JP2017509010A - 多数の蛍光色素からの発光の検出を伴う蛍光顕微鏡のためのシステムおよび方法 - Google Patents

多数の蛍光色素からの発光の検出を伴う蛍光顕微鏡のためのシステムおよび方法 Download PDF

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Abstract

本発明は蛍光顕微鏡に関し、特に、少なくとも四つの所定の蛍光色素で標識された試料から発された蛍光を検出する方法に関し、少なくとも四つの異なる蛍光色素は、一対の蛍光色素を形成する第一および第二の蛍光色素を備え、一対の蛍光色素は、第一の蛍光色素を形成するＣｙ３類似蛍光色素および第二の蛍光色素を形成する５９４類似蛍光色素として選択されるか、もしくは、一対の蛍光色素は、第一の蛍光色素を形成する４２５類似蛍光色素および第二の蛍光色素を形成する４８８類似蛍光色素として選択される。少なくとも四つの所定の蛍光色素からの蛍光の検出は、本発明によれば、第一の蛍光色素の励起が低減されるように第二の蛍光色素の励起波長間隔を選択することによって、および、第二の蛍光色素からの発光の灌流が低減されるように第一の蛍光色素の発光波長範囲を選択することによって達成される。【選択図】図１

Description

本発明は、全体として蛍光顕微鏡に関し、特に、顕微鏡システムのための方法および、複数の異なる蛍光色素で標識された試料からの発光を各別に検出できるようにするための対応する蛍光顕微鏡システムの向上に関する。
蛍光顕微鏡は、試料上もしくは試料の中にある有機分子もしくは無機化合物等の対象種からの蛍光性もしくは燐光性発光を映すことによって、試料の構造もしくは特性を検討するための光顕微鏡技術である。例えば、一つもしくは複数の異なる蛍光色素（蛍光体とも記される）、分子で、試料が標識され、それらは光を吸収すると、続いて、増加したエネルギーを種々の手段によって排出しうる。その一つは、より長い波長の発光である。
そのような分子に紫外光、可視光、遠赤色光、近赤外光、もしくは遠赤外光が照射されると、分子は電子遷移を受け、その間、分子はエネルギー量子を吸収し、電子は、基底状態において占有する軌道から、より高いエネルギーの他の軌道へと励起されうる。照射された分子が光を吸収する波長スペクトルは、吸収スペクトルもしくは励起スペクトルと呼ばれる。多くの励起された状態は一時的であり、吸収されたエネルギーは、主に蛍光もしくは燐光として再発光する。照射された分子が光を発する波長スペクトルは、発光スペクトルと呼ばれる。有機もしくは無機染料の蛍光特性は、多くの解析方法の基礎を提供し、解析方法の一つは、蛍光色素結合抗体を使用してタンパク質および他の分子を検出する免疫蛍光法である。
そのような解析に一般的に使用される例示の蛍光顕微鏡は、光源、光を励起光通路に運ぶための光学部品、対象に運ばれるべき一つ以上の励振波長帯を選択するための励起フィルタ、励起波長帯を試料に反射しつつ、試料から発光光学通路に蛍光発光波長を伝達するよう構成されたダイクロイックミラー、発光光学通路内に伝達された任意の迷入励起光波長をブロックするための発光フィルタ、および蛍光発光波長を目もしくはカメラなどの画像イメージング装置に運ぶための光学部品を備える。
概して、現代の顕微鏡の全ては、多数の素早く切り替え可能な“フィルタキューブ”を備え、各々のフィルタキューブは特定の蛍光色素（もしくは同様の蛍光色素のセット）専用であり、励起フィルタ、ダイクロイックミラー、および発光フィルタのマッチしたセットを含む。異なる蛍光色素の、各別および連続した視覚化は、マッチしたフィルタセットを一度に一つずつ次々に切り替えることによって、容易に成し遂げることができる。
それぞれが各別の励起／発光波長スペクトルを有する異なる蛍光色素のそのような連続した視覚化は、例えば、蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ）または蛍光色素標識された抗体（所謂免疫蛍光法）を用いて組織内の二つ（もしくはそれ以上）のタンパク質の空間的な位置を明らかにするために、もしくは、蛍光色素標識された核酸（プローブ）を用いて二つ（もしくはそれ以上）のＤＮＡ変異を検出するために使用することができる。
そのような研究では、情報を得るために多くのチャネルを組み合わせるよう所望されることが多い。例えば、生物学研究では、異なる蛍光色素で標識された細胞特異的抗体を使用して、組織試料内のいくつかの異なる細胞型を視覚化することは通常のことである。しかしながら今日、異なる蛍光色素からの発光滲みのために、限られた数の蛍光体のみが、同じ試料内で強く区別されることができる。この滲み（スピルオーバー作用とも称される）の問題は、補正、すなわち部分的に重なる蛍光色素スペクトルからの信号の追加を補正する、コンピュータを用いた計算によって解決されうる。しかしながら、これは複雑なプロセスであり、研究もしくは医学的検査では通常使われない。
したがって、四つより多い異なる蛍光色素からの発光の区別を簡易化、および検出を向上するよう構成された方法および顕微鏡システムを提示するのが望ましい。
本発明の第一の態様によれば、上記は、複数の所定の蛍光色素で標識された試料から発される蛍光を、光源構成を備える顕微鏡システムを使用して検出する方法によって少なくとも部分的に軽減され、前記方法は、可視光スペクトル内の光を発するよう構成された少なくとも四つの異なる蛍光色素を選択するステップであって、前記少なくとも四つの異なる蛍光色素は、一対の蛍光色素を形成する第一および第二の蛍光色素を含むステップと、前記少なくとも四つの異なる蛍光色素の励起波長間隔を選択するステップであって、前記第二の蛍光色素の前記励起波長間隔は、前記第一の蛍光色素の励起が低減されるよう選択されるステップと、前記少なくとも四つの異なる蛍光色素の発光波長間隔にマッチする前記発光波長間隔内の光を選択的に通過できるように顕微鏡システムのフィルタ構成を構成するステップであって、前記第一の蛍光色素の前記発光波長間隔は、前記第二の蛍光色素からの発光滲みを低減するよう選択されるステップと、少なくとも一部の前記選択された励起波長間隔内の光を連続して発するステップと、前記フィルタ構成を透過した、前記試料から発された光を検出するステップと、を備え、前記一対の蛍光色素は、前記第一の蛍光色素を形成するＣｙ３類似蛍光色素および前記第二の蛍光色素を形成する５９４類似蛍光色素として選択されるか、もしくは、前記一対の蛍光色素は、前記第一の蛍光色素を形成する４２５類似蛍光色素および前記第二の蛍光色素を形成する４８８類似蛍光色素として選択される。