist die räumliche Überlagerung derart gewählt, dass
die Intensitäts-Nullstelle
der Fokuslinie des optischen Signals mit dem Maximum einer Linie
zum Auslesen des von der Probe ausgehenden Messsignals räumlich überlagert
ist. Je nach Anwendung kann dabei jeder Linie eine eigene Scanneinrichtung,
vorzugsweise in Form eines Scannspiegels, zugeordnet sein, oder
die Linien werden gemeinsam mit einer einzigen Scanneinrichtung
gescannt.
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Um
die Geschwindigkeitsvorteile bei der Bilderzeugung voll auszunutzen,
wird die Scannrichtung in idealer Weise auf die jeweilige Verlaufsrichtung
der Pupillenlinie abgestimmt. In weiter vorteilhafter Weise kann
eine Liniendetektion des von der Probe ausgehenden Messsignals mittels
eines Zeilendetektors durchgeführt
werden. Der Zeilendetektor kann beispielsweise als CCD-Zeile ausgeführt sein.
Der Einsatz eines EMCCDs oder einer APD (Avalanche Photodiode) ist
ebenfalls denkbar.
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Im
Hinblick auf eine Erhöhung
der Auflösung auch
entlang der optischen Achse ist die Detektorzeile bevorzugt konfokal
zur Fokuslinie angeordnet. Konkret kann die Detektorzeile dabei
in Detektionsrichtung hinter den Scanneinrichtungen (descannte Detektion)
oder vor den Sanneinrichtungen (nicht descannte Detektion) angeordnet
sein.
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In
besonders vorteilhafter Weise wird das beschriebene Mikroskop zum
optisch induzierten Übergang
von Farbstoffmolekülen
zwischen verschiedenen Molekülzuständen eingesetzt,
die sich in mindestens einer optischen Eigenschaft voneinander unterscheiden,
So kann das Mikroskop beispielsweise zum Induzieren eines Übergangs
zwischen den Zuständen
einer Trans-Cis-Isomerisierung oder zum Schalten von photochromen
Farbstoffen eingesetzt werden. Des Weiteren ist ein Einsatz zum
Transfer von Farbstoffmolekülen
in deren Triplettzustand im Rahmen eines GSD-Verfahrens (Ground
State Depletion) möglich.
Schließlich
bietet sich die Durchführung
von STED-Verfahren an.
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Es
gibt nun verschiedene Möglichkeiten,
die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten
und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die nachgeordneten Ansprüche, andererseits
auf die nachfolgende Erläuterung
bevorzugter Ausführungsbeispiele
des erfindungsgemäßen Verfahrens
und des erfindungsgemäßen Mikroskops zur
räumlich
hochauflösenden
Untersuchung von Probe zu verweisen. In Verbindung mit Erläuterungen
der bevorzugten Ausführungsbeispiele
anhand der Zeichnungen werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen
und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigen
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1 in
einer schematischen Darstellung ein zyklisches Beleuchtungsschema
eines Verfahrens zur räumlich
hochauflösenden
Untersuchung von Proben,
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2 in
einer schematischen Darstellung die Erzeugung einer Fokuslinie mit
einem Querschnittsprofil mit einem einzigen Intensitätsmaximum,
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3 in
einer schematischen Darstellung die erfindungsgemäße Erzeugung
einer Fokuslinie mit einem Querschnittsprofil mit mindestens einer
Intensitäts-Nullstelle
mit seitlich benachbarten Intensitätsmaxima,
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4 in
einer schematischen Darstellung den Aufbau eines ersten Ausführungsbeispiels
eines erfindungsgemäßen Mikroskops
und
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5 in
einer schematischen Darstellung den Aufbau eines zweiten Ausführungsbeispiels
eines erfindungsgemäßen Mikroskops.
