JP2019532280A - 高周波数で可逆的に光スイッチング可能な蛍光種を検出する方法 - Google Patents
高周波数で可逆的に光スイッチング可能な蛍光種を検出する方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
・複数の異なるフルオロフォアを区別しながら試料を撮像し、
・自家蛍光/散乱ノイズを除去することを可能にする技法を使用して、フルオロフォアが高周波数で撮像されることを可能にし、
・一般に、混合物中の1つ又は複数の蛍光プローブを選択的且つ定量的に撮像することを目的とする。
(a)波長λ1であり、且つ角周波数ωで周期的に変調される第1の照明光線及び前記角周波数ωで周期的に変調される、λ1と異なるλ2の第2の照明光線を用いて、前記少なくとも1つの前記可逆的光スイッチング蛍光種を含有する試料を照明するステップと、
(b)そうして照明された前記試料によって発せられた蛍光放射線を検出するステップと、
(c)前記周期的に変調される第1の照明光線と同じ周期性を有し、且つ前記周期的に変調される第1の照明光線と直交する位相である前記蛍光放射線の強度の成分から振幅を抽出するステップと
を含み、
・前記第2の照明光線は、前記第1の照明光線に対して逆位相に変調され、及び
・前記第1の照明光線の平均強度、前記第2の照明光線の平均強度及びそれらの角周波数ωは、前記蛍光放射線の強度成分の前記振幅の最大に近づくように選択される、方法である。例えば、振幅は、最大の少なくとも75%、好ましくは80%、更に好ましくは90%に等しい値を有し得る。
(a)波長λ1であり、且つ角周波数ωiで変調される少なくとも2つの第1の照明成分を合算する第1の関数を用いて周期的に変調される第1の照明光線を用いて、前記可逆的光スイッチング蛍光種のそれぞれを含有する試料を照明することであって、前記第1の照明成分のそれぞれの前記角周波数ωiのそれぞれは、1つの前記可逆的光スイッチング蛍光種と関連付けられ、且つ1つ又は複数の他の前記角周波数ωiと異なる、照明することと、λ1と異なる波長λ2であり、且つ前記角周波数ωiで変調される少なくとも2つの第2の照明成分を合算する第2の関数を用いて周期的に変調される第2の照明光線を用いて試料を照明することであって、前記第2の照明成分のそれぞれの前記角周波数ωiのそれぞれは、前記第1の照明成分の前記角周波数ωiに等しい、照明することとを行うステップと、
(b)そうして照明された前記試料によって発せられた蛍光放射線(FLU)を検出するステップと、
(c)前記照明成分のそれぞれと同じ角周波数ωiを有し、且つ前記第1の照明成分のそれぞれと直交する位相である前記蛍光放射線の強度の成分の各振幅(代数)を抽出するステップと
を含み、
・前記角周波数ωiのそれぞれについて、前記角周波数ωiで変調された前記第2の照明成分のそれぞれは、前記角周波数ωiで変調された前記第1の照明成分のそれぞれと逆位相であり、及び
・前記第1の照明光線の平均強度、前記第2の照明光線の平均強度及び前記角周波数は、前記蛍光放射線の強度成分の前記振幅のそれぞれの最大に近づくように選択される、方法である。
− 前記可逆的光スイッチング蛍光種のそれぞれは、第1の化学状態及び第2の化学状態を有し得、前記状態の少なくとも一方は、蛍光であり、前記可逆的光スイッチング蛍光種のそれぞれは、第1の光誘導反応を介して前記第1の状態から前記第2の状態に変換可能であり、次に第2の光誘導反応を介して前記第1の状態に戻ることが可能であり、前記第1の照明光線は、平均強度
− 1つの前記可逆的光スイッチング蛍光種に対応する前記角周波数ωiのそれぞれについて、
− 前記ステップa)において、前記試料は、少なくとも1つの実質的に単色の照明光線によって照明され得る。
− 前記ステップb)及びc)は、前記蛍光放射線の同期検出を介して実施され得る。
− 本方法は、
d)前記ステップc)において抽出される前記蛍光放射線の強度の成分から前記可逆的光スイッチング蛍光種又は少なくとも1つの前記可逆的光スイッチング蛍光種の濃度を特定するステップ
も含み得る。
− 前記可逆的光スイッチング蛍光種又は少なくとも1つの前記可逆的光スイッチング蛍光種は、フォトクロミック蛍光タンパク質、及び蛍光プローブとの生体分子の複合体から選択される。