蛍光色素の一対はまた、異なるストークスシフトを有する二つの蛍光色素を使用することによって形成されうる。ストークスシフトは、励起波長間隔と発光波長間隔との間のずれである。このように、二つの蛍光色素は、同じ励起光間隔によって活性化でき、第一の蛍光色素の発光波長間隔が第二の蛍光色素からの発光滲みを低減するように選択され、第二の蛍光色素の発光波長間隔が第一の蛍光色素からの発光滲みを低減するように選択されるよう構成された、二つの異なる発光フィルタによって区別できる。これは、例えば、励起フィルタの代わりに発光ダイオード（ＬＥＤｓ、下記にさらに述べる）を、蛍光色素を活性化するために使用する際に有益である。一つのＬＥＤは、二つの蛍光色素を活性化するために使用できるためである。好適な実施形態では、大きなストークスシフトを有する蛍光色素は、蛍光色素の一対の上部に加えることができ、よって蛍光色素の三重項を形成する。これは例えば、４２５／４８８に結合されたＰｅｒＣＰで達成することができる。
本発明は、第一の蛍光色素および第二の蛍光色素で標識された試料から発された蛍光信号を区別するという基本の課題を解決することによって、蛍光色素が可視スペクトル内（概して４００−６４０ｎｍの範囲内）の光を発し、第一および第二の蛍光色素が、それぞれＣｙ３類似蛍光色素および５９４類似蛍光色素である蛍光色素の組み合わせ／一対であるか、もしくは第一および第二の蛍光色素が、それぞれ４２５類似蛍光色素および４８８類似蛍光色素である蛍光色素の組み合わせ／一対である場合に限って、第三および第四の（異なる）蛍光色素から由来するさらなる蛍光信号の区別もまた可能にするための複雑さの低減という利点が生じる、という理解に基づく。これは、本発明によれば、第一の蛍光色素の励起が低減されるように第二の蛍光色素の励起波長間隔を選択することによって、および、第二の蛍光色素からの発光滲みが低減されるように第一の蛍光色素の発光波長間隔を選択することによって達成される。
本発明の範囲内で、少なくとも四つの蛍光色素の信号の区別が可能である。しかしながら、全ての試料が、必ずしもいつでも、少なくとも四つの蛍光色素で標識される必要はない。したがって、区別されうる少なくとも四つの蛍光色素は、本発明によって入手可能になるが、必ずしも全てが“同時に”連続して励起される必要はなく、例えばいくつかの実施形態では、少なくとも四つの蛍光色素の一つ、二つ、もしくは三つのみが励起されうるが、顕微鏡は、少なくとも四つの蛍光色素のいずれかからの信号を区別する能力を有する。
上述した対の蛍光色素の一つに関して、“Ｃｙ３類似蛍光色素”および“５９４類似蛍光色素”という文言は、同様の励起／発光スペクトルを有する任意の有機もしくは無機化合物を含めて、最広義に解釈されるべきである（例えば、同様の励起および発光スペクトルを有する蛍光色素についての図６参照）。尚、本リストは非排他的であり、さらなる現在および将来の同等の蛍光色素が考えられ、本発明の範囲内でありうる。
上述した対の蛍光色素の他の一つに関して、“４２５類似蛍光色素”および“４８８類似蛍光色素”という文言は、同様の励起／発光スペクトルを有する任意の有機もしくは無機化合物を含めて、最広義に解釈されるべきである（例えば、同様の励起および発光スペクトルを有する蛍光色素についての図６参照）。
また、分子の複雑性および合成方法に基づいて、“蛍光色素”という文言は、タンパク質およびペプチド、小有機化合物、合成オリゴマーおよびポリマー、もしくは当技術で周知の多成分システム、表現に基づいた任意の型の蛍光色素を含めて、広義に解釈されるべきである。用途に基づいて、使用される蛍光色素の型は異なりうる。つまり、非生体試料では、概して、光安定性蛍光色素を選択することが望ましいが、例えば（生体試料を含めた）“生体イメージング”用途に関しては、概して、例えば非毒性等の特徴を有する蛍光色素を選択することが必要である。任意の用途が、本発明の方法に関して可能でありうる。
少なくとも四つの蛍光色素からの蛍光信号の区別は、特に少組織試料のタンパク質の大きなパネルの “スクリーニング”を可能にするため、蛍光顕微鏡の領域において大きな利点を有するであろう。さらに、それは高度な共存解析を可能にし、いくつかのタンパク質は、（例えば多色解析のために）同じ試料内で視覚化することができる。またそれは、ユーザが、潜在的な滲みの影響について考えることなく、フィルタセットが区別できる蛍光色素のいずれかを有する試料を標識することを選択できるため、ユーザの蛍光顕微鏡の使用を大いに簡易化する。蛍光信号の区別はまた、例えばウェスタンブロット、ＰＣＲおよびＥＬＩＳＡに使用される分光光度計等、顕微鏡以外の他の蛍光読み取りシステムにおいても大きな利点を有しうる。
本方法は、好ましくは、試料を少なくとも四つの異なる蛍光色素で標識するステップもまた備える。試料を標識する、現在利用可能な複数の異なる方法があり、標識方法は、試料の型ならびに試料のどの部分を標識するのが望ましいかに依る。それに応じて、および当業者に理解されるように、試料は例えば、蛍光色素標識された抗体、細胞膜染料、ＤＮＡ結合蛍光色素、蛍光色素標識された核酸プローブ、および人、動物、植物、および微生物からのタンパク質、ＤＮＡ、細胞および組織の生態および病態についての情報を収集するための蛍光タンパク質で標識されうる。
本発明の好適な実施形態では、五つの異なる蛍光色素が選択され、方法はそれに応じて適応される。よって、そのような実施形態では、一対の蛍光色素は、第一の蛍光色素を形成するＣｙ３類似蛍光色素および第二の蛍光色素を形成する５９４類似蛍光色素として選択され、さらなる蛍光色素の一対は、第一の蛍光色素を形成する４２５類似蛍光色素および第二の蛍光色素を形成する４８８類似蛍光色素として選択される。
