SE1351503A1 - System och metod för fluorescensmikroskopi med detektering av ljusemission från multipla fluorokromer - Google Patents

System och metod för fluorescensmikroskopi med detektering av ljusemission från multipla fluorokromer Download PDF

Info

Publication number
SE1351503A1
SE1351503A1 SE1351503A SE1351503A SE1351503A1 SE 1351503 A1 SE1351503 A1 SE 1351503A1 SE 1351503 A SE1351503 A SE 1351503A SE 1351503 A SE1351503 A SE 1351503A SE 1351503 A1 SE1351503 A1 SE 1351503A1
Authority
SE
Sweden
Prior art keywords
fluorochrome
fluorochromes
light
analog
excitation
Prior art date
Application number
SE1351503A
Other languages
English (en)
Other versions
SE537103C2 (sv
Inventor
Per Fogelstrand
Original Assignee
Per Fogelstrand
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Per Fogelstrand filed Critical Per Fogelstrand
Priority to SE1351503A priority Critical patent/SE1351503A1/sv
Priority to PCT/SE2014/051484 priority patent/WO2015094088A1/en
Priority to US15/100,646 priority patent/US20160306156A1/en
Priority to EP14872537.7A priority patent/EP3084503A4/en
Priority to EP20170591.0A priority patent/EP3745181A1/en
Priority to CN201480068794.3A priority patent/CN105829944A/zh
Priority to JP2016547559A priority patent/JP2017509010A/ja
Priority to CN202010099834.8A priority patent/CN111208106A/zh
Publication of SE537103C2 publication Critical patent/SE537103C2/sv
Publication of SE1351503A1 publication Critical patent/SE1351503A1/sv
Priority to US15/627,601 priority patent/US11668918B2/en

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G02B21/08—Condensers
    • G02B21/088—Condensers for both incident illumination and transillumination
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B6/00—Light guides; Structural details of arrangements comprising light guides and other optical elements, e.g. couplings
    • G02B6/0001—Light guides; Structural details of arrangements comprising light guides and other optical elements, e.g. couplings specially adapted for lighting devices or systems
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6419—Excitation at two or more wavelengths
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6421—Measuring at two or more wavelengths
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N2021/6463—Optics
    • G01N2021/6471—Special filters, filter wheel
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B26/00—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements
    • G02B26/007—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements the movable or deformable optical element controlling the colour, i.e. a spectral characteristic, of the light
    • G02B26/008—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements the movable or deformable optical element controlling the colour, i.e. a spectral characteristic, of the light in the form of devices for effecting sequential colour changes, e.g. colour wheels

Abstract

SAMMANDRAG Foreliggande uppfinning ror fluorescensmikroskopi och mer specifikt till forbattringar av metoden for och ett motsvarande fluorescensmikroskopisystem for att tillàta separat detektering av ett flertal fluorokromer.

