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Die
konfokale Lasermikroskopie ist unter anderem das Werkzeug für die definierte
Ansteuerung von Mikroobjekten. Auf dieser Basis wurden vielfältige Methoden
zur Untersuchung und Beeinflussung mikroskopischer Objekte vorgeschlagen,
so z.B. Denk in [
US 5,034,613 ,
TPA], Liu in [
US 6,159,749 , Tweezer]
oder
Karl Otto Greulich in „Micromanipulation by Light
in Biology and Medicine" 1999 Eine Kombination
aus einem bildgebenden Punkt- bzw. Linienscan-System und einem „Manipulator"-System rückt zunehmend
in das Interesse der Fachwelt.
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Das
Interesse an der Beobachtung und Analyse schneller mikroskopischer
Prozesse bringt neue Geräte
und Verfahren [z.B. Linienscanner LSM 5 LIVE] hervor, deren Kombination
mit obigen Manipulationsmethoden zu neuen Einsichten führt. Hierbei steht
insbesondere die simultane mikroskopische Beobachtung einer lichtinduzierten,
ortsaufgelösten Proben-Manipulation
mit Hilfe eines geeigneten bildgebenden Systems im Vordergrund (
US 6094300 ,
DE 10 2004 03 49 87 A1 ).
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Moderne
Mikroskope versuchen daher eine möglichst große Anzahl flexibler und optisch äquivalenter
Aus- und Einkoppelstellen anzubieten [
DE 10 2004 01 64 33 A1 ].
Die gleichzeitige Verfügbarkeit von
mindestens zwei Einkoppelstellen für unabhängige Scan-Systeme ist dabei
besonders wichtig, um Beschränkungen
in der zeitlichen Auflösung
aufgrund langsamer mechanischer Schaltprozesse zu vermeiden. Neben
der Tubus-Schnittestelle sind an Mikroskopstativen weitere Einkoppelstellen
an den Seiten (vorzugsweise in einem erweiterten Unendlichraum zwischen
Mikroskopobjektiv und Tubuslinse; „Sideports") sowie an der Stativ-Rückseite
(typischerweise optisch modifizierte Auf- bzw. Durchlichtachse mit
geeigneter Tubuslinse; „Rearports") sowie der Unterseite
(„Baseport") denkbar.
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Prinzipiell
sind dabei Anordnungen mit gemeinsamer Einstrahlrichtung (entweder
Auflicht oder Durchlicht) oder entgegengesetzter Einstrahlrichtung (Auflicht
und Durchlicht) denkbar. Abgesehen vom applikativen Hintergrund
wird oftmals aus gerätetechnischer
Sicht die gemeinsame Einstrahlrichtung bevorzugt.
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Für diesen
Fall ist der Einsatz von mindestens einem Element erforderlich,
das die Strahlengänge
beider Geräte
im Raum zwischen den Scannern der simultan zu betreibenden Scan-Systeme und
dem Objektiv vereinigt. Gemäß dem Stand
der Technik sind hierbei verschiedenste strahlvereinigende Elemente
denkbar, wie beispielsweise optomechanische Bauteile wie geeignet
beschichtete Strahlvereiniger- Planplatte
und Strahlvereinigerkeile, Strahlvereinigerwürfel und ein Polarisationsationsteiler.
Weiterhin denkbar sind strahlvereinigende akustooptische Modulatoren
und Deflektoren.
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Die
mechanischen Anforderungen an die Genauigkeit von Orts- und Winkellage
dieses strahlvereinigenden Elementes sind dabei sehr hoch. Ein fehlerhafter
Einbauwinkel α verursacht
in Reflektion eine Strahlkippung um 2α. Befindet sich das strahlvereinigende
Element beispielsweise im Unendlichraum zwischen einer Tubuslinse
der Brennweite fTL = 164 mm und einem Objektiv
der nominellen Vergrößerung M
= fTL/fObj = 40x,
so führt
bereits eine Winkelabweichung von 2α = 1' (Lageabweichung des Strahlvereinigers
0,5') zu einer Abweichung Δ = (fTL/M)·tan
2α = 1.2 μm beider
Scanfelder in der Objektebene. Bei einem Sehfeld 18 (Bilddiagonale)
entspricht dies bereits einer Abweichung von ca. 0,4% der Seitenlänge des
Scanfeldes. Bei den üblichen Bildformaten
von 512 × 512
bzw. 1024 × 1024
entspricht dies einer Abweichung von 2–4 Bildpixeln. Neben den hohen
mechanischen Anforderungen an die mechanische Positionierung des
strahlvereinigenden Elementes bestehen ähnlich anspruchsvolle Toleranzvorgaben
an die mechanischen Schnittstellen des bildgebenden bzw. manipulierenden Scan-Moduls
(Kippfehler und Lateralversatz der Schnittstelle, Zwischenbildlage
in axialer Richtung, Verdrehung). Weiterhin bedingen thermische
Einflüsse
(Aufwärmeerhalten
des Mikroskop-Systems, Schwankungen der Umgebungstemperatur) sowie undefinierte
statistische Effekte, dass insbesondere bei hochgenaue Messungen
die Deckung der Scanfelder von manipulierendem und bildgebendem
System wiederholt angepasst werden muß.
