DE102016119263A1

DE102016119263A1 - Verfahren zum räumlich hochauflösenden Bestimmen des Orts eines vereinzelten, mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbaren Moleküls in einer Probe

Info

Publication number: DE102016119263A1
Application number: DE102016119263.5A
Authority: DE
Inventors: Francisco BALZAROTTI; Yvan Eilers; Klaus Gwosch; Stefan W. Hell
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2016-10-10
Filing date: 2016-10-10
Publication date: 2018-04-12
Anticipated expiration: 2036-10-11
Also published as: DE102016119263B4

Abstract

Bei einem Verfahren zum räumlich hochauflösenden Bestimmen des Orts eines vereinzelten Moleküls (24) in einer oder mehreren Raumrichtungen (x., y) in einer Probe, wobei das Molekül (24) mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbar ist, wird das Anregungslichts mit einer Intensitätsverteilung auf die Probe gerichtet wird, die eine Nullstelle (20) und Intensitätsanstiegsbereiche aufweist, welche in jeder der Raumrichtungen (x, y) beidseitig an die Nullstelle (20) angrenzen. Zu jeder von verschiedenen Positionen (A–D) der Nullstelle (20) in der Probe wird das on dem Molekül (24) emittierten Lumineszenzlicht registriert; und der Ort des Moleküls (24) in der Probe wird von den Intensitäten des zu den verschiedenen Positionen (A–D) der Nullstelle (20) registrierten Lumineszenzlichts abgeleitet. Dabei wird die Nullstelle (20) an nicht mehr als n × 3 verschiedenen Positionen (A–D) in der Probe angeordnet wird, um den Ort des Moleküls (24) in den n Raumrichtungen (x, y) von den zu den verschiedenen Positionen (a–D) der Nullstelle (20) registrierten Intensitäten des Lumineszenzlichts abzuleiten.

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum räumlich hochauflösenden Bestimmen des Orts eines vereinzelten Moleküls in einer oder mehreren Raumrichtungen in einer Probe, wobei das Molekül mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbar ist. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1.
Unter einem vereinzelten, mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbaren Molekül wird hier ein Molekül verstanden, das einen Mindestabstand zu anderen gleichartigen Molekülen aufweist, die mit demselben Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht im selben Wellenlängenbereich anregbar sind. Dieser Mindestabstand wird sicher eingehalten, wenn der Abstand des vereinzelten Moleküls zu derartigen gleichartigen Molekülen mindestens gleich der Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Lumineszenzlichts ist, weil dann das Lumineszenzlicht von den verschiedenen mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbaren Molekülen getrennt erfasst werden kann. Die Erfindung umfasst aber auch Ausführungsformen, bei denen dieser Mindestabstand kleiner als die Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Lumineszenzlichts ist.
Das Lumineszenzlicht, zu dessen Emission das Molekül mit dem Anregungslicht anregbar ist, kann insbesondere Fluoreszenzlicht sein. Das Emittieren des Lumineszenzlichts durch das Molekül kann aber auf jedem photophysikalischen Prozess basieren, der durch das Anregungslicht angeregt wird. Hierzu zählen alle Prozesse der Photolumineszenz und beispielsweise auch eine durch das Anregungslicht angeregte Emission von Lumineszenzlicht durch Quantum Dots.
STAND DER TECHNIK
Das einfachste Verfahren zum Bestimmen des Orts eines vereinzelten, mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbaren Moleküls besteht darin, das Molekül mit dem Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anzuregen und das Lumineszenzlicht auf einen Kamera oder allgemeiner auf einen räumlich auflösenden Detektor abzubilden. Für die bei dieser Abbildung erreichbare räumliche Auflösung gilt zwar grundsätzlich die Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Lumineszenzlichts. Wenn jedoch eine Vielzahl von Photonen des Lumineszenzlichts mit dem räumlich auflösenden Detektor detektiert wird, die von einem einzigen Molekül an einem festen Ort in der Probe stammen, kann aus der räumlichen Verteilung dieser Photonen über den Detektor der Ort des Moleküls mit einer um einen Faktor 1/√n verbesserten Präzision bestimmt werden. Dabei ist "n" die Anzahl der registrierten Photonen. Eine deutliche Unterschreitung der Beugungsgrenze bei diesem als Lokalisierung bezeichnet Verfahren setzt daher eine Vielzahl von Photonen des Lumineszenzlichts voraus, die von dem vereinzelten Molekül emittiert und registriert werden. Damit besteht die Gefahr, dass das vereinzelte Molekül beim und evtl. schon vor dem Bestimmen seines Orts in der Probe mit der gewünschten Präzision weggeblichen wird. Insbesondere ein wiederholtes Bestimmen des Orts desselben vereinzelten Moleküls, wie es zum Tracking eines sich in einer Probe bewegenden Moleküls erforderlich ist, ist deshalb oft nicht möglich.
Wenn ein vereinzeltes Molekül Lumineszenzlicht mit einer gerichteten räumlichen Verteilung emittiert, wirkt sich dies bei der Bestimmung seines Orts aus der Verteilung der Photonen des Lumineszenzlichts über einen räumlich auflösenden Detektor, d. h. durch Lokalisierung, in Form eines Ortsfehlers aus. Dieser Ortsfehler hängt von der Orientierung des Moleküls in der jeweiligen Probe ab. Eine gerichtete Verteilung des emittierten Lumineszenzlichts zeigt sich beispielsweise bei Molekülen, deren Rotationsdiffusionszeiten länger als ihre Verweildauer in ihrem angeregten Zustand sind, aus dem heraus sie das Lumineszenzlicht emittieren (siehe Engelhardt, J. et al. "Molecular Orientation Affects Localization Accuracy in Superresolution Far-Field Fluorescence Microscopy", NanoLett 2011 Jan. 12; 11 (1): 209–13).
Aus der WO 2006/127692 A2 ist es bekannt, eine interessierende Struktur in einer Probe mit aktivierbaren Molekülen zu markieren, die sich in einem nicht-fluoreszenten Ausgangszustand befinden, aber mit Aktivierungslicht in einen fluoreszenten Zustand überführt werden können, in dem sie mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbar sind. So kann mit dem Aktivierungslicht ein geringer Anteil der insgesamt vorhandenen Moleküle in den fluoreszenten Zustand gebracht werden, bei dem nächstbenachbarte Moleküle in dem fluoreszenten Zustand einen größeren Abstand als die Beugungsgrenze aufweisen, d. h. vereinzelt sind. Bei einem anschließenden Beaufschlagen der Probe mit Anregungslicht wird Fluoreszenzlicht nur von den in dem fluoreszenten Zustand befindlichen Molekülen emittiert. So kann das Fluoreszenzlicht von den einzelnen vereinzelten Molekülen in dem fluoreszenten Zustand getrennt registriert werden; und die Orte der einzelnen Moleküle können trotz hoher absoluter Dichte der Moleküle in der Probe durch Lokalisierung mit einer Präzision jenseits der Beugungsgrenze bestimmt werden. Eine Abbildung der Verteilung der Moleküle in der Probe und damit der mit ihnen markierten interessierenden Struktur wird schrittweise erreicht, indem die Schritte des Aktivierens eines geringen Anteils der Moleküle, des Anregens dieser aktivierten Moleküle zur Emission von Fluoreszenzlicht und des Registrieren des Fluoreszenzlichts mit einem räumlich auflösenden Detektor, bis die jeweiligen aktivierten Moleküle weggeblichen sind, wiederholt und damit für immer mehr der Moleküle durchgeführt werden, die die interessierende Struktur markieren.
Die WO 2006/127692 A2 beschreibt auch, dass die Aktivierung nur einer Teilmenge der insgesamt vorhandenen Moleküle auf andere Abbildungsverfahren übertragen werden kann. Dabei können durch eine Intensitätsverteilung des Anregungslichts mit durch Minima begrenzten Maxima die vereinzelten Moleküle speziell in bestimmten Ebenen oder anderen räumlichen Untereinheiten der Probe zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt werden.
Das aus der WO 2006/127692 A2 bekannte Verfahren wird auch als PALM, d. h. als photoaktivierte Lokalisierungsmikroskopie, bezeichnet. Ein sehr ähnliches, als STORM (stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie) bezeichnetes Verfahren weist grundsätzlich dieselben Vor- und Nachteile auf.
Aus der US 8,174,692 B2 ist es bekannt, dass auch Moleküle eines normale Farbstoffs, die nicht aktivierbar sind, sondern einen fluoreszenten Ausgangszustand aufweisen, und auch nicht zwischen zwei Konformationszuständen geschaltet werden können, von denen nur einer fluoreszent ist, genutzt werden können, um den Ort einzelner Moleküle durch Lokalisierung zu bestimmen. Dazu wird die Probe mit einer so hohen Intensität von Anregungslicht, das die Moleküle zugleich mit einer gewissen Übergangswahrscheinlichkeit in einen relativ langlebigen elektronischen Dunkelzustand überführt, beaufschlagt, dass sich zwischen den aktuell in dem fluoreszenten Zustand befindlichen Molekülen Abstände oberhalb der Beugungsgrenze einstellen.
Die jeweils in dem fluoreszenten Zustand vorliegenden Moleküle werden von dem Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt, das mit einer Kamera als räumlich auflösendem Detektor registriert wird. Auf diese Weise werden sukzessive verschiedene Moleküle des Farbstoffs lokalisiert, da die Moleküle, von denen bereits Photonen registriert wurden, in den Dunkelzustand gelangen, aus dem andere Moleküle mit einer gewissen Übergangswahrscheinlichkeit in den fluoreszenten Zustand zurückkehren. Dieses bekannte Verfahren kann kontinuierlich durchgeführt werden, d. h. es können fortlaufend Frames aus der Kamera ausgelesen werden, während die Probe mit der hohen Intensität des Anregungslichts beaufschlagt wird, die den Farbstoff im Wesentlichen in dem Dunkelzustand hält und zugleich die dadurch vereinzelten fluoreszenten Moleküle zur Emission von Lumineszenzlicht anregt.