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1 zeigt
schematisch einen zyklischen Beleuchtungsvorgang, wie er zur räumlich hochauflösenden Untersuchung
von Proben jenseits der beugungslimitierten Auflösungsgrenze eingesetzt wird. Gemäß 1a wird
zunächst
im gesamten zu erfassenden Probenraum P eine in der Probe 1 bereitgestellte
Substanz, die wiederholt von einem ersten Zustand Z1 in einen zweiten
Zustand Z2 überführbar ist, wobei
sich die ersten und die zweiten Zustände Z1, Z2 in mindestens einer
optischen Eigenschaften voneinander unterscheiden, mittels eines
Schaltsignals 2 in den ersten Zustand Z1 gebracht. Im konkret
dargestellten Ausführungsbeispiel
handelt es bei dem ersten Zustand Z1 um einen fluoreszierenden Zustand
A und bei dem zweiten Zustand Z2 um einen nicht fluoreszierenden
Zustand B. Bei der in der Probe 1 bereitgestellten Substanz
handelt es sich in dem konkret dargestellten Beispiel um eine photochrome Substanz,
deren Moleküle
durch Bestrahlung mit Licht einer ersten Wellenlänge, dem Schaltsignal 2, in
den fluoreszenzfähigen
Zustand A gebracht werden. Dies geschieht in idealer Weise durch
Beleuchtung durch ein Objektiv 3 mit einer einfachen Beleuchtungslinie
des Schaltsignals 2 im Probenraum P, wie es für sich gesehen
aus dem Stand der Technik bekannt ist. Alternativ kann die Probe 1 auch
im gesamten Probenraum P bestrahlt werden.
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Im
Falle der Grundzustands-Entvölkerung (Ground
State Depletion, GSD) findet der Übergang in den fluoreszenzfähigen (Singlet)-Zustand üblicherweise
spontan statt. Das Einstrahlen optischer Schaltsignale erübrigt sich
somit in diesem Fall, es müssen
lediglich Wartezeiten von typischerweise 1 bis 100 μs (teilweise
auch ein wenig länger)
berücksichtigt
werden.
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In
einem nächsten
Schritt – dargestellt
in 1b – wird
Licht einer anderen Wellenlänge,
das sogenannte optische Signal 4, auf den zu erfassenden
Probenbereich P aufgebracht. Erfindungsgemäß geschieht dies in Form einer
Doppellinie 9 mit dazwischen liegender Intensitäts-Nullstelle 5.
Das optische Signal 4 induziert gesättigt den Übergang A -> B in allen mit Licht des optischen Signals 4 beleuchteten Bereichen 6.
Mit anderen Worten verbleibt lediglich in unmittelbarer Umgebung
der Intensitäts-Nullstelle 5 ein
eng definierter Bereich der Substanz im Zustand A. Dieser verbleibende
Bereich der Substanz in Zustand A kann viel kleiner sein als die
beugungslimitierten Strukturen. Die Größe des im Zustand A verbleibenden
Bereichs hängt
ganz maßgeblich
von der Qualität
des Intensitätsminimums 5 und
damit vom erreichten Sättigungsgrad
des Übergangs
A -> B ab.
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In 1c ist
schematisch der Auslesevorgang des Zustands A dargestellt. Dazu
wird ein optisches Testsignal 7 so in den zu erfassenden
Probebereich P eingestrahlt, dass der gemäß 1b präparierte
Bereich, in dem die Substanz in Zustand A verblieben ist, erfasst
wird. Das Testsignal 7 wird in bevorzugter Weise ebenfalls
linienförmig
eingestrahlt. Dabei wird eine einfache Linie mit einem Maximum erzeugt,
wobei das Maximum mit der Intensitäts-Nullstelle 5 des
optischen Signals 4 räumlich überlagert
wird. Dementsprechend kann auch die Detektion bevorzugt linienförmig erfolgen,
bspw. durch einen konfokal angeordneten Zeilendetektor, beispielsweise
in Form einer CCD-Zeile.
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Der
in den 1a bis c dargestellte Zyklus wird
wiederholt, wobei das Linienmuster bei jeder Wiederholung etwas
weiter geschoben wird. Auf diese Weise lässt sich der gesamte zu erfassende
Probenbereich P mit einer Auflösung
im Subdiffraktionsbereich abbilden.
