DE102006009831A1 - Method for high spatial resolution examination of sample, involves providing optical signal in the form of focal line with cross-sectional profile having intensity zero point with laterally neighboring intensity maxima - Google Patents

Method for high spatial resolution examination of sample, involves providing optical signal in the form of focal line with cross-sectional profile having intensity zero point with laterally neighboring intensity maxima Download PDF

Info

Publication number
DE102006009831A1
DE102006009831A1 DE200610009831 DE102006009831A DE102006009831A1 DE 102006009831 A1 DE102006009831 A1 DE 102006009831A1 DE 200610009831 DE200610009831 DE 200610009831 DE 102006009831 A DE102006009831 A DE 102006009831A DE 102006009831 A1 DE102006009831 A1 DE 102006009831A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
line
pupil
state
phase
optical signal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE200610009831
Other languages
German (de)
Other versions
DE102006009831B4 (en
Inventor
Marcus Dr. Dyba
Hilmar Dr. Gugel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leica Microsystems CMS GmbH
Original Assignee
Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leica Microsystems CMS GmbH filed Critical Leica Microsystems CMS GmbH
Priority to DE200610009831 priority Critical patent/DE102006009831B4/en
Priority to US11/653,446 priority patent/US7679741B2/en
Priority to JP2007019423A priority patent/JP2007233370A/en
Publication of DE102006009831A1 publication Critical patent/DE102006009831A1/en
Application granted granted Critical
Publication of DE102006009831B4 publication Critical patent/DE102006009831B4/en
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6432—Quenching

Abstract

A method for high spatial resolution examination of samples (1), involves bringing a substance in the sample region (P) into a first state (e.g. fluorescence-capable state) (Z1, A); inducing a second state (e.g. non-fluorescence-capable state) (Z2, B) using an optical signal (4) that is provided in the form of a focal line with a cross-sectional profile having at least one intensity zero point (5) with laterally neighboring intensity maxima (9) ; and recording spatially delimited sub-regions specifically excluded within the sample region. A method for high spatial resolution examination of samples (1), involves bringing a substance in the sample region (P) into a first state (e.g. fluorescence-capable state) (Z1, A); inducing a second state (e.g. non-fluorescence-capable state) (Z2, B) that is differ from the first state in at least one optical property using an optical signal (4); and recording spatially delimited sub-regions specifically excluded within the sample region. The optical signal is provided in the form of a focal line with a cross-sectional profile having at least one intensity zero point (5) with laterally neighboring intensity maxima (9). The focal line is produced using a linear illumination in a pupil plane conjugate with the pupil of the objective-pupil line and by suitable phase modulation along the pupil line. The phase modulation is undertaken in such a way that phase jumps are introduced along the pupil line. The phase jump is introduced at the pupil midpoint. The phase modulation along the pupil line is implemented using a spatial liquid-based phase modulator in an intermediate image of the pupil. The pupil line is produced by focusing an illuminating light beam of an illuminating light source with a cylindrical lens or a Powell lens; by imaging a split diaphragm into the pupil plane; or using holographic elements. The pupil line is coupled into the beam path using an Achrogate filter. The method uses a laser is used as an illuminating light source for providing the optical signal. The pulsed light sources are synchronized. An independent claim is included for a microscope, in particular a laser scanning fluorescence microscope, for high spatial resolution examination of samples comprising an optical signal that can be provided in the form of a focal line with a cross-sectional profile having at least one intensity zero point with laterally neighboring intensity maxima.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Mikroskop, insbesondere Laser-Raster-Fluoreszenzmikroskop, zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben, wobei die zu untersuchende Probe eine Substanz umfasst, die wiederholt von einem ersten Zustand in einen zweiten Zustand überführbar ist, wobei sich die ersten und die zweiten Zustände in mindestens einer optischen Eigenschaften voneinander unterscheiden, umfassend die Schritte, dass die Substanz in einem zu erfassenden Probenbereich zunächst in den ersten Zustand gebracht wird und dass mittels eines optischen Signals der zweite Zustand induziert wird, wobei innerhalb des zu erfassenden Probenbereichs räumlich begrenzte Teilbereiche gezielt ausgespart werden.The The invention relates to a method and a microscope, in particular Laser scanning fluorescence microscope to the spatially high-resolution Examination of samples, whereby the sample to be examined is a substance which repeatedly repeats from a first state to a second state Condition is transferable, wherein the first and the second states in at least one optical Characteristics differ from one another, comprising the steps of that the substance in a sample area to be detected first in the first state is brought and that by means of an optical Signals the second state is induced, being within the too spatially limited areas are specifically omitted.

Verfahren und Mikroskope der eingangs genannten Art sind aus der Praxis bekannt. Grundsätzlich ist gemäß dem Abbe'schen Gesetz der räumlichen Auflösung abbildender optischer Verfahren durch die Beugungsgrenze eine theoretische Grenze gesetzt, wobei die Beugungsgrenze von der Wellenlänge des verwendeten Lichts abhängt. Mit den hier in Rede stehenden Verfahren und Mikroskopen lassen sich allerdings räumliche Auflösungen erzielen, die über die nach Abbe bekannte theoretische Beugungsgrenze hinaus verbessert sind.method and microscopes of the type mentioned are known from practice. in principle is according to Abbe's law the spatial resolution imaging optical method by the diffraction limit a theoretical Set limit, the diffraction limit of the wavelength of the used light depends. With the procedures in question and microscopes let However, spatial resolutions achieve that over the theoretical diffraction limit known from Abbe also improved are.

Bei den bekannten Verfahren werden hierzu in zu untersuchenden Proben Substanzen bereitgestellt, die wiederholt von einem ersten Zustand in einen zweiten Zustand überführbar sind, wobei sich die ersten und die zweiten Zustände in mindestens einer optischen Eigenschaft voneinander unterscheiden. Bei den meisten bekannten Verfahren handelt es sich bei dem ersten Zustand um einen fluoreszenzfähigen Zustand (im Folgenden Zustand A genannt) und bei dem zweiten Zustand um einen nicht fluoreszenzfähigen Zustand (im Folgenden Zustand B). Nachdem die Substanz in einem zu erfassenden Probenbereich mittels eines Schaltsignals in den fluoreszenzfähigen Zustand A gebracht worden ist, wird mittels eines optischen Signals in räumlich begrenzten Teilbereichen des zu erfassenden Probenbereichs Zustand B induziert und somit eine Unterdrückung der Fluoreszenz von Fluoreszenzmolekülen erzeugt. Der physikalische Prozess der Fluoreszenzunterdrückung kann dabei sehr unterschiedlicher Natur sein. So ist bspw. die stimulierte Emission aus dem zuvor angeregten Zustand oder eine optisch induzierte Strukturänderung der Fluoreszenzmoleküle bekannt.at The known methods are for this purpose in samples to be examined Provided substances repeated from a first state be converted into a second state, wherein the first and the second states in at least one optical Distinguish property from each other. In most known The method is the first state is a fluorescent state (hereafter called state A) and in the second state a non-fluorescent Condition (in the following state B). After the substance in a to be detected sample area by means of a switching signal in the fluorescable State A has been brought is by means of an optical signal in spatial limited portions of the sample area to be detected state B induces and thus produces a suppression of the fluorescence of fluorescence molecules. The physical process of fluorescence suppression can be very different Be nature. Thus, for example, the stimulated emission from the previously stimulated State or an optically induced structural change of the fluorescent molecules known.

Entscheidend ist, dass der durch ein optisches Signal induzierte Übergang von dem ersten in den zweiten Zustand im Probenvolumen in großen Bereichen gesättigt, d.h. vollständig, stattfindet, und in mindestens einem Teilbereich des Probenvolumens gerade nicht stattfindet, indem dort das optische Schaltsignal gezielt nicht eingestrahlt wird. Dieser Effekt kann durch das Erzeugen einer Intensitätsnullstelle des optischen Signals erreicht werden. An der Nullstelle und in deren unmittelbarer Umgebung findet kein Übergang in den zweiten Zustand (im Allgemeinen der nicht fluoreszierende Zustand B) statt, so dass der erste Zustand (im Allgemeinen der fluoreszierende Zustand A) erhalten bleibt. Eine Sättigung des Übergangs A -> B durch das optische Signal führt in den beleuchteten Bereichen des zu erfassenden Probenbereichs bereits in naher Umgebung der Intensitäts-Nullstellen zu einem (nahezu) vollständigen Transfer in den Zustand B. Je stärker der Prozess in die Sättigung getrieben wird, d.h. je mehr Energie durch das optische Signal in die Bereiche um die Nullstelle herum eingebracht wird, desto kleiner wird der Bereich mit Fluoreszenzmolekülen im fluoreszenzfähigen Zustand A bzw. allgemein in einem „leuchtfähigen" Zustand. In Abhängigkeit vom Sättigungsgrad in der unmittelbaren Nullstellen-Umgebung kann dieser Bereich prinzipiell beliebig klein gemacht werden. Folglich lassen sich Regionen des Zustands A markieren, die beliebig viel kleiner sind als die kleinsten aufgrund der Beugungsgrenze möglichen Regionen eines aufgebrachten optischen Signals. Wird der Bereich des Zustands A anschließend ausgelesen, z.B. durch Einstrahlen eines Testsignals, so stammt das (Fluoreszenz-)Messsignal aus einem definierten Bereich, der kleiner sein kann als es die Beugungsgrenze zulässt. Wird die Probe auf die beschriebene Art Punkt für Punkt abgerastert, so entsteht ein Bild mit einer Auflösung die besser ist, als es die Beugungstheorie erlaubt.critical is that the transition induced by an optical signal from the first to the second state in the sample volume in large areas saturated, i.e. Completely, takes place, and in at least a portion of the sample volume just does not take place by there targeted the optical switching signal not irradiated. This effect can be achieved by creating a Intensity zero of the optical signal can be achieved. At the zero point and in their immediate environment finds no transition to the second state (generally the non-fluorescent state B), so that the first state (generally the fluorescent state A) preserved. A saturation of the transition A -> B through the optical Signal leads in the illuminated areas of the sample area to be detected Already in the vicinity of the intensity zeros to a (nearly) complete transfer in the state B. The stronger the process into saturation is driven, i. the more energy through the optical signal in the areas around the zero point are introduced, the smaller it gets the area with fluorescence molecules in fluorescent State A or generally in a "luminous" state Depending on the degree of saturation in the immediate null environment this area can in principle be made arbitrarily small. Consequently, regions of the Mark state A that is infinitely smaller than the smallest due to the diffraction limit possible Regions of an applied optical signal. Will the area state A then read out, e.g. by irradiating a test signal, the (fluorescence) measurement signal is derived from a defined area, which may be smaller than that Diffraction limit allows. If the sample is scanned in the manner described point by point, then arises a picture with a resolution which is better than the diffraction theory allows.