Das aus der US 8,174,692 B2 bekannte Verfahren wird auch als GSDIM (Ground State Depletion Individual Molecule Return Microscopy) bezeichnet.
Ein grundsätzlich anderes Verfahren zum räumlich hochaufgelösten Bestimmen von Orten von mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbaren Molekülen in einer Probe wird bei räumlich hochauflösenden Varianten der Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie angewandt. Bei der Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie basiert die Präzision beim Bestimmen der Orte von fluoreszenten Molekülen in einer Probe auf einer zu jedem Zeitpunkt nur lokalen Anregung der Probe, so dass zu dem jeweiligen Zeitpunkt registriertes Fluoreszenzlicht dem räumlichen Bereich der Anregung zugeordnet werden kann. Wenn die Moleküle in der Probe mit fokussiertem Anregungslicht angeregt werden, setzt die Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Anregungslichts die Untergrenze für die räumlichen Abmessungen des Bereichs der Anregung und damit für die räumliche Auflösung, die bei der Abbildung einer mit den fluoreszenten Molekülen markierten Struktur in der Probe erreichbar ist.
Bei der STED(Stimulated Emission Depletion)-Fluoreszenzlichtmikroskopie wird die mit fokussiertem Anregungslicht bewirkte Anregung von Molekülen, mit denen eine interessierende Struktur einer Probe markiert ist, im Umfeld jedes Messpunkts durch gerichtete Emission wieder beseitigt. Die gerichtete Emission wird mit STED-Licht stimuliert und verhindert die Emission von Fluoreszenzlicht durch die Moleküle. Danach registriertes Fluoreszenzlicht kann nur noch aus dem Bereich stammen, in dem die Anregung mit dem STED-Licht nicht beseitigt wurde. Dieser Bereich, in dem die Anregung nicht beseitigt wird, kann sehr klein gehalten werden, indem er durch eine Nullstelle der Intensitätsverteilung des STED-Lichts definiert wird und die maximale Intensität des STED-Lichts in der Nullstelle benachbarten Intensitätsmaxima hoch gewählt wird, so dass es die Anregung der Moleküle bereits sehr nahe seiner Nullstelle vollständig beseitigt.
Statt eine vorher bewirkte Anregung der Moleküle in Teilen der Probe wieder abzuregen, kann Fluoreszenzverhinderungslicht mit einer eine Nullstelle aufweisenden Intensitätsverteilung auch dazu genutzt werden, fluoreszente Moleküle außerhalb der Nullstelle in einen nicht-fluoreszenten Dunkelzustand zu schalten. Dies erfolgt beispielsweise bei der RESOLFT (Reversible Saturable Optical(Fluorescence) Transitions)-Fluoreszenzlichtmikroskopie oder der GSD(Ground State Depletion)-Fluoreszenzlichtmikroskopie.
Bei den als STED-, RESOLFT- oder GSD-Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie bekannten Verfahren wird jedes Molekül, bereits bevor Fluoreszenzlicht von ihm registriert wird, in den an die Nullstelle des Fluoreszenzverhinderungslichts angrenzenden Bereichen neben dem Anregungslicht mit den dort hohen Intensitäten des Fluoreszenzverhinderungslichts beaufschlagt, die mit einer erheblichen Gefahr des Bleichen der Moleküle verbunden sind. Die Gefahr des Bleichens besteht auch, wenn bei diesen bekannten Verfahren ein vereinzelte, mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbares Molekül in einer Probe mit der Nullstelle des Fluoreszenzverhinderungslichtsverfolgt wird, da dazu die Rate der von dem Molekül emittierten Photonen des Lumineszenzlichts fortlaufend zu maximieren ist.
Aus der WO 2012/171999 A1 ist ein Verfahren bekannt, bei dem eine Probe mit einem Anregungslichtstrahl, der mit einer Intensitätsverteilung von STED-Licht mit einem Minimum am Fokus des Anregungslichtstrahls überlagert ist, so schnell abgetastet wird, dass bei jedem von vielen aufeinanderfolgenden Abtastvorgängen Fluoreszenzlicht nur in Form von einzelnen Photonen registriert wird, die jeweils nur von einem einzelnen Molekül stammen. Die Orte der verschiedenen einzelnen Moleküle, von denen die Photonen stammen, werden den zugehörigen Positionen des Minimums des STED-Lichts in der Probe zugeordnet.
Bei diesem Verfahren werden zwar nur wenige Photonen, im Extremfall nur ein einziges, von jedem Molekül registriert, dem ein Ort in der Probe zugeordnet wird. Die Moleküle werden aber dennoch typischerweise einigen Zyklen von Anregung und stimulierter Emission unterworfen, so dass ihr Bleichen nicht ausgeschlossen ist. Zudem ist mit diesem bekannten Verfahren ein gezieltes Verfolgen eines bestimmten vereinzelten Moleküls nicht sinnvoll möglich.
Aus der DE 10 2011 055 367 A1 ist ein Verfahren zum Verfolgen eines einzelnen fluoreszenten Moleküls bekannt. Das Molekül wird mit Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt und das Fluoreszenzlicht wird registriert. Dabei wird das Anregungslicht mit einer ein lokales Minimum aufweisenden Intensitätsverteilung auf die Probe gerichtet, und das Minimum wird dem sich in der Probe bewegenden Molekül nachgeführt. Zu diesem Zweck wird die Intensitätsverteilung des Anregungslichts fortlaufend so gegenüber der Probe verschoben, dass eine Rate von Photonen des von dem Molekül emittierten Fluoreszenzlichts minimiert wird. Dies bedeutet ein Halten des Moleküls in dem Minimum der Intensitätsverteilung des Anregungslichts, bei dem es sich um eine Nullstelle der Intensitätsverteilung des Anregungslichts handeln kann.
Aus der WO 2015/097000 A1 ist ein Verfahren zum Bestimmen der Orte vereinzelter Moleküle in einer Probe bekannt, wobei sich die vereinzelten Moleküle in einem fluoreszenten Zustand befinden, in dem sie mit Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht anregbar sind, und wobei Abstände der vereinzelten Moleküle der Substanz einen Mindestwert einhalten. Die vereinzelten Moleküle werden mit dem Anregungslicht zur Emission des Fluoreszenzlichts angeregt, wobei eine Intensitätsverteilung des Anregungslichts eine Nullstelle aufweist. Das Fluoreszenzlicht von den angeregten vereinzelten Molekülen der Substanz wird für verschiedene Positionen der Nullstelle der Intensitätsverteilung des Anregungslichts in der Probe registriert. Dabei sind Abstände zwischen nächstbenachbarten Positionen der Nullstelle nicht größer als der halbe Mindestwert des Abstands der vereinzelten Moleküle. Konkret wird die Probe mit der Nullstelle abgetastet, wobei ein Rastermaß beim Abtasten der Probe nicht größer als der halbe Mindestwert ist. Die Orte der vereinzelten Moleküle in der Probe werden aus einem Verlauf der Intensität des Fluoreszenzlichts von dem jeweiligen vereinzelten Molekül über den Positionen der Nullstelle der Intensitätsverteilung des Anregungslichts abgeleitet. Dabei kann eine Funktion mit Nullstelle an den Verlauf der Intensität des Lumineszenzlichts von dem jeweiligen vereinzelten Molekül angefittet werden; und der Ort des jeweiligen Moleküls kann der Position der Nullstelle der angefitteten Funktion gleichgesetzt werden. Die Funktion kann eine quadratische Funktion sein. Die angefittete Funktion kann aber auch individuell an den Intensitätsverlauf des Lumineszenzlichts von einem vereinzelten Molekül der jeweiligen Substanz als Antwort auf den Intensitätsverlauf des Anregungslichts im Umfeld seiner Nullstelle angepasst werden.
Bei dem aus der WO 2015/097000 A1 bekannten Verfahren wird das jeweilige vereinzelte Molekül, bevor es beim Abtasten der Probe in die Nähe der Nullstelle der Intensitätsverteilung des Anregungslichts gerät, den höheren Intensitäten der angrenzenden Intensitätsmaxima des Anregungslichts ausgesetzt. Diese Intensitäten überschreiten eine Sättigungsintensität des Anregungslichts, oberhalb derer es zu keiner Steigerung der Intensität des Lumineszenzlichts von dem jeweiligen vereinzelten Molekül mehr kommt, so dass dessen Verlauf bei einem Sättigungswert konstant und damit ohne Informationsinhalt ist. Entsprechend werden von jedem vereinzelten Molekül der Substanz sehr viele Photonen emittiert, bevor die Photonen emittiert werden, aus denen der Ort des Moleküls bestimmt wird. Hierdurch besteht eine erhebliche Gefahr des Bleichens des Moleküls, selbst wenn an jeder Position der Nullstelle des Anregungslichts nur eine begrenzte Anzahl von Photonen registriert wird, bevor die Nullstelle weiter verschoben wird.
Aus der DE 10 2010 028 138 A1 ist ein Verfahren zum Bestimmen der Verteilung einer Substanz in einem Messgebiet durch Abtasten mit einer Messfront bekannt. Über eine Tiefe der Messfront, die kleiner als die Beugungsgrenze bei der Wellenlänge eines optischen Signals ist, steigt die Intensität des optischen Signals derart an, dass ein Anteil der Substanz in einem Messzustand zunächst von nicht vorhanden anwächst und dann wieder auf nicht vorhanden abfällt. Die Messfront wird in Gegenrichtung zu dem Anstieg der Intensität des optischen Signals über das Messgebiet verschoben. Das Messsignal, bei dem es sich um Fluoreszenzlicht handeln kann, wird erfasst und der jeweiligen Position der Messfront in dem Messgebiet zugeordnet.
