JP2010500563A - 回折限界以下の画像解像技術および他の画像化技術 - Google Patents

Abstract

本発明は、一般的に、回折限界以下の画像解像技術および他の画像化技術に関する。１つの態様では、本発明は、入射光の回折限界未満の距離で隔てられた２つ以上の物体からの光を決定することおよび／または画像化することに関する。例えば、これらの物体は、約１０００ｎｍ未満の距離で隔てられていてもよく、または、可視光の場合には、約３００ｎｍ未満の距離で隔てられていてもよい。ある一連の実施形態では、これらの物体を選択的に活性化してもよい。すなわち、他の物体を活性化させることなく、１つの物体を活性化して光を発生させることができる。第１の物体を活性化し、決定し（例えば、その物体から放射される光を決定することによって）、次いで、第２の物体を活性化し、決定してもよい。これらの物体は、お互いに固定されていてもよく、および／または共通の物体に固定されていてもよい。

Description

（政府の支援）
本発明の様々な局面へ導く研究は、少なくとも一部を、高等研究計画局および国立衛生研究所によって後援された。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。

（関連出願）
本出願は、優先権関連の以下の列挙のすべてに対する優先権を主張する。本出願は、２００６年１１月２９日に出願された米国仮特許出願第１１／６０５，８４２号（発明の名称：「Ｓｕｂ−Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ Ｉｍａｇｅ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」）に対する優先権を主張し、この米国仮特許特許出願第１１／６０５，８４２号は、２００６年８月７日に出願された米国仮特許特許出願第６０／８３６，１６７号（発明の名称：「Ｓｕｂ−Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ Ｉｍａｇｅ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ」）の優先権、および２００６年８月８日に出願された米国仮特許特許出願第６０／８３６，１７０号（発明の名称：「Ｓｕｂ−Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ Ｉｍａｇｅ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ」）の利益を主張する。

（発明の分野）
本発明は、一般的に、回折限界以下の画像解像技術および他の画像化技術に関する。

（背景）
蛍光顕微鏡法は、分子生物学および細胞生物学、およびその他の非侵襲性の時間分解画像化用途において広く使用されている。これらの利点にもかかわらず、標準的な蛍光顕微鏡法は、光の回折によって解像度に限界があるため、超微細構造の画像化には有用ではない。この回折限界を超えるために、近接場光学顕微鏡法（ＮＳＯＭ）、多光子蛍光、誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）、可逆的飽和性光学蛍光遷移（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｓａｔｕｒａｂｌｅ ｏｐｔｉｃａｌ ｌｉｎｅａｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）（ＲＥＳＯＬＦＴ）および飽和構造化照射顕微鏡法（ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ−ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）（ＳＳＩＭ）を含むいくつかのアプローチが用いられているが、どれも不満の残る限界を有している。電子顕微鏡法は、生体サンプルの高解像度画像化のために使用されることが多いが、電子顕微鏡法は、光ではなく電子を使用し、電子を調製する必要があるため、生体サンプルに用いるのは困難である。したがって、蛍光顕微鏡法の利点を、生体サンプルおよび他のサンプルの超高解像度画像化法に活用する、新しい技術が必要とされている。

（発明の要旨）
本発明は、一般的に、回折限界以下の画像解像技術および他の画像化技術に関する。本発明の主題は、いくつかの場合には、相互に関連する製品、特定の問題に対する代替的な解決法、および／または１つ以上のシステムおよび／または物品の複数の異なる用途に関する。

一態様では、本発明は、方法である。ある一連の実施形態では、この方法は、約１０００ｎｍ未満の距離で隔てられた第１の物体と第２の物体とを提供する工程と、前記第１の物体から放射される光を決定する工程と、前記第２の物体から放射される光を決定する工程と、前記第１の物体から放射される光と、前記第２の物体から放射される光とを用いて前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定する工程とを含む。別の一連の実施形態では、この方法は、約１０００ｎｍ未満の距離で隔てられた第１の物体と第２の物体とを提供する工程と、前記第２の物体を活性化させずに、前記第１の物体を活性化する工程と、前記第１の物体から放射される光を決定する工程と、前記第２の物体を活性化する工程と、前記第２の物体から放射される光を決定する工程と、前記第１の物体から放射される光と、前記第２の物体から放射される光とを用いて前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定する工程とを含む。

本方法は、さらに別の一連の実施形態によれば、光を放射することが可能で、そのうちのいくつかは、約１０００ｎｍ未満の距離で隔てられている、複数の物体を提供する工程と、前記複数の物体の一部分を活性化して光を放射させる工程と、前記放射される光を決定する工程と、前記複数の物体のうち、前記活性化した部分を不活性化する工程と、前記複数の物体を活性化し、不活性化する工程を繰り返し、前記複数の物体の位置を決定する工程とを含む。

別の一連の実施形態では、本方法は、ある距離で隔てられた第１の物体と第２の物体とを提供する工程と、前記隔てられた距離よりも大きな波長を有する、前記第１の物体から放射される光を決定する工程と、前記第２の物体から放射される光を決定する工程と、前記第１の物体から放射される光と、前記第２の物体から放射される光とを用いて前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定する工程とを含む。さらに別の一連の実施形態では、本方法は、ある距離で隔てられた第１の物体と第２の物体とを提供する工程と、前記第２の物体を活性化させずに、前記第１の物体を活性化する工程と、前記隔てられた距離よりも大きな波長を有する、前記第１の物体から放射される光を決定する工程と、前記第２の物体を活性化する工程と、前記第２の物体から放射される光を決定する工程と、前記第１の物体から放射される光と、前記第２の物体から放射される光とを用いて前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定する工程とを含む。

ある一連の実施形態では、本方法は、光を放射することが可能で、そのうちのいくつかは、放射される光の波長未満の距離で隔てられている、複数の物体を提供する工程と、前記複数の物体の一部分を活性化して光を放射させる工程と、前記放射される光を決定する工程と、前記複数の物体のうち、前記活性化した部分を不活性化する工程と、前記複数の物体を活性化し、不活性化する工程を繰り返し、前記複数の物体の位置を決定する工程とを含む。

別の一連の実施形態では、本方法は、約１０００ｎｍ未満の距離で隔てられ、共通の物体に固定されている第１の物体と第２の物体とを提供する工程と、第１の時間点で前記第１の物体および前記第２の物体の位置を決定する工程と、第２の時間点で前記第１の物体および前記第２の物体の位置を決定する工程と、前記第１の時間点および前記第２の時間点での前記第１の物体および前記第２の物体の位置を用いて、前記共通の物体の移動および／または構造の変化を決定する工程とを含む。いくつかの場合には、この物体は、時間内に解像されても画像化されてもよい。これらの物体の片方または両方は、いくつかの場合には、光活性化可能であっても光スイッチング可能であってもよい。２つの物体は、化学的に同じであっても別のものであってもよく、例えば、多色画像化可能なものであってもよい。さらに別の一連の実施形態では、本方法は、ある距離で隔てられ、共通の物体に固定されている第１の物体と第２の物体とを提供する工程と、前記隔てられたある距離より大きな波長を有する前記第１の物体から放射される光と、前記第２の物体から放射される光とを用いて、第１の時間点で前記第１の物体および前記第２の物体の位置を決定する工程と、第２の時間点で前記第１の物体および前記第２の物体の位置を決定する工程と、前記第１の時間点および前記第２の時間点での前記第１の物体および前記第２の物体の位置を用いて、前記共通の物体の移動および／または構造の変化を決定する工程とを含む。いくつかの場合にはこの物体は、時間内に解像されても画像化されてもよい。これらの物体の片方または両方は、いくつかの場合には、光活性化可能であっても光スイッチング可能であってもよい。２つの物体は、化学的に同じであっても別のものであってもよく、例えば、多色画像化可能なものであってもよい。

さらに別の一連の実施形態では、本方法は、時間内の一連の画像の中で、１つの物体によって各々作成される１つ以上の光放射領域を同定する工程と、各光放射領域について、その光放射領域の中心を同定する工程と、各光放射領域について、前記光放射領域を作成する前記１つの物体の位置を、前記１つの物体から放射される光の波長よりも大きな解像度で再構築する工程とを含む。これらの物体のいくつかまたはすべては、光活性化可能であっても光スイッチング可能であってもよい。これらの物体は、化学的に同じであっても別のものであってもよく、例えば、多色画像化可能なものであってもよい。

別の態様では、本発明は、約１００ｎｍ／分未満のドリフトを有する顕微鏡用の移動ステージを備える物品、および／または周期的な様式および／またはプログラムされた様式でオンオフを切り替えることが可能な時間によって調節される光源を備える物品、および／または蛍光放射を検出するための検出器を備える物品に関する。

本発明のさらに別の態様は、画像化組成物に関する。この組成物は、ある一連の実施形態によれば、第１の放射波長で光を放射可能な第１状態と、第１の放射波長では実質的に光を放射しない第２状態とに可逆的または不可逆的にスイッチング可能な光を放射する物体を含む。一実施形態では、光を放射する物体は、前記第１の波長で光を放射可能な第１部分と、外的刺激にさらされると、前記第１の物体を活性化させ、前記第１の波長で前記第１部分から光を放射させる第２部分とを含む。

別の態様では、本発明は、本明細書に記載の１つ以上の実施形態を実行するシステムに関する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載の１つ以上の実施形態を実行するためのコンピュータプログラムおよび技術に関する。たとえば、本発明の一実施形態は、時間内の一連の画像の中で、１つの物体によって各々作成される１つ以上の光放射領域を同定する工程と、各光放射領域について、その光放射領域の中心を同定する工程と、各光放射領域について、前記光放射領域を作成する前記１つの物体の位置を、前記１つの物体から放射される光の波長よりも大きな解像度で再構築する工程とを含む方法を機械に実行させるために、媒体に組み込まれたプログラムを備える機械可読媒体に関する。

本発明の他の利点および新規な特徴は、添付の図面と組み合わせて考えると、本発明の非限定的な種々の実施形態に関する以下の詳細な記載から明らかになる。本明細書および参考として組み込まれた文献の開示内容が矛盾点および／または不一致点を含んでいる場合、本明細書の内容が優先する。参考として組み込まれた２つ以上の文献の開示内容が矛盾点および／または不一致点を含んでいる場合、最近の有効日付を有する文献の内容が優先する。

本発明の非限定的な実施形態を、添付の図面を参照し、一例として記載する。図面は模式的なものであり、縮尺どおりに描画することを意図していない。図面では、同じ要素またはほぼ同じ要素は、典型的には同じ数字であらわしている。明確にするために、すべての要素に数字を付してはおらず、当業者が本発明を理解するのに、その要素の説明が必要ではない場合、本発明の各実施形態のすべての要素を示してはいない。

図１Ａは、本発明の一実施形態による、回折限界以下の解像画像化の原理を示す。 図１Ｂは、光スイッチング可能なＣｙ３−Ｃｙ５部分を示す。 図２Ａは、本発明の別の実施形態による、分子物体の位置特定を示す。図２Ｂは、本発明の別の実施形態による、分子物体の位置特定を示す。図２Ｃは、本発明の別の実施形態による、分子物体の位置特定を示す。図２Ｄは、本発明の別の実施形態による、分子物体の位置特定を示す。 図３Ａは、本発明のさらに別の実施形態による、光スイッチング可能な分子物体の回折限界以下の位置特定を示す。 図３Ｂは、本発明のさらに別の実施形態による、光スイッチング可能な分子物体の回折限界以下の位置特定を示す。 図３Ｃは、本発明のさらに別の実施形態による、光スイッチング可能な分子物体の回折限界以下の位置特定を示す。 図３Ｄは、本発明のさらに別の実施形態による、光スイッチング可能な分子物体の回折限界以下の位置特定を示す。 図４は、本発明の一実施形態による、Ｃｙ３−Ｃｙ５で標識された抗体のスイッチングの繰り返しを示す。 図５ａは、本発明の別の実施形態におけるドリフト補正を示す。図５ｂは、本発明の別の実施形態におけるドリフト補正を示す。 図６は、本発明のさらに別の実施形態における、２分子のスイッチングの繰り返しを示す。 図７Ａは、Ｃｙ３の構造を示す。 図７Ｂは、Ｃｙ５の構造を示す。 図７Ｃは、Ｃｙ５．５の構造を示す。 図７Ｄは、Ｃｙ７の構造を示す。 図７Ｅは、結合したＣｙ３−Ｃｙ５部分の一例を示す。 図８Ａは、本発明の特定の実施形態による、光スイッチング可能な種々の物体を示す。図８Ｂは、本発明の特定の実施形態による、光スイッチング可能な種々の物体を示す。 図９Ａは、本発明の特定の実施形態による、種々の部分の吸収スペクトルおよび放射スペクトルを示す。図９Ｂは、本発明の特定の実施形態による、種々の部分の吸収スペクトルおよび放射スペクトルを示す。図９Ｃは、本発明の特定の実施形態による、種々の部分の吸収スペクトルおよび放射スペクトルを示す。 図１０Ａは、本発明の特定の実施形態による、光スイッチング可能な物体を有する細胞の回折限界以下の画像化を示す。図１０Ｂは、本発明の特定の実施形態による、光スイッチング可能な物体を有する細胞の回折限界以下の画像化を示す。図１０Ｃは、本発明の特定の実施形態による、光スイッチング可能な物体を有する細胞の回折限界以下の画像化を示す。図１０Ｄは、本発明の特定の実施形態による、光スイッチング可能な物体を有する細胞の回折限界以下の画像化を示す。図１０Ｅは、本発明の特定の実施形態による、光スイッチング可能な物体を有する細胞の回折限界以下の画像化を示す。図１０Ｆは、本発明の特定の実施形態による、光スイッチング可能な物体を有する細胞の回折限界以下の画像化を示す。 図１１Ａは、本発明の特定の実施形態による、光スイッチング可能な物体を有する細胞の、回折限界以下の多色画像化を示す。図１１Ｂは、本発明の特定の実施形態による、光スイッチング可能な物体を有する細胞の、回折限界以下の多色画像化を示す。図１１Ｃは、本発明の特定の実施形態による、光スイッチング可能な物体を有する細胞の、回折限界以下の多色画像化を示す。 図１２Ａは、本発明のさらに別の実施形態による、光スイッチング可能な多種類の分子物体の、回折限界以下の多色位置特定を示す。図１２Ｂは、本発明のさらに別の実施形態による、光スイッチング可能な多種類の分子物体の、回折限界以下の多色位置特定を示す。図１２Ｃは、本発明のさらに別の実施形態による、光スイッチング可能な多種類の分子物体の、回折限界以下の多色位置特定を示す。 図１２Ｄは、本発明のさらに別の実施形態による、光スイッチング可能な多種類の分子物体の、回折限界以下の多色位置特定を示す。

（詳細な説明）
本発明は、一般的に、回折限界以下の画像解像技術および他の画像化技術に関する。１つの態様では、本発明は、入射光の回折限界未満の距離で隔てられた２つ以上の物体からの光を決定することおよび／または画像化することに関する。例えば、これらの物体は、約１０００ｎｍ未満の距離で隔てられていてもよく、または、可視光の場合には、約３００ｎｍ未満の距離で隔てられていてもよい。ある一連の実施形態では、これらの物体を選択的に活性化してもよい。すなわち、他の物体を活性化させることなく、１つの物体を活性化して光を発生させることができる。第１の物体を活性化し、決定し（例えば、その物体から放射される光を決定することによって）、次いで、第２の物体を活性化し、決定してもよい。これらの物体は、お互いに固定されていてもよく、および／または共通の物体に固定されていてもよい。放射光を用い、例えば、Ｇａｕｓｓｉａｎフィッティングまたは他の数学的技術を用い、いくつかの場合には、回折限界以下の解像によって、第１の物体の位置および第２の物体の位置を決定してもよい。したがって、本方法を使用し、例えば、共通の物体（例えば、表面または生物学的物体、例えば、ＤＮＡ、タンパク質、細胞、組織、生体分子複合体など）に固定された（直接的または間接的に、例えばリンカーを介して）２つ以上の物体の位置を決定してもよい。これらの物体は、例えば時間によって変動する反応を決定するために、時間に対して決定されてもよい。本発明の他の態様は、回折限界以下の画像解像のためのシステム、回折限界以下の画像解像のためのコンピュータプログラムおよび技術、回折限界以下の画像解像を促進する方法、光スイッチング可能な物体を製造する方法などに関する。

