JP4968575B2

JP4968575B2 - 共焦点顕微鏡

Info

Publication number: JP4968575B2
Application number: JP2006018677A
Authority: JP
Inventors: 健太御厨; 隆司吉田; 俊雄飯野; 康弘谷端
Original assignee: Yokogawa Electric Corp
Current assignee: Yokogawa Electric Corp
Priority date: 2006-01-27
Filing date: 2006-01-27
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2026-01-27
Also published as: JP2007199458A

Description

本発明は、顕微鏡ユニットと共焦点スキャナユニットから構成され、複数波長の励起用レーザ光（以下、励起光）を各波長に対応した励起側フィルタ手段で切り換えて試料に照射し、試料からの戻り蛍光を、前記励起光の各波長に対応して切り換えられる蛍光観察側フィルタ手段を介して撮像手段に結像させる共焦点顕微鏡に関するものである。

ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡の詳細については特許文献１に開示されている。図３は、共焦点顕微鏡の一般的なシステム構成の一例を示す機能ブロック図である。１は、励起光を出射する多波長励起光源である。２は、この多波長励起光源１からの励起光を選択的に入射する共焦点スキャナユニットである。３は、この共焦点スキャナに接続された蛍光観察用の倒立型顕微鏡ユニットである。

多波長励起光源１において、１ａはＡｒＫｒ（アルゴン・クリプトン）ガスレーザであり、４８８nmと５６８nmの波長で同時に発振する。これら励起光は、光ファイバ４を介して共焦点スキャナユニット２に選択的に入射される。１ｂは半導体レーザであり、４０５nmの波長で発振する。この励起光は、光ファイバ５を介して共焦点スキャナユニット２に入射される。

１ｃは、励起側フィルタホイールであり、このフィルタホイールに搭載された特定の波長のみを透過する励起フィルタによって、ＡｒＫｒガスレーザ１ａの励起光は、４８８ｎｍと５６８nmの２波長に分離して選択的に出射される。

１ｄは４０５nmの半導体レーザ１ｂの出射口付近に設けられたシャッターであり、ＡｒＫｒガスレーザ１ａの励起光が共焦点スキャナユニット２に入射されている場合には、このシャッターが閉じられ、試料に照射されないようになっている。

共焦点スキャナユニット２が、ＡｒＫｒガスレーザ１ａより４８８nmの励起光を導入する場合は、ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク）またはＹＦＰ（イエロー蛍光タンパク）を励起することが可能であり、５６８nmを導入する場合には、ＤｓＲｅｄ（レッド蛍光タンパク）やｍＲＦＰ（モノマーレッド蛍光タンパク）を励起することが可能である。励起光の切り替えは、励起側フィルタホイール１ｃが回転することによって行われ、切り替え速度は最速で１２５msecである。

共焦点スキャナユニット２が、半導体レーザ１ｂより４０５nmの励起光を導入する場合は、ＤＡＰＩ（一種の蛍光試薬）またはＣＦＰ（シアン蛍光タンパク）を励起することが可能である。

共焦点スキャナユニット２としては、背景光を抑えたマイクロレンズアレイ付きニポウ板方式のユニットが用いられている。この共焦点スキャナユニットには、励起光の波長である４８８nmと５６８nmを透過し、その他の波長を反射するマルチバンドタイプのダイクロイックミラーが内蔵されている。励起光はピンホールを通過し、対物レンズを介して試料に照射され、試料上で蛍光を励起する。

試料からの戻り蛍光は、対物レンズを通り再びピンホールを通過した後、今度はダイクロイックミラーで反射され、共焦点スキャナユニットに内蔵されたマルチバンドタイプのバリアフィルタで励起光はほとんど減衰して排除される。

戻り蛍光は更に、蛍光観察側フィルタホイール６に導かれる。蛍光観察側フィルタホイール６は、ＧＦＰ用、ＹＦＰ用、ＤｓＲｅｄ用、ｍＲＦＰ用、ＤＡＰＩ用、ＣＦＰ用に作製した分光光学ユニット用バリアフィルタが搭載されており、フィルタホイールが回転することによって時分割で分光画像が取得できるようになっている。蛍光観察側のフィルタ６の切り替え時間も、励起側と同期して最速で125msecとなっている。

蛍光観察側フィルタ６を通過した戻り蛍光は、最大２.２５倍に拡大するズームレンズ７及び光増強を行うためのイメージインテンシファイア８を介して撮像手段を形成する高感度低ノイズのＨＡＲＰカメラ９で撮像され、カメラコントローラ１０を経由して画像を取り込むための制御装置１１に渡される。