また、遠赤スペクトル内（例えば、概して６４０−６８０ｎｍの範囲内）の光を発する少なくとも一つのさらなる追加の蛍光色素も含み、一つのさらなる蛍光信号の区別ができるようにすることも可能でありうる。またさらに、近赤外スペクトル内（例えば、概して６８０ｎｍを超える）の光を発する少なくとも一つのさらなる蛍光色素も含むことも可能でありうる。これらの追加の蛍光色素は、個別にも、もしくは上記の二つの“可視”スペクトル蛍光色素の対の両方を区別する代わりに含まれうる。
好適な実施形態では、残りの蛍光色素は、ＤＡＰＩ類似蛍光色素もしくはＢＶ４２１類似蛍光色素、４２５類似蛍光色素、４８８類似蛍光色素、Ｃｙ３類似蛍光色素、５９４類似蛍光色素、６４７／６６０／６８０類似蛍光色素もしくはＰｅｒＣＰ類似蛍光色素、および７５０／７９０類似蛍光色素を備えるグループからさらに選択される。
遠赤／近赤外スペクトルの発光を伴うさらなる蛍光色素を選択することで、五つ、六つ、もしくは七つもの蛍光信号を、水銀ランプもしくはメタルハライドランプ等の紫外および可視光の照明光源をなお用いて（場合によっては遠赤スペクトル内の励起用の光源を加えて）、互いに（すなわち上述のようにコンピュータによる処理をさらに含まずに）区別することが可能になる。６４７／６６０／６８０／７００／７５０および７９０の遠赤／近赤外および赤外類似蛍光色素の例が、図６に示される。
キセノンランプもしくはＬＥＤ等の、６２０ｎｍも超える高いエネルギーを有する光を発する光源を用いることで、第一の蛍光色素を形成する６４７類似蛍光色素および第二の蛍光色素を構成する７００類似蛍光色素として選択された、遠赤／近赤外スペクトルの光を発する一対の蛍光色素の編成が可能になる。可視蛍光色素の対について上述したように、第二の蛍光色素の励起波長間隔は、第一の蛍光色素の励起が低減されるように選択され、第一の蛍光色素の発光波長間隔は、第二の蛍光色素からの発光滲みを低減するように選択される。蛍光色素が、概して７５０ｎｍを超える、赤外スペクトルより上の光を発する場合に限って、第三の蛍光色素から由来するさらなる蛍光信号の区別もまた可能にするための複雑さの低減という利点が生じる。
好適な実施形態では、紫外、可視、遠赤、近赤外、および赤外スペクトルの高いエネルギーを有する光を発する照明光源を使用し、残りの蛍光色素は、ＤＡＰＩ類似蛍光色素もしくはＢＶ４２１類似蛍光色素、４２５類似蛍光色素、４８８類似蛍光色素、Ｃｙ３類似蛍光色素、５９４類似蛍光色素、６４７類似蛍光色素、７００類似蛍光色素、および７９０類似蛍光色素を備えるグループからさらに選択される。この上部には、大きなストークスシフトを有する蛍光色素を加えることが可能である。
本発明の他の態様によれば、複数の所定の蛍光色素で標識された試料から発される蛍光信号を区別するための顕微鏡システムが提供され、前記顕微鏡システムは、光を発するよう構成された光源構成と、前記光源構成から前記試料に光を案内して前記複数の所定の蛍光色素を励起するための光ガイドと、前記試料を標識する前記複数の所定の蛍光色素によって発された蛍光を区別できるよう構成されたフィルタ構成と、前記フィルタ構成を透過した光を受光するために構成された検出装置と、を備え、前記顕微鏡フィルタセットは、一対の蛍光色素を形成する第一および第二の蛍光色素を含む、前記可視光スペクトル内の光を発する少なくとも四つの異なる蛍光色素からの信号を区別することができ、前記光源構成は、少なくとも四つの異なる励起波長間隔内の光を連続して発するよう構成され、前記第二の蛍光色素の前記励起波長間隔は、前記第一の蛍光色素の励起を低減するよう選択され、前記フィルタ構成は、少なくとも四つの異なる発光波長間隔内の光が通過できるように構成された少なくとも四つのマッチしたフィルタを備え、前記第一の蛍光色素の前記発光波長間隔は、前記第二の蛍光色素からの発光滲みを低減するよう選択され、前記一対の蛍光色素は、前記第一の蛍光色素を形成するＣｙ３類似蛍光色素および前記第二の蛍光色素を形成する５９４類似蛍光色素として選択されるか、もしくは前記一対の蛍光色素は、前記第一の蛍光色素を形成する４２５類似蛍光色素および前記第二の蛍光色素を形成する４８８類似蛍光色素として選択される。
本発明の好適な実施形態では、検出装置は、試料の蛍光の画像を撮像するよう構成された画像撮像装置を備える。そのような画像撮像装置は、コンピュータに接続されたカメラでありうる。蛍光色素のそれぞれによって発された光に関する複数の画像を連続して撮像および格納する際、例えば試料の多色解析を提供するために、画像をそれぞれの“上に”“重ねる”ことが可能でありうる。尚、顕微鏡システム／カメラ／接続されたコンピュータは、継続した（連続した）画像のストリーム（例えばビデオストリーム）が試料から撮像される、すなわち蛍光色素のそれぞれについて一つ以上の画像を
“経時的に”取得することによって撮像される“生体イメージング”のために構成されうることに留意されたい。
好ましくは、光源構成は、紫外および可視光の光源、および少なくとも四つの異なる励起波長間隔内の光が通過できるよう構成された少なくとも四つのマッチしたフィルタを備える。光源は、例えば、水銀ランプ、メタルハライドランプ、もしくはキセノンアークランプでありうる。他の適切な光源はもちろん可能であり、本発明の範囲内である。
典型的な用途では、少なくとも四つの異なる励起波長間隔内の光が通過できるよう構成された少なくとも四つのマッチしたフィルタ（“励起フィルタ”）、および、少なくとも四つの異なる発光波長間隔（“発光間隔”）内の光が通過できるよう構成された少なくとも四つのマッチしたフィルタを備えるフィルタ構成が、四つの別個の“フィルタキューブ”にそれぞれ配置され、さらにダイクロイックミラーを備える。大きなストークシフトを有する蛍光色素を使用する場合は、励起間隔（もしくは発光フィルタ間隔）は、二つの異なる蛍光色素によって共有することができる。したがって、そのような実装では、フィルタ構成は、上述した方法で少なくとも四つの蛍光色素を区別できるようにするために特に適応された四つの異なるフィルタキューブを備えるものとして見られうる。さらに、そのような実装では、本発明の概念は“後付け”用途として適応可能であり、その際本発明の概念は、利用可能な顕微鏡システムを適合させるために選択され、フィルタキューブの新たな“セット”が設けられて本発明の概念の実行を可能にする。