Description

FLUORESCENSMIKROSKOPISYSTEM TEKNISKT OMRADE Foreliggande uppfinningen hanfor sig allmant till fluorescensmikroskopi och mer specifikt till forbattringar av en metod for mikroskopisystem och ett motsvarande fluorescensmikroskopisystem for att tillâta separat detektion av ett emitterande ljus fran ett prov som är markt med ett flertal olika fluorokromer.
BAKGRUND TILL UPPFINNINGEN Fluorescensmikroskopi är en ljusmikroskopiteknik for att studera strukturer eller egenskaper hos ett prov genom att avbilda fluorescerande eller fosforerande emission fran specifika amnen sasom organiska molekyler eller oorganiska amnen lokaliserade pa eller inuti ett prov. Exempelvis kan provet vara markt med en eller ett flertal olika fluorokromer Oven betecknade som fluoroforer), molekyler som nar de absorberar ljus darefter avger deras 'Rade energi pa olika satt, varav ett är emission av ljus med langre vaglangder.
Ndr en sadan molekyl bestralas med ultraviolett, synligt, nara infrarott eller infrarott ljus kan den genomga en elektronisk forflyttning under vilken molekylen absorberar en viss mangd energi, och en elektron exciteras fran den orbital den upptar i grundtillstandet till en annan orbital av hogre energi. Vagldngdsspektrat vid vilken den bestralade molekylen absorberar ljus kallas for absorptionsspektra eller excitationsspektra. De fiesta exciterade tillstand är kortvariga och det vanligaste octet for den absorberade energin är ateremittering av ljus i form av fosforescens eller fluorescens. Vaglangdsspektrat vid vilken den bestrdlade molekylen emitterar ljus kallas for emissionsspektra. De fluorescerande egenskaperna av organiska och oorganiska fargamnen utgor grunden for ett antal analytiska metoder, av vilka en är immunofluorescens, vilka anvander fluorokromkonjugerade antikroppar for att detektera proteiner och andra molekyler.
Ett typiskt fluorescensmikroskop som vanligtvis anvands for sadana analyser innefattas av en ljuskalla, optik for att overfora ljus in i en excitationsljusbana, ett excitationsfilter for att selektera fram ett eller flera band av excitationsvaglangder som overfors till objektet, en dikroidspegel utformad att reflektera banden av excitationsvaglangder till provet och samtidigt vidarebefordra de emitterande fluorescensvaglangderna fran provet till den optiska emissionsbanan, ett emissionsfilter som blockerar exciterande stroljusvaglangder som overfOrs till den optiska emissionsbanan och optik att vidarebefordra de fluorescerande emissionsvaglangderna till ogat eller till en apparatur som tar bilder, sasom en kamera.
Generellt är alla moderna mikroskop forsedda med flera snabbt vaxlingsbara "filterkuber", ddr vane filterkub är tillagnad en specifik fluorokrom (eller en uppsattning av liknande fluorokromer) och innehaller en anpassad uppsattning av excitationsfilter, dikroidspegel och emissionsfilter. Separat och sekventiell visualisering av olika fluorokromer kan latt astadkommas genom att vdxla mellan de matchade filteruppsatningarna, en i taget i foljd.
Sadan sekventiell visualisering av olika fluorokromer, som var och en har ett unikt excitations/emissionsvagldngdsspektra, kan till exempel anvandas for aft avsloja den rumsliga lokaliseringen av tva (eller flera) proteiner i en vavnad, genom att anvanda fluorescerande proteiner (t ex GFP) eller fluorokrommarkta antikroppar (sa kallad immunofluorescens) eller detektering av tva (eller flera) DNA-mutationer i celler, genom anvandning av fluorokrommdrkta nukleinsyror (prober).
I sadana studier finns det ofta en onskan att kombinera manga kanaler for att utvinna mer information. Till exempel är det i biologiska studier vanligt att visualisera flera olika celltyper i ett vavnadsprov genom att anvanda cellspecifika antikroppar markta med olika fluorokromer. Idag kan dock endast ett begransat antal fluoroforer ordentligt skiljas at i samma prov, pa grund av genomblodning av emitterat ljus fran olika fluorokromer. Problemet med genomblOdning (awn kallat spill-over artefakter) kan losas genom kompensation, dvs. datorbaserade berdkningar som kompenserar for adderande signaler fran delvis overlappande fluorokromspektra. Detta är emellertid en komplicerad process som inte rutinmassigt anvands inom forskning eller laboratoriemedicin.
Det skulle ddrfor vara onskvart att tillhandahalla en metod och ett mikroskopisystem utformat for enkel separation och forbattrad detektering av ljusemission fran mer an fyra olika fluorokromer.
SAMMANFATTNING AV UPPFINNINGEN Enligt en forsta aspekt av uppfinningen är det ovanstaende atminstone delvis astadkommit genom en metod for att detektera fluorescens som emitteras fran ett prov markt med ett flertal forutbestamda fluorokromer och anvandning av ett mikroskopsystem innefattande en ljuskalleanordning, van i metoden innefattar stegen att valja minst fyra olika fluorokromer utformade att avge ljus inom det synliga ljusspektrat, de dtminstone fyra olika fluorokromerna innefattar en forsta och en andra fluorokrom som bildar ett par av fluorokromer, vdlja excitationsvagldngdsintervaller fOr de atminstone fyra olika fluorokromer, varvid excitaionsvaglangdsintervallet for den andra fluorokromen valjs sâ att exciteringen av den forsta fluorokromen är reducerad, utforma en filteranordning i mikroskopisystemet air att selektivt tillâta ljus att passera inom emissionsvaglangdsintervall som overensstammer med emissionsvaglangdsintervallen hos de atminstone fyra olika fluorokromerna, varvid emissionsvaglangdsintervallet for den forsta fluorokromen är vald for att minska genomblodning av ljusemission fran den andra fluorokromen, sekventiellt emittera ljus inom kminstone en del av de valda excitationsvaglangdintervallema, och detektera ljus som emitteras fran provet genom filteranordningen, varvid paret av fluorokromer valjs som en Cy3 fluorokromanalog som bildar den forsta fluorokromen och en 594 fluorokromanalog som bildar den andra fluorokromen, eller paret av fluorokromer valjs som en 425 fluorokromanalog som bildar den forsta fluorokromen och en 488 fluorokromanalog som bildar den andra fluorokromen.
Uppfinningcn är bascrad pa insiktcn att genom att losa dct primara problcmct med att separera fluorescenssignaler som emitteras fran ett prov markt med en forsta fluorokrom och en andra fluorokrom, kommer fordelar med minskade komplikationer for att ocksa mojliggora separation av ytterligare fluorescenssignaler fran en tredje och en fjarde (annan) fluorokrom, begransat till det fall dA fluorokromema emitterar ljus inom det synliga spektrat (t ex vanligtvis inom intervallet 400 till 640 nm) och den forsta och den andra fluorokromen är antingen en kombination/par av fluorokromer som utgOrs av en Cy3 fluorokromanalog och en 594 fluorokromanalog, respektive, eller den forsta och den andra fluorokromen är antingen en kombination/par av fluorokromer som utgOrs av en 425 fluorokromanalog och en 488 fluorokromanalog, respektive. Detta uppnas i enlighet med uppfinningen genom att valja ett excitationsvaglangdsintervall for den andra fluorokromen, sa att exciteringen av den forsta fluorokromen reduceras och genom att vdlja ett emissionsvaglangdsintervall for den forsta fluorokromen, sà att genomblodning av ljusemission fran den andra fluorokromen är reducerad. mom ramen for uppfinningen är det majligt att uppnà signalseparation av de kminstone fyra fluorokromema. Varje prov behover emellertid inte nodvandigtvis vid varje given tidpunkt vara inmarkt med de minst fyra fluorokromerna. Foljaktligen, de kminstone fyra fluorokromer som kan separeras är till forfogande med hjdlp av uppfinningen, men inte nodvandigtvis alla sekventiellt exciterade "samtidigt", t.ex. i vissa utforingsformer kan endast en, tva eller tre av de kminstone fyra fluorokromema exciteras, men mikroskopet har kapacitet att separera signaler fran var och en av de kminstone fyra fluorokromerna.
I fraga om en av de ovan diskuterade paren av fluorokromer, bar termen "Cy3 fluorokromanalog" tolkas i sin vidaste bemarkelse, inklusive organisk eller oorganisk forening som har ett liknande excitationsiemissionsspektrum. Saledes kan en Cy3 fluorokromanalog exempelvis vara nagon av en Cy3, en CF543, en AttoRho6G, en AF546 eller en Dylight549-baserad fluorokrom. Pa samma satt, en "594 fluorokromanalog "kan exempelvis vara nagon av en Texas rod, en CF594, en CF620R, en AF594, en Dylight594, en Atto590, en Atto594, en Atto610 eller en CF620R-baserad fluorokrom. Det bar noteras att listan inte är exklusiv och ytterligare nuvarande och framtida motsvarande fluorokromer kan overvagas, och vara inom ramen for uppfinningen.