本発明の種々の態様では、光を放射可能な任意の物体を使用してもよい。物体は、いくつかの場合、１つの分子であってもよい。放射性物体の非限定例としては、蛍光物体（フルオロフォア）またはリン光発光物体、例えば、シアニン染料（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５，５、Ｃｙ７など）、金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子または「量子ドット」または蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）が挙げられる。他の光放射性物体は、当業者には容易に知られている。本明細書で使用される場合、用語「光」は、一般的に、任意の適切な波長（または同等の意味で、周波数）を有する電磁放射を指す。例えば、いくつかの実施形態では、上述の光は、光領域または可視光領域（例えば、約４００ｎｍ〜約７００ｎｍの波長、すなわち「可視光」）、赤外波長（例えば、約３００μｍ〜７００ｎｍの波長）、紫外波長（例えば、約４００ｎｍ〜約１０ｎｍの波長）などの波長を含んでもよい。特定の場合には、以下に詳細に記載するように、２つ以上の物体を使用してもよい。すなわち、化学的に異なるかまたは別個の（例えば構造的に別個の）物体を使用してもよい。しかし、他の場合には、上述の物体は、化学的に同じであるか、または少なくとも実質的に化学的に同じであってもよい。

ある一連の実施形態では、上述の物体は、「スイッチング可能」である。すなわち、上述の物体は、２つ以上の状態をスイッチング可能であり、この状態の少なくとも１つは、所望の波長を有する光を放射する。他の状態では、この物体は光を放射しなくてもよく、または異なる波長の光を放射してもよい。例えば、ある物体を「活性化」し、所望の波長を有する光を発生可能な第１の状態にし、「不活性化」して第２の状態にしてもよい。ある物体は、適切な波長の入射光によって活性化可能である場合、「光活性化可能」である。非限定例として、Ｃｙ５は、異なる波長の光によって制御された様式および可逆的な様式で、蛍光状態と暗状態とをスイッチング可能である。すなわち、６３３ｎｍの赤色の光は、Ｃｙ５をスイッチングまたは不活性化して安定な暗状態にすることができ、５３２ｎｍの緑色の光は、Ｃｙ５をスイッチングまたは活性化して蛍光状態に戻すことができる。いくつかの場合には、上述の物体は、例えば、適切な刺激にさらされると、２つ以上の状態を可逆的にスイッチング可能である。例えば、第１の刺激（例えば、第１の波長の光）を使用し、このスイッチング可能な物体を活性化してもよく、一方、第２の刺激（例えば、第２の波長の光）を使用し、このスイッチング可能な物体を不活性化し、例えば放射しない状態にしてもよい。任意の適切な方法を使用し、上述の物体を活性化してもよい。例えば、一実施形態では、適切な波長の入射光を使用し、上述の物体を活性化し、光を放射させてもよい。すなわち、上述の物体は、「光スイッチング可能」である。したがって、光スイッチング可能な物体は、例えば、異なる波長を有する入射光によって、異なる光を放射する状態または光を放射しない状態にスイッチングさせることができる。上述の光は、単色（例えば、レーザを用いて作成）または多色であってもよい。別の実施形態では、上述の物体を、電場および／または磁場によって刺激し、活性化してもよい。他の実施形態では、上述の物体は、例えば、ｐＨを調整することによって、または物体が関与する可逆性化学反応を誘発することなどによって、適切な化学環境に置くことによって活性化してもよい。同様に、上述の物体を不活性化するために任意の適切な方法を使用してもよく、上述の物体を活性化し、不活性化する方法は同じである必要はない。例えば、上述の物体は、適切な波長の入射光を照射すると不活性化してもよく、または上述の物体は、十分な時間が経過することによって不活性化してもよい。

典型的には、「スイッチング可能な」物体は、第１の状態で励起波長を照射すると、物体が光を放射し、例えば、スイッチングする波長を有する光を照射すると、第１の状態から第２の状態に物体がスイッチングし、第２の状態で励起波長を照射すると、物体が光を放射しない（または光を放射するが強度が非常に小さい）条件を決定することによって、当業者によって同定することができる。

ある一連の実施形態では、記載したように、スイッチング可能な物体は、光を照射するとスイッチングしてもよい。いくつかの場合には、このスイッチング可能な物体を活性化するのに使用する光は、外的供給源由来のものであってもよい（例えば、蛍光源のような光源、このスイッチング可能な物体の近くにある、別の光を放射する物体など）。第２部分である光を放射する光を放射する物体は、いくつかの場合には、蛍光物体であってもよく、特定の実施形態では、第２部分である光を放射する光を放射する物体は、それ自身がスイッチング可能な物体であってもよい。

いくつかの実施形態では、スイッチング可能な物体は、第１部分である光放射部分（例えば、フルオロフォア）と、第１部分を活性化させるか、または「スイッチング」させる第２部分とを備えている。例えば、光を照射すると、スイッチング可能な物体の第２部分は、第１部分を活性化させ、第１部分が光を放射してもよい。活性化部分の例としては、限定されないが、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃｙ２（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃｙ３（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃｙ３．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＣｙ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）または他の適切な染料が挙げられる。光放射部分の例としては、限定されないが、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＣｙ７（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または他の適切な染料が挙げられる。これらの部分は、例えば、直接的またはリンカーを介して、例えば共有結合によって結合し、例えば、限定されないが、Ｃｙ５−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ｃｙ５−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ｃｙ５−Ｃｙ２、Ｃｙ５−Ｃｙ３、Ｃｙ５−Ｃｙ３．５、Ｃｙ５．５−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ｃｙ５．５−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ｃｙ５．５−Ｃｙ２、Ｃｙ５．５−Ｃｙ３、Ｃｙ５．５−Ｃｙ３．５、Ｃｙ７−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ｃｙ７−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ｃｙ７−Ｃｙ２、Ｃｙ７−Ｃｙ３、Ｃｙ７−Ｃｙ３．５またはＣｙ７−Ｃｙ５のような化合物を形成してもよい。Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５，５およびＣｙ７の構造を図７に示し、Ｃｙ３−Ｃｙ５の結合態様の非限定例を図７ｅに示す。当業者は、これらの化合物および他の化合物の構造を認識しており、これらの化合物の多くは市販されている。上述の部分は、例えば以下に詳細に記載するように、共有結合を介して、またはリンカーによって結合していてもよい。

特定の場合では、光放射部分および活性化部分は、互いに切り離されると、それぞれフルオロフォア（すなわち、励起波長のような刺激にさらされると、特定の放射波長の光を放射する物体）になってもよい。しかし、第１のフルオロフォアと第２のフルオロフォアとを含むスイッチング可能な物体を形成する場合、第１のフルオロフォアは、第１部分である光放射部分を形成し、第２のフルオロフォアは、刺激に応答して第１部分を活性化させるか、または「スイッチング」させる活性化部分を形成する。例えば、スイッチング可能な物体は、第２のフルオロフォアに直接結合した第１のフルオロフォアを含んでいてもよく、または第１の物体および第２の物体が、リンカーを介して、または共通の物体に結合していてもよい。光放射部分と活性化部分の対が適切なスイッチング可能な物体を生成するか否かは、当業者に既知の方法によって試験することができる。例えば、種々の波長を有する光を使用して、この対を刺激し、光放射部分から放射される光を測定し、この対が適切なスイッチとなるかどうかを決定することができる。

非限定例としては、Ｃｙ３とＣｙ５とを結合し、このような物体を形成してもよい。このような手順は、以下の実施例にさらに詳細に記載している。この例では、Ｃｙ３は、光放射部分Ｃｙ５を活性化可能な活性化部分である。したがって、活性化部分または上述の物体の第２部分の吸収極大の光または吸収極大付近の光（例えば、Ｃｙ３では５３２ｎｍ付近の光）は、第１部分である光放射部分を活性化する部分となり、第１部分が光を放射する（例えば、Ｃｙ５では６３３ｎｍ付近）。すでに述べたように、第１部分である光放射部分は、その後に、任意の適切な技術によって（例えば、この分子のＣｙ５部分に６３３ｎｍの赤色の光を照射することによって）不活性化することができる。

したがって、本発明の一実施形態では、第１部分である光放射部分と、第２部分である活性化部分とを備える、光を放射するスイッチング可能な物体が提供される。上述の物体は、第１部分である光放射部分によって決定される最大放射波長と、第２部分である活性化部分によって決定される最大活性化波長とを有する。特に、この２つの波長は、同じ分子物体によって制御されず、有効に分けられている。いくつかの場合には、放射部分を活性化して蛍光状態にする場合、この状態から励起して放射させる場合、放射部分を不活性化する場合に、同じ波長の光を使用することができる。さらに、あるサンプル内にある多種類のスイッチング可能な物体を独立して決定してもよい。例えば、同じ活性化部分を有するが、光放射部分が異なる２つのスイッチング可能な物体を、サンプルに適用するのと同じ波長の光によって活性化するが、異なる光放射部分のため異なる波長で放射させ、これらが回折限界による解像度未満の距離で隔てられている場合であっても、容易に識別することができる。このことにより、２色の画像を有効に得ることができる。同様に、同じ光放射部分を有するが、活性化部分が異なる２つのスイッチング可能な物体を、異なる活性化部分のためにサンプルに適用するのとは異なる波長の光によって活性化し、光放射部分は同じ波長で放射させ、これらが回折限界による解像度未満の距離で隔てられている場合であっても、識別することができる。これによっても、２色の画像を有効に得ることができる。これらの方法を組み合わせると、４色（またはそれ以上）の色画像を容易に作成することができる。この原理を用い、スイッチング可能な物体および／または活性化物体によっては、多色画像化を６色、９色などにまで広げることができる。この多色画像化の原理を、本明細書に記載の画像化方法とともに使用し、回折限界以下の解像度を得ることもでき、および／またはこの原理を回折限界以下の解像度に制限されない他の画像化方法とともに使用し、多色画像を得てもよい。

対照的に、当業者が一般的に使用する蛍光染料（例えば、単離されたＣｙ５）は、固有の最大励起波長と、最大放射波長を有し、これらはそれぞれ、その蛍光染料の性質および構造によって決定され、独立して制御することができない。したがって、本発明は、別の一連の実施形態では、第１部分である光放射部分と、第２部分である活性化部分をそれぞれ独立して選択することができるさまざまなスイッチング可能な物体を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、例えば、従来の画像化法と比べて、多くの色のセットが提供する。

第１部分である光放射部分と第２部分である活性化部分とを結合するのに、任意の適切な方法を使用してもよい。いくつかの場合には、リンカーは、例えば、光放射部分がどんな態様で不活性化される場合であっても、活性化部分が光放射部分を所望な程度に活性化するように、第１部分と第２部分との距離が十分に近い位置になるように選択される。典型的には、上述の部分は、５００ｎｍ以下、例えば、約３００ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約２０ｎｍ未満、約１０ｎｍ未満、約５ｎｍ未満、約２ｎｍ未満、約１ｎｍ未満などの距離で隔てられている。リンカーの例としては、限定されないが、炭素鎖（例えば、アルカンまたはアルケン）、ポリマー単位などが挙げられる。

本発明のある一連の実施形態では、光を放射するスイッチング可能な物体は、上述の２つの部分を必ずしも含まない他のスイッチング可能な蛍光プローブ、例えば、限定されないが、光活性化可能な染料分子または光スイッチング可能な染料分子、光活性化可能であるかまたは光スイッチング可能な天然または加工した蛍光タンパク質、光活性化可能な無機粒子または光スイッチング可能な無機粒子などを含んでいてもよい。いくつかの場合には、スイッチング可能な物体は、本明細書に記載するように、第１部分である光放射部分と、第２部分である活性化部分とを含んでいてもよい。

ある一連の実施形態では、スイッチング可能な物体は、結合対（すなわち、特定の検体と結合可能な分子）に対して、例えば共有結合によって固定することができる。結合対としては、当業者に既知の特異的な結合対、半特異的な結合対および非特異的な結合対が挙げられる。用語「特異的に結合する」は、結合対（例えば、タンパク質、核酸、抗体など）を指している場合、異なる分子の混合物（例えば、タンパク質および他の生体物質）中の結合対の１つまたは他の対の存在および／または正体を決定する要因となる反応を指す。したがって、例えば、レセプター／リガンド結合対の場合、リガンドは、分子の複雑な混合物から特異的および／または優先的にそのレセプターを選択し、逆に、レセプターは、分子の複雑な混合物から特異的および／または優先的にリガンドを選択する。他の例としては、限定されないが、酵素は、その基質と特異的に結合し、核酸は、その相補体と特異的に結合し、抗体は、その抗原と特異的に結合する。このような結合は、１つ以上の種々の機構（限定されないが、イオン性相互作用および／または共有結合性相互作用および／または疎水性相互作用および／またはファンデルワールス力による相互作用などが挙げられる）によって行われる。標的分子または標的構造（例えば、細胞内のＤＮＡまたはタンパク質）の結合対にスイッチング可能な物体を固定することによって、スイッチング可能な物体を、種々の決定または画像化に使用することができる。例えば、アミン反応性基を有するスイッチング可能な物体は、アミンを含む結合対（例えば、抗体、タンパク質または酵素）と反応してもよい。スイッチング可能な物体を抗体に固定化する非限定例を、以下の実施例に記載する。

いくつかの実施形態では、２つ以上のスイッチング可能な物体を使用してもよく、この物体は、同じであっても異なっていてもよい。いくつかの場合には、第１の物体から放射される光の波長と、前記第２の物体から放射される光の波長とは同じである。上述の物体を異なる時間点で活性化し、各物体からの光を別個に決定してもよい。これにより、２つの物体の位置を別個に決定することができ、いくつかの場合には、以下に詳細に記載するように、物体から放射される光未満の距離で隔てられている場合または放射光の回折限界未満の距離で隔てられている場合であっても、２つの物体を空間的に解像してもよい（すなわち、「回折限界以下」の解像）。特定の場合、第１の物体から放射される光の波長と、第２の物体から放射される光の波長とは、異なっている（例えば、第１の物体および第２の物体が化学的に異なっており、および／または異なる環境に配置されている場合）。物体から放射される光未満の距離で隔てられている場合または放射光の回折限界未満の距離で隔てられている場合であっても、上述の物体を空間的に解像してもよい。特定の場合、第１の物体から放射される光の波長と、第２の物体から放射される光の波長とは、実質的に同じであるが、２つの物体を異なる波長の光で活性化し、各物体からの光を別個に決定してもよい。物体から放射される光未満の距離で隔てられている場合または放射光の回折限界未満の距離で隔てられている場合であっても、上述の物体を空間的に解像してもよい。

いくつかの実施形態では、第１部分である光放射部分および第２部分である活性化部分は、上述のように、直接的に共有結合していなくてもよいし、リンカーを介して結合していなくてもよいが、それぞれ共通の物体に固定される。他の実施形態では、２つ以上のスイッチング可能な物体（そのうちいくつかは、特定の場合、第１部分である光放射部分と第２部分である活性化部分を含んでおり、それらが直接またはリンカーを介して結合していてもよい）を、本発明のいくつかの態様において、共通の物体に固定してもよい。共通の物体は、これらの実施形態のいずれかでは、任意の非生物学的物体または生物学的物体であってもよく、例えば、細胞、組織、基質、表面、ポリマー、生体分子、例えば、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡなど）、脂質分子、タンパク質またはポリペプチドなど、生体分子複合体または生体構造、例えば、オルガネラ、微小管、クラスリン被覆ピットなどであってもよい。したがって、共通の物体は、いくつかの様式で決定されてもよい（例えば画像化）。別の例として、２つ以上の物体を、ＤＮＡ鎖または他の核酸鎖に固定し（例えば、抗体、１つ以上の物体で標識された実質的に相補性のオリゴヌクレオチド、化学反応または当業者に既知の他の技術によって）、その位置を鎖に沿って検出してもよい。いくつかの場合には、核酸鎖に沿って物体を隔てている塩基の数（ｂｐ）を決定してもよい。

いくつかの場合には、上述の物体は、独立してスイッチング可能であってもよい。すなわち、第２の物体を活性化させることなく、第１の物体を活性化し、光を放射させてもよい。例えば、上述の物体が異なっている場合、第１の物体および第２の物体をそれぞれ活性化する方法は、異なっていてもよい（例えば、異なる波長の入射光を用いて、それぞれの物体を活性化してもよい）。別の非限定例として、十分に強度の弱い入射光を第１の物体および第２の物体に照射し、その入射光の範囲内の物体の部分的な集合または物体の一部分のみを活性化してもよい（すなわち、確率的またはランダムに）。活性化する特定の強度は、当業者であれば、通常の範囲内の技術を用いて決定することができる。入射光の強度を適切に選択することによって、第２の物体を活性化させることなく、第１の物体を活性化させてもよい。

第２の物体を活性化して光を放射させ、任意に、第２の物体を活性化させる前に、第１の物体を活性化させてもよい。第２の物体は、すでに記載したように任意の適切な技術によって活性化させてもよく、例えば、適切な入射光を照射することによって活性化させてもよい。