１２は、バイポーラトランジスタによるＴＴＬ（Transistor-Transistor Logic）で構成された高速のシーケンス処理手段であり、制御装置１１に搭載されているＣＰＵにより管理される。

シーケンス処理手段１２は、制御装置１１からの処理要求コマンドＣを取得すると、所定のシーケンスに従って励起側フィルタホイール１ｃ、シャッター１ｄ、蛍光観察側フィルタホイール６、カメラコントローラ１０を高速でシーケンス制御する。

図４は、励起側及び蛍光観察側フィルタホイールに搭載されたフィルタ構成とその制御系を示す機能ブロック図である。蛍光観察側フィルタホイール６には、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ｍＲＦＰ、ＤＡＰＩ、ＣＦＰの蛍光波長を透過し他の波長をブロックするバンドパスフィルタｆ１乃至ｆ６が搭載され、これらを観察光路上（図示のｆ１位置）に回転移動することで観察する蛍光波長を選択している。

蛍光観察側フィルタホイール６は、シーケンス処理手段１２の指令により作動する蛍光観察側フィルタ駆動手段１３からの操作信号Ｄ１で回転し、所定フィルタを観察光路上に移動操作する。回転方向は、選択対象フィルタまでの距離が最短となるように時計方向又は反時計方向が自動的に選択される。

励起側フィルタホイール１ｃには、中心波長４８８nmの狭帯域バンドパスフィルタＦ１と、中心波長５６８nmの狭帯域バンドパスフィルタＦ２が搭載されている。これらフィルタを交互に励起光の光路上（図示のＦ１位置）に位置を変えることによって、波長切り替えを行っている。

半導体レーザ１ｂの４０５nmnの励起光を入射する場合には、励起側フィルタホイール１ｃの励起光の光路上に遮蔽板を移動させて４８８nmと５６８nmの励起光の入射を遮光し、シャッター１ｄを開いて４０５nmnの励起光を入射する。

励起側フィルタホイール１ｃは、蛍光観察側フィルタホイール６と同期してシーケンス処理手段１２の指令により作動する励起側フィルタ駆動手段１４からの操作信号Ｄ２で回転し、所定フィルタを励起光の光路上に交互に回転移動させる。遮蔽板への回転方向は、遮蔽板までの距離が最短となるように時計方向又は反時計方向が自動的に選択される。

１５は、励起側フィルタホイール１ｃの励起光の光路の途中に設けられたシャッター手段であり、４８８nmと５６８nmの励起光を利用している期間は、励起側フィルタ駆動手段１４からのシャッター駆動信号Ｓで開に操作されている。

図５は、シーケンス処理手段１２の処理手順を説明するタイムチャートである。（Ａ）はフレーム同期信号、（Ｂ）はＣＰＵよりのスタート信号、（Ｃ）はシャッター駆動信号である。

このシャッター駆動信号は、（Ｄ）に示すように励起側フィルタホイールの回転操作でフィルタＦ１とＦ２により４８８nmと５６８nmの励起光を利用している期間、即ち時刻ｔ１からｔ４までの期間中、シャッター手段１５を開に操作する。従って、フィルタＦ１がＦ２に切り換えられる時刻ｔ２からｔ３の移動期間中でも、シャッター手段１５が開に操作されている。

図５（Ｅ）は、観察側フィルタホイールの回転操作を示し、Ｆ１が選択されている時刻ｔ１からｔ２の期間に、フィルタｆ１及びｆ２を切り換えて４８８nmＧＦＰ観察及び４８８nmＹＦＰ観察を実行し、Ｆ２が選択されている時刻ｔ３からｔ４の期間に、フィルタをｆ４に切り換えて５６８nmｍＲＦＰ観察を実行する。

図５（Ｆ）は、（Ｈ）に示すカメラ露光の終了タイミングでトリガされる観察側フィルタホイールの操作トリガ信号であり、フィルタが回転移動している期間中は（Ｇ）に示すＢＵＳＹ信号が出力される。（Ｉ）は画像転送トリガ信号であり、（Ｈ）の露光時間中に発生する。（Ｊ）は、（Ｈ）の露光時間終了のタイミングで発生する画像転送信号である。

特開平５−６０９８０号公報

ＡｒＫｒガスレーザ１ａの４８８nmの励起光にはサイドバンドがあるため、ノッチ型のマルチバンドフィルタではブロックしきれず、若干の漏れ光がある。蛍光観察側フィルタホイール６に搭載されたフィルタの並びは、ｆ１からｆ６の順で、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ｍＲＦＰ、ＤＡＰＩ、ＣＦＰと並んでいる。