AUFGABE DER ERFINDUNG
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum räumlich hochauflösenden Bestimmen des Orts eines vereinzelten, mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbaren Moleküls in einer Probe aufzuzeigen, wobei das Molekül ist, bei dem die Anzahl der Photonen, zu deren Emission das vereinzelte Molekül angeregt werden muss, bezogen auf die erreichte Präzision verglichen mit den bekannten Verfahren zum räumlich hochauflösenden Bestimmen des Orts eines vereinzelten Moleküls deutlich verringert ist.
LÖSUNG
Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 gelöst. Die abhängigen Patentansprüche 2 bis 20 betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Patentansprüche 21 und 22 betreffen wiederholte Durchführungen des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Bestimmen des Orts einer Vielzahl von nacheinander vereinzelten Molekülen bzw. zum Tracken des vereinzelten Moleküls; und Patentanspruch 23 betrifft eine Verwendung eines STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskops zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung geht aus von einem aus der WO 2015/097000 A1 bekannten Verfahren zum räumlich hochauflösenden Bestimmen des Orts eines vereinzelten Moleküls in einer oder mehreren Raumrichtungen in einer Probe, wobei das Molekül mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbar ist. Wie bei dem Ausgangsverfahren wird das Anregungslicht mit einer Intensitätsverteilung auf die Probe gerichtet, die eine Nullstelle und Intensitätsanstiegsbereiche aufweist, welche in jeder der Raumrichtungen beidseitig an die Nullstelle angrenzen. Zu jeder von verschiedenen Positionen der Nullstelle in der Probe wird das von dem Molekül emittierte Lumineszenzlicht registriert; und der Ort des Moleküls in der Probe wird von Intensitäten des zu den verschiedenen Positionen der Nullstelle registrierten Lumineszenzlichts abgeleitet.
Abweichend von dem bekannten Verfahren wird die Nullstelle erfindungsgemäß an nicht mehr als n × 3 verschiedenen Positionen in der Probe angeordnet, um den Ort des Moleküls in den n Raumrichtungen von den registrierten Intensitäten des Lumineszenzlichts abzuleiten. Tatsächlich hat es sich herausgestellt, dass der Ort des Moleküls in der Probe in den n Raumrichtungen bei sinnvoller Wahl der Positionen der Nullstelle in der Probe aus nicht mehr als den zu n × 3 verschiedenen Positionen registrierten Intensitäten des Lumineszenzlichts mit einer Präzision abgeleitet werden kann, die der beim räumlichen Abtasten eines den Ort des Moleküls umfassenden Ortsbereich in der Probe um nichts nachsteht. Zudem kann bei geschickter Wahl der Positionen, wie sie im Folgenden näher erläutert wird, diese Präzision schon erreicht werden, wenn die Nullstelle an nicht mehr als (n × 2) + 1 oder sogar nur an n + 2 verschiedenen Positionen in der Probe angeordnet wird. Dabei ist es häufig nicht einmal erforderlich, die Anzahl der Photonen des zu jeder Position der Nullstelle in der Probe registrierten Lumineszenzlichts gegenüber der Anzahl von Photonen zu erhöhen, die sinnvoller Weise beim räumlichen Abscannen der Probe an jeder Position der Nullstelle registriert wird.
So wird der Ort des vereinzelten Moleküls in der Probe bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in jeder Raumrichtung sehr schnell, d. h. auf Basis einer geringen Anzahl von von dem vereinzelten Molekül emittierten und registrierten Photonen, bestimmt. Die Präzision, mit der der Ort des vereinzelten Moleküls bestimmt wird, kann problemlos 10 nm und damit die Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Lumineszenzlichts deutlich unterschreiten.
Wie schon angesprochen wurde, wird die Probe bei dem erfindungsgemäßen Verfahren auch in einem begrenzten Ortsbereich der Probe, in dem das Molekül vermutet wird, nicht räumlich abgetastet, sondern die Nullstelle wird nur in wenigen Positionen relativ zu diesem Ortsbereich positioniert.
Dass das erfindungsgemäße Verfahren zum räumlich hochaufgelösten Bestimmen des Orts des vereinzelten Moleküls dient, bedeutet, wie sich aus der erreichbaren Präzision von 10 nm und deutlich besser unschwer besser ablesen lässt, dass insbesondere eine räumliche Auflösung deutlich unterhalb der Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Anregungslichts und auch des Lumineszenzlichts erreicht wird. In diesem Zusammenhang sei angemerkt, dass die Formulierung "räumliche Auflösung" hier als Synonym für die Präzision verwendet wird, mit der der Ort des jeweiligen vereinzelten Moleküls in der Probe bestimmt wird.
Dass das erfindungsgemäße Verfahren zum Bestimmen des Orts eines vereinzelten Moleküls dient, bedeutet, wie bereits eingangs angesprochen wurde, dass der Ort des vereinzelten Moleküls einen Mindestabstand zu nächstbenachbarten gleichartigen Molekülen einhält, die mit demselben Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht im selben Wellenlängenbereich anregbar sind, so dass das Lumineszenzlicht von den nächstbenachbarten gleichartigen Molekülen nicht aufgrund verschiedener Wellenlängen getrennt werden kann. Dieser Mindestabstand ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren von der Größenordnung der Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Lumineszenzlichts oder kleiner. Tatsächlich kann der Mindestabstand wie bei dem Ausgangsverfahren gemäß der WO 2015/097000 A1 auch erheblich kleiner als die Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Lumineszenzlichts sein, solange er nicht kleiner als eine Ausdehnung eines der an die Nullstelle angrenzenden Intensitätsanstiegsbereiche in der jeweiligen Raumrichtung ist, über der die Intensität des Anregungslichts unter einer Sättigungsintensität und damit die Intensität des Lumineszenzlichts von dem Molekül unterhalb eines Sättigungswerts bleibt. Wenn der Abstand des vereinzelten Moleküls zu nächstbenachbarten, mit dem Anregungslicht anregbaren Molekülen größer als die Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Lumineszenzlichts ist, kann das von dem vereinzelten Molekül emittierte Lumineszenzlicht mit einem räumlich auflösenden Detektor räumlich getrennt von dem Lumineszenzlicht registriert werden, das von ihm nächstbenachbarten Molekülen emittiert wird. Wenn der Abstand der vereinzelten Moleküle zumindest nicht kleiner als der von dem Intensitätsanstiegsbereich in Bezug auf die Intensität des Lumineszenzlichts von den Molekülen beeinflusste Bereich der Intensitätsverteilung des Anregungslichts ist, kann die Differenz der Intensität des Lumineszenzlichts zu dem Sättigungswert bei der Sättigungsintensität des Anregungslichts unmittelbar dem vereinzelten Molekül zugeordnet werden, weil es sich das Molekül dann allein in diesem von dem Intensitätsanstiegsbereich beeinflussten Bereich befindet.
Dass das vereinzelte Molekül mit dem Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbar ist, bedeutet, dass das vereinzelte Molekül photolumineszent ist. Konkret kann das vereinzelte Molekül fluoreszent, d. h. mit dem Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht anregbar sein. An dieser Stelle sei angemerkt, dass die Angabe "lumineszent" oder auch "fluoreszent" hier nur angibt, das das vereinzelte Molekül mit dem Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht bzw. Fluoreszenzlicht anregbar ist, nicht aber, dass es bereits luminesziert bzw. fluoresziert, d. h. angeregt ist.
Dass das Anregungslicht mit einer Intensitätsverteilung auf die Probe gerichtet wird, die eine Nullstelle und Intensitätsanstiegsbereiche aufweist, welche in jeder der Raumrichtungen beidseitig an die Nullstelle angrenzen, kann bedeuten, dass die Nullstelle mit den angrenzenden Intensitätsanstiegsbereichen durch in unterschiedlichem Abstand zu der Nullstelle unterschiedlich stark ausgeprägte destruktive Interferenz ausgeformt wird. Über jeden der an die Nullstelle angrenzenden Intensitätsanstiegsbereich steigt die Intensität des Anregungslichts mit zunehmendem Abstand zu der Nullstelle streng monoton, das heißt kontinuierlich an.
Die Nullstelle kann eine durch Interferenz gebildete Ideale Nullstelle sein, in der die Intensität des Anregungslichts tatsächlich auf null zurückgeht. Eine geringe Restintensität des Anregungslichts in der Nullstelle ist jedoch unschädlich, zumal es nicht Ziel des erfindungsgemäßen Verfahren ist, die Nullstelle so in der Probe zu positionieren, dass ihre Position mit dem Ort des Moleküls in der Probe zusammenfällt. Aus demselben Grund kann die von den Intensitätsanstiegsbereichen begrenzte Nullstelle grundsätzlich auch durch in der jeweiligen Raumrichtung beabstandete gaußförmige Intensitätsverteilungen, konkret durch das zwischen diesen verbleibende Intensitätsminimum, ausgebildet werden.
Auch mit einer flächenförmigen Nullstelle mit nur in einer einzigen Raumrichtung verlaufenden Intensitätsanstiegsbereichen kann der Ort des Moleküls in der Probe in zwei oder allen drei Raumrichtungen hoch aufgelöst bestimmt werden. Ebenso kann mit einer linienförmigen Nullstelle mit nur in zwei Raumrichtungen verlaufenden Intensitätsanstiegsbereichen der Ort des vereinzelten Moleküls in der Probe nicht nur in diesen zwei sondern auch in allen drei Raumrichtungen hoch aufgelöst bestimmt werden. Dazu ist das erfindungsgemäße Verfahren unter Ausrichtung des oder der Intensitätsanstiegsbereiche in unterschiedlichen Raumrichtungen durchzuführen.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann der Ortsbereich, in dem das Molekül mutmaßlich angeordnet ist und dem gegenüber die wenigen Positionen der Nullstelle anzuordnen sind, auf unterschiedliche Weise bestimmt werden. Beispiele hierfür werden weiter unten angegeben.