いくつかの場合には、十分に強度が弱い入射光を複数の物体に照射し、その入射光の範囲内の物体の部分的な集合または物体の一部分のみを活性化してもよい（例えば、確率的またはランダムに）。活性化する量は、任意の適切な一部分であってもよく、例えば、その用途によって、物体の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％を活性化させてもよい。例えば、入射光の強度を適切に選択することによって、物体の少なくともいくつかが他の物体と光学的に解像可能で、位置が決定可能であるように、物体を部分的にまばらに活性化させてもよい。繰り返しの活性化サイクルにより、すべての物体の位置または物体のかなりの部分を決定することができる。いくつかの場合には、この情報を用いて、回折限界以下の解像度を有する画像を構築することができる。

本発明の別の態様によれば、物体から放射される光の波長未満の距離で隔てられている場合または放射光の回折限界未満の距離で隔てられている場合であっても、２つ以上の物体を解像してもよい。物体の解像度は、本明細書に記載されるように、例えば、１μｍ（１０００ｎｍ）以下であってもよい。例えば、放射光が可視光である場合、解像度は、約７００ｎｍ未満であってもよい。いくつかの場合には、約５００ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約８０ｎｍ未満、約６０ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、または約４０ｎｍ未満の距離で隔てられている場合であっても、２つ（またはそれ以上）の物体を解像してもよい。いくつかの場合には、少なくとも約２０ｎｍまたは約１０ｎｍ未満の距離で隔てられている２つ以上の物体を、本発明の実施形態を用いて解像することができる。

各スイッチング可能な物体から放射される光は、例えば、画像またはマトリックスとして決定してもよい。例えば、第１の物体を活性化し、第１の物体から放射される光を決定してもよく、第２の物体を活性化し（第１の物体を不活性化しても不活性化しなくてもよい）、第２の物体から放射される光を決定してもよい。複数の物体それぞれから放射される光の波長は、同じであっても異なっていてもよい。任意の適切な方法を使用し、放射光を決定してもよい。例えば、ＣＣＤカメラのようなカメラ、フォトダイオード、光電子増倍器を使用するか、または分光計を使用してもよく、当業者は、他の適切な技術を知っているであろう。物体から発生した光を決定する適切な技術のさらなる非限定例を以下の実施例に記載する。いくつかの場合には、例えば、解像度を高め、および／またはノイズを減らすために、複数の画像（または他の決定因子）を使用してもよい。例えば、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００などの画像を、用途に応じて決定してもよい。

いくつかの態様では、２つ以上の物体の空間配置を決定するために、光を加工してもよい。いくつかの場合には、画像内に分布する１つ以上の物体の位置を、個々に決定してもよい。ある一連の実施形態では、放射光をＧａｕｓｓｉａｎフィッティングまたは他の適切な技術を用いて加工し、放射性物体それぞれの位置を特定してもよい。適切なＧａｕｓｓｉａｎフィッティング技術の詳細を以下の実施例に示す。当業者は、本開示内容の利点を有する他の適切な画像加工技術を特定することができるであろう。

本発明の別の実施形態によって、画像加工技術の別の例を記載する。一連の画像サンプル（例えば動画）から出発し、それぞれの光放射ピーク（例えば、蛍光、リン光などにより）を特定し、ピークの存在する時間を決定する。例えば、時間点に対し、一連の画像でほぼ同じ強度のピークが存在してもよい。ピークを、いくつかの場合、Ｇａｕｓｓｉａｎ関数および／または楕円Ｇａｕｓｓｉａｎ関数にフィッティングし、重心の位置、強度、幅および／または楕円率を決定してもよい。これらのパラメータに基づき、位置特定精度を満足いくレベルまで高めるために、特定の場合には、さらなる分析から、輪郭のはっきりしないピーク、幅広すぎるピーク、曲がっているピークなどを除外してもよい。散発性のピーク、移動しているピーク、不連続に存在するピークなども破棄してもよい。例えば、最小二乗によって、ピーク強度を２次元Ｇａｕｓｓｉａｎ関数にフィッティングし、ピークの中心位置を決定することによって、ピークの供給源（例えば、本明細書に記載されるように、光を放射可能な任意の１つ以上の物体）の位置を決定することができる。サンプル内の任意のピークまたはすべてのピークについて、このプロセスを必要なだけ繰り返してもよい。

本発明の適切な画像加工技術の別の非限定例では、一連の画像サンプル（例えば動画）は、活性化フレーム（例えば、中に活性化光あり）および画像化フレーム（例えば、中に画像化光あり）の繰り返しを備えていてもよい。１つ以上の画像化フレームで、蛍光ピークを特定し、Ｇａｕｓｓｉａｎ関数および／または楕円Ｇａｕｓｓｉａｎ関数にフィッティングし、重心の位置、強度、幅および／または楕円率を決定してもよい。これらのパラメータに基づき、位置特定精度を満足いくレベルまで高めるために、特定の場合には、さらなる分析から、輪郭のはっきりしないピーク、幅広すぎるピーク、曲がっているピークなどを除外してもよい。いくつかの場合には、散発性のピーク、移動しているピーク、不連続に存在するピークなども破棄してもよい。例えば、最小二乗によって、ピーク強度を２次元Ｇａｕｓｓｉａｎ関数にフィッティングし、ピークの中心位置を決定することによって、ピークの供給源（例えば、本明細書に記載されるように、光を放射可能な任意の１つ以上の物体）の位置を決定することができる。活性化フレームの直後に画像化フレームで現れるピークは、制御された活性化事象であると認識することができ、いくつかの実施形態では、活性化レーザの色によって色分けされていてもよい。サンプル内の任意のピークまたはすべてのピークについて、このプロセスを必要なだけ繰り返してもよい。

物体の決定を容易にするために他の画像加工技術を使用してもよく、例えば、ドリフト補正またはノイズフィルタを使用してもよい。一般的に、ドリフト補正では、例えば、固定点を特定し（例えば、基準マーカーとして、例えば、蛍光粒子を基質に固定してもよい）、固定点の移動度（すなわち、機械的なドリフトによるもの）を使用し、決定済のスイッチング可能な物体の位置を補正する。ドリフト補正の別の方法例では、異なる画像化フレームまたは活性化フレームから得た画像の相関関数を算出し、ドリフト補正に使用する。いくつかの実施形態では、ドリフトは、約１０００ｎｍ／分未満、約５００ｎｍ／分未満、約３００ｎｍ／分未満、約１００ｎｍ／分未満、約５０ｎｍ／分未満、約３０ｎｍ／分未満、約２０ｎｍ／分未満、約１０ｎｍ／分未満または約５ｎｍ／分未満であってもよい。このようなドリフトは、例えば、顕微鏡対物に対し、サンプルスライドのｘ−ｙ位置決めのために取り付けられた移動ステージを有する顕微鏡で起こることがある。スライドは、適切な制限機構（例えば、ばね仕掛けのクリップ）を用いて移動ステージに固定されていてもよい。それに加えて、ステージと顕微鏡スライドとの間に緩衝層を取り付けてもよい。緩衝層は、例えば、スライドがいくつかの様式で滑るのを防ぐことによって、移動ステージに対し、スライドのドリフトをさらに制限してもよい。緩衝層は、一実施形態では、ゴム膜またはポリマー膜、例えば、シリコーンゴム膜である。したがって、本発明の一実施形態は、移動ステージと、移動ステージに接続してスライドを固定する制限機構（例えば、ばね仕掛けのクリップ）とを備え、任意に、緩衝層（例えば、シリコーンゴム膜）を、制限機構が緩衝層と接触することにより、スライドの動きが制限されるように配置して備えるデバイスに関する。

サンプルの複数の位置を、その位置にある物体を決定するために、それぞれ分析してもよい。例えば、サンプルは、種々の複数の物体を含有していてもよく、そのいくつかは、物体から放射される光の波長未満の距離で隔てられているか、または放射光の回折限界未満の距離で隔てられている。サンプル内の異なる位置を決定してもよく（例えば、画像内でピクセルの違いとして）、これらの位置をそれぞれ独立して分析し、その位置にある１つ以上の物体を決定してもよい。いくつかの場合には、それぞれの位置にある物体を、すでに記載したように、物体から放射される光の波長未満の解像度または放射光の回折限界未満の解像度で決定してもよい。

上述のように、いくつかの実施形態では、２種類以上のスイッチング可能な物体を１サンプル中で使用し、各物体の位置を、いくつかの場合には、回折限界以下の解像度で独立して決定し、例えば、回折限界以下の解像度を有する多色画像を作成してもよい。例えば、あるサンプル中で特定のスイッチング可能な物体を活性化し、不活性化することを繰り返すことによって、複数のスイッチング可能な物体の位置を決定し、いくつかの場合には、物体から放射される光の波長未満の解像度または放射光の回折限界未満の解像度で決定してもよい。

非限定例として、サンプルは、２種類の光放射部分（例えば、Ｃｙ５およびＣｙ５．５）と、２種類の活性化部分（例えば、Ｃｙ３およびＣｙ２）を含有してもよく、合計で４種類（２×２）のスイッチング可能な部分：Ｃｙ５−Ｃｙ３、Ｃｙ５−Ｃｙ２、Ｃｙ５．５−Ｃｙ３およびＣｙ５．５−Ｃｙ２を含有する。Ｃｙ２を含有する物体を活性化させることなく、適切な波長の光を照射することによって、Ｃｙ３を含有する物体を活性化することができ（異なる活性化波長が必要なため）、Ｃｙ５を含有する分子から放射される光は、Ｃｙ５．５を含有する分子から放射される光と区別することができる（異なる波長で光を放射する）。したがって、Ｃｙ５−Ｃｙ３物体のみが決定され、他の物体は活性化しないか、または活性化はするものの、物体から放射される光を使用しない。上述の技術を用いることによって、サンプル内のＣｙ５−Ｃｙ３物体の位置を、Ｃｙ５から放射される光の波長未満の解像度まで決定することができる。さらに、適切な活性化波長および放射波長を用いて上述の手順を繰り返すことによって、他の物体の位置も、例えば、回折限界以下の解像度まで決定してもよい。別の例では、サンプルは、３種類（またはそれ以上）の光放射部分（例えば、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７）および／または３種類（またはそれ以上）の活性化部分（例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ｃｙ２およびＣｙ３）を含んでいてもよい。したがって、回折限界以下の解像度を有する多色画像化（例えば、４色、６色、８色、９色、１０色、１２色など）が実現し得る。

本発明のいくつかの実施形態では、物体は、時間の関数として解像されてもよい。例えば、２つ以上の物体を種々の時間点で観察し、時間で変動するプロセス（例えば、化学反応、細胞の挙動、タンパク質または酵素の結合など）を決定してもよい。したがって、一実施形態では、２つ以上の物体の位置を、第１の時間点で決定し（例えば、本明細書に記載されるように）、その後の何回かの時間点で決定してもよい。特定の例として、２つ以上の物体が共通の物体に固定されている場合、共通の物体を、時間の関数、例えば、時間で変動するプロセス（例えば、共通の物体の移動、共通の物体の構造変化および／または形状変化、共通の物体が関与する反応など）として決定してもよい。時間分解による画像化は、スイッチング可能な物体が複数のサイクルでスイッチング可能であり、各サイクルが物体の位置について１個のデータ点を与えるため、いくつかの場合には容易である。

本発明の別の態様は、コンピュータで実行される方法に関する。例えば、本明細書に記載のいずれかの方法を自動的および／または繰り返し実行可能なコンピュータおよび／または自動化システムが提供されてもよい。本明細書で使用される場合、「自動化」デバイスは、ヒトが命令することなく実行可能なデバイスを指す。すなわち、自動化デバイスは、任意のヒトが、ある機能を促進するための任意の操作を終了した後も、例えば、コンピュータに指示を与えることによって、一定期間、その機能を実行することができる。典型的には、自動化装置は、その時間点の後に、繰り返してその機能を実行することができる。処理工程は、いくつかの場合には、機械可読媒体に記録されてもよい。

本発明のさらに別の態様は、一般的に、本明細書に記載の１つ以上の実施形態を実行可能なシステムに関する。例えば、このシステムは、顕微鏡と、物体を活性化および／またはスイッチングさせ、所望の波長の光を発生させるデバイス（例えば、レーザ源および／または他の光源）、物体から放射される光を決定するデバイス（例えば、カメラ、例えば光学フィルタのような色フィルタデバイスを備えていてもよい）と、２つ以上の物体の空間配置を決定するためのコンピュータとを備えていてもよい。いくつかの場合には、鏡（例えば、二色性ミラーまたは多色性ミラー）、プリズム、レンズ、回折格子なども、光源からの光の向きを変えるために配置されていてもよい。いくつかの場合には、光源は、時間によって調節可能な光源（例えば、シャッター、音響光学変調器などによる）であってもよい。したがって、光源は、プログラムされた様式または周期的な様式で活性化し、不活性化することが可能なものであってもよい。一実施形態では、２つ以上の光源を使用してもよく、例えば、異なる波長または色でサンプルを照射するために使用してもよい。例えば、光源は、異なる周波数の光を発してもよく、および／または光学フィルタなどのような色フィルタデバイスを使用し、異なる波長または色の光をサンプルに照射するように、光源からの光を調節してもよい。

いくつかの実施形態では、顕微鏡は、他の蛍光源からの光（例えば、「バックグラウンドノイズ」）を最小限にしつつ、スイッチング可能な物体から放射される光を集めるような構成になっていてもよい。特定の場合、撮像幾何（例えば、限定されないが、全反射の幾何、回転円板の共焦点の幾何、走査共焦点の幾何、落射蛍光の幾何などが挙げられる）を、サンプルを励起させるために使用してもよい。いくつかの実施形態では、サンプルの薄層または平面を励起光にさらし、サンプル平面外側への蛍光の励起を減らしてもよい。非常に多くの開口レンズを使用し、サンプルから放射される光を集めてもよい。この光を、例えば、励起光を除去するためのフィルタを用いて加工して、サンプルからの放射光の集合を得てもよい。いくつかの場合には、画像を集める拡大因子は、例えば、画像の各ピクセルの縁の長さが、画像の回折限界点の標準偏差の長さに対応する場合、最適化することができる。

いくつかの場合には、スイッチング可能な物体の励起およびスイッチング可能な物体の画像の獲得を制御するためにコンピュータを使用してもよい。ある一連の実施形態では、種々の波長および／または強度を有する光を用いてサンプルを励起させてもよく、サンプルを励起させるのに使用する一連の光の波長と、スイッチング可能な物体を含有するサンプルから得た画像とをコンピュータを用いて相互に関連づけてもよい。例えば、コンピュータは、目的の各領域中の活性化されたスイッチング可能な要素の異なる平均値（例えば、場所あたり１個の活性化された物体、場所あたり２個の活性化された物体など）を得るために、種々の波長および／または強度を有する光をサンプルに適用してもよい。いくつかの場合には、この情報を用いて、いくつかの場合には、上述のように、回折限界以下の解像度でスイッチング可能な物体の画像を構築してもよい。

本発明の他の態様では、本明細書に記載のシステムおよび方法を、当業者に既知の他の画像化技術、例えば、高解像度蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）または免疫蛍光画像化法、ライブセルイメージング、共焦点画像化法、落射蛍光画像化法、全反射蛍光画像化法などと組み合わせてもよい。

以下の文献は、本明細書に参考として組み込まれる。米国特許仮出願番号第６０／８３６，１６７号（２００６年８月７日出願、発明の名称「Ｓｕｂ−Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ Ｉｍａｇｅ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ」および米国特許仮出願番号第６０／８３６，１７０号（２００６年８月８日出願、発明の名称「Ｓｕｂ−Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ Ｉｍａｇｅ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ」。

以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を説明することを意図しているが、本発明の範囲全体を例示するものではない。

本実施例は、解像度の高い光学顕微鏡法である確率的な光学再構成による顕微鏡法（「ＳＴＯＲＭ」）を示す。この方法では、本発明の一実施形態によれば、異なる色の光を用いてオンオフが切り替わる個々の蛍光物体（「フルオロフォア」）を高精度に位置特定することにより、蛍光画像が構築される。ＳＴＯＲＭ画像化プロセスは、本実施例では、一連の画像化サイクルを含む（図１ａ）。各サイクルで、視野内のフルオロフォアの一部分が、オンに切り替わるかまたは活性化し、その結果、活性なフルオロフォアは、それぞれ、残りの部分と光学的に解像することが可能であり、すなわち、それぞれの画像は重なりあっていない。これにより、これらのフルオロフォアの位置を高い精度で決定することができる。このプロセスを複数回のサイクルで繰り返し、それぞれのサイクルで、確率的に異なるフルオロフォア群がオンに切り替わるかまたは活性化し、多くのフルオロフォアの位置を決定することができ、全体的な画像を再構築することができる。これらの実施例では、解像度は約２０ｎｍであることが示されており、この値は、単純な全反射照明蛍光顕微鏡、低出力の連続波長を有するレーザおよび光スイッチング可能なシアニン染料を用いる従来の蛍光顕微鏡法の１０倍を超える改良された値である。

