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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren sowie ein Mikroskop, insbesondere
Laser-Raster-Fluoreszenzmikroskop,
zur räumlich
hochauflösenden
Untersuchung von Proben, wobei die zu untersuchende Probe eine Substanz
umfasst, die wiederholt von einem ersten Zustand in einen zweiten
Zustand überführbar ist,
wobei sich die ersten und die zweiten Zustände in mindestens einer optischen
Eigenschaften voneinander unterscheiden, umfassend die Schritte,
dass die Substanz in einem zu erfassenden Probenbereich zunächst in
den ersten Zustand gebracht wird und dass mittels eines optischen
Signals der zweite Zustand induziert wird, wobei innerhalb des zu
erfassenden Probenbereichs räumlich
begrenzte Teilbereiche gezielt ausgespart werden.
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Verfahren
und Mikroskope der eingangs genannten Art sind aus der Praxis bekannt.
Grundsätzlich
ist gemäß dem Abbe'schen Gesetz der
räumlichen
Auflösung
abbildender optischer Verfahren durch die Beugungsgrenze eine theoretische
Grenze gesetzt, wobei die Beugungsgrenze von der Wellenlänge des
verwendeten Lichts abhängt.
Mit den hier in Rede stehenden Verfahren und Mikroskopen lassen
sich allerdings räumliche
Auflösungen
erzielen, die über
die nach Abbe bekannte theoretische Beugungsgrenze hinaus verbessert
sind.
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Bei
den bekannten Verfahren werden hierzu in zu untersuchenden Proben
Substanzen bereitgestellt, die wiederholt von einem ersten Zustand
in einen zweiten Zustand überführbar sind,
wobei sich die ersten und die zweiten Zustände in mindestens einer optischen
Eigenschaft voneinander unterscheiden. Bei den meisten bekannten
Verfahren handelt es sich bei dem ersten Zustand um einen fluoreszenzfähigen Zustand
(im Folgenden Zustand A genannt) und bei dem zweiten Zustand um
einen nicht fluoreszenzfähigen
Zustand (im Folgenden Zustand B). Nachdem die Substanz in einem
zu erfassenden Probenbereich mittels eines Schaltsignals in den
fluoreszenzfähigen
Zustand A gebracht worden ist, wird mittels eines optischen Signals
in räumlich
begrenzten Teilbereichen des zu erfassenden Probenbereichs Zustand
B induziert und somit eine Unterdrückung der Fluoreszenz von Fluoreszenzmolekülen erzeugt.
Der physikalische Prozess der Fluoreszenzunterdrückung kann dabei sehr unterschiedlicher
Natur sein. So ist bspw. die stimulierte Emission aus dem zuvor angeregten
Zustand oder eine optisch induzierte Strukturänderung der Fluoreszenzmoleküle bekannt.
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Entscheidend
ist, dass der durch ein optisches Schaltsignal induzierte Übergang
von dem ersten in den zweiten Zustand im Probenvolumen in großen Bereichen
gesättigt,
d.h. vollständig,
stattfindet, und in mindestens einem Teilbereich des Probenvolumens
gerade nicht stattfindet, indem dort das optische Schaltsignal gezielt
nicht eingestrahlt wird. Dieser Effekt kann durch das Erzeugen einer
Intensitäts-Nullstelle
des optischen Signals erreicht werden. An der Nullstelle und in
deren unmittelbarer Umgebung findet kein Übergang in den zweiten Zustand (im
Allgemeinen der nicht fluoreszierende Zustand B) statt, so dass
der erste Zustand (im Allgemeinen der fluoreszierende Zustand A)
erhalten bleibt. Eine Sättigung
des Übergangs
A → B durch
das optische Signal führt
in den beleuchteten Bereichen des zu erfassenden Probenbereichs
bereits in naher Umgebung der Intensitäts-Nullstellen zu einem (nahezu) vollständigen Transfer
in den Zustand B. Je stärker
der Prozess in die Sättigung
getrieben wird, d.h. je mehr Energie durch das optische Signal in
die Bereiche um die Nullstelle herum eingebracht wird, desto kleiner wird
der Bereich mit Fluoreszenzmolekülen
im fluoreszenzfähigen
Zustand A bzw. allgemein in einem „leuchtfähigen" Zustand. In Abhängigkeit vom Sättigungsgrad
in der unmittelbaren Nullstellen-Umgebung kann dieser Bereich prinzipiell
beliebig klein gemacht werden. Folglich lassen sich Regionen des
Zustands A markieren, die beliebig viel kleiner sind als die kleinsten
aufgrund der Beugungsgrenze möglichen
Regionen eines aufgebrachten optischen Signals. Wird der Bereich
des Zustands A anschließend ausgelesen,
z.B. durch Einstrahlen eines Testsignals, so stammt das (Fluoreszenz-)Messsignal
aus einem definierten Bereich, der kleiner sein kann als es die
Beugungsgrenze zulässt.