Beim Ableiten des Orts des Moleküls in der Probe von den zu den verschiedenen Positionen der Nullstelle registrierten Intensitäten des Lumineszenzlichts, ist die Abhängigkeit der Intensität des Lumineszenzlichts, das von dem vereinzelten Molekül emittiert wird, von dem Abstand des vereinzelten Moleküls zu der Nullstelle der Intensitätsverteilung des Anregungslichts zu berücksichtigen. Diese Abhängigkeit hängt von dem Verlauf der Intensität des Anregungslichts in den an die Nullstelle angrenzenden Intensitätsanstiegsbereich und auch von dem photophysikalischen Prozess ab, der der Anregung des Moleküls zur Emission des Lumineszenzlichts zugrunde liegt. So ergibt sich bei einer durch destruktive Interferenz gebildeten Nullstelle und einer Photolumineszenz des Moleküls aufgrund eines Einphotonenprozesses näherungsweise eine quadratische Abhängigkeit der Intensität des von dem Molekül emittierten Lumineszenzlichts von dessen Abstand zu der Nullstelle. Bei einer Photolumineszenz auf Basis eines Zweiphotonenprozesses ist die Abhängigkeit noch ausgeprägter und folgt einer Funktion x⁴. Faktisch muss bei dem erfindungsgemäßen Verfahren der Verlauf der Intensität des Anregungslichts in den an die Nullstellen angrenzenden Intensitätsanstiegsbereichen nur insoweit bekannt sein, wie er sich auf die Intensität des Lumineszenzlichts von dem Molekül auswirkt. D. h., die Abhängigkeit der Intensität des Lumineszenzlichts vom Abstand des Moleküls zu der Nullstelle muss bekannt sein, um sie beim Ableiten des Orts des Moleküls in der Probe berücksichtigen zu können. Diese Abhängigkeit lässt sich aber leicht bestimmen, beispielsweise empirisch durch einmaliges Abtasten der Umgebung eines vereinzelten Moleküls mit der Nullstelle in kleinen Schritten.
Konkret kann der Ort des Moleküls von den zu den verschiedenen Positionen der Nullstelle registrierten Intensitäten des Lumineszenzlichts abgeleitet werden, indem an diese Intensitäten eine Funktion angefittet wird, die den Verlauf der Intensität des Lumineszenzlichts von dem Molekül über dem Abstand des Moleküls von der Nullstelle in den verschiedenen Raumrichtungen beschreibt und eine Nullstelle aufweist. Der Ort des Moleküls kann der Lage der Nullstelle der angefitteten Funktion in der Probe gleichgesetzt werden.
Dass der Ort des Moleküls von den zu den verschiedenen Positionen der Nullstelle registrierten Intensitäten des Lumineszenzlichts abgeleitet wird, schließt nicht nur die Möglichkeit ein, verschiedene Raten von Photonen des Lumineszenzlichts zu berücksichtigen, sondern auch die Möglichkeit, zeitliche Abstände der registrierten Photonen zu betrachten. Dabei versteht es sich, dass der Mittelwert der zeitlichen Abstände der registrierten Photonen gleich dem Kehrwert der Rate der zu einer Position der Nullstelle registrierten Photonen des Lumineszenzlichts ist.
Zusätzlich zu den Intensitäten des zu den verschiedenen Positionen der Nullstelle registrierten Lumineszenzlichts kann beim Ableiten des Orts des Moleküls ein Maß für die relative Leuchtstärke des vereinzelten Moleküls berücksichtigt werden. Bei diesem Maß kann es sich konkret um eine Maximalintensität des Lumineszenzlichts von dem Molekül bei Anregung mit dem Anregungslicht oder um einen hiermit unmittelbar korrelierter Intensitätswert handeln. Die Maximalintensität oder der damit korrelierte Intensitätswert kann für das jeweilige vereinzelte Molekül konkret gemessen oder auch für alle potentiellen vereinzelten Moleküle mit einem bestimmten Wert abgeschätzt werden.
Um mit einer besonders kleinen Anzahl von verschiedenen Positionen auszukommen, an denen die Nullstelle in der Probe angeordnet wird, können die verschiedenen Positionen so angeordnet werden, dass sie in jeder Raumrichtung, in der der Ort des Moleküls in der Probe bestimmt wird, je eine Position auf beiden Seiten eines Zentrums des Ortsbereichs in der Probe umfassen, in dem das Molekül angeordnet ist. Dies bedeutet jedoch nicht, dass je Raumrichtung zwei separate Positionen der Nullstelle vorgesehen werden müssen. So umfassen auch drei, in den Ecken eines insbesondere gleichschenkligen Dreieckes angeordnete Positionen in einer Ebene, in jeder beliebigen Raumrichtung innerhalb der Ebene mindestens zwei Positionen, die auf unterschiedlichen Seiten des Mittelpunkts des Dreiecks angeordnet sind. Entsprechend verhält es sich mit einem gleichseitigen Tetraeder in Bezug auf alle möglichen Raumrichtungen.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es weiterhin bevorzugt, wenn die verschiedenen Positionen, an denen die Nullstelle in der Probe angeordnet wird, in jeder Raumrichtung, in der der Ort des Moleküls in der Probe bestimmt wird, neben den beiden Positionen auf beiden Seiten des Zentrums des Ortsbereichs eine Position in dem Zentrum dieses Ortsbereichs umfassen. Diese eine Position im Zentrum des Ortsbereichs kann dabei für alle Raumrichtungen dieselbe sein.
Konkret können die verschiedenen Positionen, an denen die Nullstelle in der Probe angeordnet wird, in dem Fall, dass der Ort des Moleküls in zwei Raumrichtungen bestimmt wird, eine zentrale Position und drei periphere Positionen, also insgesamt vier Positionen sein, wobei die peripheren Positionen in einer von den beiden Raumrichtungen aufgespannten und durch die zentrale Position verlaufenen Ebene äquidistant auf einem Kreisbogen um die zentrale Position angeordnet sind. Anders gesagt liegen die drei peripheren Positionen in den Ecken eines gleichseitigen Dreiecks, und die zentrale Position liegt im Mittelpunkt des Dreiecks.
Wenn der Ort des Moleküls in allen drei Raumrichtungen bestimmt wird, können die verschiedenen Positionen, an denen die Nullstelle in der Probe angeordnet wird, eine zentrale Position und vier periphere Positionen sein, wobei die peripheren Positionen äquidistant auf einer Kugelschale um die zentrale Position angeordnet sind. Anders gesagt liegen die peripheren Positionen dann in den Ecken eines gleichseitigen Tetraeders, und die zentrale Position liegt im Mittelpunkt des Tetraeders.
Wie bereits angesprochen wurde, sollte sich der gesamte Ortsbereich der Probe, in dem das Molekül vermutet wird, relativ zu jeder Position der Nullstelle in einem Bereich der Intensitätsverteilung des Anregungslichts befinden, in dem die Intensitäten in den an die Nullstelle angrenzenden Intensitätsanstiegsbereichen unter der Sättigungsintensität des Anregungslichts bleiben, über der eine weitere Erhöhung der Intensität des Anregungslichts keine höhere Intensität des Lumineszenzlichts von dem vereinzelten Molekül mehr zur Folge hat. Bevorzugt ist es bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, wenn eine maximale Intensität, d. h. ein absolutes Intensitätsniveau des Anregungslichts jeweils so eingestellt wird, dass ein maximaler Abstand jeder Position der Nullstelle zu jedem Punkt zwischen den Positionen der Nullstelle in der Probe nicht größer als eine Ausdehnung jedes Intensitätsanstiegsbereichs in Richtung des Abstands ist. Noch mehr bevorzugt ist der maximale Abstand nicht größer als eine Ausdehnung jedes Intensitätsanstiegsbereichs in Richtung des Abstands, über der die Intensität des Anregungslichts bis auf 90 % einer Sättigungsintensität des Anregungslichts ansteigt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können die an die Nullstelle angrenzenden Intensitätsanstiegsbereiche rotationssymmetrisch um die Nullstelle ausgebildet sein. Zumindest kann diese rotationssymmetrische Ausbildung in einer Hauptebene orthogonal zu der Richtung vorliegen, in der das Anregungslicht in die Probe gerichtet wird. Es ist aber auch möglich, das Anregungslicht hinsichtlich seiner Wellenlänge und/oder Polarisation und/oder die an die Nullstelle angrenzenden Intensitätsbereiche hinsichtlich des Verlaufs der Intensität des Anregungslichts in den verschiedenen Raumrichtungen abhängig von der jeweiligen Position der Nullstelle unterschiedlich auszubilden. Hiermit kann insbesondere das Ziel verfolgt werden, den Ort des Moleküls an jedem Punkt zwischen den Positionen der Nullstelle in jeder Raumrichtung mit derselben Präzision zu bestimmen. Es versteht sich zwar, dass hiermit die in bestimmten Raumrichtungen maximal möglichen Präzisionen bei der Bestimmung des Orts des vereinzelten Moleküls nicht ausgeschöpft werden. Umgekehrt erscheint jedes vereinzelte Molekül bei Wiedergabe seines Orts mit einem Punkt von der Ausdehnung der erreichten Präzision nur dann als kleiner Kreis beziehungsweise Kugel, wenn diese Präzision in allen Raumrichtungen gleich ist.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das Lumineszenzlicht zu den verschiedenen Positionen der Nullstelle in der Probe quasi gleichzeitig registriert werden, indem die Nullstelle wiederholt zwischen den Positionen in der Probe verschoben wird. Zu diesem Zweck kann dieselbe Intensitätsverteilung des Anregungslichts mit Hilfe eines Scanners verschoben werden kann. Es ist aber auch möglich, die Intensitätsverteilung für jede der verschiedenen Positionen ihrer Nullstelle in der Probe neu auszubilden, beispielsweise mit Hilfe eines im Strahlengang des Anregungslichts angeordneten Spatial Light Modulators (SLM). Dann kann zumindest insoweit auf einen Scanner verzichtet werden. Weiterhin ist es möglich, die Nullstelle in der Probe zu verschieben, indem das Anregungslicht nacheinander durch ganz oder teilweise verschiedene Lichtquellen bereitgestellt wird. Bei allen diesen möglichen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Nullstelle zwischen ihren Positionen in der Probe wiederholt hin und her verschoben werden. Es versteht sich, dass dabei das zu den einzelnen Positionen der Nullstelle gehörige Lumineszenzlicht von dem Molekül getrennt registriert wird. Das quasi gleichzeitige Registrieren des Lumineszenzlichts zu den verschiedenen Positionen der Nullstelle hat den Vorteil, dass das Beaufschlagen der Probe mit dem Anregungslicht und das Registrieren des Lumineszenzlichts von der Probe sofort abgebrochen werden kann, wenn es die zu den einzelnen Positionen der Nullstelle registrierten Photonen des Lumineszenzlichts bereits erlauben, den Ort des Moleküls mit einer gewünschten Präzision von den zu den verschiedenen Positionen der Nullstelle registrierten Intensitäten des Lumineszenzlichts abzuleiten.