図１ａは、フルオロフォアで標識された仮想の六量体を用い、緑色レーザおよび赤色レーザによって、それぞれ蛍光状態および暗状態をスイッチング可能な、ＳＴＯＲＭ画像化シーケンスを示す。この非限定的な図では、最初は、すべてのフルオロフォアが、強い赤色レーザパルスによって「オフ」に切り替わり、暗状態になった（「不活性化」）。各画像化サイクルで、緑色レーザパルスを用い、フルオロフォアの一部分のみを「オン」に切り替え（「活性化し」）、光学的に解像可能な活性フルオロフォア群を得た。次いで、赤色を照射（「画像化」）すると、これらの分子は、オフに切り替わるまで蛍光を放射し、これらの分子の位置（白い十字で示す）を比較的高い精度で決定することができた。次いで、複数の画像化サイクルから得たフルオロフォアの位置から、全体的な画像を再構築した。

シアニン染料（Ｃｙ５）は、蛍光状態と暗状態とを、異なる波長の光によって制御された様式および可逆的な様式でスイッチング可能である。Ｃｙ５から蛍光を放射させる赤色レーザ光は、この染料を安定な暗状態に切り替えることもできる。緑色レーザ光を照射すると、Ｃｙ５は再び蛍光状態に戻るが、戻る速度は、いくつかの場合では、第２の染料であるＣｙ３との近さに依存する場合がある。Ｃｙ３−Ｃｙ５染料対は、スイッチとも呼ばれ得る。１個の分子を検出可能な照射条件では、このようなスイッチは、核酸またはタンパク質に結合または固定されている場合、永久的な光退色が起こるまでに数百回、オンオフサイクルを繰り返すことが可能なことがわかった（図１ｂおよび図４）。図１ｂでは、Ｃｙ５から蛍光（黒色の線）を励起させるのに赤色レーザ（６３３ｎｍ、３０Ｗ／ｃｍ^２）を使用し、Ｃｙ５は暗状態にスイッチングする。Ｃｙ５を蛍光状態に戻すのに緑色レーザ（５３２ｎｍ、１Ｗ／ｃｍ^２）を使用した。交互の赤色の線および緑色の線は、レーザの励起パターンを示す。いくつかの場合には、Ｃｙ５が戻る速度は、Ｃｙ３との近さに依存すると考えられる。

図４は、シアニンスイッチで標識したヤギ抗マウス二次抗体が、スイッチで標識されたＤＮＡとよく似た光スイッチング挙動を示すことを示している。この抗体を、Ｃｙ３およびＣｙ５で標識し（以下参照）、標識していないマウス抗−トランスフェリン一次抗体でコーティングした石英スライドに結合させた。出力結果は、約２３０秒後に永久的な光退色が起こるまで、オンオフのスイッチングに応じて１個の標識された抗体から検出されたＣｙ５の蛍光強度を示す。緑色レーザパルスおよび赤色レーザパルスで、サンプルを交互に励起させた（緑色レーザパルス０．５秒、次いで赤色レーザパルス２秒）。

他の光スイッチング可能な染料対も、同様の原理で構築することができる。例えば、Ｃｙ５に加え、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７も、蛍光状態と暗状態とを、異なる波長の光によって制御された様式および可逆的な様式でスイッチング可能である。Ｃｙ３と対にした場合、赤色レーザ（６３３ｎｍまたは６５７ｎｍ）を照射すると、これらの４種の染料（Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）はそれぞれ最初に蛍光を発し、非蛍光の暗状態にすぐにスイッチングした。緑色レーザパルス（５３２ｎｍ）を短期間照射すると、これらの染料は再活性して蛍光状態へと戻った（図８ａおよび図９）。さらに、いくつかの場合で、同じ発光部分を活性化するのに、異なる活性化部分を使用することができる。例えば、発光部分の一例としてＣｙ５を用い、Ｃｙ３、Ｃｙ２およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５とＣｙ５とを対にした。赤色レーザ（６３３ｎｍまたは６５７ｎｍ）を照射すると、Ｃｙ５が暗状態へと迅速にスイッチングすることが観察された。この実施例では、Ｃｙ５を再活性させるには、活性化剤の吸収波長に対応する、異なる色のレーザが必要であった。（図８ｂおよび図９）。Ａｌｅｘａ ４０５−Ｃｙ５対は、紫色レーザ（４０５ｎｍ）によって効率よく活性化されるが、青色レーザ（４５７ｎｍ）および緑色レーザ（５３２ｎｍ）に対する感度は低いようであった。同様に、Ｃｙ２−Ｃｙ５対は、紫色または緑色の光よりも、青色の光に対して感度が高く、Ｃｙ３−Ｃｙ５対は、緑色レーザに対する感度が高いようであった。

活性化部分の例としては、限定されないが、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ ４８８、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５またはＣｙ５が挙げられる。光放射部分の例としては、限定されないが、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７が挙げられる。これらの物質は、結合して光スイッチング可能な物体、例えば、限定されないが、Ｃｙ５−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ｃｙ５−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ｃｙ５−Ｃｙ２、Ｃｙ５−Ｃｙ３、Ｃｙ５−Ｃｙ３．５、Ｃｙ５．５−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ｃｙ５．５−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ｃｙ５．５−Ｃｙ２、Ｃｙ５．５−Ｃｙ３、Ｃｙ５．５−Ｃｙ３．５、Ｃｙ７−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ｃｙ７−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ｃｙ７−Ｃｙ２、Ｃｙ７−Ｃｙ３、Ｃｙ７−Ｃｙ３．５またはＣｙ７−Ｃｙ５を形成してもよい。

この実施例では、ＳＴＯＲＭの概念は、Ｃｙ５−Ｃ５３スイッチを用いて示されているが、任意の適した光によってスイッチングするフルオロフォアを使用することもできる。ＳＴＯＲＭの解像度は、いくつかの場合では、スイッチングサイクル中に個々のスイッチを位置特定可能な精度によって制限を受けることがある。位置特定の精度を決定する一例として、スイッチを、短い二本鎖ＤＮＡに結合または固定し、１個のスイッチを解像可能な低い密度で表面に固定した。緑色レーザ光および赤色レーザ光によって、周期的にこれらのスイッチのオンオフを切り替え、赤色レーザは、Ｃｙ５から蛍光を励起させる役割もあった。Ｃｙ３からの蛍光はこのプロセスでは記録されなかった。各スイッチングサイクル中の個々のスイッチの位置特定精度は、ＳＴＯＲＭの固有の解像度を規定するものであり、この値を図２に示す。１個のスイッチからの蛍光画像を、図２ａに点広がり関数で示す。１回のスイッチングサイクル中の、ＤＮＡ上の１個のスイッチからの放射の点広がり関数（ＰＳＦ）。この画像に対するＧａｕｓｓｉａｎフィッティング（図示せず）を使用し、ＰＳＦの重心位置を特定し、この重心は、スイッチの位置を示すものである。複数回のスイッチングサイクルから決定した位置は、かなりの広がりがあり（図２ｂ）、一連の実験にわたってサンプルをドリフト補正することによって、この広がりは顕著に減少した（図２ｃ、以下のさらなる詳細を参照）。図２ｂおよび図２ｃは、２０回の連続した画像化サイクルで決定した個々のスイッチの重心位置について、サンプルをドリフト補正する前（図２ｂ）および補正した後（図２Ｂ）を示す。スケールを示す線は２０ｎｍである。２０回の画像化サイクルから得た位置をドリフト補正すると、標準偏差は、個々のスイッチについて平均８ｎｍであった（図２ｄ）。図２ｄは、重心位置の標準偏差のヒストグラムを示す。標準偏差は、各スイッチについて、２０回の画像化サイクルを用いて（σ_ｘ＋σ_ｙ）／２（（シグマ−ｘ＋シグマ−ｙ）／２）で決定され、ここで、σ_ｘ（シグマ−ｘ）およびσ_ｙ（シグマ−ｙ）は、ｘ次元およびｙ次元の重心位置の標準偏差である。２９個のスイッチからこのヒストグラムを構築した。この値は、１回の画像化サイクルあたり、１個のスイッチの位置決定における不確実な測定値を与えた。これに対応して、実験的に測定されたスイッチの位置の広がりは、標準偏差８ｎｍから予想されるように、ＦＷＨＭ １８ｎｍでＧａｕｓｓｉａｎ分布に従っている（図５）。したがって、これらの画像化条件下で、２０ｎｍ離れた２個のスイッチを解像することができた。

図５は、ステージのドリフトを補正する前（図５ａ）および補正後（図５ｂ）の、２９個の個々のスイッチの位置分布を重ね合わせたものを示す。スケールを示す線は２０ｎｍである。これらの分布を得るために、各スイッチの画像を、所与の画像化サイクル中に、二次元Ｇａｕｓｓｉａｎ関数にフィッティングさせ、そのサイクル中の各スイッチの重心位置を得た。画像化サイクルを２０回行い、スイッチあたり２０個の測定位置を得た。各スイッチの位置データを、各スイッチの平均位置が原点になるように再調整し、異なるスイッチの測定値を重ね合わせ、全体的な位置分布をはめ込み図に示した。主要なプロットは、これらの重心位置のヒストグラムである。補正していない分布はかなり広範囲にわたっており、非対象であった。基準マーカーを用いてステージのドリフトを補正した後（以下を参照）、分布はかなり狭くなっている。ドリフトを補正したヒストグラムのＧａｕｓｓｉａｎフィッティングにより、最大値の半値での合計幅は１８±２ｎｍであった。

ＳＴＯＲＭが、非常に近い位置にある蛍光分子を解像する可能性を示すために、標識された線形の二本鎖ＤＮＡの標準サンプルを、十分に規定された数の塩基対で隔てられている複数のスイッチを用いて構築した（詳細については、以下の方法を参照）。ＤＮＡ鎖は、複数のビオチンで標識されており、高密度ストレプトアビジン層に結合しており（以下を参照）、ＤＮＡとその表面との間の複数の結合の可能性が高くなり、その結果、ＤＮＡがその平面に固定された。１３５塩基対で隔てられた２つのスイッチを含有するＤＮＡ鎖を、最初に試験した（図３ａおよび図６）。１３５塩基対の長さは、ＤＮＡの輪郭に沿って４６ｎｍに対応する。上述の画像化手順（詳細については以下を参照）を用いて得たＳＴＯＲＭ画像は、測定したスイッチの位置に２つのクラスターを示しており、このことは、２個のスイッチが十分に解像されていることを示す（図３ａ）。この画像は、測定したスイッチ位置の２個の分離したクラスターを示し（十字）、それぞれが１個のスイッチに対応している。各クラスターの質量中心を点で示す。スイッチ間の距離は、これらの３つの例で、４６ｎｍ、４４ｎｍおよび３４ｎｍである。スケールを示す線は２０ｎｍである。２個の雲の中心間の距離は、平均値が４１ｎｍであり（図３ｂ）、ＤＮＡサンプルの既知の輪郭および持続長を用いて決定した理論的な平均値（４０ｎｍ）と量的に一致した（以下を参照）。図３ｂは、ＳＴＯＲＭを用いて測定したスイッチ間距離（灰色の棒グラフ）と、ＤＮＡの可とう性を考慮して予想される距離分布（点線）との比較を示す。図３ｃは、二本鎖ＤＮＡに結合した４個のスイッチのＳＴＯＲＭ画像を示し、１対は輪郭長さ４６ｎｍで隔てられている。測定したスイッチの位置を自動化アルゴリズムでクラスターにして（詳細は以下を参照）、異なるクラスターは異なる記号で示している。スケールを示す線は２０ｎｍである。

図６は、ｄｓＤＮＡ上にある輪郭長さ４６ｎｍで隔てられたＣｙ３−Ｃｙ５スイッチの繰り返しを示す、蛍光トレーサ（黒色の線）の抜粋である（図３ａも参照）。各スイッチングサイクルは５秒間続き、このサイクルは、１個または２個のスイッチを活性化させるための短期間の緑色パルス（下側にある目盛）の後、Ｃｙ５の蛍光を励起させ、スイッチをオフ状態に戻す長時間の赤色光照射（下にある横長の四角）を含む。１個のスイッチが活性化するサイクル（例えば、２２５〜２３０秒）では、暗状態に戻る前に、１個の強度レベルが現れた。２個のスイッチが活性化するサイクル（例えば、２４５〜２５０秒）では、「階段状」の強度レベルがあらわれ、それぞれの染料が、順にオフにスイッチングすることに対応して２回のレベル低下が観測された。１個のスイッチがオンになり、すべてのピーク質基準が満足される領域（以下を参照）を、１個のスイッチの位置特定に使用した。

輪郭に沿って４６ｎｍで均一に隔てられた４個のスイッチで標識された、さらに長いＤＮＡサンプルも画像化した。ＳＴＯＲＭ画像から、スイッチ位置の４個所のクラスターがあることがわかり、曲った輪郭は、ＤＮＡの持続長と一致しており、スイッチ間の加工した距離と一致していた。これらの結果は、ＳＴＯＲＭが、生体サンプルを回折限界以下の解像度で画像化することができ、４０ｎｍ隔てられた物質は、十分に解像できる範囲にあることを示す。

ＳＴＯＲＭの利点の１つは、制御された様式でスイッチを繰り返しオンオフし、回折限界内の多数のスイッチを位置特定できることであり、これは一般的な生物学的画像化技術として用いることができる。この可能性を示すために、環状ＤＮＡプラスミドを調製し、ＲｅｃＡタンパク質でコーティングし、スイッチで標識された二次抗体を用いた間接的な免疫蛍光を用いて画像化する（図３ｄ、詳細は以下の方法を参照）。ここで、フォトスイッチは、Ｃｙ３とＣｙ５とを備えている。Ｃｙ３は活性化部分の役割を果たし、Ｃｙ５は光放射部分の役割を果たす。ＲｅｃＡ繊維のＳＴＯＲＭ画像は、従来の広範囲画像と比較して、この環状構造をきわめて高い解像度で明らかにした。この繊維の一部分は、標識されていないか、またはねじれているようであり、この部分は、ＲｅｃＡでコーティングされていないプラスミドの領域に対応している。図３ｄの上側の図は、スイッチで標識された二次抗体を用い、全反射顕微鏡法によって作成された、間接的な免疫蛍光画像を示す。下側の図は、同じ繊維の再構築されたＳＴＯＲＭ画像である。スケールを示す線は３００ｎｍである。

複数の種類の光スイッチング可能な、光放射部分および活性化部分の対の存在により、例えば、本明細書に記載するように、多色ＳＴＯＲＭ画像化が可能になる。この例は、多色ＳＴＯＲＭ画像化の初期の実施として、選択的な活性化スキームを使用する。Ａｌｅｘａ ４０５−Ｃｙ５、Ｃｙ２−Ｃｙ５またはＣｙ３−Ｃｙ５で標識した３つの異なるＤＮＡ構築物を混合し、従来の蛍光画像では個々のＤＮＡ分子が解像できないほど表面密度が高くなるように、顕微鏡スライドに固定した。ＳＴＯＲＭ画像を作成するために、まず、サンプルに赤色レーザ（６３３ｎｍ）を照射して、視野にあるほぼすべてのＣｙ５染料をオフに切り換えた。次いで、このサンプルを、一連の紫色レーザパルス（４０５ｎｍ）、青色レーザパルス（４５７ｎｍ）および緑色レーザパルス（５３２ｎｍ）で周期的に励起し、それぞれのレーザパルスは、フルオロフォアの一部分をまばらに、光学的に解像可能に活性化した。活性化パルスの間に、サンプルを赤色レーザで画像化した。それぞれの活性化した蛍光スポットの画像を分析し、重心位置を決定し（位置特定と称する）、その前に照射した活性化パルスによって色を割り当てた。同様に、画像化レーザおよび検出チャネルを３種類すべての染料対に使用したので、色収差を補正する必要はなかった。数千回の活性化サイクルの後、着色したすべての位置をプロットすることによって、ＳＴＯＲＭ画像を構築した（図１２ａ〜１２ｃ）。ＳＴＯＲＭ画像は、分離したクラスターの位置を示した。各クラスターは、個々のＤＮＡ分子に対応しており、複数のスイッチングサイクルでの１個のＣｙ５分子の位置特定を繰り返すことによって得た。各クラスター内の大部分の位置は同じ色で示されており、ＤＮＡ上に存在する活性化染料の種類を特定している。同定された色には、２種類から由来するクロストーク、間違った色のレーザパルスによる間違った活性化、および赤色画像化レーザによる非特異的な活性化が存在するが、これらの影響は量的には小さかった。各クラスター内の位置特定は、ほぼＧａｕｓｓｉａｎ分布に従い、３色のチャネルの半値全幅（ＦＷＨＭ）は、２６±１ｎｍ、２５±１ｎｍおよび２４±１ｎｍであり（図１２ｄ〜１２ｆ）、このことは画像解像度が約２５ｎｍであることを示唆していた。この解像度は、検出された光子の数から予想される理論限界よりも小さい。