I flip om en annan av de ovan diskuterade par av fluorokromer bar termen "425 fluorokromanalog" tolkas i sin vidaste bemarkelse, inklusive organisk eller oorganisk forening som har ett liknande excitationsiemissionsspektrum. Saledes, en 425 fluorokromanalog kan exempelvis vara flagon av en Atto425, Sytox blue, eller en CFPbaserad fluorokrom. Pa samma satt, en "488 analog fluorokrom" kan exempelvis vara nagon av en CF488, en AF488, en Dylight488, en Atto488, en FITC, en EGFP eller en GFP-baserad fluorokrom.
Dessutom, baserat pa molekylar komplexitet och syntetiska metoder, ska den allmanna termen "fluorokrom" tolkas brett, inklusive alla typer av fluorokromer baserade pa proteiner och peptider, sma organiska foreningar, syntetiska oligomerer och polymerer, eller flerkomponentsystem, uttryck som är val kanda inom omrndet. Beroende pa tillampning kan typen av fluorokrom som any-ands variera. Det vill saga, i icke-levande prover är det i allmanhet onskvart att valja en fotostabil fluorokrom, medan nar det galler till exempel en "live-imaging" applikation (innefattandelevande prov) är det ofta nodvandigt att \raja en fluorokrom som har egenskaper sasom till exempel att vara icke-toxisk. Olika tillampningar kan vara mojliga i enlighet enligt med nya metoden.
Separationen av fluorescenssignaler fran de kminstone fyra fluorokromerna kommer att ha stora fordelar inom omfadet fluorescensmikroskopi, speciellt eftersom det kommer att mojliggora "screening" av en stor panel av proteiner inom nagra fa vavnadsprover. Dessutom mojliggor den avancerade samlokaliseringsanalyser, dar manga proteiner kan visualiseras i samma prov (t.ex. for multifargningsanalys). Dessutom forenklar det anvandandet av fluorescensmikroskopi for anvandarna, eftersom de kan valja att marka in prover med vilka som helst av alla de fluorokromer som filteruppsattningarna kan separera utan att behova tanka pa eventuella genomblodningsartefakter.
Metoden innefattar foretradesvis aven steget att marka provet med de atminstone fyra olika fluorokromema. Det finns fOr narvarande manga olika tillgängliga metoder for att marka ett prov, dar inmarkningsmetoderna är beroende av vilken typ av prov samt vilken del av provet är det onskvart att marka. FOljaktligen och sasom inses av fackman, kan prover till exempel markas med fluorokrommarkta antikroppar, cellmembranfarger, DNA-bindande fluorokromer, fluorokrommarkta nukleinsyraprober och fluorescerande proteiner for att fa information om biologin och patologin hos proteiner, DNA, celler och vavnader fran manniskor, djur, vaxter och mikroorganismer.
I en fordelaktig utforingsform av uppfinningen valjs fern olika fluorokromer ut och metoden anpassas i enlighet armed. Foljaktligen, for en sadan utforingsform valjs ett par av fluorokromer dar Cy3 fluorokromanalogen bildar den forsta fluorokromen och 594 fluorokromanalogen bildar den andra fluorokromen, och ett ytterligare par av fluorokromer valjs dar 425 fluorokromanalogen bildar den forsta fluorokromen och 488 fluorokromanalogen bildar den andra fluorokromen.
Det kan dessutom vara mojligt att ocksa inkludera atminstone en ytterligare kompletterande fluorokrom, som sander ut ljus i det nara infraroda spektrat (t. ex. vanligtvis Mom intervallet fran 640 till 700 nm), vilket mojliggor separation av en ytterligare fluorescenssignal. Vidare kan det ocksa vara mojligt att inkludera Itminstone en ytterligare fluorokrom, som sander ut lj us inom det infraroda spektrumet (t.ex. vanligtvis Over 700 nm). Dessa ytterligare fluorokromer kan ocksa inkluderas individuellt eller i stallet for att separera de bada ovanstaende tva diskuterade par av fluorokromer i "synligt" spektrum.
I en fordelaktig utforingsform, är de aterstaende fluorokromema vidare utvalda fran en grupp bestaende av en DAPI fluorokromanalog eller en BV421 fluorokromanalog, en 425 fluorokromanalog, en 488 fluorokromanalog, Cy3 fluorokromanalog, en 594 fluorokromanalog, en 660 fluorokromanalog eller en PerCP fluorokromanalog, och en DRAQ5 fluorokromanalog.
Genom att valja ytterligare fluorokromer med emission i det nara infraroda/infraroda spektrat kan det vara mojligt att skilja sâ manga som fem, sex eller till och med sju fluorescenssignaler fran varandra (det vill saga utan att inkludera ytterligare datorbaserad behandling som diskuterats ovan) och fortfarande anvanda en lysande ljuskalla for ultraviolett och synligt ljus, sasom en kvicksilverlampa (eventuellt med tillsats av en ljuskalla for excitering inom det infraroda spektrat). Exempel pa nara infraroda fluorokromer innefattar en 660 analog fluorokrom (t ex vald fran en grupp innefattande en CF660R, AF660 eller eFlour660) eller en PerCP fluorokromanalog (t ex vald fran en grupp innefattande en PerCP, en PerCP-Cy5.5, eller PerCP -eFluor710 baserad fluorokrom), dar den infraroda fluorokromen exempelvis kan omfatta en DRAQ5 analog fluorokrom (t.ex. en DRAQ5 eller en Red dot baserad fluorokrom).
Enligt en annan aspekt av uppfinningen tillhandahalles ett mikroskopisystem fOr att separera fluorescenssignaler som emitteras fran ett prov markt med ett flertal forutbestamda fluorokromer, mikroskopisystemet innefattar en ljuskalleanordning konfigurerad att sanda ut ljus, en ljusledare for att leda ljus fran ljuskalleanordningen till provet for excitering av ett flertal forutbestamda fluorokromer, en filteranordning konfigurerad for separation av fluorescens som emitteras av namnda flertal forutbestamda fluorokromer som marker in provet, och en detektionsanordning konfigurerad for att ta emot ljus som overfors genom filteranordningen, varvid mikroskopets filteruppsattningar kan separera signaler fran minst fyra olika fluorokromer som emitterar ljus inom det synliga ljusspektrat innefattande en forsta och en andra fluorokrom som bildar ett par av fluorokromer, ljuskalleanordningen är konfigurerad att sekventiellt avge ljus inom atminstone fyra olika excitationsvaglangdsintervall, excitationsvaglangdsintervalla for den andra fluorokromen valjs for att reducera excitering av den forsta fluorokromen, filteranordningen innefattar atminstone fyra matchade filter konfigurerade for att tillâta ljus att passera inom minst fyra olika emissionsvaglangdsintervall, emissionsvaglangdsintervallet for den forsta fluorokromen är vald for att minska genomblodning av ljusemission fran den andra fluorokromen, och paret av fluorokromer valjs som en Cy3 fluorokromanalog som bildar den forsta fluorokromen och en 594 fluorokromanalog som bildar den andra fluorokromen, eller valjs paret av fluorokromer som en 425 fluorokromanalog som bildar den forsta fluorokromen och en 488 fluorokromanalog som bildar den andra fluorokromen. en fordelaktig utforingsform av uppfinningen innefattar detektionsanordningen en bildfangande anordning konfigurerad for att ta bilder av fluorescensen i provet. En sadan bildtagande anordningen kan vara en kamera som är ansluten till en dator. Genom att sekventiellt ta och lagra ett flertal bilder av det emitterade ljuset fran var och en av fluorokromerna kan det vara mojligt att lagga bilderna ovanpâ varandra for att till exempel fa en multifarganalys av provet. Det bar noteras att mikroskopisystemet/kameraniansluten dator kan konfigureras for "live-imaging", dar en fortsatt (sekventiell) strom av bilder (t.ex. video stream) tas av provet, det vill saga att "Over tid" anskaffa mer an en bild av varje fluorokrom.