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2 zeigt
schematisch die Erzeugung einer einzelnen Linienstruktur des Beleuchtungslichts zum
Auslesen der Zustände
A, d.h. einer einfachen Linie mit einem Maximum, das – wie oben
ausgeführt – mit der
Intensitäts-Nullstelle 5 der
erfindungsgemäßen Fokuslinie 10 des
optischen Signals 4 überlagert werden
kann. Gemäß 2a wird das Beleuchtungslicht durch eine
geeignete Optik 11 zunächst
linienförmig
in einer zur Fokusebene FE konjugierten Ebene FE' abgebildet. Mittels einer Abbildungslinse 12 wird
die Beleuchtungslinie kohärent
in die Pupillenebene PE eines Objektivs 13 fokussiert,
mit dem das Beleuchtungslicht in die Probe 1 fokussiert
wird. Im dargestellten Beispiel verläuft die Beleuchtungslinie in
x-Richtung. Dementsprechend
wird die Pupille PE – wie
in 2b gezeigt – zentralsymmetrisch linienförmig in
y-Richtung ausgeleuchtet (Pupillenlinie 14). In der Fokusebene
FE des Objektivs 13 entsteht dabei – wie in 2c gezeigt – ebenfalls
eine linienförmige
Lichtstruktur, die senkrecht zur Pupillenlinie 14 in x-Richtung steht (Fokuslinie 15)
und eine Abbildung der Linie in der zur Fokusebene FE konjugierten
Ebene FE' darstellt.
Der Querschnitt der Fokuslinie 15 hat eine beugungsbegrenzte
Ausdehnung, wenn die Pupillenlinie 14 den gesamten Pupillendurchmesser
erfasst. Die Querschnittsausdehnung der Fokuslinie 15 ist
beugungsbegrenzt etwa 1,4fach größer als
die einer beugungsbegrenzten Punktquelle (Airy-Scheibe).
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Die
in 2 lediglich schematisch angedeutete Optik 11 kann
in verschiedenen Formen realisiert sein. So kann eine linienförmige Beleuchtung
von FE' bzw. der
Pupille PE beispielsweise durch Abbildung einer Spaltblende oder
durch Fokussieren eines aufgeweiteten Beleuchtungslichtstrahls mittels
einer Zylinderlinse oder einer Powell-Linse erreicht werden. Die
Verwendung einer Powell-Linse bietet den Vorteil, dass die erzeugte
linienförmige
Lichtstruktur eine besonders homogene Lichtverteilung aufweist.
Eine weitere Variante ist die Beleuchtung über einen nur linienförmig reflektierenden
Strahlteiler, der in einer zur Pupillenebene PE konjugierten Ebene
des Mikroskops angeordnet ist. Entscheidend für die Erzeugung einer linienförmigen Beleuchtung
der Probe 1 in x-Richtung (2c)
ist prinzipiell nur die kohärente
linienförmige
Beleuchtung der Pupille PE in y-Richtung (2b).
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3 zeigt
schematisch ein Ausführungsbeispiel
zur Erzeugung einer erfindungsgemäßen Fokuslinie 10 mit
zentraler Nullstelle 5 im Querschnitt und seitlich begrenzenden
Maxima 9. Dazu wird eine Phasenmodulation des optischen
Signals 4 entlang der Pupillenlinie 14 realisiert.
In 3a ist die linienförmige Ausleuchtung
der Pupille PE dargestellt. Entlang der Pupillenlinie 14 ist
im Pupillenmittelpunkt ein Phasensprung von einer halben Wellenlänge eingeführt, so
dass die eine Hälfte
der Linie 14 gegenüber der
anderen Hälfte
der Linie 14 um einen halben Wellenzug verzögert ist.
Dies ist in 3a durch die unterschiedlich
schraffierten Bereiche angedeutet. Diese Phasenmodulation hat zur
Folge, dass in der Fokalebene FE eine Doppellinie 9 mit
zentraler Intensitäts-Nullstelle 5 entsteht,
wie dies in 3b dargestellt ist. Prinzipiell
können
auch andere Phasenmodulationen zu Strukturen mit einem derartigen
Zentralminimum führen.