Verfahren, der hier beschriebenen Art, bei denen als Unterschied zwischen zwei Zuständen die optische Eigenschaft fluoreszenzfähig/nicht fluoreszenzfähig ausgenutzt wird, sind bspw. aus der DE 103 25 459 A1 und der DE 103 25 460 A1 bekannt. Bei diesen Verfahren werden Fluoreszenzmoleküle mit Hilfe eines optischen Signals von einem Zustand A (fluoreszenzfähig) in einen Zustand B (nicht fluoreszenzfähig) gebracht, wobei bei dem Übergang A -> B die Sättigung erreicht wird. Die in dem fluoreszenzfähigen Zustand A verbleibenden Bereiche der Probe resultieren jeweils aus einem eine Nullstelle aufweisenden Intensitätsminimum des eingestrahlten optischen Signals. Die Intensitätsminima sind Teil eines Interferenzmusters. Das Abrastern der Probe erfolgt durch Verschiebung der Intensitätsminima des optischen Signals, wobei die Verschiebung durch Phasenverschiebung der interferierenden Strahlen bewirkt wird.Method, of the type described here, in which the optical property is exploited as being fluorescent / non-fluorescent as the difference between two states, are, for example, from DE 103 25 459 A1 and the DE 103 25 460 A1 known. In these methods, fluorescence molecules are brought from state A (fluoresceable) to state B (non-fluoresceable) by means of an optical signal, saturation being achieved at transition A -> B. The areas of the sample remaining in the fluorescence-capable state A each result from an intensity minimum of the irradiated optical signal having a zero point. The intensity minima are part of an interference pattern. The sample is scanned by shifting the intensity minima of the optical signal, the shift being caused by phase shifting of the interfering beams.

Bei den bekannten Verfahren ist nachteilig, dass durch die interferierenden Strahlen ein Interferenzmuster mit lokalen punktförmigen Intensitätsminima ausgebildet wird. Ein Abrastern der Probe erfordert dementsprechend einen punktuellen Scannvorgang in mindestens zwei Dimensionen, was den Scannvorgang äußerst zeitaufwendig macht.In the known methods, it is disadvantageous that an interference pattern with local punctiform intensity minima is formed by the interfering beams. A scanning of the sample accordingly requires a punctual scanning process in at least two dimensions, which the Makes scanning extremely time consuming.

Der vorliegenden Erfindung liegt nunmehr die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren sowie ein Mikroskop der eingangs genannten Art anzugeben, wonach mit konstruktiv einfachen und kostengünstigen Mitteln und gleichzeitig kompakter Bauform ein schnelles Abrastern einer Probe ermöglicht ist.Of the The present invention is based on the object, a method and to provide a microscope of the type mentioned, after which with structurally simple and inexpensive means and at the same time compact design enables fast scanning of a sample.

Erfindungsgemäß ist die voranstehende Aufgabe durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst. Danach ist das Verfahren derart ausgestaltet und weitergebildet, dass das optische Signal in Form einer Fokuslinie mit einem Querschnittsprofil mit mindestens einer Intensitätsnullstelle mit seitlich benachbarten Intensitätsmaxima bereitgestellt wird.According to the invention above object by a method with the features of Patent claim 1 solved. Thereafter, the method is configured and developed in such a way that the optical signal in the form of a focus line with a cross-sectional profile with at least one intensity zero is provided with laterally adjacent intensity maxima.

Die voranstehende Aufgabe ist des Weiteren durch ein Mikroskop mit den Merkmalen des Patentanspruchs 25 gelöst. Danach ist das Mikroskop derart ausgestaltet und weitergebildet, dass das optische Signal in Form einer Fokuslinie mit einem Querschnittsprofil mit mindestens einer Intensitätsnullstelle mit seitlich benachbarten Intensitätsmaxima bereitstellbar ist.The The above object is further by a microscope with the Characteristics of claim 25 solved. After that is the microscope configured and refined such that the optical signal in the form of a focus line with a cross-sectional profile with at least an intensity zero can be provided with laterally adjacent intensity maxima.

In erfindungsgemäßer Weise ist zunächst erkannt worden, dass die Bildaufnahmegeschwindigkeit bekannter hochauflösender Abbildungsverfahren für diverse Anwendungen, bspw. im Bereich der Echtzeit-Mikroskopie biologischer Proben, nicht ausreichend ist. In weiter erfindungsgemäßer Weise ist sodann erkannt worden, dass ein im Vergleich zu einem Punkt-Scann deutlich schnellerer Linien-Scann möglich ist, wenn der zweite Zustand entlang einer (prinzipiell beliebig) schmalen Linie induziert werden kann. Erfindungsgemäß wird hierzu das optische Signal in Form einer Fokuslinie bereitgestellt, wobei die Fokuslinie ein Quer schnittsprofil mit mindestens einer Intensitätsnullstelle – zur Konservierung des ersten Zustands entlang einer (prinzipiell beliebig) schmalen Linie – mit seitlich benachbarten Intensitätsmaxima – zur Induzierung des zweiten Zustands in Sättigung – aufweist.In according to the invention is first It has been recognized that the image acquisition speed of known high-resolution imaging methods for various Applications, for example in the field of real-time microscopy biological Samples, not enough. In a further inventive way It has then been recognized that one compared to a point scan significantly faster line scanning is possible if the second state is narrowing along one (in principle arbitrarily) Line can be induced. According to the invention for this purpose is the optical Signal provided in the form of a focus line, wherein the focus line a cross-sectional profile with at least one intensity zero point - for preservation of the first state along one (in principle arbitrarily) narrow Line - with laterally adjacent intensity maxima - for induction of the second state in saturation.

Das erfindungsgemäße Verfahren und das erfindungsgemäße Mikroskop lassen sich in besonders vorteilhafter Weise in Verbindung mit sehr langlebigen oder zeitlich sogar dauerhaft stabilen ersten und zweiten Zuständen einsetzen. In diesem Fall kann für die Sättigung des Übergangs vom ersten in den zweiten Zustand ein vergleichsweise langer Zeitraum gewählt werden, innerhalb dessen die zur Sättigung notwendige Energie des optischen Signals eingestrahlt wird. Die lokalen Intensitäten zur Übergangssättigung können dadurch sehr gering gewählt werden. Vor allem kann die von einer Strahlquelle des optischen Signal zur Verfügung stehende Gesamtenergie auf großräumige Bereiche im Probenraum verteilt und mehrere Intensitätsnullstellen oder eine ausgedehnte Nullstelle erzeugt werden. Trotz der daraus resultierenden geringen lokalen Intensitäten in der Umgebung der Nullstelle(n) im Vergleich zur Auftragung des Gesamtsignals um nur eine punktförmige Nullstelle herum kann die Sättigung erreicht werden. Dazu muss das Signal nur genügend lange eingestrahlt werden, bis schließlich alle Moleküle in Umgebung der Nullstellen im zweiten Zustand sind. Dies ist ein entscheidender Unterschied zum Fall eines kurzlebigen Zustandes (z.B. im STED-Verfahren mit typischen Lebenszeit von ~ 1 ns für einen fluoreszenzfähigen Zustand A), wo die zur Sättigung notwendige Energie in so kurzer Zeit eingestrahlt werden muss (deutlich schneller als die Rate A -> B), dass die Gesamtleistung der Strahlquelle nur für die Erzeugung einer (oder maximal einiger weniger) lokalen Nullstellen ausreicht. Es lässt sich für konkrete Systeme zeigen, dass im Falle stabiler Zustände (z.B. photochrome Farbstoffe) oder langlebiger Zustände (z.B. Transfer in das Tripletsystem beim GSD-Verfahren, GSD = Ground State Depletion = Grundzustandsentvölkerung) die Leistung preiswerter und kommerzieller Lasersysteme auf so große Bereiche verteilt werden kann, dass mehrere punktförmige Intensitäts-Nullstellen (>> 10) oder ganze Streifen verschwindender Intensität in der Probe erzeugt werden können, in deren unmittelbarer Umgebung nach wie vor die Sättigung erreicht werden kann. Dies ermöglicht eine parallelisierte Bildaufnahme, wenn die Probe mit der Vielzahl von Punkt-Nullstellen oder mit Nullstellen-Linien gleichzeitig abgerastert wird und die Signale gleichzeitig für jede Nullstelle getrennt von einem Detektor erfasst werden. Auf diese Weise lassen sich Mikroskope mit Auflösungen unterhalb der klassischen Beugungsgrenze konstruieren, deren Bildaufnahmegeschwindigkeit im Bereich STED basierten Verfahren liegt und im Vergleich zu Systemen mit einer einzigen lokalen Nullstelle deutlich erhöht ist.The inventive method and the microscope according to the invention can be connected in a particularly advantageous manner in conjunction with very durable or temporally stable even first and second states deploy. In this case, for the saturation of the transition from the first to the second state a comparatively long period chosen within which are the energy needed to saturate the optical signal is irradiated. The local intensities for transition saturation can be chosen very low. Above all, the beam from a source of the optical signal to disposal standing total energy on large areas distributed in the sample room and several intensity zeros or an extended Zero be generated. Despite the resulting low local intensities in the vicinity of the zero (s) compared to the plot of the Total signal around only a punctiform Zero around can saturate be achieved. For this purpose, the signal must be irradiated only long enough, until finally all molecules are in the vicinity of the zeros in the second state. This is a crucial difference to the case of a short-lived state (For example, in the STED method with typical lifetime of ~ 1 ns for a fluorescent state A), where the necessary for saturation Energy must be radiated in such a short time (much faster as the rate A -> B) that the total power of the beam source only for the generation of a (or at most a few) local zeros is sufficient. It can be for concrete systems show that in the case of stable states (e.g., photochromic dyes) or long-lived states (e.g., transfer to the triplet system in the GSD method, GSD = Ground State depletion = basic state depopulation) the performance is cheaper and commercial laser systems spread over such large areas that can be several punctiform Intensity zero points (>> 10) or entire bands disappearing intensity can be generated in the sample, in the immediate vicinity of the saturation can be achieved. this makes possible a parallelized image capture when the sample with the multiplicity scanned by point zeroes or with zeros lines at the same time and the signals are separated simultaneously for each zero be detected by a detector. In this way you can use microscopes with resolutions construct below the classical diffraction limit, their image acquisition speed in the field of STED based methods and compared to systems is significantly increased with a single local zero.

Im Rahmen einer konkreten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Fokuslinie generiert wird, indem in das Mikroskop ein optisches Bauteil integriert wird, das zunächst eine Beleuchtungslinie in einer zur Pupille des Mikroskopobjektivs konjugierten Puppillenebene erzeugt. Des Weiteren ist ein phasenmodulierendes Element vorgesehen, mit dem eine zur Erzeugung des Querschnittsprofils der Fokuslinie geeignete Phasenmodulation entlang der Pupillenlinie durchgeführt wird.in the Frame of a concrete embodiment It is envisaged that the focus line is generated by entering into the Microscope an optical component is integrated, the first one Illumination line in a pupil plane conjugate to the pupil of the microscope objective generated. Furthermore, a phase-modulating element is provided, with the one for generating the cross-sectional profile of the focus line suitable phase modulation is performed along the pupil line.