Foretradesvis innefattar ljuskalleanordningen en Ulla for ultraviolett och synligt ljus, och atminstone fyra matchade filter som ar konfigurerade att tillata ljus att passera inom de atminstone fyra olika excitationsvaglangdsintervallen. Ljuskallan kan exempelvis vara en kvicksilverlampa eller en xenonlampa. Andra lampliga ljuskallor är givetvis mojliga och inom ramen for uppfinningen. I en typisk tillampning är de iitminstone fyra anpassade filtren som är konfigurerade for att tillâta ljus passera inom atminstone fyra olika excitationsvaglangdsintervall ("excitationsfilter") och filteranordningen innefattande atminstone fyra anpassade filter konfigurerade for att tillata ljus passera Mom atminstone fyra olika emissionsvaglangdsintervall ("emissionsintervall ") som är anordnade i fyra separata "filterkuber", respektive, som ocksa innefattar en dikroidspegel. Foljaktligen i ett skiant utforande kan filteranordningen ocksà ses innehalla fyra olika filterkuber sarskilt anpassade for att tillata separation av de kminstone fyra fluorokromer pa det satt som diskuterats ovan. Vidare, i ett sadant utforande kan det uppfinningsenliga konceptet tillampas som en "retro-fit" applikation dar uppfinningskonceptet är valt for att anpassa ett tillgangligt mikroskopisystem dar ett nytt "set" av filterkuber tillhandahalls som mojliggor utforandet av uppfinningskonceptet.
Emellertid i en alternativ utforingsform kan ljuskalleanordningen innefatta ett flertal ljusemitterande dioder (LED). I ett sadant utforande behover det inte nodvandigtvis vara i behov av att inkludera specifika excitationsfilter, eftersom lysdiodema kan valjas att vara smalbandiga och konfigurerade for att i sig avge ljus inom varje av de sarskilt utvalda excitationsvaglangdsintervallen.
I forhallande till de ba.da ovannamnda utforingsformerna som ror valet av ljuskalla, valjs ljuskallan for att avge ljus Mom det ultravioletta och synliga ljusspektrat, sasom en kvicksilverlampa, dvs. vanligtvis mellan 350 till 620 nm. Det kan emellertid inom ramen for uppfinningen vara mojligt att infora ytterligare en ljusemitterande anordning, sasom bland annat en eller ett flertal lysdioder ihop med t.ex. en kvicksilverlampa fOr att "ge understod" till en sadan lampa inom de hogre vAglangdsomradena, vanligtvis Over 620 nm. T en sadan utfciringsform kan ytterligare (analoga) fluorokromer, i det nara infrarOda och infraroda spektra, som inte namnts ovan dessutom inforas, vilket mojliggor separation av aven mer an t.ex. sju fluorokromer. Emellertid är det i ett sadant scenario nadvandigt att innefatta detekteringsanordning anpassat for att ta emot ljus inom det icke synliga spektra. Foljaktligen ar det inte mojligt att uteslutande detektera ljus som emitteras fran provet med hjalp av det manskliga ogat, vilket dr mojligt enligt det allmanna konceptet hos uppfinningen.
Ytterligare sardrag hos, och fordelar med, foreliggande uppfinning kommer att bli uppenbara vid studier av de bifogade kraven och den efterfoljande beskrivningen. Fackmannen inser att olika sardrag hos den aktuella uppfinningen kan kombineras for att skapa andra an de som beskrivs i foljande utforingsformer utan att avvika fran ramen for foreliggande uppfinning.
KORT BESKRIVNING AV RITNINGARNA De olika aspekterna av uppfinningen, inklusive dess sarskilda sardrag och fordelar kommer lätt att forstas av den fOljande detaljerade beskrivningen och de bifogade ritningarna, i vilka: Fig. 1 visar ett typiskt mikroskopisystem enligt uppfinningen; Fig. 2a och 2b illustrerar altemativa filteruppsattningar for mikroskopisystemet; Fig. 3 visar ett excitations/emissionsdiagram for ett flertal olika fluorokromer som tillampas i enlighet med uppfinningen, och Fig. 4 är ett flodesschema som illustrerar metodstegen for att detektera fluorescens fran ett prov markt i enlighet med uppfinningen.
DETALJERAD BESKRIVNING Foreliggande uppfinning kommer nu att beskrivas mer fullstandigt harnedan mcd hanvisning till de bifogade ritningama, i vilka for narvarandc fordclaktiga utforingsformer av uppfinningen visas. Denna uppfinning kan emellertid utforas i manga olika former och skall inte tolkas som begransad till de utforingsformer som anges hari; snarare tillhandahalls dessa utforingsformer for noggrannhet och fullstandighet, och for att fullstandigt formedla ramen for uppfinningen for fackmannen. Samma hanvisningsbeteckningar hanvisar genomgaende till samma element.
Med hanvisning nu till ritningarna och till Fig. 1 i synnerhet, visas ett mikroskopisystemet 100 enligt en fordelaktig utforingsform av uppfinningen. Mikroskopisystemet 100 är i drift for att avbilda ett prov 102 anordnad pa ett objektsbord 104. Provet 104 är markt med ett flertal olika fluorokromer som absorberar ljus vid en exciteringsvaglangd och, som svar pa detta ljus, fluorescerar, emitterar ljus vid emissionsvaglangder langre an excitationsvaglangdema.
En ljuskalla 106 emitterar ljus inom det ultravioletta och synliga spektrat (dvs. vanligtvis hog emission inom omradet mellan 350 till 620 nm), sasom en kvicksilverlampa, genererar ljus vid excitationsvaglangden for fluorokromerna och ljuskallan 106 är kopplad till en fiberkabel 108, som leder en exciteringsljusstrale 110 fran ljuskallan 106 till en filterkub 112. I vissa utforingsformer passerar ljus som sands fran ljuskallan 106 direkt till filterkuben 112 utan att bli buren av en fiberkabel. I andra utforingsformer passerar excitationsljusstralen 110 genom optiska element, sasom linser och appningar, innan den kommer till filterkuben 112. Excitationsljusstralen 110 kommer in i filterkuben 112 som är anordnad i en filterrevolver (ej visad) i mikroskopisystemet 100. Filterrevolvern är konstruerad for att tillata ett flertal olika filterkuber att vara sekventiellt placerade inom den optiska axeln mellan ljuskallan 106 och provet 102.
Filterkuben 112 innehaller ett bandpassexcitationsfilter 114, som tar emot exciteringsljusstrale 110 fran fiberkabel 108 och endast for vidare en del av exciteringsljusstralen 110 med ett vaglangdsintervall inom excitationsvaglangdsintervallet ffir en av fluorokromema 102 som provet är inmarkt med. Excitationsljusstrale 110 passerar genom excitationsfilter 114 och mottas av en dikroidspegel 116, vilken reflekterar ljus yid excitationsvaglangden hos fluorokromema och slapper igenom ljus vid emissionsvaglangden for fluorokromema. Exciteringsljusstrale 110 reflekteras saledes av dikroidspegel 114. Dikroidspegel 114 är vanligen orienterad diagonalt inuti filterkub 112, vanligtvis vid en 45 graders vinkel i forhallande till riktningen for exciteringsljusstralen 110, sà att exciteringsljusstrale 110 reflekteras i riktning mot provet 102.
Vidare passerar exciteringsljusstralen 110 genom en objektivlins 116 och traffar prov 102 dar den exciterar fluorokromema narvarande i prov 102. Fluorokromema fluorescerar, avger fluorescensljus 118 vid emissionsvaglangderna for fluorokromema. Fluorescensen 118 fangas upp av objektivlinsen 117 och formas till en emissionsljusstrale 120 som gar in i filterkuben 112. Emissionsljusstralen 120 fors sedan genom dikroidspegel 116 och traffar ett emissionsfilter 122 som ocksi finns i filterkuben 112. Emissionsfiltret 122 är aven ett bandpassfilter (eller i vissa fall ett langpassfilter) som shipper igenom ljus runt emissionsvaglangden for fluorokromema och reflekterar andra ljus, sasom, till exempel, stroljus frail exciteringsljusstralen och emissionsljus fran andra fluorokromer i provet 102. Emissionsljusstralen 120 Overfors saledes genom emissionsfilter 122 och är riktad ut ur mikroskopisystemet 100 till en dartill ansluten detekteringsanordning 124. Detekteringsanordningen 124 kan exempelvis vara en sensor, en spektrometer, en CCD- eller CMOS-kamera, eller ett okular. I vissa utforingsformer av optiska element sitter linser eller straldelare placerade mellan emissionsfilter 122 och detekteringsanordning 124 for att rikta emissionsstrale 120 pa raft att. Gallande detekteringsanordningen 124, som innefattar en digital kamera, sasom en exempelvis en CCD-eller CMOS-kamera, ingar vanligtvis en automatisk slutare for exponeringskontroll av de insamlade bildema (en videostrom kan ocksa spelas in som diskuterats ovan). Det är vanligt att anvanda en svartvit kamera for att ta individuella bilder av emissionen fran varje fluorokrom, lagga pa en pseudofarg digitalt, och lagga dem Over varandra for att fa. en slutlig bild vid anvandning av ett flertal olika filterkuber 112.