Ein entsprechendes Abbruchkriterium kann zwar auch bei einem kontinuierlichen Registrieren des Lumineszenzlichts zu jeder Position der Nullstelle in der Probe angewandt werden. Es gibt jedoch Fälle, in denen die Betrachtung der Intensitäten des zu allen Nullstellen registrierten Lumineszenzlichts schon nach insgesamt weniger Photonen von dem Molekül erkennen lässt, dass der Ort des Moleküls mit einer gewünschten Präzision ableitbar ist.
Wenn bei dem erfindungsgemäßen Verfahren das Lumineszenzlicht zu den Positionen der Nullstelle der Intensitätsverteilung des Anregungslichts jeweils nur solange registriert wird, bis die Intensitäten des registrierten Lumineszenzlichts zu den Positionen mit einer ausreichenden Genauigkeit erfasst sind, dass der Ort des Moleküls mit einer mit einer gewünschten Präzision ableitbar ist, kann diese gewünschte Präzision im Bereich von 20 nm oder kleiner liegen. Sie kann auch kleiner als 10 nm sein. Auch eine gewünschte Präzision in der Größenordnung von 1 nm und damit herab bis zu 0,5 nm ist möglich. Grundsätzlich weist das erfindungsgemäße Verfahren keine inhärente Grenze für die bei der Bestimmung des Orts des vereinzelten Moleküls in der Probe erreichbare Präzision auf. Im jeweiligen Einzelfall auftretende Verhältnisse, wie beispielsweise ein abnehmendes Signal-zu-Rauschen-Verhältnis können jedoch die praktisch erreichbare Präzision begrenzen.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann zu Beginn des Bestimmens des Orts des vereinzelten Moleküls ein das vereinzelte Molekül umfassender Bereich der Probe in jeder der Raumrichtungen mit der Nullstelle abgetastet werden, wobei aus dem Verlauf der Intensität des Lumineszenzlichts während des Abtastens der Ort des vereinzelten Moleküls abgeschätzt und der abgeschätzte Ort dem Festlegen der Positionen der Nullstelle in der Probe zugrunde gelegt wird. Dieses räumliche Abtasten zumindest eines Bereichs der Probe kann mit vergleichsweise geringer Intensität des Anregungslichts und in vergleichsweise großen räumlichen und kleinen zeitlichen Schritten durchgeführt werden, weil der Ort des Moleküls, d. h. ein begrenzter Ortsbereich, in dem sich das Molekül mutmaßlich befindet, hieraus nur grob abgeschätzt werden muss. Statt mit der Nullstelle der Intensitätsverteilung des Anregungslichts kann der das vereinzelte Molekül umfassende Bereich der Probe zu Beginn des Bestimmens des Orts des vereinzelten Moleküls mit einer gaußförmigen Intensitätsverteilung des Anregungslichts, d. h. mit einem einfachen fokussierten Strahl des Anregungslichts, in jeder der Raumrichtungen abgetastet werden. Dies entspricht einer konfokal-mikroskopischen Abbildung des vereinzelten Moleküls in der Probe.
In einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zu Beginn des Bestimmens des Orts des vereinzelten Moleküls das Anregungslichts mit einer gaußförmigen Intensitätsverteilung nur punktweise oder auf Kreis- oder Spiralbahnen auf einen das vereinzelte Molekül umfassenden Bereich der Probe gerichtet, wobei der der Ort des vereinzelten Moleküls aus dem Verlauf der Intensität des Lumineszenzlichts über den Punkten bzw. Bahnen abgeschätzt und der abgeschätzte Ort dem Festlegen der Positionen der Nullstelle in der Probe zugrunde gelegt wird. Um dabei die Anzahl der von dem vereinzelten Molekül emittierten Photonen des Lumineszenzlichts zu begrenzen, ist die gaußförmige Intensitätsverteilung sehr schnell zu bewegen und/oder bezüglich der maximalen Intensität des Anregungslichts klein zu halten. Bei dem Bewegen der gaußförmigen Intensitätsverteilung auf Kreis- oder Spiralbahnen kann der Intensitätsanstiegsbereich in der Peripherie der gaußförmigen Intensitätsverteilung des Anregungslichts genutzt werden, um das vereinzelte Molekül mit nur geringer Intensität des Anregungslichts zu beaufschlagen, die aber ausreichend ist, um einen begrenzten Ortsbereich, in dem sich das Molekül mutmaßlich befindet, durch Lokalisierung des Moleküls zu bestimmen.
Bei noch einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zu Beginn des Bestimmens des Orts des vereinzelten Moleküls ein das vereinzelte Molekül umfassender Bereich der Probe räumlich, d. h. insgesamt, mit dem Anregungslicht beaufschlagt und auf einen das Lumineszenzlicht mit räumlicher Auflösung registrierenden Detektor, wie beispielsweise eine Kamera, abgebildet. Dann kann aus einer räumlichen Verteilung des mit dem Detektor registrierten Lumineszenzlichts der Ort des vereinzelten Moleküls abgeschätzt und der abgeschätzte Ort dem Festlegen der Positionen der Nullstelle in der Probe zugrunde gelegt werden. Da ein begrenzter Ortsbereich, in dem sich das Molekül mutmaßlich befindet, bei dieser Abschätzung noch nicht besonders eingeengt werden muss, reichen hierfür wenige Photonen von dem vereinzelten Molekül aus.
Bei allen hier geschilderten, zu Beginn des Bestimmens des Orts des vereinzelten Moleküls durchführbaren Schritten, um den Ort des Moleküls abzuschätzen bzw. eine begrenzten Ortsbereich zu bestimmen, in dem sich das Molekül mutmaßlich befindet, kann zugleich eine Maximalintensität des Lumineszenzlichts von dem Molekül bei Anregung mit dem Anregungslicht oder ein damit korrelierter Intensitätswert erfasst werden, die/der ein Maß für die relative Leuchtstärke des vereinzelten Moleküls ist.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das Lumineszenzlicht auch grundsätzlich mit einem räumlich auflösenden Detektor, wie beispielsweise einer Kamera, aber auch einem kleineren Array von beispielsweise nur 2 × 2 oder 3 × 3 Punktsensoren, registriert werden. Aus der Summe der über die verschiedenen Positionen der Nullstelle registrierten Photonen des Lumineszenzlichts von dem vereinzelten Molekül kann dessen Position zusätzlich durch Lokalisierung bestimmt werden. Dabei kann ein sich bei der Lokalisierung ergebender anderer Ort des Moleküls in der Probe auf eine bestimmte Orientierung des Moleküls in der Probe hinweisen, weil zwar die Lokalisierung zur Bestimmung des Orts des Moleküls in der Probe von dessen Orientierung beeinflusst wird, nicht aber die erfindungsgemäße Bestimmung des Orts des Moleküls in der Probe. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kommt es nicht darauf an, wo das jeweilige von dem Molekül emittierte Photon registriert wird. Entsprechend kann das Lumineszenzlicht bei dem erfindungsgemäßen Verfahren auch mit einem Punktdetektor registriert werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Probe vor dem Bestimmen des Orts des vereinzelten Moleküls mit einem Schaltsignal beaufschlagt werden, das das Molekül von benachbarten gleichartigen Molekülen vereinzelt, indem es die benachbarten gleichartigen Moleküle – im Gegensatz zu dem vereinzelten Molekül – in einen Dunkelzustand schaltet, in dem sie mit dem Anregungslicht nicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbar sind. Dieser Dunkelzustand kann ein anderer Konformationszustand der Moleküle sein, der nicht lumineszent ist. Es kann sich aber auch um einen elektronischen Dunkelzustand handeln. Alternativ kann das Schaltsignal nur das zu vereinzelnde Molekül in einen lumineszenten Zustand schalten. Das Schaltsignal kann Schaltlicht mit einer anderen Wellenlänge und Intensität als das Anregungslicht sein. Es kann aber auch dieselbe Wellenlänge wie und nur eine andere Intensität als das Anregungslicht aufweisen. Grundsätzlich kann das Schaltsignal auch das Anregungslicht selbst sein.