Im Rahmen der Phasenmodulation kann vorgesehen sein, dass entlang der Pupillenlinie ein oder mehrere Phasensprünge eingeführt werden. Besonders bevorzugt ist die Einführung eines Phasensprunges im Pupillenmittelpunkt. Dieser Phasensprung wird in weiter vorteilhafter Weise so gewählt, dass er der Länge eines halben Wellenzugs entspricht, so dass die eine Hälfte der Linie um einen halben Wellenzug verzögert wird. Auf diese Weise entsteht in der Fokalebene eine Fokuslinie mit einem Querschnittsprofil, das sich aus einer Intensitätsnullstelle mit seitlich benachbarten Intensitätsmaxima zusammensetzt. Alternativ ist es möglich, entlang der Pupillenlinie mehrere Phasensprünge um vorzugsweise jeweils einen halben Wellenzug einzuführen, so dass im Ergebnis ebenfalls die Hälfte der Gesamtlinie, d.h. die Hälfte der Lichtmenge, die durch die Pupille gestrahlt wird, im Vergleich zur anderen Hälfte um einen halben Wellenzug verzögert ist.As part of the phase modulation can be provided that along the pupil line one or more phase jumps are introduced. Particularly preferred is the introduction of a phase jump in the pupil center. This phase jump is chosen in a further advantageous manner so that it corresponds to the length of half a wave train, so that one half of the line to a half wave train is delayed. In this way, a focal line with a cross-sectional profile is formed in the focal plane, which is composed of an intensity zero point with laterally adjacent intensity maxima. Alternatively, it is possible to introduce a plurality of phase jumps along the pupil line, preferably in each case half a wave train, so that, as a result, also half of the total line, ie half the amount of light that is radiated through the pupil, by half a wave train compared to the other half is delayed.

Im Hinblick auf eine konstruktiv einfache Ausführung kann vorgesehen sein, dass die Phasenmodulation entlang der Pupillenlinie mittels eines in einem Zwischenbild der Pupille angeordneten räumlichen Phasenmodulators auf Flüssigkeitsbasis realisiert wird. Alternativ ist die Einfügung eines optischen Bauteils mit einer phasenverzögernden optischen Beschichtung denkbar. Prinzipiell können alle phasenverzögernden Elemente, wie Substrate mit dielektrischen Beschichtungen, Phasenmodulatoren auf Basis von Flüssigkristallen oder achromatische Phasenfilter eingesetzt werden. Idealerweise ist die Optik mit der phasenverzögernden Eigenschaft in oder nahe einer Pupillenebene angeordnet.in the With regard to a structurally simple design can be provided that the phase modulation along the pupil line by means of a in an intermediate image of the pupil arranged spatial phase modulator liquid-based is realized. Alternatively, the insertion of an optical component with a phase delay optical coating conceivable. In principle, all phase-delaying Elements, such as substrates with dielectric coatings, phase modulators based on liquid crystals or achromatic phase filters are used. Ideally is the optics with the phase-retarding Property arranged in or near a pupil plane.

Im Hinblick auf eine konstruktiv einfache Bauform kann vorgesehen sein, dass die Pupillenlinie durch Fokussieren eines Beleuchtungslichtstrahls einer Beleuchtungslichtquelle mit einer Zylinderlinse oder einer Powell-Linse erzeugt wird. Alternativ kann die Pupillenlinie durch Abbilden einer Spaltblende in die Pupillenebene erzeugt werden. Denkbar ist auch der Einsatz holographischer Elemente.in the With regard to a structurally simple design can be provided that is, the pupil line by focusing an illuminating light beam an illumination light source with a cylindrical lens or a Powell lens is generated. Alternatively, the pupil line can pass through Imaging a slit diaphragm are generated in the pupil plane. Conceivable is also the use of holographic elements.

In besonders vorteilhafter Weise wird die Pupillenlinie mittels eines Achrogate-Filters in den Strahlengang eingekoppelt. In bevorzugter Weise könnte die Phasenmodulation entlang der Pupillenlinie dann mittels zusätzlich phasenverzögernder Schichten auf dem Filter, beispielsweise in Form von dielektrischen Beschichtungen, realisiert werden.In Particularly advantageously, the pupil line by means of a AchroGate filter coupled into the beam path. In a preferred way, the Phase modulation along the pupil line then using additional phase-retarding layers on the filter, for example in the form of dielectric coatings, will be realized.

Im Hinblick auf eine besonders kompakte Bauform könnten das optische Bauteil zur Erzeugung der Pupillenlinie und das phasenmodulierende Element als bauliche Einheit ausgeführt sein. Im Hinblick auf eine hohe Flexibilität können das optische Bauteil zur Erzeugung der Pupillenlinie und das phasenmodulierende Element auch jeweils als separate Einheiten an unterschiedlichen Positionen im Beleuchtungsstrahlengang angeordnet sein.in the With regard to a particularly compact design could be the optical component for generating the pupil line and the phase-modulating element designed as a structural unit be. In view of a high flexibility, the optical component for Generation of the pupil line and the phase modulating element also each as separate units at different positions in the Illuminating beam path can be arranged.

Zur Sicherstellung einer kohärenten linienförmigen Beleuchtung der Pupille des Mikroskopobjektivs ist die Beleuchtungslichtquelle zur Erzeugung des optischen Signals bevorzugt als Laserlichtquelle ausgeführt.to Ensuring a coherent linear Illumination of the pupil of the microscope objective is the illumination light source for generating the optical signal preferably designed as a laser light source.

In besonders vorteilhafter Weise ist das Licht des optischen Signals senkrecht zur Pupillenlinie polarisiert, um auf diese Weise Depolarisierungseffekte weitestgehend auszuschließen.In Particularly advantageous is the light of the optical signal polarized perpendicular to the pupillary line, so as far as possible depolarization effects excluded.

Im Rahmen einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Fokuslinie nacheinander in unterschiedlichen Raumrichtungen erzeugt. Dabei kann es sich beispielsweise um orthogonal zueinander orientierte Raumrichtungen handeln. Entsprechend kann vorgesehen sein, dass das gesamte zu erfassende Probevolumen nacheinander in jeder der Raumrichtungen abgerastert wird. Anschließend können die aufgenommenen Einzelbilder mathematisch zu einem Gesamtbild zusammengeführt werden, wodurch eine Auflösungserhöhung in mehr als einer Richtung realisiert ist.in the Within the scope of a particularly preferred embodiment, the focus line becomes generated in succession in different spatial directions. It can For example, it is orthogonal to each other oriented spatial directions act. Accordingly, it can be provided that the entire Sample volume scanned in succession in each of the spatial directions becomes. Subsequently, the recorded single images can be merged mathematically into an overall image, causing a resolution increase in more than one direction is realized.

Es kann vorgesehen sein, dass der Übergang von dem ersten Zustand in den zweiten Zustand mittels Mehr-Photonen-Absorption realisiert wird. Alternativ oder zusätzlich kann das Auslesen eines von der Probe ausgehenden Messsignals mittels Mehr-Photonen-Anregung realisiert werden. Eine derartige Ausgestaltung bietet sich insbesondere bei speziellen Anwendungen an, beispielsweise wenn es gilt, ein Bleichen der Probe zu verhindern.It can be provided that the transition from the first state to the second state by multi-photon absorption is realized. Alternatively or additionally, the reading of a from the sample output signal by means of multi-photon excitation will be realized. Such a configuration is particularly suitable for special applications, for example, if applicable To prevent bleaching of the sample.

Im Rahmen einer weiter bevorzugten Ausführung ist vorgesehen, dass das optische Signal und ein Testsignal zum Auslesen der ersten Zustände jeweils mittels gepulster Lichtquellen erzeugt werden. Dabei erweist sich eine Synchronisation der gepulsten Lichtquellen als vorteilhaft.in the In a further preferred embodiment, it is provided that the optical signal and a test signal for reading out the first states respectively be generated by pulsed light sources. It turns out a synchronization of the pulsed light sources as advantageous.

Die Beleuchtungslichtquelle zum Erzeugen des optischen Signals kann mit mindestens einer weiteren Lichtquelle kombiniert sein, wobei die weitere Lichtquelle zum Auslesen des von der Probe ausgehenden Messsignals und/oder zur Erzeugung eines Schaltsignals zum Induzieren des ersten Zustandes dienen könnte. Insbesondere könnte die weitere Lichtquelle die Probe ganz oder teilweise ausleuchten, wobei eine linienförmige Ausleuchtung bevorzugt ist.The Illumination light source for generating the optical signal can be combined with at least one further light source, wherein the additional light source for reading out of the sample Measuring signal and / or for generating a switching signal for Induzieren could serve the first state. In particular, could the further light source completely or partially illuminate the sample, being a linear Illumination is preferred.

Zudem könnte die Fokuslinie des optischen Schaltsignals mit einer weiteren Linie räumlich überlagert sein. In besonders vorteilhafter Weise ist die räumliche Überlagerung derart gewählt, dass die Intensitäts-Nullstelle der Fokuslinie des optischen Signals mit dem Maximum einer Linie zum Auslesen des von der Probe ausgehenden Messsignals räumlich überlagert ist. Je nach Anwendung kann dabei jeder Linie eine eigene Scanneinrichtung, vorzugsweise in Form eines Scannspiegels, zugeordnet sein, oder die Linien werden gemeinsam mit einer einzigen Scanneinrichtung gescannt.moreover could the focus line of the optical switching signal with another line spatially superimposed be. In a particularly advantageous manner, the spatial overlay is chosen such that the intensity zero the focus line of the optical signal with the maximum of one line spatially superimposed for reading out the measurement signal emanating from the sample is. Depending on the application, each line can have its own scanning device, preferably in the form of a scanning mirror, be assigned, or The lines are shared with a single scanning device scanned.

Um die Geschwindigkeitsvorteile bei der Bilderzeugung voll auszunutzen, wird die Scannrichtung in idealer Weise auf die jeweilige Verlaufsrichtung der Pupillenlinie abgestimmt. In weiter vorteilhafter Weise kann eine Liniendetektion des von der Probe ausgehenden Messsignals mittels eines Zeilendetektors durchgeführt werden. Der Zeilendetektor kann beispielsweise als CCD-Zeile ausgeführt sein. Der Einsatz eines EMCCDs oder einer APD (Avalanche Photodiode) ist ebenfalls denkbar.To the speed advantages in the Bil fully exploit the generation, the scanning direction is ideally matched to the respective course direction of the pupil line. In a further advantageous manner, a line detection of the measuring signal emanating from the sample can be carried out by means of a line detector. The line detector can be designed, for example, as a CCD line. The use of an EMCCD or an APD (avalanche photodiode) is also conceivable.

Im Hinblick auf eine Erhöhung der Auflösung auch entlang der optischen Achse ist die Detektorzeile bevorzugt konfokal zur Fokuslinie angeordnet. Konkret kann die Detektorzeile dabei in Detektionsrichtung hinter den Scanneinrichtungen (descannte Detektion) oder vor den Sanneinrichtungen (nicht descannte Detektion) angeordnet sein.in the With regard to an increase the resolution too along the optical axis, the detector row is preferably confocal arranged to focus line. Specifically, the detector line can do this in the detection direction behind the scanning devices (descanned detection) or before the Sanneinrichtungen (not descanned detection) arranged be.

In besonders vorteilhafter Weise wird das beschriebene Mikroskop zum optisch induzierten Übergang von Farbstoffmolekülen zwischen verschiedenen Molekülzuständen eingesetzt, die sich in mindestens einer optischen Eigenschaft voneinander unterscheiden, So kann das Mikroskop beispielsweise zum Induzieren eines Übergangs zwischen den Zuständen einer Trans-Cis-Isomerisierung oder zum Schalten von photochromen Farbstoffen eingesetzt werden. Des Weiteren ist ein Einsatz zum Transfer von Farbstoffmolekülen in deren Triplettzustand im Rahmen eines GSD-Verfahrens (Ground State Depletion) möglich. Schließlich bietet sich die Durchführung von STED-Verfahren an.In Particularly advantageous manner, the described microscope for optically induced transition of dye molecules used between different molecular states, which differ from one another in at least one optical property, For example, the microscope can induce a transition between the states a trans-cis isomerization or for switching photochromic Dyes are used. Furthermore, a use for Transfer of dye molecules in their triplet state in the context of a GSD method (Ground State depletion) possible. After all offers the implementation from STED procedures.

Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die nachgeordneten Ansprüche, andererseits auf die nachfolgende Erläuterung bevorzugter Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens und des erfindungsgemäßen Mikroskops zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Probe zu verweisen. In Verbindung mit Erläuterungen der bevorzugten Ausführungsbeispiele anhand der Zeichnungen werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigenIt are now different ways to design the teaching of the present invention in an advantageous manner and further education. This is on the one hand to the subordinate claims, on the other hand to the following explanation preferred embodiments the method according to the invention and the microscope according to the invention for spatial high-resolution To direct investigation of sample. In conjunction with explanations the preferred embodiments The drawings are also generally preferred embodiments and further developments of the teaching explained. In the drawing show

1 in einer schematischen Darstellung ein zyklisches Beleuchtungsschema eines Verfahrens zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben, 1 1 is a schematic illustration of a cyclic lighting scheme of a method for spatially high-resolution examination of samples;

2 in einer schematischen Darstellung die Erzeugung einer Fokuslinie mit einem Querschnittsprofil mit einem einzigen Intensitätsmaximum, 2 in a schematic representation, the generation of a focus line with a cross-sectional profile with a single intensity maximum,

3 in einer schematischen Darstellung die erfindungsgemäße Erzeugung einer Fokuslinie mit einem Querschnittsprofil mit mindestens einer Intensitäts-Nullstelle mit seitlich benachbarten Intensitätsmaxima, 3 1 shows a schematic representation of the generation according to the invention of a focal line with a cross-sectional profile with at least one intensity zero point with laterally adjacent intensity maxima,

4 in einer schematischen Darstellung den Aufbau eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops und 4 in a schematic representation of the structure of a first embodiment of a microscope according to the invention and

5 in einer schematischen Darstellung den Aufbau eines zweiten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops. 5 in a schematic representation of the structure of a second embodiment of a microscope according to the invention.

1 zeigt schematisch einen zyklischen Beleuchtungsvorgang, wie er zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben jenseits der beugungslimitierten Auflösungsgrenze eingesetzt wird. Gemäß 1a wird zunächst im gesamten zu erfassenden Probenraum P eine in der Probe 1 bereitgestellte Substanz, die wiederholt von einem ersten Zustand Z1 in einen zweiten Zustand Z2 überführbar ist, wobei sich die ersten und die zweiten Zustände Z1, Z2 in mindestens einer optischen Eigenschaften voneinander unterscheiden, mittels eines Schaltsignals 2 in den ersten Zustand Z1 gebracht. Im konkret dargestellten Ausführungsbeispiel handelt es bei dem ersten Zustand Z1 um einen fluoreszierenden Zustand A und bei dem zweiten Zustand Z2 um einen nicht fluoreszierenden Zustand B. Bei der in der Probe 1 bereitgestellten Substanz handelt es sich in dem konkret dargestellten Beispiel um eine photochrome Substanz, deren Moleküle durch Bestrahlung mit Licht einer ersten Wellenlänge, dem Schaltsignal 2, in den fluoreszenzfähigen Zustand A gebracht werden. Dies geschieht in idealer Weise durch Beleuchtung durch ein Objektiv 3 mit einer einfachen Beleuchtungslinie des Schaltsignals 2 im Probenraum P, wie es für sich gesehen aus dem Stand der Technik bekannt ist. Alternativ kann die Probe 1 auch im gesamten Probenraum P bestrahlt werden. 1 schematically shows a cyclic lighting process, as it is used for spatially high-resolution examination of samples beyond the diffraction-limited resolution limit. According to 1a is first in the entire to be detected sample space P in the sample 1 provided substance which is repeatedly transferred from a first state Z1 in a second state Z2, wherein the first and the second states Z1, Z2 differ in at least one optical properties of each other, by means of a switching signal 2 brought into the first state Z1. In the specific embodiment shown, the first state Z1 is a fluorescent state A and the second state Z2 is a non-fluorescent state B. In the case of the sample in the sample 1 Provided substance in the example shown specifically is a photochromic substance whose molecules are irradiated by light of a first wavelength, the switching signal 2 be brought into the fluorescent state A This is done ideally by illumination through a lens 3 with a simple illumination line of the switching signal 2 in the sample space P, as is known per se from the prior art. Alternatively, the sample 1 be irradiated throughout the sample space P.

Im Falle der Grundzustands-Entvölkerung (Ground State Depletion, GSD) findet der Übergang in den fluoreszenzfähigen (Singlet)-Zustand üblicherweise spontan statt. Das Einstrahlen optischer Schaltsignale erübrigt sich somit in diesem Fall, es müssen lediglich Wartezeiten von typischerweise 1 bis 100 μs (teilweise auch ein wenig länger) berücksichtigt werden.in the Case of ground state depopulation (Ground State Depletion, GSD), the transition to the fluorescent (singlet) state usually finds spontaneously. The irradiation of optical switching signals is unnecessary thus, in this case, it must only waiting times of typically 1 to 100 μs (partially also a little longer) considered become.

In einem nächsten Schritt – dargestellt in 1b – wird Licht einer anderen Wellenlänge, das sogenannte optische Signal 4, auf den zu erfassenden Probenbereich P aufgebracht. Erfindungsgemäß geschieht dies in Form einer Doppellinie 9 mit dazwischen liegender Intensitäts-Nullstelle 5. Das optische Signal 4 induziert gesättigt den Übergang A -> B in allen mit Licht des optischen Signals 4 beleuchteten Bereichen 6. Mit anderen Worten verbleibt lediglich in unmittelbarer Umgebung der Intensitäts-Nullstelle 5 ein eng definierter Bereich der Substanz im Zustand A. Dieser verbleibende Bereich der Substanz in Zustand A kann viel kleiner sein als die beugungslimitierten Strukturen. Die Größe des im Zustand A verbleibenden Bereichs hängt ganz maßgeblich von der Qualität des Intensitätsminimums 5 und damit vom erreichten Sättigungsgrad des Übergangs A -> B ab.In a next step - shown in 1b - becomes light of a different wavelength, the so-called optical signal 4 applied to the sample area P to be detected. According to the invention, this is done in the form of a double line 9 with intermediate intensity zero 5 , The optical signal 4 induces saturated transition A -> B in all with light of the optical signal 4 illuminated areas 6 , In other words, it remains only in the immediate vicinity of the intensity zero point 5 a narrow range of substance in state A. This remaining area of substance in to Stand A can be much smaller than the diffraction-limited structures. The size of the area remaining in state A depends very much on the quality of the intensity minimum 5 and thus from the achieved saturation level of the transition A -> B.

In 1c ist schematisch der Auslesevorgang des Zustands A dargestellt. Dazu wird ein optisches Testsignal 7 so in den zu erfassenden Probebereich P eingestrahlt, dass der gemäß 1b präparierte Bereich, in dem die Substanz in Zustand A verblieben ist, erfasst wird. Das Testsignal 7 wird in bevorzugter Weise ebenfalls linienförmig eingestrahlt. Dabei wird eine einfache Linie mit einem Maximum erzeugt, wobei das Maximum mit der Intensitäts-Nullstelle 5 des optischen Signals 4 räumlich überlagert wird. Dementsprechend kann auch die Detektion bevorzugt linienförmig erfolgen, bspw. durch einen konfokal angeordneten Zeilendetektor, beispielsweise in Form einer CCD-Zeile.In 1c is schematically illustrated the readout process of the state A. This is an optical test signal 7 so irradiated in the sample area P to be detected that according to 1b prepared area in which the substance remains in state A, is detected. The test signal 7 is also irradiated in a linear manner in a preferred manner. In this case, a simple line is generated with a maximum, the maximum with the intensity zero point 5 of the optical signal 4 spatially superimposed. Accordingly, the detection can preferably be linear, for example by a confocal line detector, for example in the form of a CCD line.

Der in den 1a bis c dargestellte Zyklus wird wiederholt, wobei das Linienmuster bei jeder Wiederholung etwas weiter geschoben wird. Auf diese Weise lässt sich der gesamte zu erfassende Probenbereich P mit einer Auflösung im Subdiffraktionsbereich abbilden.The in the 1a to c is repeated, with the line pattern pushed a little further at each repetition. In this way, the entire sample area P to be detected can be imaged with a resolution in the subdiffraction area.

2 zeigt schematisch die Erzeugung einer einzelnen Linienstruktur des Beleuchtungslichts zum Auslesen der Zustände A, d.h. einer einfachen Linie mit einem Maximum, das – wie oben ausgeführt – mit der Intensitäts-Nullstelle 5 der erfindungsgemäßen Fokuslinie 10 des optischen Signals 4 überlagert werden kann. Gemäß 2a wird das Beleuchtungslicht durch eine geeignete Optik 11 zunächst linienförmig in einer zur Fokusebene FE konjugierten Ebene FE' abgebildet. Mittels einer Abbildungslinse 12 wird die Beleuchtungslinie kohärent in die Pupillenebene PE eines Objektivs 13 fokussiert, mit dem das Beleuchtungslicht in die Probe 1 fokussiert wird. Im dargestellten Beispiel verläuft die Beleuchtungslinie in x-Richtung. Dementsprechend wird die Pupille PE – wie in 2b gezeigt – zentralsymmetrisch linienförmig in y-Richtung ausgeleuchtet (Pupillenlinie 14). In der Fokusebene FE des Objektivs 13 entsteht dabei – wie in 2c gezeigt – ebenfalls eine linienförmige Lichtstruktur, die senkrecht zur Pupillenlinie 14 in x-Richtung steht (Fokuslinie 15) und eine Abbildung der Linie in der zur Fokusebene FE konjugierten Ebene FE' darstellt. Der Querschnitt der Fokuslinie 15 hat eine beugungsbegrenzte Ausdehnung, wenn die Pupillenlinie 14 den gesamten Pupillendurchmesser erfasst. Die Querschnittsausdehnung der Fokuslinie 15 ist beugungsbegrenzt etwa 1,4fach größer als die einer beugungsbegrenzten Punktquelle (Airy-Scheibe). 2 schematically shows the generation of a single line structure of the illumination light for reading the states A, ie a simple line with a maximum, which - as stated above - with the intensity zero point 5 the focus line according to the invention 10 of the optical signal 4 can be superimposed. According to 2a the illumination light is through a suitable optics 11 initially linearly imaged in a plane FE to the focal plane FE '. By means of an imaging lens 12 the illumination line becomes coherent in the pupil plane PE of a lens 13 focused, with which the illumination light into the sample 1 is focused. In the example shown, the illumination line runs in the x direction. Accordingly, the pupil PE - as in 2 B shown - centrally symmetrical line in the y-direction illuminated (pupil line 14 ). In the focal plane FE of the lens 13 arises here - as in 2c also shown a linear light structure perpendicular to the pupil line 14 in x-direction (focus line 15 ) and an image of the line in the plane FE 'conjugate to the focal plane FE'. The cross section of the focus line 15 has a diffraction-limited extension when the pupil line 14 recorded the total pupil diameter. The cross-sectional dimension of the focus line 15 is diffraction-limited about 1.4 times larger than that of a diffraction-limited point source (Airy disk).