しかしながら、代替の実施形態では、光源構成は複数の発光ダイオード（ＬＥＤ）を備えうる。そのような実施形態では、ＬＥＤは狭帯域化するよう選択され、各特定に選択された励起波長以内の固有の光を発するよう構成されうるため、必ずしも特定の励起フィルタを含まなくてよい。ＬＥＤが使用される場合は、異なるストークスシフトに基づいた蛍光色素の対を形成し、対の両方の蛍光色素が一つのＬＥＤによって活性化されることが有益でありうる。これは、蛍光色素のパネルを活性化するために必要とされるＬＥＤの数を減らしうる。
本発明の特徴および長所は、付属のクレームおよび以下の説明を検討すると明らかになるであろう。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、以下に説明される以外の実施形態を創出するために本発明の異なる特徴が組み合わされうることを理解する。
本発明の種々の態様は、その特定の特徴および利点を含めて、下記の詳細な説明および付属の図面から、容易に理解されるであろう。
本発明による例示の顕微鏡システム。 顕微鏡システムのための代替のフィルタセットアップ。 顕微鏡システムのための代替のフィルタセットアップ。 顕微鏡システムのための代替のフィルタセットアップ。 本発明によって適応された複数の異なる蛍光色素の励起／発光図。 本発明による蛍光色素類似セットアップのいくつかの変形の模式図。 特定のフィルタセットアップの異なる例。 特定のフィルタセットアップの異なる例。 特定のフィルタセットアップの異なる例。 標識された試料から蛍光を検出するための本発明による方法ステップを示すフローチャート。 同様の励起および発光スペクトルを有する蛍光色素（蛍光色素の類似物）の例を示す表。
本発明はここで、本発明の現在好ましい実施形態が示される付属の図面を参照して、以下により完全に説明される。本発明は、しかしながら、多くの異なる形式で実施されてよく、本明細書で述べられる実施形態に限定されると解釈するべきではない。むしろ、これらの実施形態は徹底および完全性のために提供され、当業者に本発明の範囲を完全に伝えるものである。全体を通して、同じ参照符号は、同じ要素を示す。
ここで図面および特に図１を参照すると、本発明の好適な実施形態による顕微鏡システム１００が描写される。顕微鏡システム１００は動作中、顕微鏡ステージ１０４に配置された試料１０２をイメージングするために使用される。試料１０４は、励起波長の光を吸収し、その光に応じて、励起波長よりも長い発光波長の蛍光を発する、複数の異なる蛍光色素で標識される。
紫外線および可視スペクトル内の光（すなわち、３５０−６２０ｎｍの範囲の概して強い発光）を発する、水銀ランプもしくはメタルハライドランプ等の光源１０６は、蛍光色素の励起波長の光を発生させ、光源１０６はファイバ１０８に結合され、ファイバ１０８は、励起ビーム１１０を光源１０６からフィルタキューブ１１２に運ぶ。いくつかの実施形態では、光源１０６から発された光は、ファイバによって運ばれず、直接フィルタキューブ１１２に移動する。他の実施形態では、励起ビーム１１０は、フィルタキューブ１１２に到着する前に、レンズおよびアパーチャ等の光学素子を通過する。励起ビーム１１０は、顕微鏡システム１００のターレット（図示せず）に配置されたフィルタキューブ１１２に進入する。ターレットは、複数の異なるフィルタキューブを、光源１０６と試料１０２との間の光軸内に順次位置決めできるように設けられる。
フィルタキューブ１１２は、バンドパス励起フィルタ（Ｅｘ）１１４を備え、バンドパス励起フィルタ１１４はファイバ１０８から励起ビーム１１０を受光し、試料１０２を標識するために使用される蛍光色素の一つの励起波長間隔内の波長間隔を有する、励起ビーム１１０の部分のみを透過させる。励起ビーム１１０は、励起フィルタ１１４を透過し、ダイクロイックミラー（ＤＭ）１１６によって受光される。ダイクロイックミラー１１６は、蛍光色素の励起波長の光を反射し、蛍光色素の発光波長の光を透過させる。励起ビーム１１０は、そのように、ダイクロイックミラー１１４によって反射される。ダイクロイックミラー１１４は概して、フィルタ（キューブ）１１２内に、励起ビーム１１０の方向に対して概して４５度で斜めに配向され、そのような励振ビーム１１０は、試料１０２に向かって反射される。
さらに、励振ビーム１１０は、対物レンズ１１６を通過し、試料１０２に入射し、試料１０２に存在する蛍光色素を励起する。蛍光色素は、蛍光色素の発光波長の蛍光１１８を発する。蛍光１１８は対物レンズ１１７によって集光され、フィルタキューブ１１２に進入する発光ビーム１２０に形成される。発光ビーム１２０はそれから、ダイクロイックミラー１１６を透過し、フィルタキューブ１１２にさらに具備される発光フィルタ（Ｅｍ）１２２に当たる。発光フィルタ１２２もまたバンドパスフィルタ（もしくはロングパスフィルタの場合もある）であり、蛍光色素の発光波長前後の光を透過させ、例えば励起ビームからの迷光および試料１０２の他の蛍光色素からの発光等の他の光を反射する。発光ビーム１２０はこうして発光フィルタ１２２を透過し、顕微鏡システム１００のうち、それに接続された検出装置１２４に方向づけられる。検出装置１２４は、例えば、センサ、分光光度計、ＣＣＤまたはＣＭＯＳカメラ、もしくは接眼レンズでありうる。いくつかの実施形態では、レンズもしくはビームスプリッタ等の光学素子が、発光ビーム１２０を適切に方向づけるために、発光フィルタ１２２と検出装置１２４との間に存在する。例えばＣＣＤまたはＣＭＯＳカメラ等のデジタルカメラを備える検出装置１２４の場合は、収集された画像の露出制御のために概して自動シャッターが含まれる（ビデオストリームもまた上述のように撮像されうる）。モノクロカメラを使用して各蛍光色素からの発光を個別に撮像し、偽色をデジタルで塗り、複数の異なるフィルタキューブ１１２を使用した際にそれらを重ねて最終的な画像を入手するのが一般的である。
