JP2005234030A

JP2005234030A - 共焦点顕微鏡

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Publication number: JP2005234030A
Application number: JP2004040008A
Authority: JP
Inventors: Koshi Kei; 虹之景; Kenta Mikuriya; 健太御厨; Hideo Hirukawa; 英男蛭川
Original assignee: Yokogawa Electric Corp
Current assignee: Yokogawa Electric Corp
Priority date: 2004-02-17
Filing date: 2004-02-17
Publication date: 2005-09-02

Abstract

【課題】ニポウディスク式共焦点スキャナと分光光学ユニットを用いて試料を多色で観察することができると共に、分光光学ユニット内でダイクロイックミラーの透過像と反射像を同じ向きに補正することにより、反転像に対する画像処理を必要としない共焦点顕微鏡を実現すること目的とする。
【解決手段】ニポウディスク方式共焦点スキャナから出力される光学像を分光する分光光学ユニットを有し、試料の多色観察を行う共焦点顕微鏡において、
前記分光光学ユニットは、
前記光学像を分光する反射透過特性の異なる複数の分光手段と、
これら分光手段で反射された光学像を反転させる反転手段と、
を備えた構成とする。

【選択図】図１

Description

本発明は、共焦点顕微鏡に関し、詳しくは、試料の蛍光信号を分光することにより試料を多色で観察するための改良に関するものである。

共焦点顕微鏡は、試料を薄切片にすることなくスライス画像が得られ、そのスライス画像から試料の正確な３次元立体像を構築できるので、生物やバイオテクノロジーなどの分野における生きた細胞の生理反応観察や形態観察あるいは半導体市場におけるＬＳＩの表面観察などに使用されている。

このような試料の観察において、同一面内にある複数個の試料を同時に観察する場合、各試料に蛍光波長の異なる別々の蛍光試薬を付加することにより、試料の反応によって試料からの戻り光を複数の異なる波長領域ごとに分離して検出し、試料の多波長（多色）観察を行うものがある（例えば、特許文献１参照）。

また、多波長観察は、試料のカラー画像を取得する場合にも用いられ、例えば、試料が発した蛍光をＲ（赤）Ｇ（緑）Ｂ（青）３波長の像に分解し、それぞれの波長の光を３枚の撮像素子で受光し、これら３枚の撮像素子で受けた像を合成して試料のカラー画像を生成する。

特開２００２−６２４８０号公報

図３は従来の共焦点顕微鏡の一例を示す構成図である。
図３において、共焦点スキャナ１１０は、顕微鏡１２０に接続してあり、レーザ光である照明用平行励起光束１１１は、マイクロレンズアレイディスク（以下、ＭＬディスクと呼ぶ。）１１２により個別の光束に集光され、ダイクロイックミラー（以下、ＤＭと呼ぶ。）１１３を透過後、ピンホールアレイディスク（以下、ニポウディスクと呼ぶ。）１１４の個々のピンホールを通過し、顕微鏡１２０の対物レンズ１２１により、試料１４０に集光される。

試料１４０から出た蛍光信号１２２は、再び対物レンズ１２１を通り、ニポウディスク１１４の個々のピンホール上に集光される。個々のピンホールを通過した蛍光信号１２２は、ＤＭ１１３で反射され、リレーレンズ１１５を介して２次元センサ１３１ａおよび１３１ｂに結像されるように共焦点スキャナ１１０より出射される。

共焦点スキャナ１１０に取り付けられた分光光学ユニット１３０では、ＤＭ１１３で反射された蛍光信号１２２は、分光光学ユニット１３０内のＤＭ１３２に到達する。
ＤＭ１３２の有する分光特性とバリアフィルタ（以下ＢＦと呼ぶ。）１３３ａ，１３３ｂの分光特性により異なる波長範囲の蛍光信号を透過、反射して、２次元センサ１３１ａ，１３１ｂに結像させる。

ニポウディスク１１４のピンポールが並んでいる平面と、試料１４０の被観察平面と、２次元センサ１３１ａ，１３１ｂの受光面とは互いに光学的に共役関係に配置してあるので、２次元センサ１３１ａ，１３１ｂ上には試料１４０の光学的断面像、即ち共焦点画像が結像される。