図６は、観察する蛍光タンパクに応じて蛍光観察側フィルタホイール６で切り替えられるフィルタの移動経路を示すイメージ図である。観察する蛍光タンパクを、ＹＦＰ（フィルタｆ２）とｍＲＦＰ（フィルタｆ４）とした場合、図６（Ａ）に示すように、蛍光観察側フィルタホイール６がＹＦＰ→ＤｓＲｅｄ→ｍＦＲＰと順方向へ回転する。ＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ｍＦＲＰのいずれのフィルタも４８８nm付近の励起光を透過しないため問題は発生しない。

一方、観察する蛍光タンパクを、ＧＦＰ（フィルタｆ１）とｍＲＦＰ（フィルタｆ４）とした場合では、蛍光観察側フィルタホイール６がＧＦＰ→ＤＡＰＩ→ＣＦＰ→ｍＲＦＰと逆方向へ回転する。ＤＡＰＩ、ＣＦＰのフィルタは特性上４８８nm付近の光を透過するため、イメージインテンシファイア８に励起光の漏れが短時間であるが照射され、画像が飽和する。このように、蛍光観察側フィルタホイール６の回転方向によっては、問題が発生する。

このような問題が発生する要因は、図５で説明したように、蛍光観察側フィルタホイール６によるフィルタの回転移動中に、励起側のシャッター手段１５が開いたままになっている状態ができてしまい、励起光が試料に無用に照射されるためである。

このような状態が発生すると、次のような不都合が発生する。
（１）無駄な励起光が試料に当たり、標識した蛍光物質が褪色する。
（２）蛍光フィルタによって励起光が十分にブロックされないため、イメージインテンシファイアの光電面に強い光が入り、イメージインテンシファイアを劣化させる。

本発明は上述した問題点を解決するためになされたものであり、蛍光観察側のフィルタホイールが回転移動している期間中は、励起光の光路への導入を確実に遮蔽する機能を備えた共焦点顕微鏡を実現することを目的としている。

このような課題を達成するために、本発明の構成は次の通りである。
（１）顕微鏡ユニットと共焦点スキャナユニットから構成され、複数波長の励起用レーザ光を各波長に対応した励起側フィルタ手段で切り換えて試料に照射し、試料からの戻り蛍光を、前記励起用レーザの各波長に対応して切り換えられる蛍光観察側フィルタ手段を介して撮像手段に結像させる共焦点顕微鏡において、
シーケンス処理手段と、
前記シーケンス処理手段により制御される、前記励起用レーザ光の途中に設けられたシャッター手段と、
前記シーケンス処理手段により制御される、前記励起側フィルタ手段及び蛍光観察側フィルタ手段を操作する励起側フィルタ駆動手段及び蛍光観察側フィルタ駆動手段と、
前記シーケンス処理手段により制御される、前記蛍光観察側フィルタ手段が切り換えられる移動期間中に、前記シャッター手段を操作し、前記励起用レーザ光の共焦点スキャナユニットへの入射を遮断するシャッター駆動手段と、
を備え、
前記シャッター駆動手段は、前記シーケンス処理手段からの指令および前記蛍光観察側フィルタ駆動手段からの移動情報を入力し、この移動情報が継続中は前記シャッターを閉に操作することを特徴とする共焦点顕微鏡。

（２）前記前記励起側フィルタ手段及び蛍光観察側フィルタ手段の移動方向は、前記励起側フィルタ駆動手段及び蛍光観察側フィルタ駆動手段自身が供えるアルゴリズムに従って制御されることを特徴とする（１）に記載の共焦点顕微鏡。

以上説明したことから明らかなように、本発明によれば次のような効果がある。
（１）無駄な励起光が試料に照射されなくなるため、より長い時間の観察が可能になる
（２）励起光がシャッター手段によって完全に遮蔽されるので、イメージインテンシファイアの光電面に漏れ光が入らないため、イメージインテンシファイアが劣化したり、画像が飽和することがない。

以下、本発明を図面により詳細に説明する。図１は、本発明を適用した共焦点顕微鏡の励起側及び蛍光観察側フィルタホイールに搭載されたフィルタ構成とその制御系を示す機能ブロック図である。図３及び図４で説明した従来の共焦点顕微鏡と同一要素には同一符号を付して説明を省略する。以下、本発明の特徴部につき説明する。

図１において、１００は、本発明が適用されたシーケンス処理手段である。基本機能は図５で説明したシーケンス処理手段１２と同一であるが、励起光の途中に設けられたシャッター手段１５のシーケンス制御の形態に特徴がある。