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Erfindung:
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Zur
Kompensation der über
die mechanische Toleranzkette nicht vollständig beherrschbaren Pixelverschiebung
(x, y) zwischen manipulierenden und bildgebendem Scanmodul wird
in dieser Anmeldung eine Kalibrierung derart vorgeschlagen, daß mit Hilfe verschiedener
Methoden die Lageabweichungen der Scanfelder beider Systeme bestimmt
und die daraus resultierende Koordinatentransformation (Skalierung,
Verdrehung, Verschiebung) rechnerisch ermittelt und in der Ansteuerung
von zumindest einem Scan-System berücksichtigt wird.
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Hierbei
ist zu beachten, dass die resultierenden Bilddeckungsparameter von
zahlreichen Geräteeinstellungen
beeinflusst werden. Ein Beispiel hierfür sind die verschiedenen Hauptfarbteiler
eines konfokalen Laser Scanning Mikroskops, welche bei vielen kommerziellen
Geräten
auf einem motorisierten Hauptfarbteilerrad angeordnet sind. Werden
die Anregungsstrahlen hierbei an dem Hauptfarbteiler unter 90° reflektiert,
so machen sich bereits kleine Winkelfehler bei der Scanfelddeckung
bemerkbar. Beispiele für
andere einstellbare Geräteparameter,
welche die Scanfeld-Deckung maßgeblich
beeinflussen können, sind
verfahrbare Optiken (z.B. Sehfeld- bzw. Pupillen-Zoom) sowie Nichtlinearitäten und
dynamische Abweichungen der in den jeweiligen Scan-Systemen verwendeten
Strahlablenkeinrichtungen (z.B. gewählte Scan-Speed und Scan-Zoom
bei Geräten
auf Basis von Galvo-Scannern). Hinzu kommt dass in Abhängigkeit
der bei verschiedenen Applikationen eingesetzten Anregungs- und Manipulations-Wellenlängen sowie
des jeweilig verwendeten Objektivs die Wellenlängenabhängigkeit der z-Ablage zu kalibrieren
ist. Unter Vorhalt des Farblängsfehlers
des jeweilig eingesetzten Objektivs kann der Abgleich z-Ebene hierbei
in eleganter Weise über
eine verfahrbare Kollimatoroptik des bildgebenden und/oder manipulierenden
Systems erfolgen.
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In
Abhängigkeit
der jeweiligen Applikation kann sich sowohl für das manipulierende als auch
für das
bildgebende System der spektrale Nutzbereich grundsätzlich vom
ultravioletten bis zum infraroten Spektralbereich erstrecken. Applikativ
typische Manipulationswellenlängen
sind z.B. 351, 355 und 364 nm (Photo-Uncaging), 405 nm (Photokonvertierung,
Kaede, Dronpa, PA-GFP), 488 und 532 nm (Photobleichen, FREI, FRAP,
FLIP) sowie 780–900
nm (Multi-Photonen-Bleichen z.B. MPFRAP, 2-Photonen Uncaging; direct multiphoton
stimulation). In Abhängigkeit
der zusammengeführten
Wellenlängen
als auch der Ankoppelpositionen von bildgebendem und manipulierendem
System ergeben sich zahlreiche applikativ sinnvolle Typen dichroischer
Strahlvereiniger. 1 zeigt eine Auswahl der spektral
möglichen
Eigenschaften applikativ relevanter Strahlvereiniger-Typen, wobei
die Manipulationswellenlängen
355 nm, 405 nm, 488 und 532 nm sowohl in Transmissions- wie auch
in Reflektionsrichtung eingesetzt werden können. Neutralvereiniger (z.B.
T20/R80) sind hierbei für
verschiedene Applikationen universell einsetzbar und ermöglichen
zudem auf einfache Weise Applikationen, bei denen sowohl für das bildgebende System
als auch für
das Manipulations-System gleiche Laserwellenlängen eingesetzt werden (insbesondere
FRAP).