Wird die Probe auf die beschriebene Art Punkt für Punkt abgerastert, so entsteht
ein Bild mit einer Auflösung
die besser ist, als es die Beugungstheorie erlaubt.
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Verfahren,
der hier beschriebenen Art, bei denen als Unterschied zwischen zwei
Zuständen
die optische Eigenschaft fluoreszenzfähig/nicht fluoreszenzfähig ausgenutzt
wird, sind bspw. aus der
DE 103
25 459 A1 und der
DE
103 25 460 A1 bekannt. Bei diesen Verfahren werden Fluoreszenzmoleküle mit Hilfe
eines optischen Signals von einem Zustand A (fluoreszenzfähig) in
einen Zustand B (nicht fluoreszenzfähig) gebracht, wobei bei dem Übergang
A → B die
Sättigung
erreicht wird. Die in dem fluoreszenzfähigen Zustand A verbleibenden
Bereiche der Probe resultieren jeweils aus einem eine Nullstelle aufweisenden
Intensitätsminimum
des eingestrahlten optischen Signals. Die Intensitätsminima
sind Teil eines Interferenzmusters. Das Abrastern der Probe erfolgt
durch Verschiebung der Intensitätsminima
des optischen Signals, wobei die Verschiebung durch Phasenverschiebung
der interferierenden Strahlen bewirkt wird.
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Bei
den bekannten Verfahren ist nachteilig, dass die Struktur der Lichtverteilung
in der Probe durch die Interferenz auf eine stehende Welle festgelegt
ist. Mit dieser Festlegung geht folglich eine starke Einschränkung im
Hinblick auf die Möglichkeiten
einer Auflösungserhöhung einher.
Darüber
hinaus ist die Bildaufnahmerate beschränkt.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt nunmehr die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren
sowie ein Mikroskop der eingangs genannten Art anzugeben, wonach
mit konstruktiv einfachen und kostengünstigen Mitteln eine Auflösungserhöhung in
beliebigen Richtungen erreicht ist. Des Weiteren soll eine erhöhte Bildaufnahmerate
ermöglicht
sein.
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Erfindungsgemäß ist die
voranstehende Aufgabe durch ein Verfahren mit den Merkmalen des
Patentanspruchs 1 gelöst.
Danach ist das Verfahren derart ausgestaltet und weitergebildet,
dass das optische Signal gleichzeitig in mehreren Brennpunkten gebündelt wird
und die Brennpunkte in verschiedene Orte der Probe fokussiert werden.
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Die
voranstehende Aufgabe ist des Weiteren durch ein Mikroskop mit den
Merkmalen des Patentanspruchs 23 gelöst. Danach umfasst das Mikroskop
eine Einrichtung zur gleichzeitigen Bündelung des optischen Signals
in mehreren Brennpunkten, wobei die Brennpunkte in verschiedene
Orte der Probe fokussierbar sind.