Vidare innefattar mikroskopisystemet 100 (vanligtvis) en styrenhet 126 for att styra driften av mikroskopisystemet 100, inklusive positionen fOr filterrevolvern, detekteringsenheten 124 och ljuskallan 106. Styrenheten 126 kan innefatta en generell processor, en applikationsspecifik processor, en krets som innehaller bearbetningskomponenter, en grupp av distribuerade processkomponenter, en grupp av distribuerade datorer konfigurerade for bearbetning, etc. Processorn kan vara eller innefatta olika antal hardvarukomponenter for utforande av data- eller signalbearbetning eller for att exekvera datorkod som lagras i minnet Minuet kan vara en eller flera anordningar for lagring av data och/eller datorkod for att slutfora eller underlatta de olika metoderna som beskrivs i foreliggande beskrivning. Minuet kan innefatta flyktigt eller ett icke-flyktigt minne Minnet kan innefatta databaskomponenter, objektkodskomponenter, skrivkomponenter, eller flagon annan typ av informationsstruktur for att stodja olika funktioner i den foreliggande beskrivningen. Enligt en exemplifierande utforingsform kan varje distribuerad eller lokal minnesanordningen utnyttjas med systemen och metoderna enligt foreliggande beskrivning. Enligt en cxemplifierandc utforingsform är minnct kommuniccrbart ansluten till proccssorn (t.ex. via en krets eller nagon annan tradbunden, trndlost, eller natverksanslutning) och innefattar datorkod for att exekvera en eller flera processer som beskrivs har.
Sasom namnts ovan medger filterrevolvern bytbar inforings- och positionskontroll av ett flertal filterkuber 112. Det vill saga, pa grund av att varje typ av fluorokrom har sift eget unika excitations- och emissionsspektra, anvands en unik kombination av exciteringsfilter 114, dikroidspegel 116, och emissionsfilter 122 for varje typ av fluorokrom. Saledes är en filterkub som har en specifik kombination av filter och spegel ihopsatt for att anvandas till en viss typ av fluorokrom. Beroende pa vilken typ av fluorokromer som är narvarande i prov 102, fors i enlighet med detta en filterkub 112 med lamplig kombination av filter och spegel in i filterrevolvern. Likasa valjs de filter och den spegel i filterkuben 112 for anvandning av en specifik ljuskalla.
De vanliga optiska konfigurationerna som beskrivs ovan anvander mikroskopoptik for att direkt producera en forstorad bild av provet pa kamerasensorn for att fanga en hogupplost bild av provet. Detta optiska system kallas vanligen "wide field" mikroskopi. Fackmannen inom mikroskopi torde inse att en hogupplost bild av provet kan skapas genom en mangd andra optiska system.
For att kort berora figurerna 2a - 2c, vilka illustrerar en alternativ tillampning av filter och ljuskallaarrangemang for det konceptuella utforandet av uppfinningen. I Fig. 2a exemplifieras uppfinningskonceptet pa ett liknande salt som i Fig. 1, men i stallet for att tillhandahalla en enda ljuskalla, sasom en kvicksilverlampa (eller liknande), tillhandahalls ett flertal lysdioder 106', dar var och en av lysdiodema 106' är smalbandiga lysdioder som vanligen emitterar ljus endast inom ett begransat vaglangdsintervall, exempelvis en bandbredd omkring 20 - 50 nm. Foljaktligen, genom att anvanda ett sadant arrangemang kan det vara mojligt att utesluta excitationsfilter hos filterkuben 112 '. Foljaktligen maste var och en av lysdiodema 106' vara justerade sà att de endast sander en exciteringsljusstrale 110 som har ett vaglangdsintervall inom excitationsvaglangdsintervallet hos en av de fluorokromer som anvands for markning av provet 102 (sasom diskuteras ovan).
Altemativt kan uppfinningskonceptet tillampas i enlighet med en sa. kallad "Pinkel-" (Fig. 2b) eller en "Sedat-" (Fig. 2c) konfiguration. Bade Pinkel- och Sedatkonfigurationema inkluderar en flerbandsdikroidspegel; emellertid skiljer de sig i den kombination av excitations- och emissionsfilter som anvands. Sedatfilterkonfigurationen anvander bade enkelbands excitationsfilter och enkelbands emissionsfilter, medan Pinkelkonfigurationen anvander enkelbands excitationsfilter och ett flerbands emissionsfilter. Forhallandet specifik signal mot bakgrundssignal som uppnas nar en Pinkclanordning anvands är potentiellt hogre an vid anvandning av en komplett flerbandskonfiguration, men i jamforelse med flerbandsfiltersatser, ger Sedatkonfigurationen i de fiesta fall det hogsta signal-till-brus-forhallandet. I jamforelse med filterkubtillampningen som visas i Fig. 1 kan Pinkel och/eller Sedatkonfigurationen eventuellt mojliggora mycket snabbt byte vid omkoppling av olika filterkonfigurationer.
Det ska tillaggas att alla de olika tillampningar som illustreras i Fig. 1 och 2a-2c visas som en tillampning att genomfora en "ljusreflekterande strategi", dvs. att ljus traffar provet 102 och sedan reflekteras tillbaka mot detekteringsanordningen 124. Det bar dock forstas att det uppfinningsenliga konceptet aven kan tillampas genom att lata ljus passera "genom" provet 102, vilket t ex Or det mOjligt att placera detekteringsanordningen 124 "bakom" provet 102, eller vid flagon annan vinkel.
Med hanvisning nu till Fig. 3, som visar excitations/emissionsdiagram for ett flertal olika fluorokromer som tillampas i enlighet med uppfinningen. I illustrationen i Fig. 3 har provet 102 markts med sju olika fluorokromer, och ger damned sju olika fluorescenssignaler som kommer till detekteringsanordningen 124.
Sasom diskuterats ovan, det generella problem som loses genom uppfinningen är separering av signalema fran ett prov markt med den forsta fluorokromen och samtidigt markt med den andra fluorokromen som bildar ett par av fluorokromer. Sasom diskuterats ovan är den forsta och den andra florokromen valda bland fluorokromer som emitterar ljus inom det synliga spektrat (t ex vanligtvis Mom 400 till 640 nm), och den forsta och den andra fluorokromen är antingen en kombination/par av fluorokromer bestaende av en Cy3 fluorokromanalog och en 594 fluorokromanalog, respektive, eller den forsta och den andra fluorokromen är antingen en kombination/par av fluorokromer bestaende av en 425 fluorokromanalog och en 488 fluorokromanalog, respektive.
Vanligtvis är dessa fluorokromer är ljusstarka och har spektral Overlappning (425 jamfort med 488 och Cy3 jdmfort med 594). I en exemplifierande utforingsform av uppfinningen har 594 excitationsfiltret forflyttats Over 595 nm (t.ex. 602/13 nm), som foljaktligen gOr det mojligt att excitera 594 utan att excitera Cy3. Dessutom, genom att flytta Cy3 emissionsfiltret under 585 nm (t. ex. 577/10 nm), har det overraskande varit mojligt att detektera emissionssignal fran Cy3 utan att detektera emissionssignal fran 594. Med dessa optimeringar, gOr filteranordningarna for Cy3 (ljus och filterkomponenter) och filteranordningarna for 594 det mojligt att separera signalerna fran varje enskild fluorokrom. Det ska noteras att fluorescenssignalerna forblev tillfredstdllande starka med de optimerade filtersatserna. En liknandc anpassning kan i ett annat exempel goras for kombinationen av en 425 och en 488 fluorokromanalog.
Därtill har signal-till-brus-forhallandet i kanalen for 488/FITC (fluoresceinisotiocyanat) optimerats genom att minska autofluorescens fran vavnaden, vilket är ett vanligt problem for detektion av 488/FITC. Manga molekyler i vdvnader aktiveras av ljus i det bla spektrat, exempelvis mitokondriella proteiner, kollagen och elastin, vilket ger upphov till autofluorescens och emission av ljus Over ett brett vaglangdsintervall . Genom att flytta excitationsfiltret Over 490 nm (500/20 nm) forsvann den storsta delen av autofluorescensen, vilket vasentligt forbattrade signal-till-brus-forhallandet. Man maste vara noga med att vdlja ett emissionsfilter for 488/FITC (525/15 nm) som inte tar in emissionssignal fran Cy3. FOrflyttningen av emissionsfiltret for 488/FITC gay utrymme for ytterligare en kanal mellan DAPI och FITC (excitation ovanfor 420 nm och emission under 495). Detta intervall är problematiskt gdllande hog autofluorescens fran vavnad och fluorokromen maste vara ljusstark nog att ge ett acceptabelt signal-till-brus-forhallande. Det finns bara en handfull flourokromer i detta intervall, och flertalet är svaga ochieller payerkas av fotoblekning Likval visade sig Atto425 vara extremt fotostabil och ljusstark nog att overskrida autofluorescens fran vavnad. Aven kdrnfargen SytoxBlue uppfyllde kriterierna i detta intervall.