顕微鏡システム１００はさらに、ターレットの位置、検出部１２４、および光源１０６を含めて顕微鏡システム１００の動作を制御するための制御部１２６を（概して）備える。制御部１２６は、汎用プロセッサ、用途特定プロセッサ、回路包含処理構成部品、分散処理構成部品のグループ、処理用に構成された分散コンピュータのグループ等を含みうる。プロセッサは、データまたは信号処理を行うため、もしくはメモリに格納されたコンピュータコードを実行するための任意の数のハードウェア構成部品でありうるもしくはそれを含みうる。メモリは、本明細書で説明される種々の方法を完了するためもしくは容易にするためのデータおよび／またはコンピュータコードを格納するための一つ以上の装置でありうる。メモリは、揮発性メモリもしくは非揮発性メモリを含みうる。メモリは、データベース構成部品、オブジェクトコード構成部品、スクリプト構成部品、もしくは本明細書の種々の活動をサポートするための任意の他の型の情報構造を含みうる。例示の実施形態によると、任意の分散もしくはローカルメモリ装置は、本明細書のシステムおよび方法で利用されうる。例示の実施形態によれば、メモリは（例えば回路、もしくは任意の他の有線の、無線の、またはネットワーク接続を介して）プロセッサに通信可能に接続され、本明細書に説明される一つ以上のプロセスを実行するためのコンピュータコードを含む。上述のように、ターレットは、複数のフィルタキューブ１１２の取り外し可能な挿入および位置制御を可能にする。つまり、蛍光色素の各型がそれ自身の特有の励起および発光スペクトルを有するため、励起フィルタ１１４、ダイクロニックミラー１１６、および発光フィルタ１２２の異なる組み合わせが各型の蛍光色素に用いられる。こうして、フィルタおよびミラーの特有の組み合わせを有するフィルタキューブが、特定の型の蛍光色素に使用するために組み立てられる。試料１０２にある蛍光色素の型に依って、フィルタと鏡の適切な組み合わせを有するフィルタキューブ１１２は適宜ターレットに挿入される。
同様に、フィルタキューブ１１２内のフィルタおよびミラーは、特定の光源に使用するために選択される。
上述した標準的な光学構成は、標本の高解像度画像を撮像するために、カメラセンサ上の標本の拡大画像を直接生成するための顕微鏡光学部品を使用する。この光学システムは、一般的には‘広視野’顕微鏡と称される。顕微鏡界の当業者は、標本の高解像度画像が、種々の他の光学システムによって創出できることを認識するであろう。
ここでしばらく、本発明による概念を実行するためのフィルタおよび光源の構成の代替の実装を図示する図２ａ−２ｃに移る。図２ａでは、本発明の概念は図１と同様に例示されるが、水銀ランプ（もしくは同様のもの）等の単一の光源を設ける代わりに、複数のＬＥＤ１０６が設けられており、ＬＥＤ１０６のそれぞれは、例えばおよそ２０−５０ｎｍのバンド幅を有する限られた波長範囲内のみの光を概して発する狭帯域化ＬＥＤである。したがって、そのような構成を用いる際は、フィルタキューブ１１２の励起フィルタを除くことが可能でありうる。したがって、ＬＥＤ１０６のそれぞれは、（上述のように）試料１０２を標識するために使用される蛍光色素の一つの励起波長間隔内の波長間隔を有する励起ビーム１１０の成分のみを透過させるよう調整されなければならない。
あるいは、本発明の概念は、所謂“Ｐｉｎｋｅｌ”（図２ｂ）もしくは“Ｓｅｄａｔ”（図２ｃ）構成によって実装されうる。ＰｉｎｋｅｌおよびＳｅｄａｔ構成は両方ともマルチバンドダイクロイックを組み込むが、使用される励起および発光フィルタの組み合わせが異なる。Ｓｅｄａｔフィルタ構成は、単バンドエキサイタおよび単バンドエミッタの両方を使用するが、Ｐｉｎｋｅｌ構成は、単バンド励起フィルタとマルチバンドエミッタとを使用する。Ｐｉｎｋｅｌセットを使用する際に達成されるＳ／Ｎ比は、フルマルチバンド構成を使用する際よりも潜在的に高いが、マルチバンドフィルタセットを比較すると、Ｓｅｄａｔ構成は多くの場合、最も高い信号／ノイズ比を与える。図１に示したフィルタキューブ実装と比較すると、Ｐｉｎｋｅｌおよび／またはＳｅｄａｔ構成は、場合によっては、異なるフィルタ構成の導入を非常に速く切り替えることを可能にしうる。
また、図１および２ａ−２ｃに図示された異なる実装の全ては、“光反射ストラテジ”の実装として示される。すなわち、光は試料１０２に入射し、それから検出装置１２４に向けて反射される。しかしながら、本発明の概念は、光が試料１０２を“介して”透過できるようにすることによっても、つまり例えば検出装置１２４を試料１０２の“後ろ”、もしくは任意の他の角度に配置できるようにすることによっても、実装されうると解されるべきである。
ここで、本発明によって用いられる複数の異なる蛍光色素の励起／発光図を示す図３ａに移る。図３ａでは、試料１０２は七つの異なる蛍光色素で標識され、したがって、検出装置１２４に提供される七つの異なる蛍光信号を形成する。
上述のように、本発明によって解決される全体的な課題は、第一の蛍光色素で標識され、同時に第二の蛍光色素で標識され、一対の蛍光色素を形成する、試料からの信号の区別である。上述のように、第一および第二の蛍光色素は、可視スペクトル内（例えば概して４００−６４０ｎｍの範囲内）の光を発する蛍光色素から選択され、第一および第二の蛍光色素は、それぞれＣｙ３類似蛍光色素および５９４類似蛍光色素の組み合わせ／対であるか、もしくは、第一および第二の蛍光色素は、それぞれ４２５類似蛍光色素および４８８類似蛍光色素の組み合わせ／対であるかのいずれかである。
概して、これらの蛍光色素は明るく、スペクトルの重なりを有する（４８８と比較した４２５、および５９４と比較したＣｙ３）。本発明の例示の実施形態では、５９４励起フィルタは、５９０ｎｍを超えるよう（例えば５９４／８もしくは６０２／１３ｎｍ）シフトされ、よって、Ｃｙ３を励起せずに５９４を励起することが可能になる。さらに、Ｃｙ３の発光フィルタを５８０ｎｍ未満（例えば、５６８／１０もしくは５７２／１０ｎｍ）にシフトすることによって、５９４発光信号を収集することなくＣｙ３発光信号を収集することが大いに可能になった。これらの最適化で、Ｃｙ３フィルタ構成（光およびフィルタ構成部品）および５９４フィルタ構成は、信号を各蛍光色素から区別することを可能にする。重要なことは、蛍光信号は、最適化されたフィルタセットでも十分に強いまま維持されることである。他の例では、４２５および４８８類似蛍光色素の組み合わせ、および６４７および７００類似蛍光色素の組み合わせについて、同様の適応が為されうる。