Eine wiederholte Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit kleiner werdenden Abständen der Positionen der Nullstelle in der Probe, wobei die Positionen der Nullstelle in der Probe bei jeder Wiederholung des Verfahrens um den Ort des Moleküls in der Probe herum angeordnet werden, der bei der vorherigen Durchführung des Verfahrens von den registrierten Intensitäten des Lumineszenzlichts abgeleitet wurde, kann zur iterativen Steigerung der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erreichten Präzision dienen. Mit den kleiner werdenden Abständen der Positionen der Nullstelle in der Probe kann die maximale Intensität des Anregungslichts erhöht werden. Auf diese Weise kann der kleiner werdende begrenzte Ortsbereich, in das Molekül mutmaßlich befindet, wieder auf die volle Bandbreite der unterschiedlichen Intensitäten des Anregungslichts in den Intensitätsanstiegsbereichen und damit auf die volle Bandbreite der unterschiedlichen Intensitäten des Lumineszenzlichts von dem vereinzelten Molekül aufgeteilt werden.
Eine wiederholte Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann auch zum Bestimmen des Orts einer Vielzahl von nacheinander vereinzelten, mit Anregungslicht zur Emission des Lumineszenzlichts anregbaren Molekülen genutzt werden, die eine interessierende Struktur in der Probe markieren. In einer anderen Ausführungsform dient eine wiederholte Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Verfolgen des sich in der Probe bewegenden vereinzelten Moleküls. Dabei kann der begrenzte Ortsbereich, in dem sich das Molekül mutmaßlich befindet, bei jeder Wiederholung des erfindungsgemäßen Verfahrens der zuvor bestimmte Ort des Moleküls plus ein diesen umgebender Fehlerbereich sein. Die Breite dieses Fehlerbereichs ist auf die maximale Bewegungsgeschwindigkeit des Moleküls in der Probe abzustimmen.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann ein STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskop verwendet werden, wobei das durch das STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskop bereitgestellte STED-Licht mit einer von Intensitätsmaxima benachbarten Nullstelle als das Anregungslicht verwendet wird.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibung genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile zwingend von erfindungsgemäßen Ausführungsformen erzielt werden müssen. Ohne dass hierdurch der Gegenstand der beigefügten Patentansprüche verändert wird, gilt hinsichtlich des Offenbarungsgehalts der ursprünglichen Anmeldungsunterlagen und des Patents Folgendes: weitere Merkmale sind den Zeichnungen – insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung – zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen der Erfindung entfallen.
Die in den Patentansprüchen und der Beschreibung genannten Merkmale sind bezüglich ihrer Anzahl so zu verstehen, dass genau diese Anzahl oder eine größere Anzahl als die genannte Anzahl vorhanden ist, ohne dass es einer expliziten Verwendung des Adverbs "mindestens" bedarf. Wenn also beispielsweise von einem vereinzelten Molekül die Rede ist, ist dies so zu verstehen, dass genau ein vereinzeltes Molekül, zwei vereinzelte Moleküle oder mehr vereinzelte Moleküle vorhanden sind, deren Orte bestimmt werden. Die in den Patentansprüchen angeführten Merkmale können durch andere Merkmale ergänzt werden oder die einzigen Merkmale sein, die der beanspruchte Gegenstand aufweist.
Die in den Patentansprüchen enthaltenen Bezugszeichen stellen keine Beschränkung des Umfangs der durch die Patentansprüche geschützten Gegenstände dar. Sie dienen lediglich dem Zweck, die Patentansprüche leichter verständlich zu machen.
Weitere Informationen zu möglichen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können der WO 2015/097000 A1 entnommen werden. Alles was dort offenbart ist und nicht im Widerspruch zu der vorliegenden Erfindung steht, kann auch bei der Umsetzung der vorliegenden Erfindung realisiert werden.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
Im Folgenden wird die Erfindung anhand in den Figuren dargestellter bevorzugter Ausführungsbeispiele weiter erläutert und beschrieben.
1 zeigt schematisch ein STED-Mikroskop, das zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Bestimmen des Orts eines vereinzelten, mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbaren Moleküls verwendbar ist.
2 zeigt einen Schnitt durch eine Intensitätsverteilung von Anregungslicht mit einer von Intensitätsmaxima benachbarten Nullstelle, das bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dem STED-Mikroskop gemäß 1 auf eine Probe gerichtet wird, und resultierende Intensitäten von Lumineszenzlicht, das von dem an den jeweiligen Ort in der Probe angeordneten lumineszenten Molekül emittiert wird.
3 illustriert eine Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in Bezug auf einen begrenzten zweidimensionalen Ortsbereich in der Probe, in dem sich das vereinzelte Molekül mutmaßlich befindet.
4 illustriert die Zusammenhänge zwischen unterschiedlichen Intensitäten des bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zu verschiedenen Positionen der Nullstelle der Intensitätsverteilung des Anregungslichts in der Probe registrierten Lumineszenzlichts.
5 ist ein Blockdiagramm einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.
FIGURENBESCHREIBUNG
1 zeigt schematisch ein STED-Fluoreszenzlicht-Mikroskop 1, mit dem ein erfindungsgemäßes Verfahren durchführbar ist. Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden nicht notwendigerweise alle Bestandteile des STED-Fluoreszenzlichtmikroskops 1 verwendet. Das STED-Fluoreszenzlichtmikroskop 1 umfasst jedoch alle Bestandteile, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens notwendig sind. Eine Lichtquelle 2, die bei der üblichen Verwendung des STED-Fluoreszenzlichtmikroskops 1 STED-Licht bereitstellt, stellt bei der Verwendung des STED-Fluoreszenzlichtmikroskops 1 zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens Anregungslicht 3 bereit. Mit Strahlformungsmitteln 4 wird das Anregungslicht 3 so geformt, dass es im Fokus eines Objektivs 5 eine Intensitätsverteilung mit mindestens einem Intensitätsanstiegsbereich aufweist. In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weist das Anregungslicht 3 im Fokus des Objektivs 5 eine Intensitätsverteilung mit einer Nullstelle auf, der in allen Raumrichtungen, in denen der Ort eines vereinzelten Moleküls in einer Probe 6 bestimmt werden soll, Intensitätsmaxima auf beiden Seiten benachbart sind. Die Flanken dieser Intensitätsmaxima bilden dann die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren genutzten Intensitätsanstiegsbereiche aus. Die Strahlformungsmittel 4 können ausschließlich passive Komponenten oder auch eine aktive Optik, wie beispielsweise einen Spatial Light Modulator (SLM) umfassen. Eine weitere Lichtquelle 7 des STED-Fluoreszenzlichtmikroskops 1, die bei seiner üblichen Verwendung Anregungslicht bereitstellt, kann bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens Schaltlicht 8 bereitstellen, um das Molekül in der Probe 6 zu vereinzeln, dessen Ort in der Probe anschließend bestimmt wird. Das Vereinzeln des Moleküls kann dabei darauf basieren, dass andere gleichartige Moleküle mit dem Schaltlicht 8 in einen Dunkelzustand geschaltet werden, in dem sie nicht mit dem Anregungslicht 3 zur Emission von Lumineszenzlicht anregbar sind. Das Schaltlicht 8 wird in den Strahlengang des Anregungslichts 3 eingekoppelt, wozu hier ein dichroitischer Strahlteiler 9 vorgesehen ist. Mit einem Scanner 10 wird der Anstiegsbereich bzw. die Nullstelle des Anregungslichts 3 in der Probe 6 verschoben. Über einen dichroitischen Strahlteiler 11, der von der Probe 6 aus vor dem Scanner 10 angeordnet ist, wird Lumineszenzlicht 12 von der Probe 6 aus dem Strahlengang des Anregungslichts 3 ausgekoppelt und mit einer Optik 13 auf eine Kamera 14 abgebildet. Die Kamera 14 ist ein Beispiel für einen räumlich auflösenden Detektor für das Lumineszenzlicht 12. Alternativ hierzu wird mit einem dichroitischen Strahlteiler 15 das Lumineszenzlicht 12 von der Probe 6 einem Punktdetektor 16 mit einer vorgeschalteten Lochblende 17 zugeführt. Das Lumineszenzlicht 12 aus der Probe 6 stammt von dem vereinzelten Molekül, das mit dem Anregungslicht 3 zur Emission des Lumineszenzlichts angeregt wird. Der dieser Emission von Lumineszenzlicht zugrundeliegende Vorgang ist Photolumineszenz, insbesondere Fluoreszenz. Die Probe 6 ist auf einem Probenhalter 18 angeordnet. Mit dem Probenhalter 18 kann die Probe beispielsweise zusätzlich in z-Richtung, d. h. in Richtung der optischen Achse des Objektivs 5 verlagert werden, um den Intensitätsanstiegsbereich bzw. die Nullstelle der Intensitätsverteilung des Anregungslichts 3 auch in dieser Richtung in der Probe 6 zu verlagern, insbesondere wenn die Nullstelle auch in z-Richtung von Intensitätsmaxima benachbart ist. Auf die Kamera 14 wird die Probe 6 so abgebildet, dass eine Lokalisierung des vereinzelten Moleküls aus der räumlichen Verteilung der Photonen des Lumineszenzlichts 12 von dem Molekül über der Kamera 14 möglich ist. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird jedoch zumindest zusätzlich der Ort des Moleküls in der Probe 6 aufgrund der Intensitäten des Lumineszenzlichts 12 bei unterschiedlicher Anordnung des Intensitätsanstiegsbereichs bzw. der Nullstelle der Intensitätsverteilung des Anregungslichts 3 in der Probe 6 bestimmt.