細胞サンプルについて、ＳＴＯＲＭ画像化を行うこともできる。この可能性を示すために、この例では、微小管の単色免疫蛍光画像化法を行った。微小管は、多くの細胞機能にとって重要な繊維状細胞骨格構造である。ＢＳ−Ｃ−１細胞を固定し、微小管に対する一次抗体で免疫染色し、スイッチで標識した二次抗体で免疫染色した。ここで、使用したフォトスイッチは、Ｃｙ３とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７とを備えており、Ｃｙ３は活性化部分の役割を果たし、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７は光放射部分の役割を果たす。ＳＴＯＲＭ画像は、従来の蛍光画像と比較して、微小管の網状組織の解像度が顕著に向上していた（図１０）。図１０ａ、１０ｃおよび１０ｅは、細胞内のある領域での微小管を異なる倍率で示した従来の画像であり、図１０ｂ、１０ｄおよび１０ｆは、同じ領域のＳＴＯＲＭ画像である。微小管が密に含まれ、従来の画像では不明確な領域において、個々の微小管繊維がＳＴＯＲＭによって解像された（図１０Ｃ〜Ｆ）。全細胞ＳＴＯＲＭ画像（約１０^６の単分子の位置特定を含む）は、２〜３０分で得られた。超解像微小管構造は、ＳＴＯＲＭ画像化から約１０〜２０秒後に現れ始めるが、まだ最適化はされていなかった。有効な画像化解像度は、固有の染料の位置特定の精度および抗体標識の大きさによって影響を受けた。有効解像度の向上は、染料で標識された一次抗体またはＦａｂフラグメントを用いた直接的な免疫蛍光染色によって達成可能である。

異なる光スイッチング可能な対を用い、細胞サンプルについて多色ＳＴＯＲＭ画像化を行うことができる。この可能性を示すために、微小管およびクラスリン被覆ピット（ＣＣＰ）（レセプターによって媒介されるエンドサイトーシスで使用する細胞構造）を同時に画像化した。微小管およびクラスリンを、一次抗体で免疫染色し、次いでスイッチで標識した二次抗体で免疫染色した。ここで、フォトスイッチは、微小管の画像化の場合、Ｃｙ２とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７とを備えており、クラスリン画像化の場合、Ｃｙ３とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７とを備えており、Ｃｙ２またはＣｙ３は活性化部分の役割を果たし、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７は光放射部分の役割を果たす。４５７ｎｍおよび５３２ｎｍのレーザを用い、２つの対を選択的に活性化した。間違った活性化および非特異的な活性化による２色のチャネル間のクロストークは、統計分析後に画像から差し引いた。図１１は、微小管およびクラスリン被覆ピットの２色の超解像度ＳＴＯＲＭ画像を示す。図１１は、異なる倍率で表した２色ＳＴＯＲＭ画像を示す。緑色チャネル（４５７ｎｍでの活性化）により、微小管の繊維状構造（これらの画像では長くて薄い構造）が明らかになった。赤色チャネルでは、これらの画像では主に球構造が明らかになり、これはクラスリン被覆ピットおよび小胞であった。

まとめると、本実施例は、ＳＴＯＲＭによって回折限界以下の解像度で生体構造を画像化することができることを示す。この技術の解像度は、光の波長によって制限されない。Ｃｙ３−Ｃｙ５スイッチの場合、１回のスイッチングサイクルあたり約３，０００個の光子が検出され、これは赤色レーザの強度とは無関係であり（データは示していない）、理論的な位置特定精度は４ｎｍであると予測される。この理論的な予測値と測定した精度８ｎｍとの差は比較的小さく、この不一致は、ステージのドリフト補正が不完全であることと、測定における焦点ドリフトによる収差とによるものである。この測定位置の精度は、約２０ｎｍ（半値全幅、ＦＷＨＭ）の画像化解像度に対応する。実際に、約４０ｎｍ隔てられた蛍光スイッチは、容易に解像できた（図３）。

シアニンスイッチは、光退色の前に、数百回の信頼性の高いオンオフの切り替えサイクルが可能であり、これにより、潜在的に時間分解様式で、多くのフルオロフォアを用いて構造を解像するのに、ＳＴＯＲＭを使用することができる。１０〜２０個のスイッチを含有するＲｅｃＡ繊維の環状構造および細胞内の微小管構造およびクラスリン被覆ピット構造は、数分間またはそれ以下の時間で解像可能であった。画像化速度は、例えば、より強い励起によるスイッチング速度を高めることによって、またはより速いスイッチング速度を有するフルオロフォアを用いてスイッチング速度を高めることによって、より速いフレーム速度を有するカメラを用いることによって、より速いカメラ読み取りスキーム（例えば、ピクセルのビニングまたはピクセルの一部分のみの読み出し）を用いることによって、または他の技術によって、向上する場合がある。したがって、ＳＴＯＲＭは、生体サンプルまたは非生体サンプルの高解像度画像化に価値のあるツールである。ＳＴＯＲＭの概念は、他の光スイッチング可能なフルオロフォアおよび蛍光タンパク質にも応用することができ、内因性標識を用いて、生きた細胞の高解像度画像化も潜在的に可能であり、回折限界以下の画像解像が望ましい他の画像化への応用も潜在的に可能である。

さらなる詳細および例は、Ｗ．Ｍ．Ｂａｔｅｓら、「Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ Ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｐｈｏｔｏ−ｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ（近刊）またはＭ．Ｊ．Ｒｕｓｔら、「Ｓｕｂ−ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ−ｌｉｍｉｔ ｉｍａｇｉｎｇ ｂｙ ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｐｔｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ （ＳＴＯＲＭ）」Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３、７９３−７９５（２００６）を参照。

上の記載に有用な方法を以下に示す。

（スイッチで標識されたＤＮＡ構築物の調製）
ビオチン化ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび／またはアミン修飾されたＤＮＡオリゴヌクレオチド（「オリゴ類」）をＯｐｅｒｏｎから購入し、ＰＡＧＥによって精製した。アミン修飾されたオリゴ類を、合成後にアミン反応性シアニン染料（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはＡｌｅｘａ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、製造業者によって提供されるプロトコルに従って標識した。染料によって標識されたオリゴ類を逆相ＨＰＬＣで精製した。ＤＮＡの相補鎖をアニーリングし、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ中で等モル量の２個の相補鎖を混合し、９０℃まで２分間加熱し、混合物を加熱ブロックで１時間かけて室温まで冷却することによって、ビオチン化した二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を得た。

上述のように相補性オリゴ類をアニーリングし、Ａ、ＢおよびＣと称される３種の異なる４５ｂｐのｄｓＤＮＡセグメントを作成し、連結反応させることによって、スイッチ間距離が１３５ｂｐで種々の長さのビオチン化ｄｓＤＮＡを構築した。このオリゴ類は、５’→３’方向に読むと、ＡがＢのみに連結し、ＢがＣのみに連結し、ＣがＡのみに連結するような、特異的な付着末端を用いて設計された。あるオリゴ類（Ａ）は、アニーリング前にＣｙ３およびＣｙ５で特異的に標識された反対側の鎖とは離れた位置にアミン反応性部位である３塩基対を含有しており、光学スイッチを形成している。オリゴ類ＢおよびＣは、鎖あたり２個の内部ビオチン修飾部を含有しており、ストレプトアビジン表面に多価結合を促進する。アニーリング後、オリゴ類を等しい濃度で混合し、Ｔ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて一晩連結させた。得られた連結産物を１．５％寒天ゲルで精製し、所望のコンカテマー化したｄｓＤＮＡ長を含有するバンドを選択した。

（スイッチで標識された抗体の調製）
ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（ＡｂｃａｍまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびヤギ抗ウサギ抗体（Ａｂｃａｍ）を、アミン反応性Ｃｙ２またはＣｙ３で非特異的に標識し（活性化部位の役割を果たす）、Ｃｙ５またはＡｌｅｘａ ６４７で非特異的に標識した（光放射部分の役割を果たす）。染料：抗体の平均比率は、ＲｅｃＡ画像化の場合、Ｃｙ３では約２：１であり、Ｃｙ５では約０．１：１であった。微小管およびクラスリン画像化の場合、染料：抗体の比率は、Ｃｙ３またはＣｙ２では約２：１であり、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７では約０．４：１であった。ＳＴＯＲＭ画像化のために、種々のＣｙ５：抗体の比率またはＡｌｅｘａ ６４７：抗体の比率を用いてもよく、例えば、０．８まで、または０．８を超える比率を用いてもよい。種々のＣｙ３：抗体の比率およびＣｙ２：抗体の比率も、有効なＳＴＯＲＭ画像化のために用いることができる。上述の画像化の質は、Ｃｙ３（またはＣｙ２）：抗体の比率に対し、それほど高感度ではない。これらの標識化比率は、複数のＣｙ５で標識された抗体では、スイッチングが非効率になるため、２個以上のＣｙ５分子で標識される抗体の一部を最小限にするように選択した。１個の抗体に２個以上のＣｙ３分子が存在しても、スイッチングを妨害しなかった。この標識化率で、かなりの割合の二次抗体がＣｙ５を有しておらず、観察されなかった。標識の密度がこのように低いことは、典型的には、間接的な免疫蛍光画像化では問題とはならず、特に、ＲｅｃＡ−プラスミド繊維または微小管の環状構造の解像を妨げなかった。

（ＲｅｃＡ繊維の調製）
０．１Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ８．３）中で精製した組み換えＲｅｃＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）とアミン反応性ビオチン−ＸＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを反応させることによって、ビオチン化ＲｅｃＡを調製した。得られたビオチン化タンパク質をＮＡＰ−５サイズ排除カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で精製した。１０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファ（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、７ｍＭ ＭｇＣｌ_２および０．８ｍｇ／ｍＬ ＡＴＰ−γ−Ｓ（ＡＴＰ−ガンマ−Ｓ）中で、ＲｅｃＡ（ビオチン化物２５％：非ビオチン化物７５％、濃度８０μｇ／ｍＬ）をプラスミドＤＮＡ（２μｇ／ｍＬ）とともに３７℃で１時間インキュベーションすることによって、ＲｅｃＡ繊維をΦＸＲＦ−ＩＩ（Ｐｈｉ−ＸＲＦ）プラスミドＤＮＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）上に形成させた。得られたＲｅｃＡ−ＤＮＡ繊維を４℃で保存し、その日のうちに画像化に使用した。

（顕微鏡スライドの調製）
石英顕微鏡スライド（Ｇ．Ｆｉｎｋｅｎｂｅｉｎｅｒ）をＡｌｃｏｎｏｘ洗浄剤で洗浄し、次いでアセトン、１Ｍ ＫＯＨ水溶液、エタノール、１Ｍ ＫＯＨ水溶液中で、順に１５分間超音波処理した。脂質二層用に調製するスライドは、２番目のＫＯＨ工程の後に、５％ＨＦ溶液に２時間浸した。最後に、スライドを脱イオン水で洗浄し、フレームドライした。両面接着テープ（３Ｍ）２片を用いてフローチャネルを調製し、１．５番のガラスカバースリップ（ＶＷＲ）で覆った。

（酸素捕捉系）
すべての画像化バッファに、酸素捕捉系を追加した。酸素捕捉系は、１０％（ｗ／ｖ）グルコース（Ｓｉｇｍａ）、０．１％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、５００μｇ／ｍＬ グルコースオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）および１０μｇ／ｍＬ カタラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を含んでいた。酸素捕捉系は、フルオロフォアのフォトスイッチングの信頼性を高めるのに重要であった。いくつかの場合には、シアニン染料を効率よくフォトスイッチングさせるために、０．０１％の低濃度のβ−メルカプトエタノールを使用することができる。他の実施形態では、β−メルカプトエタノールを、他の還元試薬（例えばグルタチオンおよびシステイン）と交換することもできる。

（ＤＮＡおよび抗体の表面固定化）
標識されたｄｓＤＮＡを表面に固定化するために、石英顕微鏡スライド（Ｇ．Ｆｉｎｋｅｎｂｅｉｎｅｒ）をＡｌｃｏｎｏｘ洗浄剤で洗浄し、１Ｍ ＫＯＨ水溶液、エタノールおよび１Ｍ ＫＯＨ水溶液中で、順に超音波処理した後、ＭｉｌｌｉＱ水で洗浄し、フレームドライした。個々の分子が十分に分割され、光学的に解像可能なようにＤＮＡ分子の表面密度が低くなるように、最初にビオチン化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）をスライドに加え、次いで０．２５ｍｇ／ｍＬ ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、最後にＤＮＡサンプルを低濃度（約３０ｐＭ）で加えた。スライドを洗浄した後、各試薬を加えた。

３色ＳＴＯＲＭ画像化用にＤＮＡ構築物を固定するために、３種の異なるＤＮＡ構築物（それぞれ、Ａｌｅｘａ ４０５−Ｃｙ５対、Ｃｙ２−Ｃｙ５対またはＣｙ３−Ｃｙ５対で標識）を溶液中で混合し、上述のように石英スライドに一緒に固定した。固定された分子の表面密度が高くなるように、濃度５００ｐＭのＤＮＡを用いた。

複数のスイッチで標識されたＤＮＡサンプルを石英スライドに固定化するために、最初に、卵ＰＣのリポソームおよび５％ビオチン−ＰＥ（Ａｖａｎｔｉ）中に流すことによって、脂質二層をスライド上に形成させた。製造業者の指示にしたがってリポソームを形成させ、脂質の濃度５ｍｇ／脱イオン水（ｍＬ）で０．０５μｍフィルタ膜を押し出して通し、使用直前に、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌを含有するバッファと１：１の比率で混合した。２時間インキュベーションした後、この二層を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＮａＣｌで十分に洗浄し、二層をストレプトアビジン（０．２５ｍｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに３０分間インキュベーションした。十分に洗浄した後、ストレプトアビジン表面を４％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドＰＢＳ液中で１時間架橋させ、Ｔｒｉｓバッファで洗浄した後にビオチン化し、スイッチで標識されたＤＮＡを結合させた。ＤＮＡを、上述の酸素捕捉系を含むＴｒｉｓバッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＮａＣｌ）中で画像化した。

スイッチで標識された抗体を表面に固定化するために、石英スライドを上述のように洗浄し、マウス抗トランスフェリンＩｇＧ（Ａｂｃａｍ）とともに５分間インキュベーションし、非特異的に結合させた。次いで、スライドを、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳバッファ中で、標識された二次抗体とともに１０分間インキュベーションした。画像化用に、バッファを、酸素捕捉系を含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）と交換した。

（ＲｅｃＡ−ｄｓＤＮＡ繊維の免疫蛍光画像化）
ビオチン化ＲｅｃＡ−ｄｓＤＮＡ繊維を、ビオチン化ＢＳＡで非特異的にコーティングした石英スライドにストレプトアビジン結合で接続した。次いで、この表面を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、７ｍＭ ＭｇＣｌ_２、３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（ブロックバッファ）で洗浄し、３０分間インキュベーションし、この表面に対する非特異的な抗体の結合を阻止した。次いで、ＲｅｃＡに対するモノクローナルマウス抗体（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）を２μｇ／ｍＬ含有する上述のブロックバッファ中でスライドを１時間インキュベーションした。ブロックバッファで十分に洗浄した後、スイッチで標識された二次抗体を０．３μｇ／ｍＬ含有する上述のブロックバッファ中でスライドを１時間インキュベーションした。最後に、サンプルを洗浄し、上述のような酸素捕捉系を追加した５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、７ｍＭ ＭｇＣｌ_２に画像化した。