Die in 2 lediglich schematisch angedeutete Optik 11 kann in verschiedenen Formen realisiert sein. So kann eine linienförmige Beleuchtung von FE' bzw. der Pupille PE beispielsweise durch Abbildung einer Spaltblende oder durch Fokussieren eines aufgeweiteten Beleuchtungslichtstrahls mittels einer Zylinderlinse oder einer Powell-Linse erreicht werden. Die Verwendung einer Powell-Linse bietet den Vorteil, dass die erzeugte linienförmige Lichtstruktur eine besonders homogene Lichtverteilung aufweist. Eine weitere Variante ist die Beleuchtung über einen nur linienförmig reflektierenden Strahlteiler, der in einer zur Pupillenebene PE konjugierten Ebene des Mikroskops angeordnet ist. Entscheidend für die Erzeugung einer linienförmigen Beleuchtung der Probe 1 in x-Richtung (2c) ist prinzipiell nur die kohärente linienförmige Beleuchtung der Pupille PE in y-Richtung (2b).In the 2 only schematically indicated optics 11 can be realized in different forms. Thus, a linear illumination of FE 'or of the pupil PE can be achieved, for example, by imaging a slit or by focusing an expanded illuminating light beam by means of a cylindrical lens or a Powell lens. The use of a Powell lens offers the advantage that the generated line-shaped light structure has a particularly homogeneous light distribution. A further variant is the illumination via a beam divider which only reflects in a linear manner and which is arranged in a plane of the microscope conjugate to the pupil plane PE. Crucial for the generation of a linear illumination of the sample 1 in X direction ( 2c ) is in principle only the coherent linear illumination of the pupil PE in the y-direction ( 2 B ).

3 zeigt schematisch ein Ausführungsbeispiel zur Erzeugung einer erfindungsgemäßen Fokuslinie 10 mit zentraler Nullstelle 5 im Querschnitt und seitlich begrenzenden Maxima 9. Dazu wird eine Phasenmodulation des optischen Signals 4 entlang der Pupillenlinie 14 realisiert. In 3a ist die linienförmige Ausleuchtung der Pupille PE dargestellt. Entlang der Pupillenlinie 14 ist im Pupillenmittelpunkt ein Phasensprung von einer halben Wellenlänge eingeführt, so dass die eine Hälfte der Linie 14 gegenüber der anderen Hälfte der Linie 14 um einen halben Wellenzug verzögert ist. Dies ist in 3a durch die unterschiedlich schraffierten Bereiche angedeutet. Diese Phasenmodulation hat zur Folge, dass in der Fokalebene FE eine Doppellinie 9 mit zentraler Intensitäts-Nullstelle 5 entsteht, wie dies in 3b dargestellt ist. Prinzipiell können auch andere Phasenmodulationen zu Strukturen mit einem derartigen Zentralminimum führen. So erzeugt jede zentralsymmetrische Phasenmodulation, welche die Eigenschaft hat, das 50 % der Pupillenlinie 14 um einen halben Wellenzug verzögert werden, eine orthogonal zur Pupillenlinie 14 ausgerichtete Fokuslinie 10 mit einem Zentralminimum im Querschnittsprofil. Allerdings wird der Querschnitt der Fokuslinie 10 dabei komplizierter und damit im Allgemeinen aus mehreren Maxima und Minima bestehen. 3 schematically shows an embodiment for generating a focus line according to the invention 10 with central zero 5 in cross-section and laterally limiting maxima 9 , For this purpose, a phase modulation of the optical signal 4 along the pupil line 14 realized. In 3a the line-shaped illumination of the pupil PE is shown. Along the pupil line 14 is introduced at the pupillary center a phase jump of half a wavelength, so that one half of the line 14 opposite the other half of the line 14 delayed by half a wave train. This is in 3a indicated by the differently hatched areas. This phase modulation has the consequence that in the focal plane FE a double line 9 with central intensity zero 5 arises, as in 3b is shown. In principle, other phase modulations can lead to structures with such a central minimum. Thus, each center-symmetric phase modulation having the property produces 50% of the pupil line 14 delayed by half a wave, one orthogonal to the pupil line 14 aligned focus line 10 with a central minimum in the cross-sectional profile. However, the cross section becomes the focus line 10 more complicated and thus generally consist of several maxima and minima.

Wie in 3a durch die dargestellten Pfeile angedeutet, ist das Licht senkrecht zur Pupillenlinie 14, d.h. in x-Richtung, polarisiert. Auf diese Weise wird erreicht, dass in der Eintrittspupille 14 nur Polarisationsvektoren mit reiner Tangentialkomponente auftreten. Beim Durchlaufen nachfolgender Optiken depolarisieren diese wesentlich schwächer in z-Richtung, d.h. in Strahlrichtung, als beispielsweise Polarisationsvektoren mit (in Bezug auf die Pupille) radialen Komponenten.As in 3a indicated by the illustrated arrows, the light is perpendicular to the pupil line 14 , ie in the x-direction, polarized. In this way it is achieved that in the entrance pupil 14 only polarization vectors with pure tangential component occur. When passing through subsequent optics they depolarize much weaker in the z-direction, ie in the beam direction, as, for example, polarization vectors with (with respect to the pupil) radial components.

4 zeigt schematisch ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops. Bei der in 4a dargestellten Ausführungsform wird kohärentes Beleuchtungslicht einer Strahlquelle 16 durch eine geeignete Optik 11 linienförmig in eine Zwischenbildebene ZB3 des Mikroskops fokussiert. Die Linie verläuft dabei in x-Richtung. Die Optik 11 zur Realisierung einer linienförmigen Lichtstruktur ist als Zylinderlinse 17 ausgeführt. Das Zwischenbild ZB3 wird über eine Linse 18 in die zur Pupille P1 des Mikroskopobjektivs 13 konjugierte Pupillenebene P2 abgebildet, wo die Lichtverteilung linienförmig in y-Richtung verläuft. 4 schematically shows an embodiment of a microscope according to the invention. At the in 4a illustrated embodiment, coherent illumination light of a beam source 16 through a suitable optics 11 focussed in an intermediate image plane ZB3 of the microscope. The line runs in the x-direction. The optics 11 to realize a linear light structure is as a cylindrical lens 17 executed. The intermediate image ZB3 is transmitted via a lens 18 into the pupil P1 of the microscope objective 13 Conjugated pupil plane P2 shown where the light distribution is linear in the y-direction.

In der Pupillenebene P3 des Mikroskops ist ein Strahlteiler 19 mit einer streifenförmigen Reflexionsschicht RS angeordnet. Der Strahlteiler 19 ist nur im Bereich der Linie RS reflektierend, so dass das rückwärts zu detektierende Messsignal 8, welches die gesamte Pupillenebene P3 ausleuchtet, fast vollständig transmittiert wird.In the pupil plane P3 of the microscope is a beam splitter 19 arranged with a strip-shaped reflection layer RS. The beam splitter 19 is only reflective in the area of the line RS, so that the measurement signal to be detected backwards 8th , which illuminates the entire pupil plane P3, is almost completely transmitted.

Die Pupille P3 wird durch Optiken 20 und 18 auf einen Y-Scanner 21 abgebildet, der den Strahl zur Bildaufnahme in y-Richtung scannen kann. Dieser befindet sich ebenfalls in der Pupillenebene P2. Die weitere Abbildung erfolgt über das Scannokular 22 in ein Zwischenbild ZB1, wo wieder ein Lichtstreifen in x-Richtung entsteht. Dieser wird über die Tubuslinse 23 und das Objektiv 13 in die Fokusebene FE im Probenraum abgebildet. In der Pupille P1 des Objektivs 13 entsteht dabei eine linienförmige Lichtverteilung in y-Richtung analog zur Pupillenebene P3, in der sich der Strahlteiler 19 befindet. In der Fokalebene FE entsteht ein (beugungsbegrenzter) Beleuchtungsstreifen analog zur Zwischenbildebene ZB3.The pupil P3 is made by optics 20 and 18 on a Y-scanner 21 imaged, which can scan the beam for image acquisition in the y-direction. This is also located in the pupil plane P2. The further imaging is done via the scan eyepiece 22 in an intermediate image ZB1, where again a light strip in the x-direction is formed. This is via the tube lens 23 and the lens 13 imaged in the focal plane FE in the sample space. In the pupil P1 of the lens 13 In this case, a line-shaped light distribution in the y direction arises analogously to the pupil plane P3, in which the beam splitter 19 located. In the focal plane FE creates a (diffraction-limited) illumination strip analogous to the intermediate image plane ZB3.

Zur Erzeugung der erfindungsgemäßen Fokuslinie 10 mit zentraler Intensitäts-Nullstelle 5 und seitlichen Intensitäts-Maxima 9 wird eine Phasenmodulation entlang der Pupillenlinie 14 durchgeführt In dem dargestellten Ausführungsbeispiel wird dazu in der Pupille P3 ein Phasensprung eingeführt, indem ein Teil des Strahlteilers 19 mit einer phasenverzögernden Struktur PV versehen wird, welche die Phase des Lichts um einen halben Wellenzug verzögert. Die hier transparent ausgeführte Beschichtung PV deckt dabei – wie in 4b gezeigt – die eine Hälfte der über den gesamten Pupillendurchmesser verlaufenden Reflexionsschicht RS ab. Beim Durchlaufen der Beschichtung PV wird das Licht aufgrund des Brechungsindex der Schicht verzögert gegen das Licht, das unbeschichtete Stellen (also Luft) durchläuft. Die Beschichtung PV kann z.B. aus einem Dielektrikum wie Magnesiumfluorit oder Siliziumdioxid hergestellt sein und auf die Reflexionsschicht RS aufgedampft werden. Auch eine Struktur basierend auf einer Flüssigkristall-Schicht ist denkbar.For generating the focus line according to the invention 10 with central intensity zero 5 and lateral intensity maxima 9 becomes a phase modulation along the pupil line 14 In the illustrated embodiment, for this purpose, a phase jump is introduced in the pupil P3, by a part of the beam splitter 19 is provided with a phase-retarding structure PV, which delays the phase of the light by half a wave train. The transparent PV coating here covers - as in 4b shown - one half of the over the entire pupil diameter extending reflection layer RS. When passing through the coating PV, the light is delayed due to the refractive index of the layer against the light that passes through uncoated areas (ie air). The coating PV can be made, for example, from a dielectric such as magnesium fluorite or silicon dioxide and vapor-deposited on the reflection layer RS. Also, a structure based on a liquid crystal layer is conceivable.