− 試料は、生体材料を含有し得る。
− 前記照明光線は、ある量の日光を含み、前記量の日光は、前記可逆的光スイッチング蛍光種によって受け取られる光強度に含まれるが、前記照明光線の平均強度以下のままである。
− 図においてIF inで示される、第1の照明光線FEX1と同相の成分、及び
− 図においてIF outで示される、励起ビームと直交する成分
に分解され得る。特許出願国際公開第2015075209 A1号パンフレットは、種Pの観測中に成分IF outを観測する利点及び根拠を開示している。
I(t)=I1(t)+I2(t) (35)
及び
2=20+αf(t) (39)
及び
1=10−αf(t) (40)
式(2)及び(3)を用いて、濃度1及び2の時間の関数としての変動を支配する微分連立方程式を解いて、
20=20+αa0 (57)
10=10−αa0 (58)
2n,sin=−1n,sin=bn,sin (59)
2n,cos=−1n,cos=an,cos (60)
であり、又は実際に、
20=20+αa0 (63)
10=10−αa0 (64)
2n,m,sin=−1n,m,sin=bn,m,sin (65)
2n,m,cos=−1n,m,cos=an,m,cos (66)
である。
Oj(t)=Q1,j1(t)+Q2,j2(t) (67)
蛍光放射If(t)を抽出すると、式(68)が与えられる。
IF(t)=O1(t)I1(t)+O2(t)I2(t) (68)
したがって、式(55)及び(56)によって時間依存性を用いて、
h2(t)=0 (81)
である。光スイッチングの一次式に発展させて、式(41)は、
20=20 (83)
10=10 (84)
h2(t)=sin(ωt+ψ) (94)
であり、式中、ε<<1である。
20=20 (96)
10=10 (97)
h2(t)=−sin(ω1t)−βsin(ω2t) (123)
を考慮し、式中、ε<<1である。この場合、
20=20 (125)
10=10 (126)
Claims (15)
- 少なくとも1つの可逆的光スイッチング蛍光種(P)を検出する方法であって、
(a)波長λ1であり、且つ角周波数ωで周期的に変調される第1の照明光線(FEX1)及び前記角周波数ωで周期的に変調される、λ1と異なるλ2の第2の照明光線(FEX2)を用いて、前記少なくとも1つの前記可逆的光スイッチング蛍光種を含有する試料を照明するステップと、
(b)そうして照明された前記試料によって発せられた蛍光放射線(FLU)を検出するステップと、
(c)前記周期的に変調される第1の照明光線(FEX1)と同じ周期性を有し、且つ前記周期的に変調される第1の照明光線(FEX1)と直交する位相である前記蛍光放射線(FLU)の強度の成分から振幅(IF out)を抽出するステップと
を含み、
・前記第2の照明光線(FEX2)は、前記第1の照明光線(FEX1)に対して逆位相に変調され、及び
・前記第1の照明光線(FEX1)の平均強度、前記第2の照明光線(FEX2)の平均強度及びそれらの角周波数ωは、前記蛍光放射線(FLU)の前記強度成分の前記振幅の最大に近づくように選択される、方法。 - 少なくとも1つの前記可逆的光スイッチング蛍光種(P)は、第1の化学状態及び第2の化学状態を有し、前記状態の少なくとも一方は、蛍光であり、前記可逆的光スイッチング蛍光種(P)又は前記可逆的光スイッチング蛍光種(P)のそれぞれは、第1の光誘導反応を介して前記第1の状態から前記第2の状態に変換可能であり、次に第2の光誘導反応を介して前記第1の状態に戻ることが可能であり、前記第1の照明光線は、平均強度
- 前記第1の照明光線(FEX1)の前記平均強度、前記第2の照明光線(FEX2)の前記平均強度及びそれらの角周波数ωは、前記蛍光放射線(FLU)の前記強度成分の前記振幅と、干渉種によって生成されるものと同じ周期性を有する蛍光強度成分の振幅との間の最小コントラストを保証するようにも選択される、請求項1又は2に記載の方法。
- 異なる動力学的性質を有する少なくとも2つの可逆的光スイッチング蛍光種(P)を検出する方法であって、