（細胞中の微小管およびクラスリン被覆ピットの免疫蛍光画像化）
ミドリザル腎臓ＢＳ−Ｃ−１細胞をＬａｂＴｅｋ ＩＩ ８ウェルチャンバーのカバーガラス（Ｎｕｎｃ）に密度３０Ｋ／ウェルで置いた。１６〜２４時間後、これらをリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）バッファで洗浄し、ＰＢＳ中の３％ホルムアルデヒドおよび０．１％グルタルアルデヒドで室温で１０分間固定し、ＰＢＳ中の０．１％ホウ化水素ナトリウムで７分間クエンチし、未反応のアルデヒド基と、固定中に生成した蛍光産物を還元した。加水分解を防ぐために、ホウ化水素ナトリウム溶液は使用直前に調製した。固定したサンプルをブロッキングバッファ（３％ ＢＳＡ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＰＢＳ中）で１０分間浸透させ、チューブリンおよびクラスリンに対する一次抗体（２．５μｇ／ｍＬマウス抗ベータ（β）チューブリン、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｔｏｎ製ＡＴＮ０１および／またはウサギ抗クラスリン重鎖の場合２μｇ／ｍＬ、Ａｂｃａｍ製ａｂ２１６７９）の片方または両方で、ブロッキングバッファ中で３０分間染色した。次いで、サンプルを洗浄バッファ（０．２％ ＢＳＡ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＰＢＳ中）で３回洗浄した。光スイッチング可能なプローブで標識された対応する二次抗体（２．５μｇ／ｍＬ）をブロッキングバッファ中でサンプルに加え、３０分後に十分に洗浄した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍｇ／ｍＬ グルコースオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｇ２１３３）、４０μｇ／ｍＬ カタラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１０６８１０）、１０％（ｗ／ｖ）グルコースおよび１％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノールを含有する標準的な画像化バッファ中で細胞画像化を行った。β−メルカプトエタノールは、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７のフォトスイッチングの挙動を観察することによって重要であることがわかっているが、低濃度のβ−メルカプトエタノール（０．０２％（ｖ／ｖ）または潜在的にはこれより低い）でさえ、フォトスイッチングに役立った。β−メルカプトエタノールは、低濃度（０．１％）で、生きている細胞の画像化が可能であった。β−メルカプトエタノールをシステイン（１００ｍＭ）と交換してもフォトスイッチングが観察され、この条件で生きている細胞の画像化も可能であった。グルコースオキシダーゼを酸素捕捉系として使用し、シアニン染料の光安定性を高め、細胞は、報告されたグルコースオキシダーゼ濃度で少なくとも３０分間生存可能であった。

ヤギ抗マウス抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびヤギ抗ウサギ抗体（Ａｂｃａｍ）を、それぞれアミン反応性活性化剤およびレポーターの混合物で標識した。Ａｌｅｘａ ４０５、Ｃｙ２およびＣｙ３をフォトスイッチの活性化部分として使用した。Ａｌｅｘａ ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、Ｃｙ５と非常によく似た構造および光学特性を有しているが、これをフォトスイッチの光放射部分として使用した。それぞれの抗体が、平均で、２個の活性化染料と、０．３〜０．４の光放射染料とを有するように、反応性染料の濃度を制御した。画像化手順。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１顕微鏡を用いて、フォトスイッチの特性決定、ＤＮＡコンカテマー画像化およびＲｅｃＡ−ｄｓＤＮＡ画像化を行った。プリズム型全反射蛍光（ＴＩＲＦ）撮像幾何を用いて、単分子画像化を行った。サンプルを６５７ｎｍのレーザで励起させ、５３２ｎｍ、４５７ｎｍまたは４０５ｎｍのレーザで活性化した。染料の蛍光放射を、Ｎ．Ａ．１．２５ ６０倍浸水対物で集め、６６５ｎｍロングパスフィルタ（Ｃｈｒｏｍａ）を通した後、電子増倍型ＣＣＤカメラ（Ａｎｄｏｒ Ｉｘｏｎ ＤＶ８９７）で画像化した。サンプルのステージの移動を追跡するために、２００ｎｍの赤色蛍光ポリスチレンビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｆ−８８１０）を、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含有するＴｒｉｓバッファ中でスライドに加え、表面に結合させた。Ｌａｂｖｉｅｗで書き込まれたカスタムデータ獲得ソフトウェアでデータを得て、サンプルに交互に照射される赤色レーザ励起パルスおよび緑色レーザ励起パルスの連続シーケンスが可能になり、染料がオンオフにスイッチングされる。レーザ励起は、１ｍｓの精度でカメラの露光と同期化された。

ＤＮＡコンカテマーの画像化実験は、典型的には、スイッチを活性化させ、不活性化させるために、６０回のレーザパルスサイクルを含んでおり、各サイクルは５秒間続き、最終的な画像を得るのに５分間かかった。重心位置の分布を示す複数のクラスター形状は、典型的には２分以内に現れた。抗体で標識されたＲｅｃＡ−ｄｓＤＮＡ繊維に関する実験は、７０回のスイッチングサイクルを含んでおり、各サイクルは１０秒間続いた。ＲｅｃＡ−ｄｓＤＮＡ繊維の環状の形状は、典型的には、２分以内に明らかになったが、サンプル中の各スイッチの存在位置は、この時点ではまだ特定されていなかった。スイッチング速度は、励起強度、サイクル時間に線形に依存するため、赤色レーザの強度を上げることによって、位置特定の精度に実質的に影響を与えることなく、最終的な画像化時間を短くすることができた。緑色レーザの強度は、典型的には、緑色パルス照射中に１〜３個のスイッチがオンにスイッチングするように選択し、ほとんどの場合では、すべての活性化したスイッチが、そのサイクルの赤色照射中にオフに切り替わった。

ＳＴＯＲＭで再構築した画像と比較するために、それぞれのスイッチが、蛍光状態または暗状態の維持時間にかかわらず、等しくあらわされるように、画像化シーケンス全体で最大蛍光値を各ピクセルで記録することによって、ＲｅｃＡ−ｄｓＤＮＡの生画像を作成した。

Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１倒立顕微鏡を用いて、プリズム型ＴＩＲＦ構成で、ＤＮＡサンプルの３色ＳＴＯＲＭ画像化を行った。６３３ｎｍのＨｅＮｅレーザを画像化レーザとして使用し、紫色レーザ（４０５ｎｍ）、青色レーザ（４５７ｎｍ）および緑色レーザ（５３２ｎｍ）を活性化光源として使用した。最初に、サンプルに赤色画像化光を照射し、視野にあるほぼすべてのＣｙ５染料をオフにスイッチングさせた。次いで、一連の紫色、青色および緑色のレーザパルスでサンプルを周期的に活性化し、それぞれのレーザパルスは、フルオロフォアの一部分をまばらに、光学的に解像可能に活性化し、次いで、これを赤色レーザで画像化した。これらのプローブからの蛍光をロングパス放射フィルタ（Ｃｈｒｏｍａ、ＨＱ６４５ＬＰ）に通した後、ＣＣＤカメラで検出した。ＳＴＯＲＭデータを得ている間、カメラは、一定のフレーム速度１９Ｈｚで蛍光シグナルを記録した。それぞれのスイッチングサイクルで、活性化レーザの１種類が１フレームで照射された後、赤色画像化レーザが９フレームで照射された。

対物型ＴＩＲＦ画像化構成を有するＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１顕微鏡で、細胞のＳＴＯＲＭ画像化を行った。カスタム多色ビームスプリッタ（ｚ４５８／５１４／６４７ｒｐｃ、Ｃｈｒｏｍａ）は、対物（１００倍の油、ＮＡ １．４、ＵＰｌａｎＳＡｐｏ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）を通ってサンプルに励起レーザ光を反射し、サンプルからの蛍光放射を同じ対物によって集めた。放射光を２個の組み合わせたデュアルバンド放射フィルタ（５１００７ｍ、Ｃｈｒｏｍａおよび５９５−７００ＤＢＥＭ、Ｏｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌ）にかけた後、ＥＭＣＣＤカメラで画像化した。デュアルバンドエミッタを使用することにより、レポーター染料の蛍光に加え、Ｃｙ３からの蛍光を集めることができる。緑色活性化レーザを照射するフレーム中に集めたＣｙ３蛍光をドリフト補正のために使用し、従来の蛍光画像を作成するのに使用した。Ａｌｅｘａ ６４７をフォトスイッチの光放射部分として用い、Ｃｙ３を活性化部分として用いた単色ＳＴＯＲＭ画像化のために、赤色レーザ（６５７ｎｍ）を画像化に使用し、緑色レーザパルス（５３２ｎｍ）を活性化のために使用した。Ｃｙ２およびＣｙ３を活性化部分として使用する２色ＳＴＯＲＭ画像化の場合、青色および緑色のレーザパルス（４５７ｎｍおよび５３２ｎｍ）を活性化のために交互に使用した。フレーム速度１９Ｈｚで画像を得た。それぞれのスイッチングサイクルで、活性化レーザの１種類が１フレームで照射された後、赤色画像化レーザが９フレームで照射された。ＳＴＯＲＭ画像化で使用する典型的なレーザ出力は、赤色レーザの場合４０ｍＷであり、それぞれの活性化レーザの場合２μＷであった。画像分析。画像分析の一例では、最初に、データ分析のために、平均化した画像の蛍光構造を１３×１３ピクセル平方のフィッティングウィンドウで切り取った。所与のウィンドウで、合計蛍光強度を各フレームで積算し、蛍光時間結果を得た（図６を参照）。いくつかの基準を使用し、１個のスイッチの高精度位置特定を行った。

（１）各スイッチングサイクルで、少なくとも３個のフレーム（０．３秒）で１個のスイッチのみがオンである領域のみを位置特定分析で使用した（図６を参照）。

（２）これらの領域にある蛍光画像を、非線形最少二乗回帰で連続的な楕円Ｇａｕｓｓｉａｎ：

式中、

にフィッティングさせた。

ここで、Ａは、バックグラウンド蛍光レベルであり、Ｉ_０は、ピークの振幅であり、ａおよびｂは、ｘ方向およびｙ方向に沿ったＧａｕｓｓｉａｎ分布の幅を反映しており、ｘ_０およびｙ_０は、ピークの中心座標を記述するものであり、θ（シータ）は、ピクセル縁に対する楕円の傾斜角である。このフィッティングに基づき、

であると定義されるピーク楕円率を算出した。この楕円率が１５％を超える場合、画質が悪いか、または複数の活性スイッチが存在する可能性を示し、この領域は分析から除外した。

（３）そのピークで集めたカウントの合計数を２πａｂＩ_０（２パイａｂＩ_０）として算出し、光電子に変換し、電子の増倍および画像化中に使用するＡＤＣゲイン設定のために、カメラ製造業者の較正曲線を用いて光子の数を検出した。そのピークの光電子の合計数が２，０００未満であった場合、高い位置特定精度を達成するのに統計的に十分ではないため、その領域は除外した。

上述の試験に合格した蛍光トレースの領域を、最終的な位置特定分析で使用した。これらの領域に対応する蛍光画像を、ピクセルにしたＧａｕｓｓｉａｎ関数を用いて最終的にフィッティングさせ、重心位置を決定した。ＣＣＤチップが有限サイズの平方ピクセルを含んでいるため、精度を最適化するために、画像を以下にフィッティングさせた：

これを、評価を簡単にするために、誤差関数の観点から以下のように表しなおすことができる：

式中、Ａ、Ｉ_０、ａ、ｂ、ｘ_０およびｙ_０は上に定義したとおりであり、δ（デルタ）は、目的平面のピクセルの固定した半幅である。このフィッティングで得た最終的な重心の座標（ｘ_０，ｙ_０）を、最終的なＳＴＯＲＭ画像の１個のデータ点として使用した。

画像分析の別の例では、活性化フレーム（例えば、中に活性化レーザあり）および画像化フレーム（例えば、中に画像化レーザあり）の繰り返しを備えた動画を調製した。それぞれの画像化フレームで、蛍光スポットを特定し、Ｇａｕｓｓｉａｎ関数および／または楕円Ｇａｕｓｓｉａｎ関数にフィッティングし、重心の位置、強度、幅および楕円率を決定してもよい。これらのパラメータに基づき、位置特定精度を満足いくレベルまで高めるために、特定の場合には、さらなる分析から、輪郭のはっきりしないピーク、幅広すぎるピーク、曲がっているピークなどを除外してもよい。連続した画像化フレームで１カメラピクセルよりも小さな変位であらわれるピークは、同じ蛍光分子由来のものであると考えられ、これらのピークの重心位置をフレーム全体でつなげ、データ構造にまとめる。このことを「ストリング（ｓｔｒｉｎｇ）」と称する。各ストリングは、１個の蛍光レポーター分子の１個のスイッチングサイクルをあらわし、ストリングの出発点は、分子がオンにスイッチングするフレームであり、終点は、その分子がオフにスイッチングするフレームである。分子の最終的な位置は、ストリング全体にわたる重心位置の重量平均として決定され、各フレームのピーク強度によって重量測定された。各スイッチングサイクルで検出された光子の合計数をさらなるフィルタとして使用し、精度の低い位置特定をさらに排除した。活性化フレームの直後に画像化フレームから出発するストリングは、制御された活性化事象であると認識することができ、活性化レーザの色によって色分けされていてもよい。他のストリングは、非特異的な活性化であると特定され、ほとんどは、赤色画像化レーザによって誘発されたものであると考えられる。

画像化中の顕微鏡の機械的なドリフトを補正するために、同じフィッティングアルゴリズムを使用し、視野にあるいくつかの蛍光ビーズの動きを自動で調べた。ビーズは基準マークの役割を果たし、各画像化サイクル中に、ビーズの位置をサンプリングした。ビーズの平均化した動きを、各１個のスイッチの位置から得た座標から引き、ドリフト補正して再構築した画像を得た。

別のドリフト補正法として、活性化フレームで活性化剤フルオロフォアを画像化し、第１の活性化フレームとその後のすべての活性化フレームとの相関関数を算出した。上述の相関関数の重心を調べることにより、画像のドリフトを決定し、ＳＴＯＲＭ画像を補正した。基準マーカーの画像から得た相関関数をドリフト補正に使用してもよい。いくつかの場合には、ＳＴＯＲＭ画像の相関関数自体を時間の関数として分析することによって、いくつかのさらなるドリフト補正が可能であることもわかった。

ｄｓＤＮＡ上に等間隔にあるスイッチを用いて、画像の定量分析をする場合、再構築した画像の座標をｋ平均クラスタリングアルゴリズムを用いて分類し、スイッチ間の距離をクラスターの重心間の距離として算出した。上述のアルゴリズムへのクラスターの入力数は、最初の赤色光照射中に観測される光退色工程の数によって選択した。

（ＤＮＡ形状の予測）
表面に結合したｄｓＤＮＡの１３５ｂｐ片の可能な形状は、ＤＮＡのＭｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏシミュレーションによって、平面に虫様形状の鎖であると算出された。ｄｓＤＮＡのＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ構造によれば、Ｃｙ５分子をヌクレオチドに接続するＣ_６リンカーの長さを説明することができ、隣にあるＣｙ５分子との輪郭長さの予想値は４６±１ｎｍであると算出された。平面内にある一連の１Å（オングストローム）接続部としてＤＮＡを処理し、それぞれ、持続長５０ｎｍを与えるように選択されたＧａｕｓｓｉａｎ分布から選択されるランダムな角度で曲っている。スイッチ間の距離の測定値を、この状況でのポリマーの末端から末端までの距離の分布と比較した。

本発明のいくつかの実施形態を本明細書に記載し、図示してきたが、当業者は、本明細書に記載の機能を実施し、および／または本明細書に記載の結果および／または１つ以上の利点を得るための種々の他の手段および／または構造を容易に想像でき、このような変形例および／または改変例はそれぞれ、本発明の範囲内にあると考えられる。さらに一般的には、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、物質および構成は例示を意図しており、実際のパラメータ、寸法、物質および／または構成は、本発明の教示内容が使用される特定の１つ以上の適用例に依存することを容易に理解するであろう。当業者は、通常の実験を超えない範囲で、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態の多くの等価物を理解するか、または解明することができるであろう。したがって、上述の実施形態が単に一例をあらわすものであり、添付の特許請求の範囲およびその等価物の範囲内で、本発明は、特定的に記載され、特許請求の範囲に記載されたもの以外のやり方で実施してもよいことを理解するべきである。本発明は、本明細書に記載のそれぞれの個々の特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法に関する。それに加え、２つ以上のこのような特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法の任意の組み合わせは、このような特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法が互いに矛盾していない場合には、本発明の範囲内に含まれる。

すべての定義は、本明細書で定義され、使用される場合、辞書の定義、参考として組み込まれる文書に記載の定義、および／または定義された用語の一般的な意味よりも優先すると理解されるべきである。

不定冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、矛盾する意味が明確に示されていない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。

句「および／または」は、本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、その接続された要素の「いずれかまたは両方」、すなわち、いくつかの場合には接続的に存在する要素、他の場合には非接続的に存在する要素を意味すると理解されるべきである。「および／または」で列挙される複数の要素は、同じ様式で解釈されるべきである。すなわち、接続された要素の「１つ以上」であると解釈されるべきである。「および／または」の節で特定的に特定された要素以外の他の要素が任意に存在してもよく、他の要素は、特定的に特定された要素と関係ある要素でもよいし、無関係な要素であってもよい。したがって、非限定例として、「Ａおよび／またはＢ」とは、例えば「〜を含む」のような非限定な語句と組み合わせて使用される場合、一実施形態では、Ａのみ（Ｂ以外の要素を任意に含む）を指し、別の実施形態では、Ｂのみ（Ａ以外の要素を任意に含む）を指し、さらに別の実施形態では、ＡおよびＢの両方（他の要素を任意に含む）などを指す。