Eine alternative Realisierung wäre die Einfügung eines phasenverzögernden Elements in einer weiteren Pupillenebene, die durch weitere Abbildungslinsen erzeugt werden kann (hier nicht dargestellt). In dieser weiteren Pupillenebene könnten dann phasenverzögernde Elemente, wie Substrate mit dielektrischen Beschichtungen, Phasenmodulatoren auf Basis von Flüssigkristallen oder achromatische Phasenfilter angeordnet werden. Entscheidend ist nur die Einführung einer Optik mit der beschriebenen phasenverzögernden Eigenschaft, wobei diese in idealer Weise in oder nahe einer Pupillenebene angeordnet ist.A alternative realization would be the insertion a phase-retarding Elements in another pupil plane, through further imaging lenses can be generated (not shown here). In this further Pupil level could then phase delayed Elements, such as substrates with dielectric coatings, phase modulators based on liquid crystals or achromatic phase filters are arranged. It is crucial only the introduction an optic having the described phase-delaying property, wherein these are ideally located in or near a pupil plane is.

Das Detektionslicht (im Allgemeinen Fluoreszenz) wird als Messsignal 8 durch das Objektiv 13, die Tubuslinse 23, das Scann-Okular 22, den Scanner 21 (Descanned Detection), die Linsen 18 und 20, einen Filter 24 zur spektralen Filterung und eine Detektorlinse 25 auf einen konfokal angeordneten Zeilendetektor 26 abgebildet. Auch eine Non-Descanned-Detektion ist denkbar, wobei dabei der Detektor 26 zwischen Scanner 21 und Objektiv 13 angeordnet wäre.The detection light (generally fluorescence) is used as a measurement signal 8th through the lens 13 , the tube lens 23 , the scanning eyepiece 22 , the scanner 21 (Descanned Detection), the lenses 18 and 20 , a filter 24 for spectral filtering and a detector lens 25 on a confocal arranged line detector 26 displayed. Even a non-descanned detection is conceivable, while the detector 26 between scanners 21 and lens 13 would be arranged.

In 5 ist – schematisch – eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Mikroskops dargestellt, wobei der Aufbau konzeptionell dem Aufbau des Mikroskops gemäß 4 ähnelt. Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind die Strahlverläufe nicht dargestellt. In der Pupillenebene P3, die linienförmig ausgeleuchtet wird (Pupillenlinie 14 in y-Richtung), ist – im Unterschied zur Ausführung gemäß 4 – kein Strahlteiler 19 angeordnet, der gleichzeitig als (räumlicher) Strahlteiler und als phasenverzögendes Element fungiert. Vielmehr sind beide Funktionen separiert, indem der Strahlteiler 19 nunmehr ausschließlich als räumlicher Strahlteiler fungiert, wohingegen die Phasenverzögerung durch eine zusätzlich eingeführte phasenverzögernde Optik 27 erfolgt. Bei der phasenverzögernden Optik 27, die ebenfalls in oder nahe der Pupille P3 angeordnet ist, kann es sich wiederum um ein Substrat handeln, das räumlich strukturiert mit einer phasenverzögernden, transparenten Beschichtung PV (Dielektrikum) versehen ist. In der in 5b dargestellten Ausführung ist die Optik 27 kreisförmig ausgebildet, wobei der in negativer y-Richtung liegende Halbkreis mit der phasenverzögernden Beschichtung PV versehen ist. Des Weiteren kommen wieder Phasenmodulatoren auf Basis von Flüssigkristallen oder achromatische Phasenfilter, Arrays mit beweglichen Mikrospiegeln oder andere deformierbare Spiegel in Frage. Als Strahlteiler 19 zur Trennung von Beleuchtungslicht und Detektionslicht kommt ein konventioneller dichroitischer Strahlteiler 28, bspw. in Form eines Kantenfilters, zum Einsatz. Der dichroitische Strahlteiler 28 ist der phasenverzögernden Optik 27 nachgeschaltet.In 5 is shown - schematically - another embodiment of a microscope according to the invention, the structure conceptually according to the structure of the microscope according to 4 similar. For reasons of clarity, the beam paths are not shown. In the pupil plane P3, which is illuminated linearly (pupil line 14 in the y-direction), unlike the embodiment according to FIG 4 - no beam splitter 19 arranged, which acts simultaneously as a (spatial) beam splitter and phase-delaying element. Rather, both functions are separated by the beam splitter 19 now acts exclusively as a spatial beam splitter, whereas the phase delay by an additionally introduced phase-delay optics 27 he follows. In the phase-delay optics 27 , which is likewise arranged in or near the pupil P3, can again be a substrate, which is spatially structured with a phase-retarding, transparent coating PV (dielectric). In the in 5b illustrated embodiment is the optics 27 formed circular, wherein the lying in the negative y-direction semicircle is provided with the phase-retardant coating PV. Furthermore, phase modulators based on liquid crystals or achromatic phase filters, arrays with movable micromirrors or other deformable mirrors are possible again. As a beam splitter 19 A conventional dichroic beam splitter is used to separate illuminating light and detection light 28 , for example in the form of an edge filter used. The dichroic beam splitter 28 is the phase-delay optics 27 downstream.

Hinsichtlich weiter vorteilhafter Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens und des erfindungsgemäßen Mikroskops werde zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil der Beschreibung sowie auf die beigefügten Patentansprüche verwiesen.With regard to further advantageous embodiments of the method according to the invention and of the microscope according to the invention, in order to avoid repetition, reference is made to the general part of the description and to the attached patent documents referenced claims.

Schließlich sei ausdrücklich darauf hingewiesen, dass die voranstehend beschriebenen Ausführungsbeispiele lediglich zur Erörterung der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele einschränkt.Finally, be expressly pointed out that the above-described embodiments for discussion only the claimed teaching, but not on the embodiments limits.

Claims (43)