In 2 ist die Intensitätsverteilung 19 des Anregungslichts 3 längs eines Schnitts in x-Richtung quer zur optischen Achse des Objektivs 5 gemäß 1 gezeigt. Die Intensitätsverteilung umfasst eine zentrale Nullstelle 20, in der die Intensität I_A des Anregungslichts 3 bis auf null oder zumindest nahe null zurückgeht. Dieser Nullstelle 20 sind auf beiden Seiten Intensitätsmaxima 21 benachbart. Zwischen der Nullstelle 20 und den Intensitätsmaxima 21 sind Intensitätsanstiegsbereiche 22 ausgebildet. In diesen Intensitätsanstiegsbereichen 22 steigt die Intensität I_A des Anregungslichts 3 von null auf eine Sättigungsintensität I_S und darüber hinaus an. Bei der Sättigungsintensität I_S erreicht die Intensität I_L des mit dem Anregungslicht 3 angeregten Lumineszenzlichts 12 einen Sättigungswert I_SW, über den hinaus die Intensität I_L nicht weiter ansteigt. Die Intensitätsverteilung 19 des Anregungslichts 3 ist symmetrisch zu der Nullstelle 20 ausgebildet, d. h. die Intensitätsanstiegsbereiche verlaufen symmetrisch zueinander.
3 illustriert einen begrenzten Ortsbereich 23 in der Probe 6, in dem sich das Molekül 24 mutmaßlich befindet. Dieser Ortsbereich 23 ist ein Kreis in der x-y-Ebene. Um den Ort des Moleküls 24 in x- und y-Richtung zu bestimmen wird die Nullstelle 20 der Intensitätsverteilung 19 des Anregungslichts 3 in der x-y-Ebene an vier Positionen A bis D relativ zu dem begrenzten Ortsbereich angeordnet. Dabei liegen die drei auch als periphere Positionen bezeichneten Positionen A bis C auf einem Kreisbogen 25 um den begrenzten Ortsbereich 23 und sind dabei längs des Kreisbogens 25 in gleichen Abständen angeordnet. Die vierte Position D der Nullstelle 20 liegt im Zentrum des begrenzten Ortsbereichs 23 und damit im Mittelpunkt des Kreisbogens 25. Anders beschrieben liegen die Positionen A bis C in der x-y-Ebene in den Ecken eines gleichseitigen Dreiecks, und die Position D liegt im Mittelpunkt dieses Dreiecks. Zu den Positionen A bis D der Nullstelle 20 in der Probe wird das von dem Molekül 24 aufgrund seiner Anregung mit dem Anregungslicht 3 emittierte Lumineszenzlicht 12 registriert. Bei einer rotationssymmetrischen Ausbildung der Intentsitätsanstiegsbereiche 22 um die Nullstelle 20 in der x-y-Ebene hängt die Intensität des zu den verschiedenen Positionen A bis D der Nullstelle 20 registrierten Lumineszenzlichts 12 allein von dem Abstand a des Moleküls 24 zu der jeweiligen Position A bis D und dem Verlauf 26 der Intensität I_L des Lumineszenzlichts über diesem Abstand a ab, wie er in 4 aufgetragen ist. In 4 sind auch die Abstände a_A bis a_D des Moleküls 24 von der Nullstelle 20 für die Positionen A bis D eingezeichnet sowie die hieraus resultierenden Intensitäten des Lumineszenzlichts I_A bis I_D. Indem diese Intensitäten bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens gemessen werden, können anhand des Verlaufs 26 die zugehörigen Abstände a_A bis a_D ermittelt werden, und hieraus kann der Ort des Moleküls 24 gegenüber den bekannten Positionen A bis D bestimmt werden. Da die Intensitäten I_A bis I_D jeweils nur mit einer gewissen Genauigkeit bestimmt werden können, die von der Anzahl der zu den Positionen A bis D registrierten Photonen des Lumineszenzlichts 12 abhängt, kann auch der Ort des Moleküls 24 nicht exakt sondern nur mit einer bestimmten Präzision bestimmt werden. Verglichen mit der hierfür benötigten Gesamtanzahl der Photonen des Lumineszenzlichts 12 ist die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erreichte Präzision bei der Bestimmung des Orts des Moleküls 24 aber sehr hoch. Sie ist insbesondere deutlich höher als bei einer Lokalisierung des Moleküls 24 auf Basis einer räumlichen Verteilung der Photonen des Lumineszenzlichts von dem Molekül 24, die mit einem räumlich auflösenden Detektor wie der Kamera 14 gemäß 1 detektiert wird. Alternativ zu einer Bestimmung des Orts des Moleküls 24 gegenüber den Positionen A bis D auf Basis der Abstände a_A bis a_D kann an die zu den Positionen A bis D gemessenen Intensitäten I_A bis I_D eine den Verlauf 26 beschreibende Funktion angefittet werden, und der Ort des Moleküls 24 in der Probe kann dem Ort der Nullstelle 27 des Verlaufs 26 gleichgesetzt werden.
Bei einer praktischen Erprobung des erfindungsgemäßen Verfahrens konnte mit weniger als 5 % der Photonen des Lumineszenzlichts, die für eine Lokalisation des Moleküls 24 mit derselben Präzision benötigt werden, der Ort des Moleküls auf etwa 1 nm genau bestimmt werden.
Die in 5 in Form eines Blockdiagramms gezeigte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens beginnt nach dem Start 28 mit einem Vereinzeln 29 des Moleküls. Es folgt ein Bestimmen 30 des begrenzten Ortsbereichs 23, in dem sich das Molekül mutmaßlich befindet, beispielsweise indem die Probe 6 insgesamt mit dem Anregungslicht 3 beaufschlagt und das auf die Kamera 14 abgebildete Lumineszenzlicht 12 aus der Probe ausgewertet wird. Dann folgt eine Prozedur 31 bestehend aus dem Anordnen der Nullstelle 20 an bestimmten Positionen A bis D und des Registrierens des Lumineszenzlichts 12 zu diesen Positionen A bis D. Hieran schließt sich ein Ableiten 32 des Orts des Moleküls 24 in der Probe 6 aus den Intensitäten des zu den verschiedenen Positionen A bis D registrierten Lumineszenzlichts 12 an. Eine Schleife 33, in der die Prozedur 31 und das Ableiten 32 erneut durchgeführt werden, kann vor dem Ende 34 dazu dienen, den Ort des Moleküls 24 mit noch höherer Präzision zu bestimmen, wobei die Position A bis D der Nullstelle 20 mehr an den beim ersten Ableiten 32 bestimmten Ort des Moleküls 24 in der Probe 6 herangerückt werden und die absolute Intensität des Anregungslichts erhöht wird.
Die Schleife 33 kann aber auch vielfach ohne dichtere Anordnung der Positionen A bis D der Nullstelle durchlaufen werden, um ein sich in der Probe bewegendes vereinzeltes Molekül 24 zu verfolgen, das heißt zu tracken. Dabei können die Positionen A bis D immer um den beim vorherigen Ableiten 32 bestimmten Ort des Moleküls 24 herum angeordnet werden. Der dabei von den Positionen A bis D überspannte Ortsbereich 23 ist so groß zu wählen, dass er das Molekül 24 auch dann noch umfasst, wenn es sich nach dem letzten Registrieren des Lumineszenzlichts 12 maximal weit in der Probe 6 bewegt hat. Eine größere Schleife 35 umfasst die Wiederholung aller Schritte 29 bis 32, um von einer Vielzahl von Molekülen, mit denen eine interessierende Struktur in der Probe 6 markiert ist, immer andere zu vereinzeln. Die Summe der bestimmten Orte der vereinzelten Moleküle 24 beschreibt dann mit zunehmender Genauigkeit die interessierende Struktur in der Probe 6.