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In
erfindungsgemäßer Weise
ist zunächst
erkannt worden, dass sich – im
Vergleich zur Erzeugung einer stehenden Welle – eine deutlich erhöhte Flexibilität hinsichtlich
der Realisierung einer Auflösungsverbesserung
dadurch erreichen lässt,
dass das optische Signal gleichzeitig in mehreren Brennpunkten gebündelt wird.
Diese Brennpunkte können nahezu
beliebig in verschiedene Orte der Probe fokussiert werden, so dass
mit einfachen Mitteln eine flexible Lichtverteilung in der Probe
er möglicht
ist. Durch das erfindungsgemäße gleichzeitige
Fokussieren mehrerer Brennpunkte in unterschiedliche Orte der zu
untersuchende Probe ist zudem eine Parallelisierung des Proben-Rasterns
erreicht, was wiederum eine signifikante Erhöhung der Bildaufnahmerate zur
Folge hat.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
und das erfindungsgemäße Mikroskop
lassen sich besonders vorteilhaft im Bereich der STED-Mikroskopie
(STimulated Emission Depletion), im Zusammenhang mit der Up-Conversion,
wie sie beispielsweise in der
US 6,859,313 B2 oder der
US 6,667,830 B1 beschrieben ist,
und/oder in der GSD-Fluoreszenzmikroskopie (Ground-State-Depletion)
anwenden.
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Im
Rahmen einer konkreten Ausführungsform
ist vorgesehen, dass die Pupillenfunktionen der einzelnen Brennpunkte
moduliert werden. Mit anderen Worten wird die Lichtverteilung in
den einzelnen Brennpunkten moduliert. Im Hinblick auf eine optimale
Ausnutzung der generierten Brennpunkte wird die Modulation in besonders
vorteilhafter Weise derart durchgeführt, dass in jedem Brennpunkt
mindestens eine Intensitäts-Nullstelle
entsteht.
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Im
Konkreten könnte
die Modulation mittels eines Phasenfilters durchgeführt werden.
Der Phasenfilter wird bevorzugt in einer Ebene angeordnet, die zu
der Pupille eines Objektivs, durch das die Probe beleuchtet wird,
konjugiert ist und die sich zwischen dem Objektiv und der Ebene
der erzeugten Brennpunkte befindet. Dies hat den Vorteil, dass die Lichtstrahlen
sämtlicher
erzeugter Brennpunkte den Phasenfilter passieren, so dass ein einziger
Phasenfilter zur Modulation des optischen Signals in allen Brennpunkten
ausreichend ist.
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Alternativ
oder zusätzlich
kann auch ein Phasenfilter-Array verwendet werden, wobei beispielsweise
jedem Brennpunkt genau ein Phasenfilter des Phasenfilter-Arrays zugeordnet
sein könnte.
Prinzipiell können
zur Modulation alle bekannten Phasenfilter eingesetzt werden. Insbesondere
kann es sich beispielsweise um eine aufgedampfte Struktur auf einem
Substrat, um einen achromatischen Phasenfilter oder um einen mit
Hilfe eines LCDs realisierten Phasenfilter handeln.
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Hinsichtlich
der konkreten Ausgestaltung des Phasenfilters kann vorgesehen sein,
dass dieser in Form eines Halbkreises ausgeführt ist. Eine derartige Ausführung bietet
sich insbesondere für
eine eindimensionale Auflösungserhöhung an.
Insbesondere im Hinblick auf eine dreidimensionale Auflösungserhöhung ist
eine kreisförmige
Ausführungsform
des Phasenfilters bevorzugt. Schließlich kann der Phasenfilter
auch als Phasenuhr ausgeführt
sein, wobei diese Ausführung
insbesondere für
eine zweidimensionale Auflösungserhöhung vorteilhaft
ist.