次に、４８８／ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）チャネルの信号／ノイズ比が、４８８／ＦＩＴＣ検出の共通の課題である、組織からの自家蛍光を減らすことによって最適化された。組織内の多くの分子は、青色スペクトルの光によって活性化され、例えばミトコンドリアタンパク質、コラーゲンおよびエラスチンは、自家蛍光を引き起こし、広い波長間隔にわたって光を発する。励起フィルタを、４９０ｎｍを超えるよう（５００／２０ｎｍ）シフトすることによって、自家蛍光の大部分は消滅し、信号／ノイズ比は著しく向上した。Ｃｙ３発光信号を全く収集しない４８８／ＦＩＴＣ発光フィルタ（５２５／１５ｎｍ）を選択するよう配慮しなければならない。４８８／ＦＩＴＣ発光フィルタのシフトは、ＤＡＰＩとＦＩＴＣの中間の追加のチャネル（励起は４２０ｎｍを超え、発光は４９５未満）の余地を与えた。この間隔は高い組織自家蛍光について問題であり、蛍光色素は、許容できる信号／ノイズ比を与えるのに十分明るい必要がある。この間隔で利用できる蛍光色素は一握りしかなく、それらの多くは暗いおよび／または光退色するよう作用される。それでも、Ａｔｔｏ４２５は、光安定性があり、組織自家蛍光より優先するのに十分明るいとわかった。また、核染色ＳｙｔｏｘＢｌｕｅは、この間隔での基準を満たした。
最後に、試料１０２を標識するために、近赤外蛍光色素が選択／導入／使用された。水銀ランプもしくはメタルハライドランプは、６２０ｎｍを超える波長では弱いため、近赤外蛍光色素を適切に励起するのに十分なエネルギーを得ることは難しい。多くの染料をテストした後、ＰｅｒＣＰおよびその類似物（例えばＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）が優れているとわかった。ＰｅｒＣＰは、（比較的）大きなストークスシフトを有し、したがって高エネルギーの青色光で活性化することができ、その信号は、４２５および４８８類似蛍光色素と共に蛍光色素三重項を形成することによって、セットアップ中の他の蛍光色素から容易に区別されうる。（比較的）小さなストークスシフトを有する、テストされたすべての赤外染料の中では、６４７類似蛍光色素、およびいくつかの６６０類似蛍光色素（ＣＦ６６０Ｒ等）が、６２０ｎｍを超える波長間隔で活性化されても、適度で良好な信号を与えることがわかった。したがって、ＰｅｒＣＰ類似蛍光色素もしくは６４７類似蛍光色素およびいくつかの６６０類似蛍光色素は、多色セットアップに使用され、水銀ランプもしくはメタルハライドランプによって活性化されうる。
したがって、本発明によって、可視スペクトル内の光を発する四つ以上の異なる蛍光色素からの信号を区別して検出することが可能である。また、遠赤スペクトル（概して６４０から７００ｎｍの光を発する）、近赤外スペクトル（概して７００から７５０ｎｍの光を発する）、もしくは赤外スペクトル（概して７５０ｎｍを超える光を発する）内の光を発する蛍光色素を選択することによって、七つもの異なる蛍光色素信号を区別することが可能である。さらに、すなわち、七つより多い異なる蛍光色素信号は、可視スペクトル内および可視スペクトルを超えた（遠赤／近赤外／赤外）以内の両方の光を発する光源（例えば、さらなるＬＥＤと組み合わせた“通常”光源）を、遠赤／近赤外／赤外スペクトルでアクティブになる蛍光色素と組み合わせて使用する場合に、区別することが可能になりうる。同じ概念は、紫外スペクトルならびに他の光源の組み合わせにももちろん可能である。
図３（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）は、本発明による多色セットアップを達成するために、蛍光色素の対がどのように他の蛍光色素の対および他の単一の蛍光色素と組み合わせることができるかという、代替のセットアップを図示する。例えば、図３（ｂ）は、水銀ランプによって達成できる多色セットアップを示す。同様に、図３（ｃ）および図３（ｄ）は、遠赤／近赤外／赤外スペクトルの強い光も発する光源構成によって達成できる多色セットアップを示す
下記（表１）に、例示の蛍光色素（もしくは任意の類似型）と、励起および発光フィルタを置くための適切な間隔との可能な組み合わせを示す。セットアップは、水銀ランプもしくはメタルハライドランプで機能しうる。
Figure 2017509010
あるいは、本発明の他の実施形態では、下記（表２）の組み合わせが可能でありうる。この例では、ＤＡＰＩチャネルは、紫外光によって活性化される蛍光色素の対（ＤＹ−３６０ＸＬもしくはＢＶ４２１と結合したＤＹ−３５０ＸＬ）に替わり、遠赤／近赤外蛍光色素の対が追加される（７００と結合した６４７）。セットアップは、好ましくは、７００および７９０蛍光色素を適切に活性化するための遠赤および近赤外スペクトルの高いエネルギーを有する光を発する照明光源を要する。
Figure 2017509010
図４ａ−ｃは、励起および発光フィルタセットアップおよびそれらの対応する波長／バンド幅の三つの特定の例を示す。
最後に、本発明による顕微鏡システム１００を動作させるための方法ステップを示す例示のフローチャートを図示する図５に移る。プロセスは、Ｃｙ３類似蛍光色素および５９４類似蛍光色素を含む少なくとも四つの異なる蛍光色素の選択Ｓ１によって始まる。少なくとも四つの異なる蛍光色素はそれから、上記のうち任意の型の試料１０２を標識するために使用される。