So erzeugt jede zentralsymmetrische Phasenmodulation, welche die
Eigenschaft hat, das 50 % der Pupillenlinie 14 um einen
halben Wellenzug verzögert
werden, eine orthogonal zur Pupillenlinie 14 ausgerichtete
Fokuslinie 10 mit einem Zentralminimum im Querschnittsprofil.
Allerdings wird der Querschnitt der Fokuslinie 10 dabei
komplizierter und damit im Allgemeinen aus mehreren Maxima und Minima
bestehen.
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Wie
in 3a durch die dargestellten Pfeile angedeutet,
ist das Licht senkrecht zur Pupillenlinie 14, d.h. in x-Richtung,
polarisiert. Auf diese Weise wird erreicht, dass in der Eintrittspupille 14 nur
Polarisationsvektoren mit reiner Tangentialkomponente auftreten.
Beim Durchlaufen nachfolgender Optiken depolarisieren diese wesentlich
schwächer
in z-Richtung, d.h. in Strahlrichtung, als beispielsweise Polarisationsvektoren
mit (in Bezug auf die Pupille) radialen Komponenten.
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4 zeigt
schematisch ein Ausführungsbeispiel
eines erfindungsgemäßen Mikroskops.
Bei der in 4a dargestellten Ausführungsform
wird kohärentes
Beleuchtungslicht einer Strahlquelle 16 durch eine geeignete
Optik 11 linienförmig
in eine Zwischenbildebene ZB3 des Mikroskops fokussiert. Die Linie
verläuft
dabei in x-Richtung. Die Optik 11 zur Realisierung einer
linienförmigen
Lichtstruktur ist als Zylinderlinse 17 ausgeführt. Das
Zwischenbild ZB3 wird über
eine Linse 18 in die zur Pupille P1 des Mikroskopobjektivs 13 konjugierte
Pupillenebene P2 abgebildet, wo die Lichtverteilung linienförmig in y-Richtung
verläuft.
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In
der Pupillenebene P3 des Mikroskops ist ein Strahlteiler 19 mit
einer streifenförmigen
Reflexionsschicht RS angeordnet. Der Strahlteiler 19 ist
nur im Bereich der Linie RS reflektierend, so dass das rückwärts zu detektierende
Messsignal 8, welches die gesamte Pupillenebene P3 ausleuchtet,
fast vollständig
transmittiert wird.
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Die
Pupille P3 wird durch Optiken 20 und 18 auf einen
Y-Scanner 21 abgebildet, der den Strahl zur Bildaufnahme
in y-Richtung scannen kann. Dieser befindet sich ebenfalls in der
Pupillenebene P2. Die weitere Abbildung erfolgt über das Scannokular 22 in ein
Zwischenbild ZB1, wo wieder ein Lichtstreifen in x-Richtung entsteht.
Dieser wird über
die Tubuslinse 23 und das Objektiv 13 in die Fokusebene
FE im Probenraum abgebildet. In der Pupille P1 des Objektivs 13 entsteht
dabei eine linienförmige
Lichtverteilung in y-Richtung analog zur Pupillenebene P3, in der
sich der Strahlteiler 19 befindet. In der Fokalebene FE entsteht
ein (beugungsbegrenzter) Beleuchtungsstreifen analog zur Zwischenbildebene
ZB3.
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Zur
Erzeugung der erfindungsgemäßen Fokuslinie 10 mit
zentraler Intensitäts-Nullstelle 5 und seitlichen
Intensitäts-Maxima 9 wird
eine Phasenmodulation entlang der Pupillenlinie 14 durchgeführt In dem
dargestellten Ausführungsbeispiel
wird dazu in der Pupille P3 ein Phasensprung eingeführt, indem ein
Teil des Strahlteilers 19 mit einer phasenverzögernden
Struktur PV versehen wird, welche die Phase des Lichts um einen
halben Wellenzug verzögert. Die
hier transparent ausgeführte
Beschichtung PV deckt dabei – wie
in 4b gezeigt – die eine Hälfte der über den
gesamten Pupillendurchmesser verlaufenden Reflexionsschicht RS ab.