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Im
Hinblick auf eine besonders einfache Erzeugung der Brennpunkte kann
vorgesehen sein, dass eine Linsenanordnung mit mehreren Mikrolinsen
im Strahlengang positioniert wird. Auf diese Weise könnten die
Brennpunkte im Sinne eines Fokus-Array erzeugt werden. Im Falle
des Einsatzes eines Mikrolinsen-Arrays kann der Phasenfilter insbesondere
in der Ebene der Linsenanordnung oder einer dazu konjugierten Ebene
angeordnet sein. Bei einer Anordnung in der Ebene der Linsenanordnung ließe sich
der Phasenfilter in besonders einfacher Weise beispielsweise durch
Aufdampfen auf die Mikrolinsen herstellen.
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Im
Rahmen einer weiteren Ausführungsform ist
vorgesehen, ein Fokus-Array mittels mehrerer hintereinander geschalteter
Strahlteiler zu erzeugen. Auch die Verwendung einer Lochblendenscheibe, insbesondere
in Form einer Nipkov-Scheibe,
ist denkbar. Weiter alternativ oder zusätzlich könnte ein Array von Glasfasern
und/oder holographische Elemente eingesetzt werden. Unabhängig von
der Art der die Brennpunkte erzeugenden Einrichtungen werden die
Einrichtungen in vorteilhafter Weise so angeordnet, dass die Brennpunkte
im Bild, im Zwischenbild oder in einer dazu konjugierten Ebene entstehen.
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Gemäß einer
besonders bevorzugten Ausführungsform
ist eine Anordnung des Phasenfilters vorgesehen, bei der dieser
nur von dem optischen Signal durchsetzt wird. Mit anderen Worten
ist die Anordnung derart ausgeführt,
dass das eingangs beschriebene Schaltsignal zum Überführen der Substanz in den ersten
Zustand, das Testsignal zum Auslesen des ersten Zustands und das
von der Probe ausgehende Messsignal von dem Phasenfilter nicht beeinflusst
werden. Diese Anordnung kann beispielsweise in der Form realisiert
sein, dass das Schaltsignal und/oder das Testsignal und/oder das
Messsignal vor dem Phasenfilter von dem optischen Signal getrennt
werden. Die Trennung kann dabei beispielsweise durch einen oder
mehrere dichroitische Filter oder Polarisationsfilter erfolgen.
Hinter dem Phasenfilter können
das Schaltsignal und/oder das Testsignal und/oder das Messsignal
wieder mit dem optischen Signal vereint werden, wobei hierzu ebenfalls wieder
ein oder mehrere dichroitische Filter oder Polarisationsfilter eingesetzt
werden können.
Vorzugsweise werden die optischen Weglängen dabei gleich lang gewählt. Unter
Umständen
ist eine leicht unterschiedliche optische Weglänge vorteilhaft, wenn es gilt,
chromatische Abberationen auszugleichen. Bei der beschriebenen Trennung
und Vereinigung der Signale ist zu beachten, dass das Messsignal
den Aufbau in umgekehrter Richtung wie das Schaltsignal und das
Testsignal durchläuft.
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Zur
Vermeidung einer Beeinflussung des Licht des Schaltsignals, des
Testsignals und/oder des Messsignals durch den eingesetzten Phasenfilter
kann alternativ vorgesehen sein, dass das Schaltsignal und/oder
das Messsignal an einer Stelle zwischen dem Phasenfilter und dem
Objektiv in den Strahlengang eingekoppelt bzw. ausgekoppelt werden.
Hierzu werden vorzugsweise Teilbereiche des Strahlengangs ausgewählt, in
denen die Lichtstrahlen parallel verlaufen. Eine derartige Einkopplung
ist für
das Testsignal nicht realisierbar, da dieses – wie das optische Signal – die Einrichtung
zur Erzeugung durchlaufen muss.
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Im
Hinblick auf ein schnelles Rastern der Probe kann eine geeignete
Bewegung der die Brennpunkte erzeugenden Einrichtungen vorgesehen
sein. Im Falle des Einsatzes von Mikrolinsen sind insbesondere laterale
Bewegungen oder Rotationen der Mikrolinsen denkbar. Alternativ kann
das Rastern der Probe mittels geeigneter Bewegung von im Strahlengang
angeordneten Scannspiegeln durchgeführt werden. Vorzugsweise erfolgt
das Rastern in einer zur Objektivpupille konjugierten Ebene, da
die Struktur des Phasenfilters in der Pupille stillsteht und die Punkt-Verbreiterungs-Funktion
(PSF, Point Spread Function) demzufolge ortsinvariant ist.