(a)波長λ1であり、且つ角周波数ωiで変調される少なくとも2つの第1の照明成分を合算する第1の関数を用いて周期的に変調される第1の照明光線(FEX1)を用いて、前記可逆的光スイッチング蛍光種(P)のそれぞれを含有する試料を照明することであって、前記第1の照明成分のそれぞれの前記角周波数ωiのそれぞれは、1つの前記可逆的光スイッチング蛍光種(P)と関連付けられ、且つ1つ又は複数の他の前記角周波数ωiと異なる、照明することと、λ1と異なる波長λ2であり、且つ前記角周波数ωiで変調される少なくとも2つの第2の照明成分を合算する第2の関数を用いて周期的に変調される第2の照明光線(FEX2)を用いて前記試料を照明することであって、前記第2の照明成分のそれぞれの前記角周波数ωiのそれぞれは、前記第1の照明成分の前記角周波数ωiに等しい、照明することとを行うステップと、
(b)そうして照明された前記試料によって発せられた蛍光放射線(FLU)を検出するステップと、
(c)前記照明成分のそれぞれと同じ角周波数ωiを有し、且つ前記第1の照明成分のそれぞれと直交する位相である前記蛍光放射線の強度の成分の各振幅(IF out)を抽出するステップと
を含み、
・前記角周波数ωiのそれぞれについて、前記角周波数ωiで変調された前記第2の照明成分のそれぞれは、前記角周波数ωiで変調された前記第1の照明成分のそれぞれと逆位相であり、及び
・前記第1の照明光線(FEX1)の平均強度、前記第2の照明光線(FEX2)の平均強度及び前記角周波数は、前記蛍光放射線の前記強度成分の前記振幅のそれぞれの最大に近づくように選択される、方法。 - 前記可逆的光スイッチング蛍光種(P)のそれぞれは、第1の化学状態及び第2の化学状態を有し、前記状態の少なくとも一方は、蛍光であり、前記可逆的光スイッチング蛍光種(P)のそれぞれは、第1の光誘導反応を介して前記第1の状態から前記第2の状態に変換可能であり、次に第2の光誘導反応を介して前記第1の状態に戻ることが可能であり、前記第1の照明光線(FEX1)は、平均強度
- 少なくとも2つの前記角周波数ωi間の比率は、厳密に10よりも高い、請求項5に記載の方法。
- 前記ステップa)において、前記試料は、少なくとも1つの実質的に単色の照明光線によって照明される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップb)及びc)は、前記蛍光放射線の同期検出を介して実施される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- d)前記ステップc)において抽出される前記蛍光放射線の前記強度の前記成分から前記可逆的光スイッチング蛍光種(P)又は少なくとも1つの前記可逆的光スイッチング蛍光種(P)の濃度を特定するステップ
も含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。 - 前記可逆的光スイッチング蛍光種又は少なくとも1つの前記可逆的光スイッチング蛍光種は、
− フォトクロミック蛍光タンパク質、及び
− 蛍光プローブとの生体分子の複合体
から選択される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。 - 前記試料は、生体材料を含有する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記照明光線(FEX)は、ある量の日光を含み、前記量の日光は、前記可逆的光スイッチング蛍光種(P)によって受け取られる光強度に含まれるが、前記照明光線(FEX1、FEX2)の前記平均強度以下のままである、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載の検出方法を実施する蛍光撮像方法。
- 前記試料は、生体を含み得、前記可逆的光スイッチング蛍光種(P)の存在及び濃度から選択される少なくとも1つの要素は、前記生体の試料をとることなく、前記ステップc)において抽出される前記蛍光放射線の前記強度の前記成分に基づいて測定される、請求項14に記載の方法。
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