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Typischerweise
besteht die Anforderung, in Abhängigkeit
der jeweiligen Applikation verschiedene Strahlvereinigertypen bei
einem Mikroskop-System verwenden zu können. Zu diesem Zweck wird eine
motorisierte Wechseleinrichtung eingesetzt. Dies kann z.B. ein motorisierter
Reflektorrevolver im Bereich des Unendlichraumes zwischen Objektiv
und Tubuslinse sein, wie er in 2 dargestellt
ist. Eine Alternative zu dem dargestellten Reflektorrevolver ist beispielsweise
ein entsprechender Reflektorschieber. Die Wechseleinrichtung für die verschiedenen Strahlvereiniger
bedingt weitere Einflußgrößen auf die
Deckung der Scanfelder des bildgebenden und manipulierenden Systems.
So führen
bereits geringe gegenseitige Abweichungen der Strahlvereinigerausrichtung
insbesondere in Reflektionsrichtung zu einer messbaren Scanfeldverschiebung.
Eine weitere fehlerbehaftete Größe ist mechanische
Reproduzierbarkeit (Strahlvereiniger-Ort und Strahlvereiniger-Ausrichtung)
der Rastposition der Wechseleinrichtung. Somit steigen einerseits
im Vergleich zu gewöhnlichen
lichtmikroskopischen Systemen die Genauigkeits- und Reproduzierbarkeitsanforderungen
der Wechseleinrichtung und andererseits der Anspruch an die praktische
Handhabung der oben erwähnten Kalibriermethode.
Auch der komplette Wechsel der in 2 dargestellten
Revolvereinrichtung kann aufgrund von Restfehlern der mechanischen
Aufnahme zu einer Abweichung der Scanfeld-Deckung führen und
damit eine Neukalibrierung erfordern.
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Zusammenfassend
stellt sich somit ganz allgemein die Anforderung nach einer möglichst
einfachen Kalibriermethode, welche es erlaubt die Scanfeld-Deckung
von bildgebenden und manipulierenden System in Abhängigkeit
der variierenden Geräteeinstellungen
zu korrigieren. Diese Kalibriermethode soll insbesondere auch vom
Gerätebenutzer
angewendet und nach Möglichkeit
automatisiert durchgeführt
werden können.
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Technische Lösung der
beschriebenen Probleme
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Die
Erfindung wird nachstehend anhand folgender schematischer Darstellungen
näher beschrieben:
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3a zeigt
die nicht übereinstimmenden Scanfelder
eines abbildenden Scansystems (imaging) manipulierenden Systems
(manipulating) mit voneinander abweichenden Orientierungen der schematisch
dargestellten X/Y Orientierung.
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Sowie
Orientierungspunkte P1–P3,
deren Lage auf beiden Systemen zur Überdeckung herangezogen wird.
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3b zeigt
beispielhaft eine affine Transformation bezüglich der Orientierungspunkte
P1–P3 und
ihrer Lage.
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In 4 sind
schematisch die verschiedenen Methoden die im weiteren beschrieben
werden, dargestellt; links die Erstellung von statischen Referenzpunkten
durch das eine Scansystem, vorzugsweise des Manipulationssystems
(in Reflekion, Fluoreszenz oder beider Photokonvetrierung, allgemein jeder
Probenmodifikation durch Beleuchtung (auch z.B. Ablation)), rechts
die crosscorreletion anhand von Bildmerkmalen beider Scanner.
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In 5a wird
das abbildende System in Transmission und das manipulierende in
Reflexion ein- bzw. ausgekoppelt, in 5b ist
es umgekehrt.
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In 5c ist
ein stationärer
Fokus des Manipulationssystems dargestellt, wobei im abbildenden
System mindestens drei solcher Foki in Reflektionsrichtung direkt
erfasst werden.
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In 6a–c wird
statt des Fokus ein von einem Manipulationslaser erzeugter liumineszierender oder
anders durch Frequenzkonversion erzeugter Leuchtpunkt erfasst und
herangezogen.
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In 7 werden
durch das Manipulationssystem erzeugte lichtinduzierte Probenmodifikationen
als Punkte durch die Bilderfassung erfasst und herangezogen. Dieses
kann statisch nacheinander oder auch während der Scanbewegung der
beiden Systeme (durch ein- und Ausschalten des Manipulatorlichtes
an verschiedenen Orten) erfolgen In 8 wird ein
strukturiertes Kalibriersubstrat, von beiden Systemen detektiert
und die Lage der Linien zur Kalibrierung herangezogen, entweder
durch crosscorrelation oder interaktiv durch den Benutzer (Verschiebung
zueinander auf der Anzeige).