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Im
Hinblick auf das Rastern der Probe kann in weiter vorteilhafter
Weise eine Synchronisation dahingehend vorgesehen sein, dass der
Rastervorgang auf das zyklische Einstrahlen des Schaltsignals, des optischen
Signals, des Testsignals sowie auf das Auslesen des Messsignals
abgestimmt ist. Das bedeutet konkret, dass die Substanz zunächst im
gesamten zu erfassenden Probenvolumen durch Einstrahlen des Schaltsignals
in den ersten Zustand gebracht wird. Daraufhin wird das optische
Signal eingestrahlt, um die Substanz mit Ausnahme von eng umgrenzten
Bereichen um die Intensitäts-Nullstellen des
optischen Signals herum, welche durch Modulation wie oben beschrieben
erzeugt worden sind, in den ersten Zustand zu überführen. Im Anschluss daran wird
das Testsignal eingestrahlt und das von der Probe daraufhin ausgehende
Messsignal ausgelesen. Erst danach folgt ein Rasterschritt, mit
dem die Brennpunkte mit einer definierten Schrittweite und einem
definierten Schrittmuster in der Probe verschoben werden.
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Das
von der Probe ausgehende Messsignal kann beispielsweise mittels
einer CCD-Kamera
oder einer EMCCD-Kamera detektiert werden. Alternativ kann der Detektor
als Detekor-Array, beispielsweise als APD-Array (Avalanche Photodiode),
ausgeführt sein.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden den einzelnen erzeugten Brennpunkten jeweils definierte Detektorbereiche,
vorzugsweise einzelne Kamerapixel und/oder Kamerapixelbereiche zugeordnet,
wodurch quasi eine Konfokalisierung geschaffen ist. Je kleiner die
zugeordneten Detektorbereiche sind, desto besser ist die Konfokalisierung. Beim
Rastern der Probe können
den jeweiligen Brennpunkten bei jedem Rasterschritt andere Kamerapixel
bzw. Kamerapixelbereiche zugeordnet werden. Dabei wird die Kamera
nach jedem Aufnahmezyklus ausgelesen. Durchläuft das Messsignal die Rastereinheit
(in Form der die Brennpunkte erzeugenden Einrichtung oder in Form
eines separaten Scannspiegels), bevor es auf den Detektor trifft,
dann ist es bereits „entrastert" (descanned) und
die Brennpunkte sind dementsprechend auf dem Detektor ortsfest.
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Zusätzlich oder
alternativ zu der beschriebenen Zuordnung können den einzelnen Detektorbereichen
zur Erzielung einer Konfokalisierung Pinholes zugeordnet werden.
Eine derartige Anordnung erweist sich insbesondere beim Einsatz
von Detektoren mit einer geringen Anzahl von einzelnen Detektorelementen,
wie zum Beispiel beim Einsatz eines APD-Arrays, als vorteilhaft.
Beim Einsatz von CCDs und EMCCDs wird die Synchronisation von Pixeln und
Brennpunkten erleichtert.
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Im
Hinblick auf eine weitere Auflösungserhöhung kann
eine sich an die Bildaufnahme anschließende elektronische Bildverarbeitung
vorgesehen sein. Insbesondere durch lineare oder nicht lineare Entfaltungen
kann die Auflösung
noch weiter gesteigert werden.