試料のカラー画像を取得する場合は、上述の分光光学ユニット内のＤＭおよびＢＦと２次元センサとの組み合わせを３セット用意し、共焦点画像をＲ（赤）Ｇ（緑）Ｂ（青）の３つの波長で分離した後、３つの画像を画像処理により合成してカラー画像を生成する。

しかしながら、従来の共焦点顕微鏡において多波長観察を行う場合、共焦点スキャナで得た像を分光光学ユニット内で１枚のＤＭで透過像と反射像に分けるため、この２つの像は互いに左右もしくは上下が反転した像となってしまう。このため、多波長観察では像の向きが異なり、そのままでは合成できず合成像を得るには左右もしくは上下反転の画像処理が必要となるという問題があった。

本発明は、このような問題を解決しようとするものであり、ニポウディスク式共焦点スキャナと分光光学ユニットを用いて試料を多色で観察することができると共に、分光光学ユニット内でＤＭの透過像と反射像を同じ向きに補正することにより、反転像に対する画像処理を必要としない共焦点顕微鏡を実現すること目的とする。

本発明は次の通りの構成になった共焦点顕微鏡である。

（１）ニポウディスク方式共焦点スキャナから出力される光学像を分光する分光光学ユニットを有し、試料の多色観察を行う共焦点顕微鏡において、
前記分光光学ユニットは、
前記光学像を分光する反射透過特性の異なる複数の分光手段と、
これら分光手段で反射された光学像を反転させる反転手段と、
を備えたことを特徴とする共焦点顕微鏡。

（２）前記分光光学ユニットは、前記分光手段および前記反転手段を介した光学像から蛍光信号以外の光を取り除く迷光除去手段を有することを特徴とする（１）に記載の共焦点顕微鏡。

（３）前記分光手段および前記迷光除去手段は、観察する光学像の波長に基づいて取り替えられることを特徴とする（２）に記載の共焦点顕微鏡。

（４）前記光学ユニットから出力される分光光学像を撮像する撮像手段と、
この撮像手段の撮像信号に基づき画像処理を行う画像処理手段と、
を有することを特徴とする（１）乃至（３）のいずれかに記載の共焦点顕微鏡。

（５）前記撮像手段は、微弱光を増幅する光増幅手段を有することを特徴とする（４）に記載の共焦点顕微鏡。

本発明によれば、以下のような効果がある。

請求項１に記載の発明によれば、ポウディスク式共焦点スキャナと分光光学ユニットを用いて、試料を多色で観察することができると共に、分光手段と反転手段の組合せを利用して、左右もしくは上下反転のない画像を得ることができる。

請求項２記載の発明によれば、分光手段、迷光除去手段を利用して、試料の蛍光すなわち信号光以外の光をカットし、ＳＮ比の高い画像が得られる。

請求項３に記載の発明によれば、分光手段、迷光除去手段は観察波長によって自由に取り替えられるので、試料からの蛍光を効率よく観察することができ、多種多様な試料に対応できる。

請求項４に記載の発明によれば、撮像手段に結像される像の向きは全て同一方向となり、画像処理装置により像の反転処理を行い整合とる必要が無くなり、画像処理に費やす時間を短縮することができる。

請求項５に記載の発明によれば、撮像手段に光増幅手段を付加したことにより、微弱な蛍光しか出さない試料の観察を超高感度で行うことができる。

以下図面を用いて本発明を詳細に説明する。図１は本発明に係る共焦点顕微鏡の一実施例を示す構成図である。

図１において、共焦点スキャナ２０は、前出のニポウディスク式共焦点スキャナと同一の構成であるため、構成および動作の説明は省略する。この共焦点スキャナ２０は、顕微鏡１０に接続してあり、レーザ光である照明用平行励起光束は顕微鏡１２０内の全反射ミラー１２を介して対物レンズ１１により試料６０に集光される。試料６０から出た蛍光信号は、再び対物レンズ１１を通り、全反射ミラー１２を介して共焦点スキャナ２０に戻り、ニポウディスクの個々のピンホールを通過した蛍光信号は、ＤＭで反射されリレーレンズ２１を介して共焦点像２２を結像する（ニポウディスク，ＤＭは図示せず）。