Slutligen valdes/introducerades/anvdndes ndra infraroda fluorokromer for att marka in provet 102. Eftersom kvicksilverlampan är svag vid vagldngder Over 600 nm är det svart att fa tillräckligt med ljusenergi for att pa ett adekvat skt excitera ndra infraroda fluorokromer. Efter att ha testat ett antal fluorokromer, visade sig PerCP och dess analoger (t.ex. PerCP-Cy5.5) vara utmarkta.
PerCP har ett stort (i jamfOrelse) Stoke skift och kan armed aktiveras med blatt ljus med hog energi, och dess signal kunde latt skiljas fran de andra fluorokromerna i uppstallningen. Av alla infrarOda fluorokromer som testades med mindre (i jamfOrelse) Stoke skift, har det visat sig att CF66OR gay en tillrackligt bra signal aven nar den aktiverades vid ett vaglangdsinteryall > 625 nm. Alltsa kunde bade PerCP och CF66OR anvandas i denna flerfargsuppstallning.
Foljaktligen, med hjalp av uppfinningen är det mojligt att separat detektera signaler fran fyra eller flera olika fluorokromer som emitterar ljus inom det synliga spektrumet. Genom att dessutom valja fluorokromer som avger ljus i det nara infraroda eller infraroda spektrumet (typiskt over det synliga spektrumet) är det mojligt att separera sa manga som sju olika fluorescenssignaler. Vidare, det vill saga mer an sju olika fluorescenssignaler skullc kunna vara mojligt att separcra vid anvandning av en ljuskdlla (t.cx. en "normal" ljuskalla i kombination med till exempel ytterligare LED-lampor) som avger ljus i bade det synliga spektrumet och det infraroda spektrumet i kombination med fluorokromer som är aktiva i det infraroda spektrumet. Samma koncept är naturligtvis mojligt aven for det ultravioletta spektrumet saval som for andra ljuskallakombinationer.
Nedan ges en mojlig kombination av exemplifierade fluorokromer (eller andra analoga fluorokromer) med lampliga intervall for att placera excitation och emissionsfilter inom.
Fluorokrom Ex ci tati on s filter Emi ssi on sfi fter DAPI 330-380 420-500 Atto4420-4455-48 488 480-5500-5 Cy3 535-55565-59 594 590-6600-65 660R eller 625-660 660 - PerCP-Cy5.420-500 645 - Altemativt kan i en annan utforingsform av uppfinningen nedanstaende kombination vara mojlig.
Fluorokrom Excitations filter Emissionsfilter BV421 330-380 410-4 Atto4425-4455-480 488 480-5500-5 Cy3 535-55565-59 594 590-6600-65 PerCP 420-500 655 - DRAQ600-65695 - Slutligen till Fig. 4 som illustrerar ett exemplifierande flodesschema som visar mctodstcgcn for att skota mikroskopisystemet 100 i enlighct mcd uppfinningcn. Proccsscn borjar med valet, Si, av atminstone fyra olika fluorokromer, inklusive en Cy3 fluorokromanalog och en 594 fluorokromanalog. De atminstone fyra olika fluorokromema anvands sedan for att marka provet 102, ett prov är av flagon av de ovan diskuterade typerna.
Pa grundval av de fluorokromer som valts for att marka provet 102, valjs ett motsvarande antal (vanligtvis sâ manga som antalet valda fluorokromer) excitationsvaglangdsintervall, S2, dar excitationsvaglangdsintervallet for den andra fluorokromen är specifikt valt med hansyn till ovanstaende diskussion och sâ att exciteringen av den fOrsta fluorokromen är reducerad. Sedan valjs filteranordningen, t ex emissionsfiltret/filtren av filterkuben/kubema 112 (eller alternativt enligt Pinkel eller Sedat konfiguration), S3, for att tillâta ljus att passera Mom olika emissionsvaglangdsintervall som overensstammer med emissionsvaglangdsintervallen hos minst fyra olika fluorokromer. Aven har ska de allmanna kriteriema uppfyllas, dar emissionsvaglangdsintervallet for den forsta fluorokromen valjs for att minska genomblodning av ljusemission frail den andra fluorokromen, dar en Cy3 fluorokromanalog bildar den forsta fluorokromen och en 594 fluorokromanalog bildar den andra fluorokromen, eller en 425 fluorokromanalog bildar den forsta fluorokromen och en 488 fluorokromanalog bildar den andra fluorokromen.
Genom att t ex anvanda styrenheten 126 i kombination med ljuskallan 106, filterrevolvem och filterkuber 112, anvands mikroskopisystemet 100 for att sekventiellt emittera ljus, S4, Mom de utvalda excitationsvaglangdsintervallen. Antingen baserat pa en konfiguration med reflekterande ljus eller genom att lata ljus passera genom provet 102, detekteras fluorescerande ljus fran fluorokromema som anviinds for att marka provet 102 till exempel under kontroll av styrenheten 126 i kombination med den digitala kameran (detektionsanordning 124) nar ljuset har passerat genom filteranordningen (vanligtvis atminstone inkluderat emissionsfilter).
Sasom diskuterats ovan, kan bildema vara tagna individuellt, en pseudofarg kan digitalt appliceras, och bildema kan sedan laggas samman Over varandra for att skapa en flerfargsbild. Det kan, sasom ocksâ diskuterats ovan, vara mojligt att utfora en kontinuerlig insamling bilder som tas efter hand.
Sammanfattningsvis ror foreliggande uppfinning en metod for att detektera fluorescens som emitteras fran ett prov markt med ett flertal forutbestamda fluorokromer med anvandning av ett mikroskopisystem som innefattar en ljuskalleanordning, varvid metoden innefattar stegen att valja atminstone fyra olika fluorokromer konfigurerade for att avge ljus inom det synliga ljusspektrumet, de atminstone fyra olika fluorokromema innefattar en forsta och en andra fluorokrom som bildar ett par av fluorokromer, valja excitationsvaglangdsintervall for de atminstone fyra olika fluorokromema, dar excitationsvaglangdsintervallet for den andra fluorokromen valjs sâ att exciteringen av den forsta fluorokromen är reducerad, konfiguration av en filteranordning hos mikroskopisystemet for att selektivt tillâta ljus att passera inom emissionsvaglangdsintervall som overensstammer med emissionsvaglangdsintervallen hos de atminstone fyra olika fluorokromema, dar emissionsvaglangdsintervallet for den fOrsta fluorokromen är vald for att minska genomblodning av ljusemission fran den andra fluorokromen, sekventiellt emittera ljus inom atminstone en del av de valda exciteringsvaglangdsintervallerna och detektera ljus som emitteras fran provet genom fifteranordningen, dar paret av fluorokromer valjs som en Cy3 fluorokromanalog som bildar den forsta fluorokromen och en 594 fluorokromanalog som bildar den andra fluorokromen, eller paret av fluorokromer valjs som en 425 fluorokromanalog som bildar den forsta fluorokromen och en 488 fluorokromanalog som bildar den andra fluorokromen.
Uppfinningen är baserad pa insikten att genom att losa det primara problemet med att separera fluorescenssignaler som emitteras fran ett prov markt med en forsta fluorokrom och en andra fluorokrom, kommer fordelar med reducerade komplikationer for att ocksa tillAta separering av ytterligare fluorescenssignaler harstammade fran en tredje och en fiarde (olika) fluorokrom, begransat till det fall da. fluorokromema emitterar ljus inom det synliga spektrat (t ex typiskt i intervallet 400 till 640 nm) och de forsta och andra fluorokromema är antingen en kombination/par av fluorokromer som utgors av en Cy3 fluorokromanalog och en 594 analog fluorokrom, respektive, eller de fOrsta och andra fluorokromerna är en kombination/par av fluorokromer som utgors av en 425 fluorokromanalog och en 488 fluorokromanalog, respektive. Detta i enlighet med uppfinningen uppnas genom att valja ett exciteringsvaglangdsintervall for den andra fluorokromen, sà att exciteringen av den forsta fluorokromen reduceras och genom att vdlja ett emissionsvaglangdsintervall for den forsta fluorokromen, sa att genomblodning av ljusemission fran den andra fluorokromen är reducerad.
Aven om figurerna kan visa en viss ordning av metodsteg kan ordningen av stegen skilja sig fran bilden. Dessutom kan tva eller flera steg utforas samtidigt eller delvis samtidigt. Sadana variationer beror pa utformarens val. Alla sadana variationer är inom ramen for upptackten. Dessutom, awn om uppfinningen har beskrivits med hanvisning till specifika utforingsexempel, kommer manga olika andringar, modifieringar och liknande att bli uppenbara for fackmannen inom teknikomradet. Variationer av de beskrivna utforingsformerna kan forstas och genomforas av fackmannen vid anvandning av den patentsokta uppfinningen, genom att begrunda ritningarna, beskrivningen och de bifogade kraven. Dessutom, i kraven, ordet "innefattande" utesluter inte andra element eller steg, och den obestamda artikeln "en" eller "ett" utesluter inte en mangfald.