２００は、本発明が適用されたシャッター駆動手段であり、シーケンス処理手段１００からの指令及び蛍光観察側フィルタホイール１３から回転移動中信号Ｍを取得し、蛍光観察側フィルタホイール６が回転移動中にはシャッター手段１５を閉に操作する。

図２は、をシーケンス処理手段１００の処理手順説明するタイムチャートである。図５で説明した従来のシーケンス処理手段１２の処理手順を示すタイムチャートとの相違点は、（Ｃ）のシャッター駆動信号によるシーケンス処理である。

従来のシャッター駆動信号のシーケンス処理では、励起側フィルタホイールの回転操作で４８８nmと５６８nmの励起光を利用している期間、即ち時刻ｔ１からｔ６までの期間（図５では、ｔ１からｔ４までの期間）、シャッター手段１５が開に操作されている。

本発明によるシーケンス処理では、時刻ｔ１からｔ６までの期間中において、（Ｅ）に示す蛍光観察側フィルタホイールがフィルタｆ１からフィルタｆ２に回転移動操作している期間、即ち時刻ｔ２からｔ３までの期間中は、（Ｃ）に示すようにシャッター手段１５を閉に操作する。

時刻ｔ２のタイミングは、（Ｆ）に示す蛍光観察側フィルタホイールの駆動トリガ信号であり、時刻ｔ３のタイミングは、（Ｇ）に示す蛍光観察側フィルタホイールのＢＵＳＹ信号の終了時刻である。

同様に、蛍光観察側フィルタホイールがフィルタｆ２からフィルタｆ４に回転移動操作している期間、即ちｔ４からｔ５までの期間中は、（Ｃ）に示すようにシャッター手段１５を閉に操作する。

同様に、時刻ｔ４のタイミングは、（Ｆ）に示す蛍光観察側フィルタホイールの駆動トリガ信号であり、時刻ｔ５のタイミングは、（Ｇ）に示す蛍光観察側フィルタホイールのＢＵＳＹ信号の終了時刻である。

以上説明した実施形態では、高速処理を実行するシーケンス処理手段１００としては、バイポーラトランジスタによるＴＴＬを例示したが、これに限定されるものではなく、ＣＭＯＳトランジスタによるロジック回路等を採用することが可能である。

本発明を適用した共焦点顕微鏡の励起側及び蛍光観察側フィルタホイールに搭載されたフィルタ構成とその制御系を示す機能ブロック図である。図１のシーケンス処理手段の処理手順を説明するタイムチャートである。共焦点顕微鏡の一般的なシステム構成の一例を示す機能ブロック図である。励起側及び蛍光観察側フィルタホイールに搭載されたフィルタ構成とその制御系を示す機能ブロック図である。図４のシーケンス処理手段の処理手順を説明するタイムチャートである。観察する蛍光タンパクに応じて蛍光観察側フィルタホイールで切り替えられるフィルタの移動経路を示すイメージ図である。

符号の説明

１ｃ励起側フィルタホイール
６蛍光観察側フィルタホイール
１１制御装置
１３蛍光観察側フィルタ駆動手段
１４励起側フィルタ駆動手段
１５シャッター手段
１００シーケンス処理手段
２００シャッター駆動手段

Claims

顕微鏡ユニットと共焦点スキャナユニットから構成され、複数波長の励起用レーザ光を各波長に対応した励起側フィルタ手段で切り換えて試料に照射し、試料からの戻り蛍光を、前記励起用レーザの各波長に対応して切り換えられる蛍光観察側フィルタ手段を介して撮像手段に結像させる共焦点顕微鏡において、
シーケンス処理手段と、
前記シーケンス処理手段により制御される、前記励起用レーザ光の途中に設けられたシャッター手段と、
前記シーケンス処理手段により制御される、前記励起側フィルタ手段及び蛍光観察側フィルタ手段を操作する励起側フィルタ駆動手段及び蛍光観察側フィルタ駆動手段と、
前記シーケンス処理手段により制御される、前記蛍光観察側フィルタ手段が切り換えられる移動期間中に、前記シャッター手段を操作し、前記励起用レーザ光の共焦点スキャナユニットへの入射を遮断するシャッター駆動手段と、
を備え、
前記シャッター駆動手段は、前記シーケンス処理手段からの指令および前記蛍光観察側フィルタ駆動手段からの移動情報を入力し、この移動情報が継続中は前記シャッターを閉に操作することを特徴とする共焦点顕微鏡。
前記前記励起側フィルタ手段及び蛍光観察側フィルタ手段の移動方向は、前記励起側フィルタ駆動手段及び蛍光観察側フィルタ駆動手段自身が供えるアルゴリズムに従って制御されることを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。