共焦点スキャナ２０に取り付けられた分光光学ユニット３０では、レンズ３１により共焦点像２２の蛍光信号を平行光にする。ＤＭ３３ａは、レンズ３１を通過した蛍光信号を、その分光特性により蛍光信号を透過する波長域と反射する波長域に分離する。

全反射ミラー３２ａは、ＤＭ３３ａで反射された波長域の蛍光信号をさらに反射する。反射した蛍光信号は、ＢＦ３４ｃを透過し、ＢＦ３４ｃにより蛍光信号以外の光を取り除かれ、レンズ３５ｃによりカメラ４０ｃの撮像面に結像する。

ＤＭ３３ｂは、ＤＭ３３ａを透過した波長域の蛍光信号を、その分光特性により透過する波長域と反射する波長域とに分離する。ＤＭ３３ｂを透過した波長域の蛍光信号は、ＢＦ３４ｂを透過することで蛍光信号以外の光が取り除かれ、レンズ３５ｂによりカメラ４０ｂの撮像面に結像する。

全反射ミラー３２ｂは、ＤＭ３３ｂで反射された波長域の蛍光信号をさらに反射する。反射した蛍光信号は、ＦＢ３４ａを透過し、ＢＦ３４ａにより蛍光信号以外の光を取り除かれ、レンズ３５ａによりカメラ４０ａの撮像面に結像する。

例えば、分光ユニット３０への入射光の波長成分が（Ｒ＋Ｇ＋Ｂ）であるとすると、ＤＭ３３ａでＢ成分のみが反射され（Ｒ＋Ｇ）の成分が透過する。Ｂ成分の像は全反射ミラー３２ａ，ＢＦ３４ｃ，レンズ３５ｃを介してカメラ４０ｃに撮像される。
ＤＭ３３ａを透過した（Ｒ＋Ｇ）のＲ成分は、ＤＭ３３ｂで反射され、Ｇ成分のみがＤＭ３３ｂを透過し、ＢＦ３４ｂ，レンズ３４ｂを介してカメラ４０ｂに撮像される。ＤＭ３３ｂを反射したＲ成分は、全反射ミラー３２ｂ，ＢＦ３４ａ，レンズ３５ａを介してカメラ４０ａで撮像される。

画像処理装置５０は、カメラ４０ａ，４０ｂ，４０ｃからの撮像信号を画像として表示するものであり、例えばカメラ４０ａ，４０ｂ，４０ｃの画像がＲ，Ｇ，Ｂの波長域に分離された画像であればこれらを合成してカラー画像を生成する。

ここで、ダイクロイックミラーＤＭ３３ａ，３３ｂが分光手段、全反射ミラー３２ａ，３２ｂが反転手段、バリアフィルタＢＦ３４ａ，３４ｂ，３４ｃが迷光除去手段、カメラ４０ａ，４０ｂ，４０ｃが撮像手段、画像処理装置５０が画像処理手段に相当する。
また、カメラには、例えばＣＣＤ（charge-coupled device）やＣＭＯＳ（complementary MOS）などの撮像素子が用いられ、画像処理装置は、例えばパーソナルコンピュータが用いられる。

このように、カメラ４０ｂに結像する像はＤＭ３３ａおよびＤＭ３３ｂを透過した像であるため反転が起こらない。また、カメラ４０ａに結像する像は、ＤＭ３３ｂで反射され反転し再び全反射ミラー３２ｂの反射により反転する。さらに、カメラ４０ｃに結像する像は、ＤＭ３３ａで反射され反転し再び全反射ミラー３２ａの反射により反転する。

従って、カメラ４０ａ，４０ｂ，４０ｃに結像される像の向きは全て同一方向となり、画像処理装置５０により、像の反転処理を行い整合とる必要が無くなり、画像処理に費やす時間を短縮することができる。