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10 zeigt
einen in beiden Systemen angeordneten separaten Detektor (Quadrantendiode oder
CCD Empfänger)
unmittelbar am Strahlvereiniger, der die transmitterte bzw. reflektierte
Reststrahlung zur Kalibrierung erfasst und auswertet. Werden für das bildgebende
und/oder manipulierende System eine programmierbare, automatisiert
ansteuerbare Strahlablenkeinrichtung eingesetzt, so ist das beschriebene
Problem der pixelgenauen Scanfeld-Deckung in eleganter Weise mit
Hilfe einer geeigneten Koordinatentransformation lösbar. So
können
bei Abwesenheit einer Winkelverzerrung entsprechend der 3a die
Koordinatensysteme der beiden Scansysteme bereits im zweidimensionalen Fall
gegeneinader
- – um den Translationsvektor
(m0, n0) parallel
verschoben
- – um
den Winkel ψ verdreht
- – um
x- bzw. y-Skalierungsfaktoren gestaucht bzw. gestreckt
sein.
In diesem Fall ist mit Hilfe einer affinen Abbildung eine Transformation
der Koordinaten k und j des manipulierenden Systems in die jeweiligen
Koordinaten m und n des bildgebenden Systems möglich (vgl. 3b): m = m0 + a11k
+ a12j (1a) n = n0 + a21k
+ a22j (1b)
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Werden
also im Rahmen einer geeigneten Kalibrierung die Koordinaten von
mindestens drei Punkten in den beiden unabhängigen Scan-Koordinatensystemen
bestimmt, so können
mit Hilfe der Gleichungen (1a) und (1b) für beliebige Scanfeld-Punkte
die Koordinaten beider Scansysteme ineinander umgerechnet werden.
Bei diesem Kalibrierprozeß sind
insgesamt 6 Bilddeckungsparameter zu ermitteln: Offset (Nullpunktlage),
Winkel (gegenseitige Verdrehung) und drei Streckungsparameter. Dies ermöglicht es
somit, die Strahlablenkeinrichtung des manipulierenden Systems so
anzusteuern, dass eine pixelgenaue Deckung mit dem Objektfeld des
bildgebenden Systems möglich
ist (bzw. umgekehrt).
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Dieses
Verfahren zur Realisierung einer pixelgenauen Scanfeld-Deckung der
beiden unabhängigen
Scan-Systeme setzt voraus, dass mindestens ein System über eine programmierbare,
automatisiert ansteuerbare Strahlablenkeinrichtung verfügt. Hierbei
kann beispielsweise eines der folgenden Scan-Prinzipien zugrunde
liegen:
- – Galvo-Spiegel
bzw.
- – auslenkbare
insbesondere dreh- oder kippbare Spiegel, z.B. schrittmotorsteuerte
Ablenkspiegel
- – Polygon-Spiegel
- – akustooptische
Ablenkeinrichtungen, insbesondere akustooptische Deflektoren (AODs)
- – bewegte
Lochmaske insbesondere in Form einer Nipkow-Scheibe
- – bewegte
(Monomode-)Fasern
- – bewegliche
Objektive oder Objektivteile
- – mechanische
x- und y-Verstellung eines geeigneten Teiles oder des gesamten Scansystems, z.B.
mittels akustooptischer Modulatoren
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(Da
beide Scansysteme im Sinne der Erfindung voneinander unabhängig sein
müssen,
ist eine mechanisch x- und y der Probe dagegen nicht zulässig.)
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Im
Falle der häufig
bei kommerziellen Systemen eingesetzten Galvo-Spiegel ist beispielsweise eine
Transformation entsprechend Gleichung (1a, b) durch geeignete Anpassung
der Gain- und Offset-Werte der zugehörigen Ansteuerelektronik möglich.
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Bei
konfokalen Systemen ist grundsätzlich eine
Deckung der Scankoordinaten von bildgebendem und manipulierendem
System im dreidimensionalen Raum erforderlich. So wie in der Ebene
kann verallgemeinernd auch eine Transformation der beiden Scan-Koordinatensysteme
im Raum vorgenommen werden: x = φ1(u, v, w) (2a) y = φ2(u, v, w) (2b) z = φ3(u, v, w) (2c)
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Bei
konfokalen bildgebenden Systemen werden dreidimensionale Proben-Objekte
erfast, indem jeweils bei verschiedenen Probentiefen z mikroskopische
Bilder der Schnittebenen x, y aufgenommen werden. Zwischen der Aufnahme
der einzelnen konfokalen Schnittbilder wird die Probentiefe z jeweils durch
eine mechanische Verstellung der Probe, des Objektiv bzw. der gesamten
Mikroskopeinheit variiert. Neben den üblichen (mikro-)mechanischen
Antriebstechniken können
hierbei insbesondere bei schnellen bildgebenden Systemen zur z-Verstellung auch
akustooptische Modulatoren eingesetzt werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden daher für
das bildgebende und manipulierende System zwei in x- und y-Richtung
unabhängige Scan-Systeme
eingesetzt, wobei mindestens ein System über eine programmierbare, automatisiert ansteuerbare
Strahlablenkeinrichtung verfügt,
so dass mit Hilfe der affinen Abbildung (1a, b) eine pixelgenaue
Scanfeld-Deckung möglich
ist. Der Scanprozeß in
z-Richtung wirkt bei dieser bevorzugten Ausführungsform dagegen auf beide
Systeme gemeinsam; z.B. indem die Probe bzw. das gemeinsame Objektiv
in z-Richtung verstellt werden. In diesem Fall ist zu gewährleisten,
dass die Scanebenen der beiden unabhängigen Module deckungsgleich
sind. Eine gegenseitige Justage stellt hierbei sicher, dass beide
Scanebenen nicht gegeneinander verkippt sind. Der Abgleich der parallel
ausgerichteten Scanebenen in z-Richtung erfolgt dabei voteilhafterweise mit
Hilfe von geeigneten motorisiert verstellbaren Optiken. Hierbei
kommen vorzugsweise die in
DE
197 02 753 A1 beschriebenen Kollimatoren zur Anwendung.