Claims (10)

PATENTKRAV 1. Metod fOr detektering av fluorescens som emitteras fran ett prov markt med ett flertal forutbestamda fluorokromer genom att anvanda ett mikroskopisystem innefattande en ljuskalleanordning, varvid metoden innefattar stegen att: 1. valja atminstone fyra olika fluorokromer som är konfigurerade att avge ljus inom det synliga ljusspektrumet, de atminstone fyra olika fluorokromerna innefattar en fcirsta och en andra fluorokrom som bildar ett par av fluorokromer; 2. valja excitationsvaglangdsintervall for de atminstone fyra olika fluorokromerna, dar excitationsvaglangdsintervallet for den andra fluorokromen valjs sa att exciteringen av den forsta fluorokromen är reducerad; 3. konfigurera en filteranordning hos mikroskopisystemet for att selektivt tillata ljus att passera inom emissionsvaglangdsintervall som overensstammer med emissionsvaglangdsintervallen hos de atminstone fyra olika fluorokromerna, dar emissionsvaglangdsintervallet for den forsta fluorokromen är valt for att minska genomblodning av ljusemission fran den andra fluorokromen; 4. sekventiellt emittera ljus i atminstone en del av de utvalda excitationsvaglangdsintervallen; och 5. detektera ljus som emitteras frail provet genom filteranordningen, varvid paret av fluorokromer valjs som en Cy3 fluorokromanalog som bildar den fOrsta fluorokromen och en 594 fluorokromanalog som bildar den andra fluorokromen, eller valjs paret av fluorokromer som en 425 fluorokromanalog som bildar den forsta fluorokromen och en 488 fluorokromanalog som bildar den andra fluorokromen. 2. Metod enligt patentkrav 1, vidare innefattande steget att separera fluorescenssignaler fran de atminstone fyra olika fluorokromerna. 3. Metod enligt nagot av foregaende krav, vidare innefattande val av atminstone fern olika fluorokromer, varvid excitationsvaglangdsintervallet valjs for de atminstone fern olika fluorokromerna och filteranordningen är konfigurerad for de atminstone fern olika fluorokromerna, paret av fluorokromer valjs som Cy3 fluorokromanalog som bildar den forsta fluorokromen och 594 fluorokromanalog som bildar den andra fluorokromen, och ett ytterligare par av fluorokromer valjs som 425 fluorokromanalog som bildar den forsta fluorokromen och 488 fluorokromanalog som bildar den andra fluorokromen. 4. Metod enligt nagot av foregaende krav, vidare innefattande att valja atminstone en ytterligare fluorokrom konfigurerad for att avge ljus inom det nara infraroda spektrumet. 5. Metod enligt nagot av foregaende krav, vidare innefattande att valja atminstone en ytterligare fluorokrom konfigurerad for att avge ljus inom det infrarOda spektrumet. 6. Metod enligt nagot av de foregaende kraven, varvid de aterstaende fluorokromema är valda fran en grupp innefattande en DAPI fluorokromanalog eller en BV421 fluorokromanalog, en 425 fluorokromanalog, en 488 fluorokromanalog, Cy3 fluorokromanalog, en 594 fluorokromanalog, en PerCP fluorokromanalog eller en 660 fluorokromanalog, och en DRAQ5 fluorokromanalog. 7. Mikroskopisystem for att separera fluorescenssignaler som emitteras fran ett prov markt mcd ctt flertal forutbestamda fluorokromcr, mikroskopisystcmct innefattar:
1. en ljuskalleanordning konfigurerad att emittera ljus;
2. en ljusledare for att leda ljus fran ljuskalleanordningen till provet for excitering av de flertal forutbestamda fluorokromema;
3. en filteranordning konfigurerad for att tillata separation av fluorescens som emitteras av de flertal forutbestamda fluorokromerna som provet är inmarkt med. och
4. en detekteringsanordning konfigurerad fOr att ta emot ljus som passerar genom filteranordningen, dar
5. filtersatsema i mikroskopet kan separera signaler fran atminstone fyra olika fluorokromer som avger ljus i det synliga ljusspektrumet med en forsta och en andra fluorokrom som bildar ett par fluorokromer,
6. ljuskalleanordningen är konfigurerad for att sekventiellt emittera ljus inom atminstone fyra olika excitationsvaglangdsintervall,
7. excitationsvaglangdsintervallet for den andra fluorokromen är vald for att reducera excitering av den forsta fluorokromen, 8. filteranordningen innefattar atminstone fyra matchade filter konfigurerade for att tillâta ljus att passera inom minst fyra olika emissionsvaglangdsintervall, 9. emissionsvaglangdsintervallet for den forsta fluorokromen är vald for att minska genomblodning av ljusemission fran den andra fluorokromen, och 10. paret av fluorokromer valjs som en Cy3 fluorokromanalog som bildar den forsta fluorokromen och en 594 fluorokromanalog som bildar den andra fluorokromen, eller paret av fluorokromer valjs som en 425 fluorokromanalog som bildar den forsta fluorokromen och en 488 fluorokromanalog som bildar den andra fluorokromen.
8. Mikroskopisystem enligt krav 7, varvid detektionsanordningen innefattar en bildfangande anordning konfigurerad for att ta fluorescensbilder av provet.
9. Mikroskopisystem enligt nagot av kraven 7-8, varvid ljuskalleanordningen innefattar ett flertal smalbandade lysdioder.
10. Mikroskopisystem enligt nagot av 'craven 7-9, varvid ljuskalleanordningen innefattar en kombination av en ljuskalla som emitterar ljus inom ett ultravioletta och synliga vaglangdsspektrumet och ett flertal lysdioder som avger ljus inom atminstone en av det nara infraroda eller infraroda ljusspektrumet. 100 124 Control of position to turret Control of position to turret 126 106 1k IN■1 1 117 104 I
SE1351503A 2013-12-16 2013-12-16 System och metod för fluorescensmikroskopi med detektering av ljusemission från multipla fluorokromer SE1351503A1 (sv)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE1351503A SE1351503A1 (sv) 2013-12-16 2013-12-16 System och metod för fluorescensmikroskopi med detektering av ljusemission från multipla fluorokromer
PCT/SE2014/051484 WO2015094088A1 (en) 2013-12-16 2014-12-11 System and method for fluorescence microscopy with detection of light emission from multiple fluorochromes
US15/100,646 US20160306156A1 (en) 2013-12-16 2014-12-11 System and method for fluorescence microscopy with detection of light emission from multiple fluorochromes
EP14872537.7A EP3084503A4 (en) 2013-12-16 2014-12-11 System and method for fluorescence microscopy with detection of light emission from multiple fluorochromes
EP20170591.0A EP3745181A1 (en) 2013-12-16 2014-12-11 Fluorescence microscopy system and method
CN201480068794.3A CN105829944A (zh) 2013-12-16 2014-12-11 用于荧光显微镜以检测来自多种荧光染料的光发射的系统和方法
JP2016547559A JP2017509010A (ja) 2013-12-16 2014-12-11 多数の蛍光色素からの発光の検出を伴う蛍光顕微鏡のためのシステムおよび方法
CN202010099834.8A CN111208106A (zh) 2013-12-16 2014-12-11 显微镜系统和用显微镜系统检测从样本发射的荧光的方法
US15/627,601 US11668918B2 (en) 2013-12-16 2017-06-20 System and method for fluorescence microscopy with detection of light emission from multiple fluorochromes