Verfahren zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben, wobei die zu untersuchende Probe (1) eine Substanz umfasst, die wiederholt von einem ersten Zustand (Z1, A) in einen zweiten Zustand (Z1, A) überführbar ist, wobei sich die ersten und die zweiten Zustände (Z1, A; Z2, B) in mindestens einer optischen Eigenschaften voneinander unterscheiden, umfassend die Schritte, dass die Substanz in einem zu erfassenden Probenbereich (P) zunächst in den ersten Zustand (Z1, A) gebracht wird und dass mittels eines optischen Signals (4) der zweite Zustand (Z2, B) induziert wird, wobei innerhalb des zu erfassenden Probenbereichs (P) räumlich begrenzte Teilbereiche gezielt ausgespart werden, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Signal (4) in Form einer Fokuslinie (10) mit einem Querschnittsprofil mit mindestens einer Intensitätsnullstelle (5) mit seitlich benachbarten Intensitätsmaxima (9) bereitgestellt wird.Method for spatially high-resolution examination of samples, wherein the sample to be examined ( 1 ) comprises a substance which is repeatedly convertible from a first state (Z1, A) to a second state (Z1, A), wherein the first and the second states (Z1, A; Z2, B) have at least one optical property differ from one another, comprising the steps of first bringing the substance in a sample region (P) to be detected into the first state (Z1, A) and by means of an optical signal ( 4 ), the second state (Z2, B) is induced, wherein within the sample region (P) to be detected spatially limited subregions are deliberately recessed, characterized in that the optical signal ( 4 ) in the form of a focus line ( 10 ) having a cross-sectional profile with at least one intensity zero point ( 5 ) with laterally adjacent intensity maxima ( 9 ) provided. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe (1) durch ein Objektiv (3, 13) beleuchtet wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Fokuslinie (10) mittels einer linienförmigen Ausleuchtung in einer zur Pupille (P1) des Objektivs (3, 13) konjugierten Pupillenebene (P3) – Pupillenlinie (14) – und durch geeignete Phasenmodulation entlang der Pupillenlinie (14) erzeugt wird.The method of claim 1, wherein the sample ( 1 ) through a lens ( 3 . 13 ), characterized in that the focus line ( 10 ) by means of a line-shaped illumination in one of the pupil (P1) of the objective ( 3 . 13 ) conjugated pupil plane (P3) - pupil line ( 14 ) - and by suitable phase modulation along the pupil line ( 14 ) is produced. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Phasenmodulation derart vorgenommen wird, dass entlang der Pupillenlinie (14) ein oder mehrere Phasensprünge eingeführt werden.A method according to claim 2, characterized in that the phase modulation is performed such that along the pupil line ( 14 ) one or more phase jumps are introduced. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Phasensprung im Pupillenmittelpunkt eingeführt wird.Method according to claim 3, characterized a phase jump is introduced at the pupillary center. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der eingeführte Phasensprung der Länge eines halben Wellenzuges entspricht.Method according to claim 4, characterized in that that the introduced Phase jump of the length half a wave corresponds. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass entlang der Pupillenlinie (14) mehrere Phasensprünge um jeweils eines halben Wellenzug eingeführt werden.Method according to claim 2, characterized in that along the pupil line ( 14 ) several phase jumps are introduced by half a wave train. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Phasenmodulation entlang der Pupillenlinie (14) mittels eines in einem Zwischenbild der Pupille (P1) angeordneten räumlichen Phasenmodulators auf Flüssigkeitsbasis realisiert wird.Method according to one of claims 2 to 6, characterized in that the phase modulation along the pupil line ( 14 ) is realized by means of a liquid-based spatial phase modulator arranged in an intermediate image of the pupil (P1). Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Phasenmodulation entlang der Pupillenlinie (14) mittels eines in einem Zwischenbild der Pupille (P1) angeordneten optischen Bauteils (19, 27) mit phasenverzögernder optischer Beschichtung (PV) realisiert wird.Method according to one of claims 2 to 6, characterized in that the phase modulation along the pupil line ( 14 ) by means of an optical component arranged in an intermediate image of the pupil (P1) ( 19 . 27 ) is realized with phase-retarding optical coating (PV). Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Phasenmodulation entlang der Pupillenlinie (14) mittels eines in einem Zwischenbild der Pupille (P1) angeordneten optischen Bauteils realisiert wird, wobei das Bauteil zunächst einen Phasensprung durch Totalreflexion und anschließend eine Reflexion an einer Metallschicht erzeugt.Method according to one of claims 2 to 6, characterized in that the phase modulation along the pupil line ( 14 ) is realized by means of a in an intermediate image of the pupil (P1) arranged optical component, wherein the component first generates a phase jump by total reflection and then a reflection on a metal layer. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Phasenmodulation entlang der Pupillenlinie (14) mittels eines in einem Zwischenbild der Pupille (P1) angeordneten optischen Elements realisiert wird, wobei das Element einen oder mehrere deformierbare und/oder bewegliche Spiegel und/oder Spiegelelemente aufweist.Method according to one of claims 2 to 6, characterized in that the phase modulation along the pupil line ( 14 ) is realized by means of an optical element arranged in an intermediate image of the pupil (P1), the element having one or more deformable and / or movable mirrors and / or mirror elements. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Pupillenlinie (14) durch Fokussieren eines Beleuchtungslichtstrahls einer Beleuchtungslichtquelle mit einer Zylinderlinse (17) oder einer Powell-Linse erzeugt wird.Method according to one of claims 2 to 10, characterized in that the pupil line ( 14 ) by focusing an illumination light beam of an illumination light source with a cylindrical lens ( 17 ) or a Powell lens. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Pupillenlinie (14) durch Abbilden einer Spaltblende in die Pupillenebene erzeugt wird.Method according to one of claims 2 to 10, characterized in that the pupil line ( 14 ) is produced by imaging a slit diaphragm in the pupil plane. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Pupillenlinie (14) mittels holographischer Elemente erzeugt wird.Method according to one of claims 2 to 10, characterized in that the pupil line ( 14 ) is generated by means of holographic elements. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Pupillenlinie (14) mittels eines Achrogate-Filters in den Strahlengang eingekoppelt wird.Method according to one of claims 2 to 10, characterized in that the pupil line ( 14 ) is coupled by means of an Achrogate filter in the beam path. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Phasenmodulation entlang der Pupillenlinie (14) mittels zusätzlicher phasenverzögernder Schichten auf dem Achrogate-Filter realisiert wird.Method according to claim 14, characterized in that the phase modulation along the pupil line ( 14 ) is realized by means of additional Phasenverzögernder layers on the Achrogate filter. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass als Beleuchtungslichtquelle zur Bereitstellung des optischen Signals (4) ein Laser verwendet wird.Method according to one of claims 1 to 15, characterized in that as illumination light source for providing the optical signal ( 4 ) a laser is used. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Licht des optischen Signals (4) senkrecht zur Pupillenlinie (14) polarisiert ist.Method according to one of claims 2 to 16, characterized in that the light of the optical signal ( 4 ) perpendicular to the pupillary line ( 14 ) is polarized. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Fokuslinie (10) nacheinander in unterschiedlichen Raumrichtungen erzeugt wird.Method according to one of claims 1 to 17, characterized in that the focus line ( 10 ) is generated successively in different spatial directions. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der zu erfassende Probenbereich (P) mehrfach jeweils entsprechend der jeweiligen Raumrichtung der Fokuslinie (10) gescannt wird.A method according to claim 18, characterized in that the sample area to be detected (P) several times each corresponding to the respective spatial direction of the focus line ( 10 ) is scanned. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Einzelbilder mathematisch zu einem Gesamtbild zusammengefügt werden.Method according to claim 19, characterized that the single images are mathematically combined to a total image. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Übergang von dem ersten Zustand (Z1, A) in den zweiten Zustand (Z2, B) mittels Mehr-Photonen-Absorption realisiert wird.Method according to one of claims 1 to 20, characterized that the transition from the first state (Z1, A) to the second state (Z2, B) by means of Multi-photon absorption is realized. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Auslesen des von der Probe (1) ausgehenden Messsignals (8) mittels Mehr-Photonen-Anregung realisiert wird.Method according to one of claims 1 to 21, characterized in that the read-out of the sample ( 1 ) outgoing measuring signal ( 8th ) is realized by means of multi-photon excitation. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Signal (4) und ein Testsignal (7) zum Auslesen des ersten Zustandes (Z1, A) mittels gepulster Lichtquellen erzeugt werden.Method according to one of claims 1 to 22, characterized in that the optical signal ( 4 ) and a test signal ( 7 ) are generated for reading the first state (Z1, A) by means of pulsed light sources. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die gepulsten Lichtquellen synchronisiert sind.Method according to claim 23, characterized that the pulsed light sources are synchronized. Mikroskop, insbesondere Laser-Raster-Fluoreszenzmikroskop, zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben und insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei die zu untersuchende Probe (1) eine Substanz umfasst, die wiederholt von einem ersten Zustand (Z1, A) in einen zweiten Zustand (Z2, B) überführbar ist, wobei sich die ersten und die zweiten Zustände (Z1, A; Z2, B) in mindestens einer optischen Eigenschaften voneinander unterscheiden, umfassend die Schritte, dass die Substanz in einem zu erfassenden Probenbereich (P) zunächst in den ersten Zustand (Z1, A) gebracht wird und dass mittels eines optischen Signals (4) der zweite Zustand (Z2, B) induziert wird, wobei innerhalb des zu erfassenden Probenbereichs (P) räumlich begrenzte Teilbereiche gezielt ausgespart werden, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Signal (4) in Form einer Fokuslinie (10) mit einem Querschnittsprofil mit mindestens einer Intensitätsnullstelle (5) mit seitlich benachbarten Intensitätsmaxima (9) bereitstellbar ist.Microscope, in particular laser scanning fluorescence microscope, for spatially high-resolution examination of samples and in particular for carrying out a method according to one of claims 1 to 24, wherein the sample to be examined ( 1 ) comprises a substance which is repeatedly convertible from a first state (Z1, A) to a second state (Z2, B), wherein the first and the second states (Z1, A; Z2, B) have at least one optical property differ from one another, comprising the steps of first bringing the substance in a sample region (P) to be detected into the first state (Z1, A) and by means of an optical signal ( 4 ), the second state (Z2, B) is induced, wherein within the sample region (P) to be detected spatially limited subregions are deliberately recessed, characterized in that the optical signal ( 4 ) in the form of a focus line ( 10 ) having a cross-sectional profile with at least one intensity zero point ( 5 ) with laterally adjacent intensity maxima ( 9 ) is available. Mikroskop nach Anspruch 25, gekennzeichnet durch ein optisches Bauteil (11) zur Erzeugung einer Beleuchtungslinie in einer zur Pupille (P1) des Mikroskopobjektivs (3, 13) konjugierten Pupillenebene (P3).Microscope according to claim 25, characterized by an optical component ( 11 ) for generating a line of illumination in one of the pupil (P1) of the microscope objective ( 3 . 13 ) conjugated pupil plane (P3). Mikroskop nach Anspruch 26, gekennzeichnet durch einen phasenmodulierendes Element (19, 27) zur Erzeugung des Querschnittsprofils der Fokuslinie (10) durch Phasenmodulation der Pupillenlinie (14).Microscope according to claim 26, characterized by a phase modulating element ( 19 . 27 ) for generating the cross-sectional profile of the focus line ( 10 ) by phase modulation of the pupil line ( 14 ). Mikroskop nach Anspruch 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Bauteil (11) zur Erzeugung der Pupillenlinie (14) und das phasenmodulierende Element (19, 27) als bauliche Einheit ausgeführt sind.Microscope according to claim 26 or 27, characterized in that the optical component ( 11 ) for generating the pupil line ( 14 ) and the phase modulating element ( 19 . 27 ) are designed as a structural unit. Mikroskop nach Anspruch 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Bauteil (11) zur Erzeugung der Pupillenlinie (14) und das phasenmodulierende Element (19, 27) jeweils als separate Einheiten im Beleuchtungsstrahlengang angeordnet sind.Microscope according to claim 27 or 28, characterized in that the optical component ( 11 ) for generating the pupil line ( 14 ) and the phase modulating element ( 19 . 27 ) are each arranged as separate units in the illumination beam path. Mikroskop nach einem der Ansprüche 27 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass das phasenmodulierende Element (19, 27) als ein in einem Zwischenbild der Pupille (P1) angeordneter räumlicher Phasenmodulator auf Flüssigkeitsbasis oder als optisches Bauteil mit phasenverzögernder dielektrischer Beschichtung (PV) ausgeführt ist.Microscope according to one of Claims 27 to 29, characterized in that the phase-modulating element ( 19 . 27 ) is embodied as a liquid-based spatial phase modulator arranged in an intermediate image of the pupil (P1) or as a phase-retarding dielectric coating (PV) optical component. Mikroskop nach einem der Ansprüche 26 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Bauteil (11) zur Erzeugung der Pupillenlinie (14) als Zylinderlinse (17) und/oder als Powell-Linse und/oder als holographisches Element ausgeführt ist.Microscope according to one of claims 26 to 30, characterized in that the optical component ( 11 ) for generating the pupil line ( 14 ) as a cylindrical lens ( 17 ) and / or designed as a Powell lens and / or as a holographic element. Mikroskop nach einem der Ansprüche 25 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungslichtquelle zur Erzeugung des optischen Signals (4) als Laser ausgeführt ist.Microscope according to one of claims 25 to 31, characterized in that the illumination light source for generating the optical signal ( 4 ) is designed as a laser. Mikroskop nach einem der Ansprüche 25 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungslichtquelle zur Erzeugung des optischen Signals (4) mit mindestens einer weiteren Lichtquelle zum Auslesen des von der Probe (1) ausgehenden Messsignals (8) oder zum Induzieren des ersten Zustands (Z1, A) kombiniert ist.Microscope according to one of claims 25 to 32, characterized in that the illuminating light source for generating the optical signal ( 4 ) with at least one further light source for reading out the sample ( 1 ) outgoing measuring signal ( 8th ) or for inducing the first state (Z1, A) is combined. Mikroskop nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere Lichtquelle die Probe (1) ganz oder teilweise, vorzugsweise linienförmig, beleuchtet.Microscope according to claim 33, characterized in that the further light source is the sample ( 1 ) wholly or partially, preferably linear, illuminated. Mikroskop nach einem der Ansprüche 25 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass die Fokuslinie (10) des optischen Signals (4) mit einer weiteren Linie räumlich überlagert ist.Microscope according to one of claims 25 to 34, characterized in that the focus line ( 10 ) of the optical signal ( 4 ) with another Li never spatially superimposed. Mikroskop nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensitäts-Nullstelle (5) der Fokuslinie (10) des optischen Signals (4) mit dem Maximum einer Linie (15) zum Auslesen des von der Probe (1) ausgehenden Messsignals (8) räumlich überlagert ist.Microscope according to claim 35, characterized in that the intensity zero point ( 5 ) of the focus line ( 10 ) of the optical signal ( 4 ) with the maximum of a line ( 15 ) for reading the from the sample ( 1 ) outgoing measuring signal ( 8th ) is spatially superimposed. Mikroskop nach Anspruch 35 oder 36, dadurch gekennzeichnet, dass jeder Linie (10, 15) eine eigene Scanneinrichtung (21), vorzugsweise in Form eines Scannspiegels, zugeordnet ist.Microscope according to claim 35 or 36, characterized in that each line ( 10 . 15 ) own scanning device ( 21 ), preferably in the form of a scanning mirror. Mikroskop nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass die Scannrichtung mit der Verlaufsrichtung der Pupillenlinie (14) übereinstimmt.Microscope according to Claim 37, characterized in that the scanning direction is aligned with the direction of progression of the pupil line ( 14 ) matches. Mikroskop nach einem der Ansprüche 25 bis 38, gekennzeichnet durch einen Zeilendetektor (26) zur Liniendetektion des von der Probe (1) ausgehenden Messsignals (8).Microscope according to one of Claims 25 to 38, characterized by a line detector ( 26 ) for line detection of the sample ( 1 ) outgoing measuring signal ( 8th ). Mikroskop nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass der Zeilendetektor (26) als CCD-Zeile, als EMCCD oder als APD ausgeführt ist.Microscope according to claim 39, characterized in that the line detector ( 26 ) as CCD line, as EMCCD or as APD. Mikroskop nach Anspruch 39 oder 40, dadurch gekennzeichnet, dass der Zeilendetektor (26) konfokal zur Fokuslinie (10) angeordnet ist.Microscope according to claim 39 or 40, characterized in that the line detector ( 26 ) confocal to the focus line ( 10 ) is arranged. Mikroskop nach einem der Ansprüche 39 bis 41, dadurch gekennzeichnet, dass der Zeilendetektor (26) in Detektionsrichtung hinter der/den Scanneinrichtung(en) (21) oder vor der/den Scanneinrichtung(en) (21) angeordnet ist.Microscope according to one of claims 39 to 41, characterized in that the line detector ( 26 ) in the detection direction behind the scanning device (s) ( 21 ) or in front of the scanning device (s) ( 21 ) is arranged. Verwendung eines Mikroskops nach einem der Ansprüche 25 bis 42 zum optisch induzierten Übergang von Farbstoffmolekülen zwischen verschiedenen Molekülzuständen, die sich in mindestens einer optischen Eigenschaft voneinander unterscheiden.Use of a microscope according to one of claims 25 to 42 to the optically induced transition of dye molecules between different molecular states that differ from each other in at least one optical property.
DE200610009831 2006-03-01 2006-03-01 Method and microscope for spatially high-resolution examination of samples Expired - Fee Related DE102006009831B4 (en)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE200610009831 DE102006009831B4 (en) 2006-03-01 2006-03-01 Method and microscope for spatially high-resolution examination of samples
US11/653,446 US7679741B2 (en) 2006-03-01 2007-01-16 Method and microscope for high spatial resolution examination of samples
JP2007019423A JP2007233370A (en) 2006-03-01 2007-01-30 Method and microscope for high spatial resolution examination of sample