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Im
Hinblick auf eine hohe Benutzerfreundlichkeit kann ein modularer
Aufbau des Mikroskops vorgesehen sein, so dass einzelne Bauteile
und/oder Baugruppen einfach austauschbar sind. Im Hinblick auf eine
besonders leichte Handhabbarkeit kann zudem vorgesehen sein, dass
einzelne Bauteile und/oder Baugruppen und/oder der gesamte Aufbau in
einem Gehäuse
eingefasst sind. Zur Erleichterung der Bedienbarkeit können die
optischen Elemente zudem mit elektrisch gesteuerten Justagehilfsmitteln versehen
sein, wobei es sich konkret um Motoren und/oder Piezoelemente handeln
könnte.
Es können auch
Sensoren im Strahlengang positioniert sein, welche die Strahl- und/oder
Fokuslage detektieren. Besonders vorteilhaft ließe sich dann mit Hilfe einer Rückkopplung
und Regelung der Aufbau automatisch nachjustieren bzw. stabil halten.
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Es
gibt nun verschiedene Möglichkeiten,
die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten
und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die nachgeordneten Ansprüche, andererseits
auf die nachfolgende Erläuterung
bevorzugter Ausführungsbeispiele
des erfindungsgemäßen Verfahrens
und des erfindungsgemäßen Mikroskops zur
räumlich
hochauflösenden
Untersuchung von Probe zu verweisen. In Verbindung mit Erläuterungen
der bevorzugten Ausführungsbeispiele
anhand der Zeichnungen werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen
und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigen
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1 in
einer schematischen Darstellung ein zyklisches Beleuchtungsschema
eines Verfahrens zur räumlich
hochauflösenden
Untersuchung von Proben und
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2 in
einer schematischen Darstellung ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops
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1 zeigt
schematisch einen zyklischen Beleuchtungsvorgang, wie er zur räumlich hochauflösenden Untersuchung
von Proben jenseits der beugungslimitierten Auflösungsgrenze eingesetzt wird. Gemäß 1a wird
zunächst
im gesamten zu erfassenden Probenraum P eine in der Probe 1 bereitgestellte
Substanz, die wiederholt von einem ersten Zustand Z1 in einen zweiten
Zustand Z2 überführbar ist, wobei
sich die ersten und die zweiten Zustände Z1, Z2 in mindestens einer
optischen Eigenschaften voneinander unterscheiden, mittels eines
Schaltsignals 2 in den ersten Zustand Z1 gebracht. Im konkret
dargestellten Ausführungsbeispiel
handelt es bei dem ersten Zustand Z1 um einen fluoreszierenden Zustand
A und bei dem zweiten Zustand Z2 um einen nicht fluoreszierenden
Zustand B. Bei der in der Probe 1 bereitgestellten Substanz
handelt es sich in dem konkret dargestellten Beispiel um eine photochrome Substanz,
deren Moleküle
durch Bestrahlung mit Licht einer ersten Wellenlänge, dem Schaltsignal 2, in
den fluoreszenzfähigen
Zustand A gebracht werden. Dies geschieht in idealer Weise, indem
die Probe 1 im gesamten Probenraum P durch Beleuchtung durch
ein Objektiv 3 mit dem Schaltsignal 2 bestrahlt wird.
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Im
Falle der Grundzustands-Entvölkerung (Ground
State Depletion, GSD) findet der Übergang in den fluoreszenzfähigen (Singlet)-Zustand üblicherweise
spontan statt. Das Einstrahlen optischer Schaltsignale erübrigt sich
somit in diesem Fall, es müssen
lediglich Wartezeiten von typischerweise 1 bis 100 μs (teilweise
auch ein wenig länger)
berücksichtigt
werden.
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In
einem nächsten
Schritt – dargestellt
in 1b – wird
Licht einer anderen Wellenlänge,
das sogenannte optische Signal 4, auf den zu erfassenden
Probenbereich P aufgebracht. Dies geschieht in Form einer Lichtstruktur
mit definierten Intensitäts-Nullstellen 5.