Der Einsatz von motorisierten Optiken zum z-Abgleich beider Scanebenen
ermöglicht
insbesondere die automatisierte Korrektur chromatischer Längsfehler
der verschiedenen eingesetzten Objektive bei den verschiedenen Anregungs-
und Manipulationswellenlängen.
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Haben
die beiden unabhängigen
Scanmodule dagegen keine gemeinsame Einstrahlrichtung auf die Probe,
so ist im allgemeinen für
beide Systeme auch eine unabhängige
Scaneinrichtung in z-Richtung erforderlich. Um in diesem Fall im
dreidimensionalen Raum eine pixelgenaue Deckung der x, y und z-Scaneinrichtungen
zu realisieren ist dagegen die verallgemeinerte Gleichung (2a–c) erforderlich.
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Die
Bestimmung der jeweiligen Transformationsgleichung mit deren Hilfe
die beiden unabhängigen
Scan-Systeme pixelgenau zur Deckung gebracht werden können erfordert
eine geeignete Kalibriermethode. So wurde bereits erwähnt, dass
sich die affine Abbildungsgleichung (1a, b) eindeutig ermitteln
lässt,
wenn die Koordinaten von wenigstens drei Scanfeld-Punkten in beiden
Scan-Koordinatensystemen bekannt sind. Die 4 gibt eine
schematische Übersicht über die
verschiedenen Kalibriermethoden zur Bestimmung der Scanfeld-Deckung. Eingangs
wurde bereits erläutert,
dass die Deckung der Scanfelder der beiden unabhängigen Scansysteme von verschiedenen
Einstellgrößen abhängt. So bedingen
beispielsweise bereits feine Winkel-Abweichungen zwischen den verschiedenen
Haupt- und Nebenfarbfarbteilern des bildgebenden Systems oder zwischen
den verschiedenen eingesetzten Strahlvereinigern (vgl. 1 und 2)
messbare Unterschiede bei der Deckung der beiden Scan-Systeme. Insbesondere
bei den kommerziell häufig
eingesetzten Scan-Systemen
mit Galvo-Spiegeln als Strahlablenkeinrichtung wird die Deckung
der beiden Scanfelder darüber
hinaus auch von der an beiden Systemen eingestellten Scan-Geschwindigkeit und dem
jeweils gewählten
Scan-Zoom abhängen.
In einer Ausführungsform
der Erfindung werden die in 4 dargestellten
Kalibriermethoden daher für verschiedene
Einstellkombinationen der die Scanfeld-Deckung beeinflussender Stellgrößen des
Systems ermittelt (z.B. Bestimmung der Abbildungsgleichung (1a,
b) für
die verschiedenen Haupt- und Nebenfarbteiler des Systems und die
verschiedenen Strahlvereiniger der in 2 dargestellten
Wechseleinrichtung). Dies kann für
die jeweilige Einstellkombination individuell durch den Gerätebenutzer
erfolgen, wobei eine geeignete Bedien-SW zur Verfügung steht.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung ermöglicht
dagegen die automatisierte Bestimmung individueller Kalibrierdatensätze für sämtliche
Einstellkombinationen aller relevanten Stellgrößen wobei die Steuer-SW in
Abhängigkeit
der eingestellten Gerätekonfiguration
auf den jeweilig relevanten Kalibrierdatensatz zurückgreift.
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Bei
einer erfindungsgemäßen Kalibriermethode
wird die Position des ortsstabilen Fokus des manipulierenden Scan-Systems
mit Hilfe des scannenden bildgebenden Systemes bestimmt. Wird diese
Prozedur für
mindestens drei Fokuspositionen des manipulierenden Systemes durchgeführt, ist
eine eindeutige Bestimmung der Transformationsgleichung (1a, b)
möglich.