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE1351503A SE1351503A1 (sv) 2013-12-16 2013-12-16 System och metod för fluorescensmikroskopi med detektering av ljusemission från multipla fluorokromer

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SE537103C2 SE537103C2 (sv) 2015-01-07
SE1351503A1 true SE1351503A1 (sv) 2015-01-07

Family

ID=52122270

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SE1351503A SE1351503A1 (sv) 2013-12-16 2013-12-16 System och metod för fluorescensmikroskopi med detektering av ljusemission från multipla fluorokromer

Country Status (6)

Country Link
US (2) US20160306156A1 (sv)
EP (2) EP3745181A1 (sv)
JP (1) JP2017509010A (sv)
CN (2) CN111208106A (sv)
SE (1) SE1351503A1 (sv)
WO (1) WO2015094088A1 (sv)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180065038A (ko) * 2016-11-29 2018-06-18 한국화학연구원 자외선 검사 장치
CN106596497A (zh) * 2017-01-16 2017-04-26 浙江大学 一种短波红外荧光显微成像的方法
JP6977287B2 (ja) * 2017-03-29 2021-12-08 東ソー株式会社 複数の蛍光物質を用いた標識方法
CN110488024B (zh) * 2019-09-23 2022-07-12 北京纳诺金生物科技有限公司 采用荧光技术检测多种待检测物质的方法及荧光检测产品

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5863504A (en) * 1995-03-16 1999-01-26 Bio-Rad Laboratories, Inc. Fluorescence imaging instrument utilizing fish
CA2350692A1 (en) * 1998-10-29 2000-05-11 Cell Works Inc. Multiple marker characterization of single cells
GB0121700D0 (en) * 2001-09-07 2001-10-31 Univ Leicester Detection of fluorescence
JP4673000B2 (ja) * 2004-05-21 2011-04-20 株式会社キーエンス 蛍光顕微鏡、蛍光顕微鏡装置を使用した表示方法、蛍光顕微鏡画像表示プログラム及びコンピュータで読み取り可能な記録媒体並びに記憶した機器
JP4789454B2 (ja) * 2004-12-03 2011-10-12 株式会社キーエンス 蛍光顕微鏡
JP4968575B2 (ja) * 2006-01-27 2012-07-04 横河電機株式会社 共焦点顕微鏡
US7776613B2 (en) * 2006-08-07 2010-08-17 President And Fellows Of Harvard College Sub-diffraction image resolution and other imaging techniques
JP2008139796A (ja) * 2006-12-05 2008-06-19 Keyence Corp 蛍光顕微鏡、蛍光顕微鏡の操作方法、蛍光顕微鏡操作プログラム及びコンピュータで読み取り可能な記録媒体並びに記録した機器
JP4952784B2 (ja) * 2007-03-19 2012-06-13 株式会社島津製作所 生体用蛍光測定装置及び蛍光測定用励起光照射装置
WO2009001390A1 (en) * 2007-06-28 2008-12-31 Gian Luca Ferri Adjustable multi-band excitation and visualization / imaging system for simultaneous viewing multiple fluorescence
WO2009057301A1 (ja) * 2007-10-31 2009-05-07 Nikon Corporation レーザ励起蛍光顕微鏡
JP5445135B2 (ja) * 2007-11-27 2014-03-19 株式会社ニコン 蛍光顕微鏡
US8031924B2 (en) * 2007-11-30 2011-10-04 General Electric Company Methods and systems for removing autofluorescence from images
DE102008049886B4 (de) * 2008-09-30 2021-11-04 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Vorrichtung, insbesondere ein Mikroskop, zur Untersuchung von Proben
JP2010284101A (ja) * 2009-06-11 2010-12-24 Hitachi High-Technologies Corp 反応容器，並列処理装置、及びシーケンサ
DE202010010932U1 (de) * 2010-04-19 2011-10-07 Witec Wissenschaftliche Instrumente Und Technologie Gmbh Vorrichtung zur Abbildung einer Probenoberfläche
JP6075963B2 (ja) * 2012-03-26 2017-02-08 オリンパス株式会社 蛍光観察方法及び蛍光観察装置
EP2757402B1 (en) * 2013-01-22 2016-03-30 FEI Company Method of observing samples with a fluorescent microscope
CN103513411B (zh) * 2013-09-27 2016-02-03 香港应用科技研究院有限公司 荧光显微镜中聚焦的装置和方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2015094088A1 (en) 2015-06-25
SE537103C2 (sv) 2015-01-07
EP3084503A1 (en) 2016-10-26
US11668918B2 (en) 2023-06-06
JP2017509010A (ja) 2017-03-30
CN105829944A (zh) 2016-08-03
US20160306156A1 (en) 2016-10-20
EP3084503A4 (en) 2017-09-13
CN111208106A (zh) 2020-05-29
US20170285317A1 (en) 2017-10-05
EP3745181A1 (en) 2020-12-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11668918B2 (en) System and method for fluorescence microscopy with detection of light emission from multiple fluorochromes
JP6190096B2 (ja) インターリーブされた画像によるマルチイメージングシステム
US8081310B2 (en) Multimarking fibre-type fluorescence microscopic imaging method and system
EP3465161B1 (en) Imaging system with oblique illumination
US20110183370A1 (en) Optical imaging for identifying cells labeled with fluorescent nanoparticles
JP2009065848A (ja) 遺伝子発現解析方法および遺伝子発現解析システム
CN212514276U (zh) 宽光谱荧光多通道实时成像系统
US11041756B2 (en) Method and apparatus of filtering light using a spectrometer enhanced with additional spectral filters with optical analysis of fluorescence and scattered light from particles suspended in a liquid medium using confocal and non confocal illumination and imaging
US20210181112A1 (en) Devices and methods for imaging biomolecules
US20160215330A1 (en) Nucleic-Acid-Sequence Determination Device and Nucleic-Acid-Sequence Determination Method
US20180252909A1 (en) Microscopy system and microscopy method for quantifying a fluorescence
Connolly et al. Simultaneous multi‐spectral, single‐photon fluorescence imaging using a plasmonic colour filter array
DE102011055639A1 (de) Verfahren und Vorrichtung zur simultanen Multikanal- und Multimethoden-Akquisition von synchronisierten Parametern in systemübergreifenden Fluoreszenzlebensdaueranwendungen
Kraus et al. Linear fluorescence unmixing in cell biological research
JP2007225381A (ja) 蛍光測定方法及び蛍光顕微鏡
WO2018074833A1 (ko) 다중 파장 내시경 시스템 및 이를 이용한 영상 처리 방법
US10610088B2 (en) Multi-wavelength endoscopic system and image processing method using same
KR20130042791A (ko) 형광 영상을 촬영하는 장치 및 방법
Wang et al. A single-shot hyperspectral phasor camera for fast, multi-color fluorescence microscopy
CN219270887U (zh) 一种双通道分时曝光成像设备
Wang et al. SHy-Cam: a Single-shot Hyperspectral Phasor Camera for fast, multi-color fluorescence microscopy
US20180128684A1 (en) Dye measurement device and dye measurement method
JP2005069827A (ja) レーザ走査型蛍光顕微鏡