Bezugszeichenliste

1: STED-Fluoreszenzlichtmikroskop
2: Lichtquelle
3: Anregungslicht
4: Strahlformungsmittel
5: Objektiv
6: Probe
7: Lichtquelle
8: Schaltlicht
9: dichroitischer Strahlteiler
10: Scanner
11: dichroitischer Strahlteiler
12: Lumineszenzlicht
13: Optik
14: Kamera
15: dichroitischer Strahlteiler
16: Punktdetektor
17: Lochblende
18: Probenhalter
19: Intensitätsverteilung
20: Nullstelle der Intensitätsverteilung 19 des Anregungslichts 3
21: Maximum
22: Intensitätsanstiegsbereich
23: begrenzter Ortsbereich
24: Molekül
25: Kreisbogen
26: Verlauf
27: Nullstelle des Verlaufs 26
28: Start
29: Vereinzeln
30: Bestimmen
31: Prozedur
32: Ableiten
33: Schleife
34: Ende
35: Schleife
I_A: Intensität des Anregungslichts 3
I_L: Intensität des Lumineszenzlichts 12
I_S: Sättigungsintensität des Anregungslichts 3
I_SW: Sättigungswert der Intensität I_L des Lumineszenzlichts 12
a: Abstand
A: Position der Nullstelle 20
B: Position der Nullstelle 20
C: Position der Nullstelle 20
D: Position der Nullstelle 20
a_A: Abstand der Position A der Nullstelle 20 von dem Molekül 24
a_B: Abstand der Position B der Nullstelle 20 von dem Molekül 24
a_C: Abstand der Position C der Nullstelle 20 von dem Molekül 24
a_D: Abstand der Position D der Nullstelle 20 von dem Molekül 24
I_A: Intensität des Lumineszenzlichts 12 an der Position A Position der Nullstelle 20
I_B: Intensität des Lumineszenzlichts 12 an der Position B Position der Nullstelle 20
I_C: Intensität des Lumineszenzlichts 12 an der Position C Position der Nullstelle 20
I_D: Intensität des Lumineszenzlichts 12 an der Position D Position der Nullstelle 20

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 2006/127692 A2 [0006, 0007, 0008]
US 8174692 B2 [0009, 0011]
WO 2012/171999 A1 [0016]
DE 102011055367 A1 [0018]
WO 2015/097000 A1 [0019, 0020, 0024, 0029, 0060]
DE 102010028138 A1 [0021]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Engelhardt, J. et al. "Molecular Orientation Affects Localization Accuracy in Superresolution Far-Field Fluorescence Microscopy", NanoLett 2011 Jan. 12; 11 (1): 209–13 [0005]

Claims

Verfahren zum räumlich hochauflösenden Bestimmen des Orts eines vereinzelten Moleküls (24) in einer oder mehreren Raumrichtungen in einer Probe (6), wobei das Molekül (24) mit Anregungslicht (3) zur Emission von Lumineszenzlicht (12) anregbar ist, – wobei das Anregungslichts (3) mit einer Intensitätsverteilung (19) auf die Probe (6) gerichtet wird, die eine Nullstelle (20) und Intensitätsanstiegsbereiche (22) aufweist, welche in jeder der Raumrichtungen beidseitig an die Nullstelle (20) angrenzen, – wobei zu jeder von verschiedenen Positionen (A–D) der Nullstelle (20) in der Probe (6) das von dem Molekül (24) emittierte Lumineszenzlicht (12) registriert wird und – wobei der Ort des Moleküls (24) in der Probe (6) von den Intensitäten (I_A–I_D) des zu den verschiedenen Positionen (A–D) der Nullstelle (20) registrierten Lumineszenzlichts (12) abgeleitet wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Nullstelle (20) an nicht mehr als n × 3 verschiedenen Positionen (A–D) in der Probe (6) angeordnet wird, um den Ort des Moleküls (24) in den n Raumrichtungen von den zu den verschiedenen Positionen (A–D) der Nullstelle (20) registrierten Intensitäten (I_A–I_D) des Lumineszenzlichts (12) abzuleiten.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nullstelle (20) an nicht mehr als (n × 2) + 1 verschiedenen Positionen (A–D) in der Probe angeordnet wird, um den Ort des Moleküls (24) in den n Raumrichtungen von den zu den verschiedenen Positionen (A–D) der Nullstelle (20) registrierten Intensitäten (I_A–I_D) des Lumineszenzlichts (12) abzuleiten.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nullstelle (20) an nicht mehr als n + 2 verschiedenen Positionen (A–D) in der Probe angeordnet wird, um den Ort des Moleküls (24) in den n Raumrichtungen von den zu den verschiedenen Positionen (A–D) der Nullstelle (20) registrierten Intensitäten (I_A–I_D) des Lumineszenzlichts (12) abzuleiten.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die verschiedenen Positionen (A–D), an denen die Nullstelle (20) in der Probe (6) angeordnet wird, in jeder Raumrichtung, in der der Ort des Moleküls (24) in der Probe (6) bestimmt wird, je eine Position (A–C) auf beiden Seiten eines Zentrums eines begrenzten Ortsbereichs (23) in der Probe umfassen, in dem das Molekül (24) angeordnet ist.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die verschiedenen Positionen (A–D), an denen die Nullstelle (20) in der Probe (6) angeordnet wird, in jeder Raumrichtung, in der der Ort des Moleküls (24) in der Probe (6) bestimmt wird, neben den beiden Positionen (A–C) auf beiden Seiten des Zentrums des begrenzten Ortsbereich (23) eine Position (D) in dem Zentrum des begrenzten Ortsbereichs (23) umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass die verschiedenen Positionen (A–D), an denen die Nullstelle (20) in der Probe (6) angeordnet wird, wenn der Ort des Moleküls (24) in zwei Raumrichtungen bestimmt wird, eine zentrale Position (D) und drei periphere Positionen (A–C) sind, wobei die peripheren Positionen (A–C) in einer von den beiden Raumrichtungen aufgespannten und durch die zentrale Position verlaufenden Ebene äquidistant auf einem Kreisbogen (25) um die zentrale Position angeordnet sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass die verschiedenen Positionen, an denen die Nullstelle (20) in der Probe (6) angeordnet wird, wenn der Ort des Moleküls (24) in drei Raumrichtungen bestimmt wird, eine zentrale Position und vier periphere Positionen sind, wobei die peripheren Positionen äquidistant auf einer Kugelschale um die zentrale Position angeordnet sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine maximale Intensität des Anregungslichts (3) so eingestellt wird, dass ein maximaler Abstand jeder Position (A–D) der Nullstelle (20) zu jedem Punkt zwischen den Positionen (A–D) der Nullstelle (20) in der Probe (6) nicht größer als eine Ausdehnung jedes Intensitätsanstiegsbereichs (22) in Richtung des Abstands (a) ist, über der die Intensität des Anregungslichts (3) bis auf 90 % einer Sättigungsintensität (I_S) des Anregungslichts (3) ansteigt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die an die Nullstelle (20) angrenzenden Intensitätsanstiegsbereiche (22) rotationssymmetrisch um die Nullstelle (20) ausgebildet sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht (3) hinsichtlich seiner Wellenlänge und/oder Polarisation und/oder die an die Nullstelle (20) angrenzenden Intensitätsanstiegsbereiche (22) hinsichtlich des Verlaufs der Intensität (I_A) des Anregungslichts (3) in den verschiedenen Raumrichtungen abhängig von der jeweiligen Position (A–D) der Nullstelle (20) unterschiedlich ausgebildet wird/werden.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht (3) und/oder die an die Nullstelle (20) angrenzenden Intensitätsanstiegsbereiche (22) abhängig von der jeweiligen Position (A–D) der Nullstelle derart unterschiedlich ausgebildet wird/werden, dass der Ort des Moleküls (24) an jedem Punkt zwischen den Positionen (A–D) der Nullstelle (20) in jeder Raumrichtung mit derselben Präzision bestimmt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Lumineszenzlicht (12) zu den Positionen (A–D) der Nullstelle (20) quasi gleichzeitig registriert wird, indem die Nullstelle (20) wiederholt zwischen den Positionen (A–D) verschoben wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Lumineszenzlicht (12) zu den Positionen (A–D) der Nullstelle nur so lange registriert wird, bis die Intensitäten (I_A–I_D) des registrierten Lumineszenzlichts (12) zu den Positionen (A–D) der Nullstelle (20) mit einer ausreichenden Genauigkeit erfasst sind, dass der Ort der vereinzelten Moleküls (24) mit einer vorgegebenen Präzision bestimmbar.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die vorgegebene Präzision im Bereich zwischen 0,5 und 20 nm liegt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein das vereinzelte Molekül (24) umfassender Bereich der Probe (6) zu Beginn des Bestimmens des Orts des vereinzelten Moleküls (24) mit der Nullstelle (20) oder einer gaußförmigen Intensitätsverteilung des Anregungslichts (3) in jeder der Raumrichtungen abgetastet wird, wobei aus dem Verlauf der Intensität (I_L) des Lumineszenzlichts (12) während des Abtastens der Ort des vereinzelten Moleküls (24) abgeschätzt und der abgeschätzte Ort dem Festlegen der Positionen (A–D) der Nullstelle (20) in der Probe (6) zugrunde gelegt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslichts (3) zu Beginn des Bestimmens des Orts des vereinzelten Moleküls (24) mit einer gaußförmigen Intensitätsverteilung (19) punktweise oder auf Kreis- oder Spiralbahnen auf einen das vereinzelte Molekül (24) umfassenden Bereich der Probe (6) gerichtet wird, wobei der der Ort des vereinzelten Moleküls (24) aus dem Verlauf der Intensität (I_L) des Lumineszenzlichts (12) über den Punkten bzw. Bahnen abgeschätzt und der abgeschätzte Ort dem Festlegen der Positionen (A–D) der Nullstelle (20) in der Probe (6) zugrunde gelegt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein das vereinzelte Molekül (24) umfassender Bereich der Probe (6) zu Beginn des Bestimmens des Orts des vereinzelten Moleküls (24) räumlich mit dem Anregungslicht (3) beaufschlagt und auf einen räumlich auflösenden Detektor abgebildet wird, wobei aus einer räumlichen Verteilung des mit dem Detektor registrierten Lumineszenzlichts (12) der Ort des vereinzelten Moleküls (24) abgeschätzt und der abgeschätzte Ort dem Festlegen der Positionen (A–D) der Nullstelle (20) in der Probe (6) zugrunde gelegt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Lumineszenzlicht (12) mit räumlicher Auflösung registriert wird, wobei zusätzlich eine räumliche Verteilung des insgesamt registrierten Lumineszenzlichts (12) hinsichtlich des Orts des Moleküls (24) in der Probe (6) ausgewertet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (6) vor dem Bestimmen des Orts des vereinzelten Moleküls (24) mit einem Schaltsignal beaufschlagt wird, das das Molekül (24) von benachbarten gleichartigen Molekülen vereinzelt, indem die benachbarten gleichartigen Moleküle (24) nach dem Vereinzeln – im Gegensatz zu dem vereinzelten Molekül (24) – mit dem Anregungslicht (3) nicht zur Emission von Lumineszenzlicht (12) anregbar sind.
Wiederholte Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit kleiner werdenden Abständen der Positionen (A–D) der Nullstelle (20) in der Probe (6), wobei die Positionen (A–D) der Nullstelle (20) in der Probe (6) bei jeder Wiederholung des Verfahrens um den Ort des Moleküls (24) in der Probe (6) herum angeordnet werden, der bei der vorherigen Durchführung des Verfahrens von den registrierten Intensitäten (I_A–I_D) des Lumineszenzlichts (12) abgeleitet wurde.
Wiederholte Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche zum Bestimmen des Orts einer Vielzahl von nacheinander vereinzelten, mit Anregungslicht (3) zur Emission des Lumineszenzlichts (12) anregbaren Molekülen (24), die eine interessierende Struktur in der Probe (6) markieren.
Wiederholte Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 20 zum Verfolgen des sich in der Probe (6) bewegenden vereinzelten Moleküls (24).
Verwendung eines STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskop (1) zur Durchführung des Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei durch das STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskop (1) bereitgestelltes STED-Licht als das Anregungslicht (3) verwendet wird.