試料１０２を標識するために選択された蛍光色素に基づいて、対応する数（概して、選択された蛍光色素の数と同数）の励起波長間隔が選択Ｓ２され、第二の蛍光色素の励起波長間隔は特に、上記に従って、第一の蛍光色素の励起が低減されるよう選択される。それから、フィルタ構成、例えばフィルタキューブ１１２の（もしくは代替としてＰｉｎｋｅｌまたはＳｅｄａｔ構成による）発光フィルタが選択Ｓ３され、少なくとも四つの異なる蛍光色素の発光波長間隔にマッチする異なる発光波長間隔内の光が通過できるようにする。またここで、第一の蛍光色素の発光波長間隔が、第二の蛍光色素からの発光滲みを低減するよう選択され、Ｃｙ３類似蛍光色素が第一の蛍光色素を形成し、５９４類似蛍光色素が第二の蛍光色素を形成する、もしくは４２５類似蛍光色素が第一の蛍光色素を形成し、４８８類似蛍光色素が第二の蛍光色素を形成するという一般的な基準が満たされるべきである。
例えば制御部１２６を光源１０６、ターレットおよびフィルタキューブ１１２と組み合わせて使用して、顕微鏡システム１００は、選択された励起波長間隔内の光を連続して発光Ｓ４するのに使用される。光反射構成に基づいて、もしくは光が試料１０２を通過できるようにすることのいずれかによって、試料１０２を標識するのに用いられる蛍光色素からの蛍光は、光がフィルタ構成（概して少なくとも発光フィルタを含む）を通過すると、例えばデジタルカメラ（検出装置１２４）と組み合わされた制御部１２６の制御下で検出される。
上述のように、多色画像を作像できるようにするために、画像は個別に撮像され、偽色がデジタルで塗られ、画像はそれから各々の上に重ねられうる。上記でも述べたように、続いて収集された画像のライブ収集を実行することが可能でありうる。
要約すると、本発明は、複数の所定の蛍光色素で標識された試料から発された蛍光を、光源構成を備える顕微鏡システムを使用して検出する方法に関し、前記方法は、可視光スペクトル内の光を発するよう構成された少なくとも四つの異なる蛍光色素を選択するステップであって、前記少なくとも四つの異なる蛍光色素は、一対の蛍光色素を形成する第一および第二の蛍光色素を含むステップと、前記少なくとも四つの異なる蛍光色素の励起波長間隔を選択するステップであって、前記第二の蛍光色素の前記励起波長間隔は、前記第一の蛍光色素の励起が低減されるよう選択されるステップと、前記少なくとも四つの異なる蛍光色素の発光波長間隔にマッチする前記発光波長間隔内の光が選択的に通過できるように顕微鏡システムのフィルタ構成を構成するステップであって、前記第一の蛍光色素の前記発光波長間隔は、前記第二の蛍光色素からの発光滲みを低減するよう選択されるステップと、少なくとも一部の前記選択された励起波長間隔内の光を連続して発するステップと、前記フィルタ構成を透過した、前記試料から発された光を検出するステップと、を備え、前記一対の蛍光色素は、前記第一の蛍光色素を形成するＣｙ３類似蛍光色素および前記第二の蛍光色素を形成する５９４類似蛍光色素として選択されるか、もしくは、前記一対の蛍光色素は、前記第一の蛍光色素を形成する４２５類似蛍光色素および前記第二の蛍光色素を形成する４８８類似蛍光色素として選択される。
本発明はまた、複数の所定の蛍光色素で標識された試料から発された蛍光を、光源構成を備える顕微鏡システムを使用して検出する方法に関し、前記方法は、可視、遠赤、および近赤外光スペクトル内の光を発するよう構成された少なくとも六つの異なる蛍光色素を選択するステップであって、前記少なくとも六つの異なる蛍光色素は、可視スペクトル内の光を発し一対の蛍光色素を形成する第一および第二の蛍光色素と、遠赤／近赤外スペクトル内の光を発し一対の蛍光色素を形成する第一および第二の蛍光色素とを含むステップと、前記少なくとも六つの異なる蛍光色素の励起波長間隔を選択するステップであって、前記第二の蛍光色素の前記励起波長間隔は、前記第一の蛍光色素の励起が低減されるよう選択されるステップと、前記少なくとも六つの異なる蛍光色素の発光波長間隔にマッチする前記発光波長間隔内の光が選択的に通過できるよう前記顕微鏡システムのフィルタ構成を構成するステップであって、前記第一の蛍光色素の前記発光波長間隔は、前記第二の蛍光色素からの発光滲みを低減するよう選択されるステップと、少なくとも一部の前記選択された励起波長間隔内の光を連続して発するステップと、前記フィルタ構成を透過した、前記試料から発された光を検出するステップと、を備え、“可視の”一対の蛍光色素は、前記第一の蛍光色素を形成するＣｙ３類似蛍光色素および前記第二の蛍光色素を形成する５９４類似蛍光色素として選択されるか、もしくは、前記一対の蛍光色素は、前記第一の蛍光色素を形成する４２５類似蛍光色素および前記第二の蛍光色素を形成する４８８類似蛍光色素として選択され、“不可視の”一対の蛍光色素は、前記第一の蛍光色素を形成する６４７類似蛍光色素および前記第二の蛍光色素を形成する７００類似蛍光色素として選択される。
本発明は、第一の蛍光色素および第二の蛍光色素で標識された試料から発された蛍光信号を区別するという基本の課題を解決することによって、蛍光色素が可視スペクトル内（例えば概して４００−６４０ｎｍの範囲内）の光を発する場合に限って、可視スペクトル内の第三および第四の（異なる）蛍光色素から由来するさらなる蛍光信号の区別もまた可能にするための複雑さの低減という利点が生じる、という理解に基づく。さらに、遠赤／近赤外スペクトル内（概して６４０−７５０ｎｍの範囲内）の蛍光色素の対がまた追加された場合は、赤外スペクトル内（概して７５０ｎｍを超える）の蛍光色素から由来するさらなる蛍光信号の区別もまた可能にするための複雑さの低減という利点が生じる。第一および第二の蛍光色素は、それぞれＣｙ３類似蛍光色素および５９４類似蛍光色素の組み合わせ／対であるか、もしくは、第一および第二の蛍光色素は、それぞれ４２５類似蛍光色素および４８８類似蛍光色素の組み合わせ／対であるか、もしくは、第一および第二の蛍光色素は、それぞれ６４７類似蛍光色素および７００類似蛍光色素の組み合わせ／対であるかのいずれかである。これは、本発明によれば、第一の蛍光色素の励起が低減されるように第二の蛍光色素の励起波長間隔を選択することによって、および、第二の蛍光色素からの発光滲みが低減されるように第一の蛍光色素の発光波長間隔を選択することによって達成される。