本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上に定義した「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リストで項目に分けられている場合、「または」または「および／または」は、包括的に解釈されるべきであり、すなわち、多くの要素または要素のリストのうち、少なくとも１つを含むが、２つ以上も含み、任意に、列挙されていない項目をさらに含むと解釈されるべきである。それとは反対に、示されているもののみを示す用語、例えば、「〜のうち１つのみ」または「〜のうち実際に１つ」または請求項で使用される場合、「〜からなる」は、多くの要素または要素のリストのうち、実際に１つの要素を含むことを指す。一般的に、用語「または」は、本明細書で使用される場合、排他的な用語（例えば、「いずれか」、「〜のうち１つ」、「〜のうち１つのみ」または「実際に〜のうち１つ」）が前にある場合、排他的な代替物のみを示すと解釈される（すなわち、「片方または他方であり、両方ではない」）。「〜から本質的になる」は、特許請求の範囲で使用される場合、特許法の分野で通常使用される意味を有する。

本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、句「少なくとも１つ」は、１つ以上の要素のリストを参照している場合、その要素のリストにある任意の１つ以上の要素から選択される、少なくとも１つの要素を意味するが、その要素のリストに特定的に列挙された各要素およびすべての要素のうち少なくとも１つを必ず含むわけではなく、その要素のリストにある要素の任意の組み合わせを排除するものではないと理解されるべきである。この定義では、要素が、任意に、句「少なくとも１つ」が指す要素のリストに特定的に特定された要素以外の要素（特定的に特定された要素と関係のある要素であってもよいし、無関係の要素であってもよい）が存在してもよい。したがって、非限定例として、「ＡおよびＢのうち少なくとも１つ」（または、同じ意味で、「ＡまたはＢのうち少なくとも１つ」、または同じ意味で、「Ａおよび／またはＢのうち少なくとも１つ」）は、一実施形態では、少なくとも１つ、任意に２つ以上のＡを含み、Ｂが存在しないこと（Ｂ以外の要素を任意に含む）を指し、別の実施形態では、少なくとも１つ、任意に２つ以上のＢを含み、Ａが存在しないこと（Ａ以外の要素を任意に含む）を指し、さらに別の実施形態では、少なくとも１つ、任意に２つ以上のＡを含み、少なくとも１つ、任意に２つ以上のＢを含むこと（他の要素を任意に含む）などを指す。

矛盾する意味が明確に示されていない限り、２つ以上のステップまたは工程を含む本明細書で請求される任意の方法では、その方法のステップまたは工程の順序は、本方法のステップまたは工程操作が列挙されている順序に必ずしも限定されるものではないことも理解されるべきである。

特許請求の範囲および上の記載では、すべての移行句（例えば、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「〜を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「〜を保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「〜から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ）」などは、非限定的であると理解されるべきである。すなわち、含むことを意味するが限定するものではないと理解されるべきである。移行句の中で、「〜からなる」および「〜から本質的になる」は、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、Ｓｅｃｔｉｏｎ ２１１１．０３に記載されるように、それぞれ、限定的な移行句または半限定的な移行句である。

Claims (211)