Es sind verschiedene praktische Ausführungsformen dieser Kalibriermethode denkbar:
- 1. Im einfachsten Fall wird gemäß 5a und
b der stationäre
Laserfokus des manipulierenden Systems direkt mit Hilfe des konfokalen
bildgeben Systemes beobachtet. Bei dieser Kalibriermessung „rastert" das bildgebende
Scanmodul ohne Einstrahlung von Anregungslicht die Objektebene ab.
Genau dann wenn sich der stationäre
Fokus des manipulierenden Systems innerhalb des Detektionsvolumens
des bildgebenden Systems befindet, erscheint der Manipulationsfokus
vor einem dunklen Bildhintergrund (5c). Da
typischerweise das manipulierende und das bildgebende System die
gleiche Einstrahlrichtung auf die Probe aufweisen, wird hierbei
ein Oberflächen-Reflex
des Manipulatorfokus an einem in der Objektebene befindlichen Spiegel
beobachtet, wobei zumindest ein geringer Anteil dieses Reflexes
(gestrichelt gezeichnet in 5a. und b.)
den Strahlvereiniger in Richtung des bildgebenden Systems passieren
muß. Diese
Methode ist daher besonders gut geeignet, wenn ein Neutralteiler
als Strahlvereiniger verwendet wird. Aufgrund der typischerweise
sehr großen
Sensitivität bildgebender
konfokaler Systeme eignet sich diese Kalibriermethode in der Praxis
aber auch in gleicher Weise für
beliebige dichroitische Strahlvereiniger, bei welchen im Idealfall
weniger als 1% des reflektierten (gestrichelt gezeichneten) Manipulationslichtes
den Strahlvereiniger in Richtung des bildgebenden Systems passiert.
Weiterhin erfordert diese Methode im bildgebenden System eine Emissionsfilterbestückung, welche
eine direkte Beobachtung der Manipulationswellenlänge ermöglicht.
Dies ist bei kommerziellen Systemen insbesondere im NIR- und UV-Bereich
oftmals nicht gewährleistet.
- 2. Bei einer Abwandlung der Kalibriermethode 1. entsprechend 6a.–c.
wird der stationäre
Fokus des manipulierenden Systems indirekt durch das bildgebende
System beobachtet. Hierbei detektiert das bildgebende System eine
Frequenzkonvertierung wie Lumineszenz, nichtlineare Prozesse, inelastische
Streuung wie Raman, welches der ortsstabile Fokus des manipulierenden
Systems in einem geeigneten, in der Objektebene bzw. einer Zwischenbildebene
befindlichen Substrat erzeugt. Auch hierbei rastert das bildgebende
System die Objektebene ohne Einstrahlung von Anregungslicht ab.
Da nicht die Wellenlänge des
manipulierenden Systems direkt beobachtet wird,
- 3. sondern das von diesem im Bereich des sichtbaren Spektrums
erzeugte Licht, ist dieses Kalibrierverfahren oftmals besser den
spektralen Eigenschaften der im System verwendeten Strahlvereiniger
und Emissionsfilter angepasst als Kalibriermethode 1. Entsprechend
erlaubt das Kalibrierverfahren 2 auch bei Verwendung von Manipulationslicht
im Bereich des UV bzw. NIR – also
einem Spektralbereich, in dem die Detektionsoptik (Pinholeoptik)
von kommerziellen bildgebenden Systemen typischerweise nicht korrigiert
ist – eine Anpassung
der Scanfeld-Deckung in z-Richtung. Idealerweise ist die Schichtdicke
des Kalibrier-Substrats,
in dem das manipulierende System die Lumineszenzstrahlung erzeugt,
so gering wie möglich,
da andernfalls – aufgrund
einer mangelnden Ortsdiskriminierung zum Streulicht – der im bildgebenden
System beobachtete Spot zu groß wird.
- 4. Bei einer weiteren Abwandlung der Kalibriermethoden 1. und
2. wird gemäß 7 ein
geeignetes unstrukturiertes Probensubstrat durch Beleuchtung mit
dem stationären
Fokus des manipulierenden Systems verändert. Bei dieser lichtinduzierten
Probenmodifikation kann es sich z.B. um das Ausbleichen, Photoaktivieren
bzw. Photokonvertieren eines Fluoreszenz-Farbstoffs handeln oder
auch um eine thermisch bzw. mechanisch induzierte Probenveränderung
(z.B. Laserablation). Entscheidend für den Kalibrierprozeß ist, dass sich
diese lichtinduzierte Modifikation ausschließlich auf den Bereich des stationären Fokus
des manipulierenden Systems beschränkt und zumindest zeitweilig
stabil ist. Nachdem diese laserinduzierte Probenmodifikation an
zumindest drei unterschiedlichen Scanfeld-Positionen vorgenommen
wurde, wird das so strukturierte Probensubstrat mit Hilfe des bildgebenden
Systems vermessen. Der Unterschied zu den Kalibrierverfahren 1.