図面は方法ステップの特定の順序を示しうるが、ステップの順は描写されたものと異なりうる。また、二つ以上のステップが、同時もしくは部分的に同時に実行されうる。そのような変形は、設計者選択に依る。全てのそのような変形は、本開示の範囲内である。また、本発明がその特定の例示の実施形態を参照して説明されていても、多くの異なる変更、修正などが当業者に明らかになるであろう。開示された実施形態の変形は、図面、明細書、および付属の請求の範囲を検討することで、請求項に係る発明を実施する際に当業者によって理解および実行することができる。さらに、請求の範囲において、“備える”という用語は他の要素もしくはステップを除外するものではなく、不定冠詞“ａ”もしくは“ａｎ”は、複数を除外するものではない。

Claims (10)

  1. 複数の所定の蛍光色素で標識された試料から発された蛍光を、光源構成を備える顕微鏡システムを使用して検出する方法であって、
    可視光スペクトル内の光を発するよう構成された少なくとも四つの異なる蛍光色素を選択するステップであって、前記少なくとも四つの異なる蛍光色素は、一対の蛍光色素を形成する第一および第二の蛍光色素を含むステップと、
    前記少なくとも四つの異なる蛍光色素の励起波長間隔を選択するステップであって、前記第二の蛍光色素の前記励起波長間隔は、前記第一の蛍光色素の励起が低減されるよう選択されるステップと、
    前記少なくとも四つの異なる蛍光色素の発光波長間隔にマッチする前記発光波長間隔内の光が選択的に通過できるように顕微鏡システムのフィルタ構成を構成するステップであって、前記第一の蛍光色素の前記発光波長間隔は、前記第二の蛍光色素からの発光滲みを低減するよう選択されるステップと、
    少なくとも一部の前記選択された励起波長間隔内の光を連続して発するステップと、
    前記フィルタ構成を透過した、前記試料から発された光を検出するステップと、を備え、
    前記一対の蛍光色素は、前記第一の蛍光色素を形成するＣｙ３類似蛍光色素および前記第二の蛍光色素を形成する５９４類似蛍光色素として選択されるか、もしくは、前記一対の蛍光色素は、前記第一の蛍光色素を形成する４２５類似蛍光色素および前記第二の蛍光色素を形成する４８８類似蛍光色素として選択される、方法。
  2. 前記少なくとも四つの異なる蛍光色素からの蛍光信号を区別するステップをさらに備える、請求項１に記載の方法。
  3. 少なくとも五つの異なる蛍光色素を選択することをさらに備え、励起波長間隔は前記少なくとも五つの異なる蛍光色素について選択され、前記フィルタ構成は前記少なくとも五つの異なる蛍光色素について構成され、前記一対の蛍光色素は、前記第一の蛍光色素を形成するＣｙ３類似蛍光色素および前記第二の蛍光色素を形成する５９４類似蛍光色素として選択され、さらなる一対の蛍光色素は、前記第一の蛍光色素を形成する４２５類似蛍光色素および前記第二の蛍光色素を形成する４８８類似蛍光色素として選択される、請求項１または２に記載の方法。
  4. 遠赤／近赤外スペクトル内の光を発するよう構成された少なくとも一つのさらなる蛍光色素を選択することをさらに備える、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 遠赤外スペクトル内の光を発するよう構成された少なくとも一つのさらなる蛍光色素を選択することをさらに備える、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 残りの蛍光色素は、ＤＡＰＩ類似蛍光色素もしくはＢＶ４２１類似蛍光色素、４２５類似蛍光色素、４８８類似蛍光色素、Ｃｙ３類似蛍光色素、５９４類似蛍光色素、ＰｅｒＣＰ類似蛍光色素もしくは６４７／６６０／６８０／７００類似蛍光色素、および７２５／７５０／７９０類似蛍光色素を備えるグループから選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 複数の所定の蛍光色素で標識された試料から発される蛍光信号を区別するための顕微鏡システムであって、
    光を発するよう構成された光源構成と、
    前記光源構成から前記試料に光を案内して前記複数の所定の蛍光色素を励起するための光ガイドと、
    前記試料を標識する前記複数の所定の蛍光色素によって発された蛍光を区別できるよう構成されたフィルタ構成と、
    前記フィルタ構成を透過した光を受光するために構成された検出装置と、を備え、
    前記顕微鏡フィルタセットは、一対の蛍光色素を形成する第一および第二の蛍光色素を含む、前記可視光スペクトル内の光を発する少なくとも四つの異なる蛍光色素からの信号を区別することができ、
    前記光源構成は、少なくとも四つの異なる励起波長間隔内の光を連続して発するよう構成され、
    前記第二の蛍光色素の前記励起波長間隔は、前記第一の蛍光色素の励起を低減するよう選択され、
    前記フィルタ構成は、少なくとも四つの異なる発光波長間隔内の光が通過できるように構成された少なくとも四つのマッチしたフィルタを備え、
    前記第一の蛍光色素の前記発光波長間隔は、前記第二の蛍光色素からの発光滲みを低減するよう選択され、
    前記一対の蛍光色素は、前記第一の蛍光色素を形成するＣｙ３類似蛍光色素および前記第二の蛍光色素を形成する５９４類似蛍光色素として選択されるか、もしくは前記一対の蛍光色素は、前記第一の蛍光色素を形成する４２５類似蛍光色素および前記第二の蛍光色素を形成する４８８類似蛍光色素として選択される、顕微鏡システム。
  8. 前記検出装置は、前記試料の蛍光の画像を撮像するよう構成された画像撮像装置を備える、請求項７に記載の顕微鏡システム。
  9. 前記光源構成は、複数の狭帯域化発光ダイオードを備える、請求項７から８のいずれか一項に記載の顕微鏡システム。
  10. 前記光源構成は、紫外および可視波長スペクトル内の光を発する光源と、遠赤、近赤外、もしくは赤外スペクトルのうち少なくとも一つ以内の光を発する複数の発光ダイオードとの組み合わせを備える、請求項７から９のいずれか一項に記載の顕微鏡システム。
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