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE200610009831 DE102006009831B4 (en) 2006-03-01 2006-03-01 Method and microscope for spatially high-resolution examination of samples

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE102006009831A1 true DE102006009831A1 (en) 2007-09-13
DE102006009831B4 DE102006009831B4 (en) 2013-07-04

Family

ID=38335817

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE200610009831 Expired - Fee Related DE102006009831B4 (en) 2006-03-01 2006-03-01 Method and microscope for spatially high-resolution examination of samples

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP2007233370A (en)
DE (1) DE102006009831B4 (en)

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102008052223A1 (en) * 2008-10-17 2010-04-22 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Luminescence scanner for spatially resolved determination of physical characteristics of semiconductor component, has analyzing unit determining physical properties of semiconductor component from detected spatially resolved luminescence
DE102008054317A1 (en) * 2008-11-03 2010-05-06 Carl Zeiss Microlmaging Gmbh combining microscopy
DE102008059328A1 (en) * 2008-11-27 2010-06-02 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Resolution-enhanced microscopy
DE102009008646A1 (en) 2009-02-12 2010-08-19 Dodt, Hans-Ulrich, Dr. Method for detecting chromophore in two-dimensional sample in field of e.g. ultramicroscopy, involves detecting subset of chromophore from direction that is perpendicular to line and/or to surface in sample
DE102009023279A1 (en) 2009-05-29 2010-12-09 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Device for determining information from germ distribution dependent on carrier substrate, has carrier substrate with readable location information, and has beam sampling device with radiation source
DE102009029831A1 (en) * 2009-06-17 2011-01-13 W.O.M. World Of Medicine Ag Apparatus and method for multi-photon fluorescence microscopy for obtaining information from biological tissue
DE102010028138A1 (en) * 2010-04-22 2011-10-27 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Determining the distribution of a substance by scanning with a measuring front
DE102013114860B3 (en) * 2013-12-23 2015-05-28 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method and device for determining the locations of individual molecules of a substance in a sample
WO2016156541A3 (en) * 2015-03-31 2016-12-29 Laser-Laboratorium Göttingen e.V. Method and scanning fluorescence microscope for multidimensional high-resolution imaging of a structure or a path of a particle in a sample
DE102016119264A1 (en) * 2016-10-10 2018-04-12 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. A method for spatially high-resolution determination of the location of a singled, excitable light for the emission of luminescent light molecule in a sample
WO2018208687A1 (en) * 2017-05-06 2018-11-15 Howard Hughes Medical Institute Scanned line angular projection microscopy
DE102021002540A1 (en) 2021-05-14 2022-11-17 Horst Wochnowski High-resolution fluorescence-based (localization) microscopy method as a combination of RESOLFT (STED/GSD) and PALM/STORM and SIM

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110687687B (en) * 2019-09-25 2021-05-04 腾景科技股份有限公司 Laser facula homogenizing device

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010045523A1 (en) * 1994-07-15 2001-11-29 Baer Stephen C. Superresolution in microlithography and fluorescence microscopy
DE10154699A1 (en) * 2001-11-09 2003-05-28 Max Planck Gesellschaft Method and device for stimulating an optical transition in a spatially limited manner
DE10118355B4 (en) * 2001-04-12 2005-07-21 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method and apparatus for multiphoton excitation of a sample
EP1584918A2 (en) * 2004-04-07 2005-10-12 Europhoton GmbH, Gesellschaft für optische Sensorik Method and device for fluorescence lifetime imaging nanoscopy
DE102004034996A1 (en) * 2004-07-16 2006-02-02 Carl Zeiss Jena Gmbh Scanning microscope with linear scan
DE102004034962A1 (en) * 2004-07-16 2006-02-16 Carl Zeiss Jena Gmbh Microscope with increased resolution

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10325459A1 (en) * 2003-04-13 2004-11-18 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Creating a high-resolution structure with a substance that can be altered with an optical signal comprises applying the signal so that an intensity minimum excludes a restricted area, e.g. for writing to data storage media

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010045523A1 (en) * 1994-07-15 2001-11-29 Baer Stephen C. Superresolution in microlithography and fluorescence microscopy
DE10118355B4 (en) * 2001-04-12 2005-07-21 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method and apparatus for multiphoton excitation of a sample
DE10154699A1 (en) * 2001-11-09 2003-05-28 Max Planck Gesellschaft Method and device for stimulating an optical transition in a spatially limited manner
EP1584918A2 (en) * 2004-04-07 2005-10-12 Europhoton GmbH, Gesellschaft für optische Sensorik Method and device for fluorescence lifetime imaging nanoscopy
DE102004034996A1 (en) * 2004-07-16 2006-02-02 Carl Zeiss Jena Gmbh Scanning microscope with linear scan
DE102004034962A1 (en) * 2004-07-16 2006-02-16 Carl Zeiss Jena Gmbh Microscope with increased resolution

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102008052223A1 (en) * 2008-10-17 2010-04-22 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Luminescence scanner for spatially resolved determination of physical characteristics of semiconductor component, has analyzing unit determining physical properties of semiconductor component from detected spatially resolved luminescence
DE102008054317A1 (en) * 2008-11-03 2010-05-06 Carl Zeiss Microlmaging Gmbh combining microscopy
US8704196B2 (en) 2008-11-03 2014-04-22 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Combination microscopy
DE102008059328A1 (en) * 2008-11-27 2010-06-02 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Resolution-enhanced microscopy
US8610086B2 (en) 2008-11-27 2013-12-17 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Increased resolution microscopy
DE102009008646A1 (en) 2009-02-12 2010-08-19 Dodt, Hans-Ulrich, Dr. Method for detecting chromophore in two-dimensional sample in field of e.g. ultramicroscopy, involves detecting subset of chromophore from direction that is perpendicular to line and/or to surface in sample
DE102009023279A1 (en) 2009-05-29 2010-12-09 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Device for determining information from germ distribution dependent on carrier substrate, has carrier substrate with readable location information, and has beam sampling device with radiation source
DE102009029831A1 (en) * 2009-06-17 2011-01-13 W.O.M. World Of Medicine Ag Apparatus and method for multi-photon fluorescence microscopy for obtaining information from biological tissue
US9846121B2 (en) 2009-06-17 2017-12-19 W.O.M. World Of Medicine Gmbh Device and method for multi-photon fluorescence microscopy for obtaining information from biological tissue
US8912511B2 (en) 2009-06-17 2014-12-16 W.O.M. World Of Medicine Ag Device and method for multi-photon fluorescence microscopy for obtaining information from biological tissue
US9024279B2 (en) 2010-04-22 2015-05-05 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. Determining the distribution of a substance by scanning with a measuring front
DE102010028138A1 (en) * 2010-04-22 2011-10-27 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Determining the distribution of a substance by scanning with a measuring front
DE102013114860B3 (en) * 2013-12-23 2015-05-28 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method and device for determining the locations of individual molecules of a substance in a sample
US9719928B2 (en) 2013-12-23 2017-08-01 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. High-resolution fluorescence microscopy using a structured beam of excitation light
WO2016156541A3 (en) * 2015-03-31 2016-12-29 Laser-Laboratorium Göttingen e.V. Method and scanning fluorescence microscope for multidimensional high-resolution imaging of a structure or a path of a particle in a sample
DE102016119264A1 (en) * 2016-10-10 2018-04-12 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. A method for spatially high-resolution determination of the location of a singled, excitable light for the emission of luminescent light molecule in a sample
DE102016119264B4 (en) 2016-10-10 2018-05-30 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. A method for spatially high-resolution determination of the location of a singled, excitable light for the emission of luminescent light molecule in a sample
WO2018208687A1 (en) * 2017-05-06 2018-11-15 Howard Hughes Medical Institute Scanned line angular projection microscopy
US10830701B2 (en) 2017-05-06 2020-11-10 Howard Hughes Medical Institute Scanned line angular projection microscopy
DE102021002540A1 (en) 2021-05-14 2022-11-17 Horst Wochnowski High-resolution fluorescence-based (localization) microscopy method as a combination of RESOLFT (STED/GSD) and PALM/STORM and SIM

Also Published As

Publication number Publication date
JP2007233370A (en) 2007-09-13
DE102006009831B4 (en) 2013-07-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE102006009831B4 (en) Method and microscope for spatially high-resolution examination of samples
DE102006009833B4 (en) Method and microscope for spatially high-resolution examination of samples
EP2860566B1 (en) High resolution scanning microscopy
EP2641078B1 (en) Microscopy with improved depth resolution
EP1944600B1 (en) Laser scanning microscope
DE10004191B4 (en) Fluorescence scanning microscope
DE10257120B4 (en) Scanning microscope for imaging an object
DE102013001238B4 (en) Light microscope and microscopy method
DE102006056429B3 (en) Microscope-type imaging device for examining biological and medical test samples, has spatially separating beam splitter for partly separating coherent detection light from incoherent light
EP2317362A1 (en) Microscopic method and microscope with improved resolution
EP2904442B1 (en) Confocal microscope with freely adjustable sample scanning
DE19801139A1 (en) Point scanning luminescence microscope for investigating biological specimens using bifocal scanning
EP2102695A1 (en) Method and arrangement for collimated microscopic imaging
DE102008009216A1 (en) Apparatus and method for spatially high resolution imaging of a structure of a sample
DE102007009550B4 (en) Method and microscope device for observing a moving sample
EP3283917B1 (en) Method and device for examination of a sample
DE102020209889A1 (en) Microscope and method for microscopic imaging with variable illumination
DE102015116598A1 (en) Method and microscope for high-resolution imaging by means of SIM
LU93022B1 (en) Method and microscope for examining a sample
EP2784564A1 (en) Light microscope and method for examining a microscopic sample
DE102006009832B4 (en) Method and microscope for spatially high-resolution examination of samples
LU93143B1 (en) A method of assaying a sample and apparatus for carrying out such a method
DE19851240C1 (en) Fluorescence microscopy with nonconfocal fluorescence microscopes, which can be used as theta microscopes with single or double lenses where resolution is increased in at least two wavelength zones
DE10206004A1 (en) Device for confocal optical microanalysis
DE102018132212B4 (en) Method and microscope for high-resolution light microscopic imaging of a sample

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
R016 Response to examination communication
R018 Grant decision by examination section/examining division
R020 Patent grant now final

Effective date: 20131005

R119 Application deemed withdrawn, or ip right lapsed, due to non-payment of renewal fee