und 2. besteht darin, dass die Kalibrierung in einem zweistufigen
Prozess erfolgt, wobei bei die der Probenstrukturierung nachfolgende
Bildaufnahme mit dem Anregungslicht des bildgebenden Systems erfolgt,
ggf. auch mittels Proben, bei denen eine Probenmodifikation, z.B. über optische
Schalter, wieder rückgängig gemacht
werden kann.
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Entscheidend
für die
Funktion der drei beschriebenen Kalibrierverfahren ist jeweils eine
korrekte Justage der konfokalen Blende des jeweiligen bildgebenden
Systems (z.B. Pinhole bei Punktscannern und Schlitzblende bei Linienscannern).
Bei den Kalibrierverfahren 2. und 3. liegt das Signallicht typischerweise
im Bereich des sichtbaren Spektrums (also in dem auch bei den meisten
Applikationen typischen Detektionsbereich). Daher bestehen bei diesen
Kalibrierverfahren die gleichen Anforderungen an die korrekte Justage
der konfokalen Blende wie bei handelsüblichen Konfokal-Mikroskopen.
Bei der Kalibriermethode 1 ist die konfokale Blende dagegen so zu
justieren, dass eine direkte Detektion von Laserlicht erfolgen kann,
wobei der Spektralbereich ggf. auch im Bereich des UV bzw. NIR liegt.
Wellenlängenabhängigkeiten
des Detektionskanals vom bildgebenden System werden somit bei Kalibriermethode
1 die größte Rolle
spielen. In einer Ausführungsform
der Erfindung werden daher die drei Kalibrierverfahren 1–3 mit automatischen
Positions-Optimierung
der konfokalen Blende kombiniert. Diese automatisierte Justage der
konfokalen Blende kann interaktiv vom Gerätebenutzer durchgeführt werden,
wobei eine geeignete SW-Oberfläche
zur Verfügung steht
oder auch vollautomatisiert vom Mikroskopsystem im Rahmen des eigentlichen
Kalibrierprozesses durchgeführt
werden. Die optimalen Justage-Positionen für die jeweiligen Geräteinstellungen
können hierbei
in entsprechenden Kalibrierdatensätzen abgelegt werden.
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Verallgemeinernd
kombinieren die Kalibriermethoden 1 bis 3 jeweils einen dynamischen Scan-Prozeß des einen
Moduls mit einer statischen Fokus-Positionierung des jeweils anderen
Scan-Moduls. Bei den meisten der eingangs beschriebenen Applikationen
wird dagegen kein Spot-Bleichen durchgeführt, sondern der Bleichprozeß erfolgt
innerhalb einer ausgedehnten „region
of interest". Alle
bisher erläuterten
Kalibrier-Methoden haben somit den Nachteil, dass dynamische Effekte
der Strahlablenkeinrichtung des einen Scan-Moduls bei der Kalibrierung
der Scanfeld-Deckung grundsätzlich
nicht ermittelt werden können.
Wie bereits erläutert
treten derartige dynamische Effekte insbesondere bei Galvo-Scannern
auf, wobei die Scanfeld-Deckung beispielsweise von der jeweils ausgewählten Scan-Speed
und dem jeweiligen Scan-Zoom abhängen
kann.
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Dieser
Nachteil wird gelöst
durch eine grundsätzlich
andere in 8 aufgeführte Kalibriermethode. Bei
diesem dynamischen Kalibrier-Verfahren („area based image matching") wird ein in der
Objekt- bzw. einer gemeinsamen Zwischenbildebene befindliches strukturiertes
Kalibrier-Präparat
jeweils von beiden unabhängigen
Scan-Systemen vermessen, wobei
die Ansteuerung der Strahlablenkreinrichtung von zumindest einem
der beiden Scan-Systeme gemäß Gleichung
(1a; b) so angepasst wird, dass die mit beiden Systemen aufgenommenen
Bilder der strukturierten Kalibrierprobe zur Deckung gebracht werden.
Diese Kalibrierprozedur kann interaktiv vom Gerätebenutzer durchgeführt werden,
indem mit Hilfe einer geeigneten SW-Oberfläche die mit beiden Scan-Systemen
aufgenommenen Probenbilder „on-line" überlagert werden. Es ist aber
auch eine vollautomatisierte Kalibrier-Routine denkbar, bei der die
optimale Überlagerung
der mit beiden Scansystemen aufgenommenen Probenbilder rechnerisch
z.B. mit Hilfe der Methode der Kreuzkorrelation ermittelt wird.