1. 約１０００ｎｍ未満の距離で隔てられた第１の物体と第２の物体とを提供することと；
   前記第１の物体から放射される光を決定することと；
   前記第２の物体から放射される光を決定することと；
   前記第１の物体から放射される光と、前記第２の物体から放射される光とを用いて、前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定することとを含む、方法。
2. 前記第１の物体から放射される光の波長と、前記第２の物体から放射される光の波長とが異なる、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１の物体から放射される光の波長と、前記第２の物体から放射される光の波長とが実質的に同じである、請求項１に記載の方法。
4. 前記第１の物体および前記第２の物体が、異なる波長によって活性化される、請求項１に記載の方法。
5. 前記第１の物体および前記第２の物体が、実質的に同じ波長によって活性化される、請求項１に記載の方法。
6. 前記第１の物体を活性化させ、前記第１の物体から放射される光を発生することを含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記第１の物体を第１の波長を有する入射光にさらすことによって、前記第１の物体が活性化する、請求項６に記載の方法。
8. 前記第１の物体から放射される光を発生させないように、前記第１の物体を不活性化することを含む、請求項６に記載の方法。
9. 前記第２の物体を第１の波長を有する入射光にさらすことによって、前記第１の物体が不活性化する、請求項８に記載の方法。
10. 前記第１の物体を第１の波長を有する入射光にさらすことによって、前記第１の物体が不活性化する、請求項８に記載の方法。
11. 前記第２の物体を活性化させずに、前記第１の物体を活性化し、光を発生させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
12. 前記第２の物体を活性化し、光を発生させることをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記第１の物体を不活性化することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記第１の物体を不活性化させる工程の後に、前記第２の物体を活性化し、光を発生させる工程が行われる、請求項１３に記載の方法。
15. 前記第１の物体が、前記第２の物体とは化学的に異なっている、請求項１に記載の方法。
16. 前記第１の物体が、前記第２の物体と化学的に実質的に同じである、請求項１に記載の方法。
17. 前記第１の物体が、光活性化可能なプローブまたは光スイッチング可能なプローブであり、前記第２の物体が、光活性化可能なプローブまたは光スイッチング可能なプローブである、請求項１に記載の方法。
18. 前記第１の物体が、光活性化可能な染料または光スイッチング可能な染料である、請求項１に記載の方法。
19. 前記第１の物体が、光活性化可能な蛍光タンパク質または光スイッチング可能な蛍光タンパク質である、請求項１に記載の方法。
20. 前記第２の物体が、光活性化可能な染料または光スイッチング可能な染料である、請求項１に記載の方法。
21. 前記第２の物体が、光活性化可能な蛍光タンパク質または光スイッチング可能な蛍光タンパク質である、請求項１に記載の方法。
22. 前記第１の物体が、第１部分である光放射部分と、外的刺激にさらされると前記第１部分を活性化する第２部分である活性化部分とを含む、請求項１に記載の方法。
23. 前記第１部分である光放射部分がＣｙ５である、請求項２２に記載の方法。
24. 前記第１部分である光放射部分がＣｙ５．５である、請求項２２に記載の方法。
25. 前記第１部分である光放射部分がＣｙ７である、請求項２２に記載の方法。
26. 前記第１部分である光放射部分がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７である、請求項２２に記載の方法。
27. 前記第２部分である活性化部分がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５である、請求項２２に記載の方法。
28. 前記第２部分である活性化部分がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８である、請求項２２に記載の方法。
29. 前記第２部分である活性化部分がＣｙ２である、請求項２２に記載の方法。
30. 前記第２部分である活性化部分がＣｙ３である、請求項２２に記載の方法。
31. 前記第２部分である活性化部分がＣｙ３．５である、請求項２２に記載の方法。
32. 前記第２部分である活性化部分がＣｙ５である、請求項２２に記載の方法。
33. 前記第２の物体が、第１部分である光放射部分と、外的刺激にさらされると前記第１部分を活性化する第２部分である活性化部分とを含む、請求項２２に記載の方法。
34. 前記第１部分である光放射部分がＣｙ５である、請求項３３に記載の方法。
35. 前記第１部分である光放射部分がＣｙ５．５である、請求項３３に記載の方法。
36. 前記第１部分である光放射部分がＣｙ７である、請求項３３に記載の方法。
37. 前記第１部分である光放射部分がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７である、請求項３３に記載の方法。
38. 前記第２部分である活性化部分がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５である、請求項３３に記載の方法。
39. 前記第２部分である活性化部分がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８である、請求項３３に記載の方法。
40. 前記第２部分である活性化部分がＣｙ２である、請求項３３に記載の方法。
41. 前記第２部分である活性化部分がＣｙ３である、請求項３３に記載の方法。
42. 前記第２部分である活性化部分がＣｙ３．５である、請求項３３に記載の方法。
43. 前記第２部分である活性化部分がＣｙ５である、請求項３３に記載の方法。
44. 前記第１の物体の第１部分と、前記第２の物体の第１部分とが、化学的に実質的に同じであり、前記第１の物体の第２部分と、前記第２の物体の第２部分とが、化学的に同じではない、請求項３３に記載の方法。
45. 前記第１の物体の第１部分と、前記第２の物体の第１部分とが、化学的に同じではなく、前記第１の物体の第２部分と、前記第２の物体の第２部分とが、化学的に実質的に同じである、請求項３３に記載の方法。
46. 前記第１の物体の第１部分と、前記第２の物体の第１部分とが、化学的に同じではなく、前記第１の物体の第２部分と、前記第２の物体の第２部分とが、化学的に同じではない、請求項３３に記載の方法。
47. 前記第１の物体の第１部分と、前記第２の物体の第１部分とが、化学的に実質的に同じであり、前記第１の物体の第２部分と、前記第２の物体の第２部分とが、化学的に実質的に同じである、請求項３３に記載の方法。
48. 前記第１の物体および前記第２の物体がスイッチング可能である、請求項１に記載の方法。
49. 前記第１の物体から放射される光が可視光である、請求項１に記載の方法。
50. 前記第１の物体および前記第２の物体が、共通の物体に固定される、請求項１に記載の方法。
51. 前記共通の物体が生体分子複合体を含む、請求項５０に記載の方法。
52. 前記共通の物体が生体分子を含む、請求項５０に記載の方法。
53. 前記生体分子が核酸である、請求項５２に記載の方法。
54. 前記第１の物体と前記第２の物体とを隔てている塩基の数を決定することをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
55. 前記生体分子がＤＮＡである、請求項５３に記載の方法。
56. 前記生体分子がＲＮＡである、請求項５３に記載の方法。
57. 前記生体分子がＰＮＡである、請求項５３に記載の方法。
58. 前記生体分子がタンパク質である、請求項５２に記載の方法。
59. 前記共通の物体が細胞である、請求項５０に記載の方法。
60. 前記共通の物体が組織である、請求項５０に記載の方法。
61. 前記共通の物体が生体物質ではない、請求項５０に記載の方法。
62. 前記第１の物体から放射される光を決定する工程と、前記第２の物体から放射される光を決定する工程とを繰り返す、請求項１に記載の方法。
63. 前記第１の物体から放射される光を決定する工程が、前記第１の物体から放射される光の画像を得ることを含む、請求項１に記載の方法。
64. 前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定する工程が、前記放射光のＧａｕｓｓｉａｎフィッティングを用いて、前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
65. 前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定する工程が、ドリフト補正を用いて、前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定することをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
66. 前記ドリフト補正が、基準マーカーを用いて行われる、請求項６５に記載の方法。
67. 前記ドリフト補正が、画像相関を用いて行われる、請求項６５に記載の方法。
68. 前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置が、少なくとも約３００ｎｍの精度で決定される、請求項１に記載の方法。
69. 前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置が、少なくとも約１００ｎｍの精度で決定される、請求項１に記載の方法。
70. 前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置が、少なくとも約５０ｎｍの精度で決定される、請求項１に記載の方法。
71. 前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置が、少なくとも約２０ｎｍの精度で決定される、請求項１に記載の方法。
72. 前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置が、前記第１の物体および／または前記第２の物体から放射される光の波長未満の精度で決定される、請求項１に記載の方法。
73. 前記第１の物体と前記第２の物体とが、約７００ｎｍ未満の距離によって隔てられている、請求項１に記載の方法。
74. 前記第１の物体と前記第２の物体とが、前記第１の物体から放射される光の波長または前記第２の物体から放射される光の波長未満の距離によって隔てられている、請求項１に記載の方法。
75. 第１の時間点で前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定することと、第２の時間点で前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定することとを含む、請求項１に記載の方法。
76. ２つ以上の時間点で前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定することおよび／または時間の関数として前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
77. 前記工程が、列挙した順に行われる、請求項１に記載の方法。
78. 約１０００ｎｍ未満の距離で隔てられた第１の物体と第２の物体とを提供することと；
    前記第１の物体を活性化し、前記第２の物体を活性化しないことと；
    前記第１の物体から放射される光を決定することと；
    前記第２の物体を活性化することと；
    前記第２の物体から放射される光を決定することと；
    前記第１の物体から放射される光と、前記第２の物体から放射される光とを用いて、前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定することとを含む、方法。
79. ある距離で隔てられた第１の物体と第２の物体とを提供することと；
    前記隔てられた距離よりも大きな波長を有する、前記第１の物体から放射される光を決定することと；
    前記第２の物体から放射される光を決定することと；
    前記第１の物体から放射される光と、前記第２の物体から放射される光とを用いて、前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定することとを含む、方法。
80. 前記第１の物体から放射される光の波長と、前記第２の物体から放射される光の波長とが異なる、請求項７９に記載の方法。
81. 前記第１の物体から放射される光の波長と、前記第２の物体から放射される光の波長とが実質的に同じである、請求項７９に記載の方法。
82. 前記第１の物体を活性化するのに使用する光の波長と、前記第２の物体を活性化するのに使用する光の波長とが異なる、請求項７９に記載の方法。
83. 前記第１の物体を活性化するのに使用する光の波長と、前記第２の物体を活性化するのに使用する光の波長とが実質的に同じである、請求項７９に記載の方法。
84. 前記第１の物体を活性化させ、前記第１の物体から放射される光を発生することを含む、請求項７９に記載の方法。
85. 前記第１の物体を第１の波長を有する入射光にさらすことによって、前記第１の物体が活性化する、請求項８４に記載の方法。
86. 前記第１の物体から放射される光を発生させないように、前記第１の物体を不活性化することを含む、請求項８４に記載の方法。
87. 前記第２の物体を第１の波長を有する入射光にさらすことによって、前記第１の物体が不活性化する、請求項８６に記載の方法。
88. 前記第１の物体を第１の波長を有する入射光にさらすことによって、前記第１の物体が不活性化する、請求項８６に記載の方法。
89. 前記第２の物体を活性化させずに、前記第１の物体を活性化し、光を発生させることをさらに含む、請求項７９に記載の方法。
90. 前記第２の物体を活性化し、光を発生させることをさらに含む、請求項８９に記載の方法。
91. 前記第１の物体を不活性化することをさらに含む、請求項９０に記載の方法。
92. 前記第１の物体を不活性化させる工程の後に、前記第２の物体を活性化し、光を発生させる工程が行われる、請求項９１に記載の方法。
93. 前記第１の物体が、前記第２の物体とは化学的に異なっている、請求項７９に記載の方法。
94. 前記第１の物体が、前記第２の物体と化学的に実質的に同じである、請求項７９に記載の方法。
95. 前記第１の物体が、光活性化可能なプローブまたは光スイッチング可能なプローブであり、前記第２の物体が、光活性化可能なプローブまたは光スイッチング可能なプローブである、請求項７９に記載の方法。
96. 前記第１の物体が、第１部分である光放射部分と、外的刺激にさらされると前記第１部分を活性化する第２部分である活性化部分とを含む、請求項７９に記載の方法。
97. 前記第１部分である光放射部分がＣｙ５である、請求項９６に記載の方法。
98. 前記第１部分である光放射部分がＣｙ５．５である、請求項９６に記載の方法。
99. 前記第１部分である光放射部分がＣｙ７である、請求項９６に記載の方法。
100. 前記第１部分である光放射部分がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７である、請求項９６に記載の方法。
101. 前記第２部分である活性化部分がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５である、請求項９６に記載の方法。
102. 前記第２部分である活性化部分がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８である、請求項９６に記載の方法。
103. 前記第２部分である活性化部分がＣｙ２である、請求項９６に記載の方法。
104. 前記第２部分である活性化部分がＣｙ３である、請求項９６に記載の方法。
105. 前記第２部分である活性化部分がＣｙ３．５である、請求項９６に記載の方法。
106. 前記第２部分である活性化部分がＣｙ５である、請求項９６に記載の方法。
107. 前記第２の物体が、第１部分である光放射部分と、外的刺激にさらされると前記第１部分を活性化する第２部分である活性化部分とを含む、請求項７９に記載の方法。
108. 前記第１の物体の第１部分と、前記第２の物体の第１部分とが、化学的に実質的に同じであり、前記第１の物体の第２部分と、前記第２の物体の第２部分とが、化学的に同じではない、請求項１０７に記載の方法。
109. 前記第１の物体の第１部分と、前記第２の物体の第１部分とが、化学的に同じではなく、前記第１の物体の第２部分と、前記第２の物体の第２部分とが、化学的に実質的に同じである、請求項１０７に記載の方法。
110. 前記第１の物体の第１部分と、前記第２の物体の第１部分とが、化学的に同じではなく、前記第１の物体の第２部分と、前記第２の物体の第２部分とが、化学的に同じではない、請求項１０７に記載の方法。
111. 前記第１の物体の第１部分と、前記第２の物体の第１部分とが、化学的に実質的に同じであり、前記第１の物体の第２部分と、前記第２の物体の第２部分とが、化学的に実質的に同じである、請求項１０７に記載の方法。
112. 前記第１の物体から放射される光が可視光である、請求項７９に記載の方法。
113. 前記第１の物体および前記第２の物体が、共通の物体に固定される、請求項７９に記載の方法。
114. 前記第１の物体から放射される光を決定する工程と、前記第２の物体から放射される光を決定する工程とを繰り返す、請求項７９に記載の方法。
115. 前記第１の物体から放射される光を決定する工程が、前記第１の物体から放射される光の画像を得ることを含む、請求項７９に記載の方法。
116. 前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定する工程が、前記放射光のＧａｕｓｓｉａｎフィッティングを用いて、前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定することを含む、請求項７９に記載の方法。
117. 前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定する工程が、ドリフト補正を用いて、前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定することをさらに含む、請求項１１６に記載の方法。
118. 前記ドリフト補正が、基準マーカーを用いて行われる、請求項１１７に記載の方法。
119. 前記ドリフト補正が、画像相関を用いて行われる、請求項１１７に記載の方法。
120. 前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置が、少なくとも約３００ｎｍの精度で決定される、請求項７９に記載の方法。
121. 前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置が、前記第１の物体または前記第２の物体から放射される光の波長よりもおおきな精度で決定される、請求項７９に記載の方法。
122. 第１の時間点で前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定することと、第２の時間点で前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定することとを含む、請求項７９に記載の方法。
123. ２つ以上の時間点で前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定することおよび／または時間の関数として前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定することを含む、請求項７９に記載の方法。
124. ある距離で隔てられた第１の物体と第２の物体とを提供することと；
     前記第１の物体を活性化し、前記第２の物体を活性化しないことと；
     前記隔てられた距離よりも大きな波長を有する、前記第１の物体から放射される光を決定することと；
     前記第２の物体を活性化することと；
     前記第２の物体から放射される光を決定することと；
     前記第１の物体から放射される光と、前記第２の物体から放射される光とを用いて、前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定することとを含む、方法。
125. 光を放射することが可能で、そのうちのいくつかは、放射される光の波長未満の距離で隔てられている、複数の物体を提供することと；
     前記複数の物体の一部分を活性化し、光を放射させることと；
     前記放射される光を決定することと；
     前記複数の物体のうち、前記活性化した部分を不活性化することと；
     前記複数の物体を活性化し、不活性化する工程を繰り返して、前記複数の物体の位置を決定することとを含む、方法。
126. 前記複数の物体の少なくともいくつかが、異なる波長で光を放射する、請求項１２５に記載の方法。
127. 前記複数の物体が、各々実質的に同じ波長で光を放射する、請求項１２５に記載の方法。
128. 前記複数の物体の少なくともいくつかが、異なる波長の光によって活性化される、請求項１２５に記載の方法。
129. 前記複数の物体が、実質的に同じ波長の光によって活性化される、請求項１２５に記載の方法。
130. 第１の波長を有する入射光を前記複数の物体に照射することによって、前記複数の物体の一部分が活性化する、請求項１２５に記載の方法。
131. 第２の波長を有する入射光を前記複数の物体の一部分に照射することによって、前記複数の物体の一部分を不活性化する、請求項１２５に記載の方法。
132. 第１の波長を有する入射光を前記複数の物体に照射することによって、前記複数の物体の一部分を不活性化する、請求項１２５に記載の方法。
133. 前記複数の物体の少なくともいくつかが化学的に異なっている、請求項１２５に記載の方法。
134. 前記複数の物体が化学的に実質的に同じである、請求項１２５に記載の方法。
135. 前記複数の物体の少なくともいくつかが、光活性化可能なプローブまたは光スイッチング可能なプローブである、請求項１２５に記載の方法。
136. 前記複数の物体の少なくともいくつかが、第１部分である光放射部分と、外的刺激にさらされると前記第１部分を活性化する第２部分である活性化部分とを含む、請求項１２５に記載の方法。
137. 前記複数の物体の第１部分が化学的に同じであり、前記複数の物体の第２部分が化学的に同じではない、請求項１３６に記載の方法。
138. 前記複数の物体の第１部分が化学的に同じではなく、前記複数の物体の第２部分が化学的に実質的に同じである、請求項１３６に記載の方法。
139. 前記複数の物体の第１部分が化学的に同じではなく、前記複数の物体の第２部分が化学的に同じではない、請求項１３６に記載の方法。
140. 前記複数の物体の第１部分が化学的に実質的に同じであり、前記複数の物体の第２部分が化学的に実質的に同じである、請求項１３６に記載の方法。
141. 前記放射光が可視光である、請求項１２５に記載の方法。
142. 前記複数の物体の少なくともいくつかが、共通の物体に固定される、請求項１２５に記載の方法。
143. 前記放射光を決定する工程が、前記放射光の画像を得ることを含む、請求項１２５に記載の方法。
144. 前記複数の物体の位置を決定する工程が、前記放射光のＧａｕｓｓｉａｎフィッティングを用いて、前記複数の物体の位置を決定することを含む、請求項１２５に記載の方法。
145. 前記複数の物体の位置を決定する工程が、ドリフト補正を用いて、前記複数の物体の位置を決定することを含む、請求項１４４に記載の方法。
146. 前記ドリフト補正が、基準マーカーを用いて行われる、請求項１４５に記載の方法。
147. 前記ドリフト補正が、画像相関を用いて行われる、請求項１４５に記載の方法。
148. 前記複数の物体の位置が、少なくとも約３００ｎｍの精度で決定される、請求項１２５に記載の方法。
149. 前記複数の物体の位置が、前記複数の物体から放射される光の波長よりも大きな精度で決定される、請求項１２５に記載の方法。
150. 第１の時間点で前記複数の物体の位置を決定することと、第２の時間点で前記複数の物体の位置を決定することとを含む、請求項１２５に記載の方法。
151. ２つ以上の時間点で前記複数の物体の位置を決定することおよび／または時間の関数として前記複数の物体の位置を決定することを含む、請求項１２５に記載の方法。
152. 前記工程が、列挙した順に行われる、請求項１２５に記載の方法。
153. 光を放射することが可能で、そのうちのいくつかは、約１０００ｎｍ未満の距離で隔てられている、複数の物体を提供することと；
     前記複数の物体の一部分を活性化し、光を放射させることと；
     前記放射される光を決定することと；
     前記複数の物体の前記活性化した部分を不活性化することと；
     前記複数の物体を活性化し、不活性化する工程を繰り返し、前記複数の物体の位置を決定することとを含む、方法。
154. 前記複数の物体の少なくともいくつかが、異なる波長で光を放射する、請求項１５３に記載の方法。
155. 前記複数の物体が、各々実質的に同じ波長で光を放射する、請求項１５３に記載の方法。
156. 前記複数の物体の少なくともいくつかが、異なる波長の光によって活性化される、請求項１５３に記載の方法。
157. 前記複数の物体が、実質的に同じ波長の光によって活性化される、請求項１５３に記載の方法。
158. 第１の波長を有する入射光を前記複数の物体の一部分に照射することによって、前記複数の物体の一部分を活性化する、請求項１５３に記載の方法。
159. 第２の波長を有する入射光を前記複数の物体の一部分に照射することによって、前記複数の物体の一部分を不活性化する、請求項１５３に記載の方法。
160. 第１の波長を有する入射光を前記複数の物体の一部分に照射することによって、前記複数の物体の一部分を不活性化する、請求項１５３に記載の方法。
161. 前記複数の物体の少なくともいくつかが、光活性化可能なプローブまたは光スイッチング可能なプローブである、請求項１５３に記載の方法。
162. 前記プローブの少なくともいくつかが、光活性化可能な染料または光スイッチング可能な染料である、請求項１６１に記載の方法。
163. 前記プローブの少なくともいくつかが、光活性化可能な蛍光タンパク質または光スイッチング可能な蛍光タンパク質である、請求項１６１に記載の方法。
164. 前記複数の物体の少なくともいくつかが、第１部分である光放射部分と、外的刺激にさらされると前記第１部分を活性化する第２部分である活性化部分とを含む、請求項１５３に記載の方法。
165. 前記複数の物体の第１部分が化学的に同じであり、前記複数の物体の第２部分が化学的に同じではない、請求項１６４に記載の方法。
166. 前記複数の物体の第１部分が化学的に同じではなく、前記複数の物体の第２部分が化学的に実質的に同じである、請求項１６４に記載の方法。
167. 前記複数の物体の第１部分が化学的に同じではなく、前記複数の物体の第２部分が化学的に同じではない、請求項１６４に記載の方法。
168. 前記複数の物体の少なくともいくつかが、共通の物体に固定される、請求項１５３に記載の方法。
169. 前記放射光を決定する工程が、前記放射光の画像を得ることを含む、請求項１５３に記載の方法。
170. 前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定する工程が、前記放射光のＧａｕｓｓｉａｎフィッティングを用いて、前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定することを含む、請求項１５３に記載の方法。
171. 前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定する工程が、ドリフト補正を用いて、前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定することをさらに含む、請求項１７０に記載の方法。
172. 前記ドリフト補正が、基準マーカーを用いて行われる、請求項１７１に記載の方法。
173. 前記ドリフト補正が、画像相関を用いて行われる、請求項１７１に記載の方法。
174. 前記複数の物体の位置が、少なくとも約３００ｎｍの精度で決定される、請求項１５３に記載の方法。
175. 前記複数の物体の位置が、前記第１の物体から放射される光の波長未満の精度で決定される、請求項１５３に記載の方法。
176. 第１の時間点で前記複数の物体の位置を決定することと、第２の時間点で前記複数の物体の位置を決定することとを含む、請求項１５３に記載の方法。
177. 約１０００ｎｍ未満の距離で隔てられ、各々共通の物体に固定されている第１の物体と第２の物体とを提供することと；
     第１の時間点で前記第１の物体および前記第２の物体の位置を決定することと；
     第２の時間点で前記第１の物体および前記第２の物体の位置を決定することと；
     前記第１の時間点および前記第２の時間点での前記第１の物体および前記第２の物体の位置を用いて、前記共通の物体の移動を決定することとを含む、方法。
178. ある距離で隔てられ、共通の物体に固定されている第１の物体と第２の物体とを提供することと；
     前記隔てられたある距離より大きな波長を有する前記第１の物体から放射される光と、前記第２の物体から放射される光とを用いて、第１の時間点で前記第１の物体および前記第２の物体の位置を決定することと；
     第２の時間点で前記第１の物体および前記第２の物体の位置を決定することと；
     前記第１の時間点および前記第２の時間点での前記第１の物体および前記第２の物体の位置を用いて、前記共通の物体の移動を決定することとを含む、方法。
179. 時間内の一連の画像の中で、１つの物体によって各々作成される１つ以上の光放射領域を同定することと；
     各光放射領域について、その光放射領域の中心を同定することと；
     各光放射領域について、前記光放射領域を作成する前記１つの物体の位置を、前記１つの物体から放射される光の波長よりも大きな解像度で再構築することとを含む、方法。
180. 前記光放射領域の中心を同定する工程が、Ｇａｕｓｓｉａｎ関数に対する最少二乗法を用いることを含む、請求項１７９に記載の方法。
181. 前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定する工程が、ドリフト補正を用いて、前記第１の物体の位置および前記第２の物体の位置を決定することをさらに含む、請求項１７９に記載の方法。
182. 前記ドリフト補正が、基準マーカーを用いて行われる、請求項１８１に記載の方法。
183. 前記ドリフト補正が、画像相関を用いて行われる、請求項１８１に記載の方法。
184. 前記１つの物体が、光活性化可能なプローブまたは光スイッチング可能なプローブである、請求項１７９に記載の方法。
185. 前記１つの物体が、第１部分である光放射部分と、外的刺激にさらされると前記第１部分を活性化する第２部分である活性化部分とを含む、請求項１７９に記載の方法。
186. 前記１つ以上の光放射領域の位置を再構築したものを用いて、画像を作成することをさらに含む、請求項１７９に記載の方法。
187. 時間内の一連の画像の中で、１つの物体によって各々作成される１つ以上の光放射領域を同定する工程と；
     各光放射領域について、その光放射領域の中心を同定する工程と；
     各光放射領域について、前記光放射領域を作成する前記１つの物体の位置を、前記１つの物体から放射される光の波長よりも大きな解像度で再構築する工程とを含む方法を機械に実行させるために、媒体に組み込まれたプログラムを備える機械可読媒体を含む、物品。
188. 約１００ｎｍ／分未満のドリフトを有する顕微鏡用の移動ステージを備える、物品。
189. 前記移動ステージが、約１０ｎｍ／分未満のドリフトを有する、請求項１８８に記載の物品。
190. 前記移動ステージの少なくとも一部分に照射するように配置された光源をさらに備え、この光源を、プログラムされた様式で作動させ、停止させることが可能である、請求項１８８に記載の物品。
191. 前記移動ステージの少なくとも一部分に照射するように配置された光源をさらに備え、この光源を、周期的な様式で作動させ、停止させることが可能である、請求項１８８に記載の物品。
192. 前記移動ステージの少なくとも一部分に照射するように配置された光源をさらに備え、この光源をシャッターを用いて調節することが可能である、請求項１８９に記載の物品。
193. 前記移動ステージの少なくとも一部分に照射するように配置された光源をさらに備え、この光源を音響光学変調器を用いて調節することが可能である、請求項１８９に記載の物品。
194. 前記移動ステージに光学的に連結した位置に光検出器をさらに備える、請求項１８９に記載の物品。
195. 前記光検出器が、フォトダイオード、光電子増倍器またはＣＣＤカメラを備える、請求項１９４に記載の物品。
196. 前記移動ステージの少なくとも一部分に照射するように配置された２つ以上の光源をさらに備える、請求項１８９に記載の物品。
197. 前記２つ以上の光源のうち少なくとも２つは、異なる波長で光を放射する、請求項１９６に記載の物品。
198. 光源から前記移動ステージに直接光があたるように配置された二色性ミラーまたは多色性ミラーを備える、請求項１８９に記載の物品。
199. 前記移動ステージの少なくとも一部分に照射するように配置された光源と、前記移動ステージに照射する前に、前記光源から放射される光の少なくとも一部分を変えるように配置されたカラーフィルタとをさらに備える、請求項１８９に記載の物品。
200. 第１の放射波長で光を放射可能な第１状態と、第１の放射波長では実質的に光を放射しない第２状態とにスイッチング可能な、光を放射する物体を含む、画像化組成物。
201. 前記光を放射する物体と区別可能であり、第１の放射波長で光を放射可能な第１状態と、第１の放射波長では実質的に光を放射しない第２状態とにスイッチング可能な、第２の光を放射する物体をさらに含む、請求項２００に記載の画像化組成物。
202. 前記光を放射する物体が、
     前記第１の波長で光を放射可能な第１部分と；
     外的刺激にさらされると、前記第１の部分を活性化させ、前記第１の波長で前記第１部分から光を放射させる第２部分とを含む、請求項２００に記載の画像化組成物。
203. 励起波長を有する光にさらされると、前記第２部分が前記第１部分を活性化させる、請求項２０２に記載の画像化組成物。
204. 前記第１部分が前記第２部分と共有結合している、請求項２０２に記載の画像化組成物。
205. 前記第１部分および前記第２部分が、各々共通の物体に結合している、請求項２０２に記載の画像化組成物。
206. 前記第１部分が、前記第２部分から切り離されると蛍光性である、請求項２０２に記載の画像化組成物。
207. 前記第２部分が、前記第１部分から切り離されると蛍光性である、請求項２０２に記載の画像化組成物。
208. 前記第１部分が、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７である、請求項２０２に記載の画像化組成物。
209. 前記第２部分が、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ｃｙ２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ｃｙ３またはＣｙ３．５である、請求項２０２に記載の画像化組成物。
210. 前記第１部分および前記第２部分が、約５０ｎｍ以下の距離で隔てられている、請求項２０２に記載の画像化組成物。
211. 前記光を放射する物体と区別可能な第２の光を放射する物体をさらに含み、この第２の光を放射する物体が、第１の波長で光を放射可能な第１部分と、外的刺激にさらされると前記第１部分を活性化する第２部分とを含み、それにより前記第１部分が前記第１の波長で光を放射する、請求項２０２に記載の画像化組成物。
     

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