Beim Durchlaufen der Beschichtung PV wird das Licht aufgrund des Brechungsindex
der Schicht verzögert
gegen das Licht, das unbeschichtete Stellen (also Luft) durchläuft. Die
Beschichtung PV kann z.B. aus einem Dielektrikum wie Magnesiumfluorit
oder Siliziumdioxid hergestellt sein und auf die Reflexionsschicht
RS aufgedampft werden. Auch eine Struktur basierend auf einer Flüssigkristall-Schicht
ist denkbar.
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Eine
alternative Realisierung wäre
die Einfügung
eines phasenverzögernden
Elements in einer weiteren Pupillenebene, die durch weitere Abbildungslinsen
erzeugt werden kann (hier nicht dargestellt). In dieser weiteren
Pupillenebene könnten dann
phasenverzögernde
Elemente, wie Substrate mit dielektrischen Beschichtungen, Phasenmodulatoren
auf Basis von Flüssigkristallen
oder achromatische Phasenfilter angeordnet werden. Entscheidend ist
nur die Einführung
einer Optik mit der beschriebenen phasenverzögernden Eigenschaft, wobei
diese in idealer Weise in oder nahe einer Pupillenebene angeordnet
ist.
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Das
Detektionslicht (im Allgemeinen Fluoreszenz) wird als Messsignal 8 durch
das Objektiv 13, die Tubuslinse 23, das Scann-Okular 22,
den Scanner 21 (Descanned Detection), die Linsen 18 und 20,
einen Filter 24 zur spektralen Filterung und eine Detektorlinse 25 auf
einen konfokal angeordneten Zeilendetektor 26 abgebildet.
Auch eine Non-Descanned-Detektion ist denkbar, wobei dabei der Detektor 26 zwischen
Scanner 21 und Objektiv 13 angeordnet wäre.
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In 5 ist – schematisch – eine weitere Ausführungsform
eines erfindungsgemäßen Mikroskops
dargestellt, wobei der Aufbau konzeptionell dem Aufbau des Mikroskops
gemäß 4 ähnelt. Aus
Gründen
der Übersichtlichkeit
sind die Strahlverläufe
nicht dargestellt. In der Pupillenebene P3, die linienförmig ausgeleuchtet
wird (Pupillenlinie 14 in y-Richtung), ist – im Unterschied
zur Ausführung
gemäß 4 – kein Strahlteiler 19 angeordnet,
der gleichzeitig als (räumlicher)
Strahlteiler und als phasenverzögendes
Element fungiert. Vielmehr sind beide Funktionen separiert, indem
der Strahlteiler 19 nunmehr ausschließlich als räumlicher Strahlteiler fungiert,
wohingegen die Phasenverzögerung
durch eine zusätzlich
eingeführte
phasenverzögernde
Optik 27 erfolgt. Bei der phasenverzögernden Optik 27, die
ebenfalls in oder nahe der Pupille P3 angeordnet ist, kann es sich
wiederum um ein Substrat handeln, das räumlich strukturiert mit einer
phasenverzögernden,
transparenten Beschichtung PV (Dielektrikum) versehen ist. In der
in 5b dargestellten Ausführung ist
die Optik 27 kreisförmig
ausgebildet, wobei der in negativer y-Richtung liegende Halbkreis
mit der phasenverzögernden
Beschichtung PV versehen ist. Des Weiteren kommen wieder Phasenmodulatoren
auf Basis von Flüssigkristallen
oder achromatische Phasenfilter, Arrays mit beweglichen Mikrospiegeln
oder andere deformierbare Spiegel in Frage. Als Strahlteiler 19 zur
Trennung von Beleuchtungslicht und Detektionslicht kommt ein konventioneller
dichroitischer Strahlteiler 28, bspw. in Form eines Kantenfilters,
zum Einsatz. Der dichroitische Strahlteiler 28 ist der
phasenverzögernden
Optik 27 nachgeschaltet.
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Hinsichtlich
weiter vorteilhafter Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens
und des erfindungsgemäßen Mikroskops
werde zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil der
Beschreibung sowie auf die beigefügten Patentansprüche verwiesen.
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Schließlich sei
ausdrücklich
darauf hingewiesen, dass die voranstehend beschriebenen Ausführungsbeispiele
lediglich zur Erörterung
der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele
einschränkt.