Das optische Signal 4 induziert gesättigt den Übergang A → B in allen mit Licht des optischen
Signals 4 beleuchteten Bereichen 6. Mit anderen
Worten verbleiben lediglich in unmittelbarer Umgebung der Intensitäts-Nullstellen 5 eng
definierte Bereiche der Substanz im Zustand A. Die verbleibenden
Bereiche A1, A2,
A3, ... der Substanz in Zustand A können viel
kleiner sein als die Dimensionen der Lichtstruktur des optischen
Signals 4 selbst, d.h. konkret viel kleiner als beugungslimitierte
Strukturen. Die Größe der im
Zustand A verbleibenden Bereiche A1, A2, A3, ... der Substanz
hängt ganz
maßgeblich
von der Qualität
der Intensitätsminima 5 und
damit vom erreichten Sättigungsgrad
des Übergangs
A → B ab.
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In 1c ist
schematisch der Auslesevorgang des Zustands A dargestellt. Dazu
wird ein optisches Testsignal 7 so in den zu erfassenden
Probebereich P eingestrahlt, dass diejenigen gemäß 1b präparierten
Bereiche, in denen die Substanz in Zustand A verblieben ist, erfasst
werden. Eventuell noch existierende Bereiche der Substanz im Zustand A,
die außerhalb
des zu erfassenden Probenbereichs P liegen, dürfen dabei nicht erfasst werden.
Das von der Substanz im Zustand A ausgehende Fluoreszenzlicht wird
als Messsignal 8 von einem Detektor (nicht gezeigt) erfasst,
wobei eine eindeutige Zuordnung der detektierten Messsignale 8 zu
den Einzelbereichen A1, A2,
A3, ... vorgenommen wird.
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Der
in den 1a bis c dargestellte Zyklus wird
wiederholt, wobei die erzeugten Brennpunkte (und damit auch die
durch Phasenmodulation generierten Intensitäts-Nullstellen 5) bei jeder Wiederholung
etwas weiter geschoben werden. Auf diese Weise lässt sich der gesamte zu erfassende
Probenbereich mit einer Auflösung
im Subdiffraktionsbereich abbilden.
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2 zeigt
schematisch ein Ausführungsbeispiel
eines erfindungsgemäßen Mikroskops,
bei dem das optische Signal 4 und das Testsignal 7 jeweils über eine
Lichtleitfaser 9, 10 in den Strahlengang eingekoppelt
werden. Alternativ können
sich die Lichtquellen auch direkt im Mikroskop befinden, das Licht
kann mittels Freistrahloptik eingekoppelt werden, oder das optische
Signal 4 und das Testsignal 7 können beide über eine
einzige Lichtleitfaser eingekoppelt werden.
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Es
ist eine Einrichtung 11 zur Erzeugung von N-Brennpunkten
vorgesehen, wobei diese in dem in 2 dargestellten
Ausführungsbeispiels
als Mikrolinsen-Array 12 ausgeführt ist. Das Mikrolinsen-Array 12 umfasst
insgesamt N Linsen 13, von denen aus Gründen der Übersichtlichkeit lediglich
drei dargestellt sind.
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Das
aus der Faser 9 austretende Licht des optischen Signals 4 wird
durch eine Optik 14 kollimiert bzw. chromatisch vorfokussiert
bzw. defokussiert, um chromatische Abberationen der Mikrolinsen 13 des
Mikrolinsen-Arrays 12 auszugleichen. Das aus der Faser 10 austretende
Licht des Testsignals 7 wird ebenfalls durch eine Optik 15 kollimiert
bzw. chromatisch vorfokussiert bzw. defokussiert, was ebenfalls
dem Ausgleich chromatischer Abberationen der Mikrolinsen 13 dient.
Das Licht des optischen Signals 4 und des Testsignals 7 wird
an einem als dichroitisches Filter 16 ausgeführten optischen
Element 17 vereint.
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Nach
der Vereinigung durchlaufen die Lichtstrahlen das Mikrolinsen-Array 12 und
werden dabei in N-Teilstrahlen 18 aufgespalten. Die Teilstrahlen 18 werden
mittels einer nachfolgenden Optik 19 wieder kollimiert,
wobei die Optik 19 in einem Abstand zu den Mikrolinsen 13 angeordnet
ist, die der Summe der Brennweiten der Mikrolinsen 13 und
der Optik 19 entspricht.