Werden als Strahlablenkeinrichtungen Galvo-Scanner eingesetzt, so
werden bei der Kalibrierung der Scanfeld-Deckung die elektronischen
Gain- und Offset-Einstellungen von zumindest einem Scan-System angepasst.
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Eine
Voraussetzung für
dieses Kalibrierverfahren ist, dass beide Scan-Systeme unabhängig voneinander
die Bildaufnahme der Kalibrierprobe ermöglichen. Falls in dem manipulierenden
System kein zur Bildaufnahme geeigneter Detektor (z.B. eine kostengünstige Diode
mit einfacher Grab-Elektronik) integriert ist, muss hierzu gemäß 8 ein
externer Detektor (vorzugsweise im Transmissions-Strahlengang) verwendet
werden.
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9 zeigt
ein Ausführungsbeispiel
für eine geeignete
strukturierte Kalibrierprobe. Hierbei kann es sich z.B. um eine
reflektierende Struktur auf einem Glassubstrat handeln bzw. umgekehrt
um eine transparente Struktur auf einem reflektierenden Substrat. Bei
der Kalibrierung wird das vom jeweiligen Scan-System an der dieser
Kalibrierprobe reflektierte bzw. transmittierte (bei Einsatz eines
externen Detektors) Laserlicht zur Bildaufnahme verwendet. Wird als
bildgebendes System ein Linienscanner mit einem Strichspiegel als
raumfilterndes Element (
DE
10 257 237 A1 ) verwendet, so kann weder das reflektierte
noch das transmittierte Laserlicht direkt detektiert werden. In
diesem Fall kann das beschriebene Kalibrierverfahren durchgeführt werden,
indem die Kalibrierstruktur in einem direkten Kontakt mit einem
homogenen Fluoreszenzsee gebracht wird, wobei eine dunkle Probenstruktur
vor einem hellen Fluoreszenzuntergrund detektiert wird. Eine andere
Möglichkeit besteht
darin, die Probenstruktur mit Hilfe einer Lampe im Weitfeld zu beleuchten
und mit Hilfe des konfokalen Scan-Systems abzurastern.
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Dieses
Verfahren eignet sich aufgrund der parallelisierten Datenerfassung
insbesondere dann, wenn als bildgebendes System ein konfokaler Linienscanner
verwendet wird.
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Dieses
Kalibrierverfahren hat den Vorteil eine dynamische Methode zu sein,
d.h. relative Änderungen
zwischen der Bildfeld-Deckung zwischen beiden scannenden Modulen
können
als Funktion der Scan-Geschwindigkeit und des Scan-Zooms direkt
bestimmt werden. Auf diese Weise können dynamische Effekte der
jeweiligen Strahlablenkeinrichtung in entsprechenden Kalibrierdatensätzen berücksichtigt
werden.
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Sämtliche
der bislang beschriebenen Methoden zur Optimierung der Scanfeld-Deckung
können mit
Hilfe einer geeigneten Software automatisiert werden, wobei jedoch
stets eine Interaktion des Gerätebenutzers
erforderlich ist. Die in 10 gezeigte
Anordnung ermöglicht
dagegen eine vollautomatisierte Kalibrierung der Scanfeld-Deckung ohne dass der
Anwender eingebunden werden muss. Hierbei wird jeweils der zweite
Ausgang des Strahlvereingers zur Bestimmung des gegenseitigen Scanfeld-Deckung der beiden
Scan-Systeme genutzt. So wird entsprechend der 10 selbst
bei dichroitischen Strahlvereinigern ein geringer Anteil des eingestrahlten
Lichtes in Richtung des zweiten Ausganges reflektiert bzw. transmittiert
werden. Befindet sich in dieser Position ein ortsauflösender Flächenbild-Detektor
(z.B. eine CCD- bzw. CMOS-Kamera
oder eine Quadrantendiode), so können
relative Lageabweichungen zwischen den beiden Scan-Modulen direkt bestimmt
und automatisiert nachkorrigiert werden ohne dass eine weitere Interaktion
des Benutzers (wie z.B. das Einlegen einer Kalibrierprobe in die Ojektebene)
erforderlich ist. Die in 10 dargestellte
Anordnung eignet sich somit insbesondere für automatisierte Regelprozesse,
die es ermöglichen, bei
schwankenden Umgebungseinflüssen
(z.B. Temperatur) und variablen Geräteeinstellungen (z.B. Strahlvereiniger,
Hauptfarbteiler, Zoom-Optiken, Objektive, Wellenlängen) die
jeweils optimale Scanfeld-Deckung geräteintern nachzukorrigieren.