なお、本発明はカラー画像の生成に用いるだけでなく、従来例で示したように試料の観察において、同一面内にある複数個の試料を同時に観察する場合、各試料に蛍光波長の異なる別々の蛍光試薬を付加することにより、試料の反応によって試料からの戻り光を複数の異なる波長領域ごとに分離して検出し、試料の多波長観察を行うことができる。
また、蛍光信号の分光は３波長域に限るものではなく、ＤＭの反射透過特性の組み合わせを選択することにより、分光する波長域の数を増減してもよい。

さらに、ＤＭやＢＦをそれらが着脱自在となったホルダーのような保持手段により分光光学ユニット内に固定するようにして、各ＤＭ，各ＢＦは観察波長によって自由に取り替えるようにする。これにより、試料からの蛍光を効率よく観察することができ、多種多様な試料に対応できる。

図２は、本発明の他の実施例を示した構成図である。図２で前出の図１と同一のものには同一の符号を付けてその部分の説明は省略する。

図２において、図１と異なる部分は、カメラ４０ａ，４０ｂ，４０ｃの前にイメージインテンシファイア（ＩＩ）７０ａ，７０ｂ，７０ｃを付加した部分である。イメージインテンシファイアは、微弱光の像の強度を増幅するものであり、増幅された像をカメラで撮像するため微弱な蛍光しか出さない試料の観察を超高感度で行うことができる。ここで、イメージインテンシファイアが、光増幅手段に相当する。

以上により、ニポウディスク式共焦点スキャナと分光光学ユニットを用いて、試料を多色で観察することができると共に、ＤＭと全反射ミラーの組合せを利用して、左右もしくは上下反転のない画像を得ることができる。

また、各ＤＭ、各ＢＦを利用して、試料の蛍光すなわち信号光以外の光をカットし、ＳＮ比の高い画像が得られる。さらに、各ＤＭ、各ＢＦの組合せを任意に設計して、あらゆる波長の観察が自由にできる。加えて、分離した各波長域の撮像ごとに１台ずつカメラを使用することによって、高い空間解像度が得られる。

なお、本発明は、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形をも含むものである。

本発明に係る共焦点顕微鏡一実施例を示す構成図である。本発明に係る共焦点顕微鏡の他の実施例を示す構成図である。従来の共焦点顕微鏡の一例を示す構成図である。

符号の説明

１０顕微鏡
１１対物レンズ
１２全反射ミラー
２０共焦点スキャナ
２１リレーレンズ
２２共焦点像
３０分光光学ユニット
３１、３５ａ、３５ｂ、３５ｃレンズ
３２ａ、３２ｂ全反射ミラー
３３ａ、３３ｂＤＭ
３４ａ、３４ｂ、３４ｃＢＦ
４０ａ、４０ｂ、４０ｃカメラ
５０画像処理装置
６０試料
７０ａ、７０ｂ、７０ｃイメージインテンシファイア（ＩＩ）
２０試料

Claims

ニポウディスク方式共焦点スキャナから出力される光学像を分光する分光光学ユニットを有し、試料の多色観察を行う共焦点顕微鏡において、
前記分光光学ユニットは、
前記光学像を分光する反射透過特性の異なる複数の分光手段と、
これら分光手段で反射された光学像を反転させる反転手段と、
を備えたことを特徴とする共焦点顕微鏡。
前記分光光学ユニットは、前記分光手段および前記反転手段を介した光学像から蛍光信号以外の光を取り除く迷光除去手段を有することを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
前記分光手段および前記迷光除去手段は、観察する光学像の波長に基づいて取り替えられることを特徴とする請求項２に記載の共焦点顕微鏡。
前記光学ユニットから出力される分光光学像を撮像する撮像手段と、
この撮像手段の撮像信号に基づき画像処理を行う画像処理手段と、
を有することを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれかに記載の共焦点顕微鏡。
前記撮像手段は、微弱光を増幅する光増幅手段を有することを特徴とする請求項４に記載の共焦点顕微鏡。