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Das
optische Signal 4 durchläuft einen Phasenfilter 20,
mit dem eine Modulation der Pupillenfunktion des optischen Signals 4 derart
erfolgt, dass in jedem Brennpunkt mindestens eine Intensitäts-Nullstelle
entsteht. Zur Vermeidung, dass auch das Testsignal 7 den
Phasenfilter 20 durchläuft,
ist vor dem Phasenfilter 20 ein dichroitisches Filter 21 angeordnet,
mit dem das optische Signal 4 und das Testsignal 7 voneinander
getrennt werden. Anstelle des dichroitischen Filters 21 könnte auch
ein AOBS eingesetzt werden. Das Testsignal 7 wird um den Phasenfilter 20 herumgeführt und
hinter dem Phasenfilter 20 wieder mit dem optischen Signal 4 vereint.
Zur Vereinigung dient ein dichroitisches Filter 22, wobei
auch hier wiederum ein AOBS eingesetzt werden könnte.
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Zwischen
der Trennung und der Vereinigung des optischen Signals 4 und
des Testsignals 7 sind optische Elemente 23, 24 zur
Strahlumlenkung im Strahlengang angeordnet, wobei es sich hier konkret um
Spiegel 25, 26 handelt. Die Lichtstrahlen durchlaufen
anschließend
weitere Optiken 27–30 zur Strahlformung
und werden mit einem Mikroskopobjektiv 31 in die zu untersuchende
Probe 1 fokussiert.
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An
einem optischen Element 32, dass als dichroitisches Filter 33 ausgeführt ist
und zwischen der Optik 19 und dem Objektiv 31 im
Strahlengang positioniert ist, wird das gestrichelt dargestellte
Schaltsignal 2, das über
eine Lichtleitfaser 34 in das Mikroskop eingekoppelt wird,
mit dem optischen Signal 4 und dem Testsignal 7 vereint.
Alternativ kann sich die Lichtquelle des Schaltsignals 2 auch
unmittelbar im Mikroskop befinden, oder das Licht kann mittels Freistrahloptik
eingekoppelt werden.
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Das
gepunktet dargestellte Messsignal 8, bei dem es sich im
dargestellten Beispiel um Fluoreszenzlicht handelt, wird mit dem
Objektiv 31 gesammelt und kollimiert. Anschließend wird
das Messsignal 8 an einem als dichroitisches Filter 35 ausgeführten optischen
Element 36 vom restlichen Strahlengang getrennt und mittels
eines weiteren optischen Elements 37 auf einen Detektor 38 fokussiert.
Der Detektor 38 ist als CCD-Kamera 39 ausgeführt. Zur Erzielung
einer detektionsseitigen Konfokalisierung können den mittels der einzelnen
Mikrolinsen 13 erzeugten Fokussen jeweils einzelne Kamerapixel
bzw. Kamerapixelbereiche zugeordnet werden (nicht gezeigt). Je kleiner
diese Bereiche sind, desto besser ist die Konfokalisierung.
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Zum
Rastern der Probe 1 werden die Mikrolinsen 13 des
Mikrolinsen-Arrays 12 in geeigneter Weise bewegt. Die Bewegungen
können
insbesondere in Form von lateralen Bewegungen oder Rotationen durchgeführt werden.
Das Rastern der Probe 1 kann auch durch einen sich bewegenden
Scannspiegel 40 im Strahlengang erfolgen.
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Hinsichtlich
weiter vorteilhafter Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens
und des erfindungsgemäßen Mikroskops
wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil der
Beschreibung sowie auf die beigefügten Patentansprüche verwiesen.
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Schließlich sei
ausdrücklich
darauf hingewiesen, dass die voranstehend beschriebenen Ausführungsbeispiele
lediglich zur Erörterung
der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele
einschränken.