JP4793626B2 - 共焦点顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、共焦点顕微鏡に関し、詳しくは、観察試料に対して光刺激を行なう機能を備えた共焦点顕微鏡に関するものである。

共焦点顕微鏡は、試料の収束光点を走査し、試料からの戻り蛍光を結像させて画像を得ることにより試料を観察するもので、生物やバイオテクノロジーなどの分野おける生きた細胞の生理反応観察や形態観察、あるいは半導体市場におけるＬＳＩに表面観察などに使用されている。

図３は、従来の共焦点顕微鏡の一例を示した構成図である。図３において、共焦点スキャナユニット１１０は、顕微鏡ユニット１２０のポート１２２に接続されており、レーザ光１１１は、マイクロレンズディスク１１２のマイクロレンズ１１７により個別の光束に集光され、ダイクロイックミラー１１３を透過後、ピンホールディスク（以下、ニポウディスク）１１４の個々のピンホール１１６を通過し、顕微鏡ユニット１２０の対物レンズ１２１により、ステージ１２３上の試料１４０に集光される。

このレーザ光１１１の照射により試料１４０が蛍光する。試料１４０から出た戻り蛍光は、再び対物レンズ１２１を通り、ニポウディスク１１４の個々のピンホール上に集光される。個々のピンホールを通過した戻り蛍光は、ダイクロイックミラー１１３で反射され、リレーレンズ１１５を介してイメージセンサ１３１に結像される。

このような装置では、図示しないモータでマイクロレンズディスク１１２及びニポウディスク１１４を同軸で一定速度回転させており、この回転によるピンホール１１６の移動により試料１４０への集光点を走査している。

ニポウディスク１１４のピンホールが並んでいる表面と、試料１４０の被観察面と、イメージセンサ１３１の受光面とは互いに光学的に共役関係に配置されているので、イメージセンサ１３１には、試料１４０の光学的断面像、即ち共焦点画像が結像される。ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡の詳細に関しては、特許文献１に開示されている。

このような共焦点顕微鏡を用いた画像計測では、細胞等の試料など対して光刺激を行ない、時間経過に対する状態変化（フォトアクチベーションやＦＲＡＰ（fluorescence recovery after photobleaching）など）を観察したい要求がある。

フォトアクチベーションとは、例えば細胞の所定の部分に画像計測用レーザ光（画像計測用光ビーム）以外の刺激用光ビームのスポット光を照射し、その部分の蛍光色を変化させてマーキングする。このマーキングが時間経過により、細胞に広がっていく様子を観察するものである。

ＦＲＡＰ（蛍光褪色法）とは、蛍光タンパクを発現した細胞の蛍光を、刺激用光ビームの照射により部分的に褪色させ、細胞における蛍光褪色後のタンパク質の局在変化を観察するものである。

本発明が対象とするニポウディスク方式の共焦点顕微鏡に関連する先行技術文献としては特許文献１に記載されたものがある。

特開平５−６０９８０号公報

しかしながら、上述の従来のニポウディスク方式の共焦点顕微鏡には、試料に光刺激を与えてその変化を観察する機能を備えたものがない。

本発明は、このような従来の共焦点顕微鏡が有していた問題を解決しようとするものであり、ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡に光刺激を行なう機能を付加し、ニポウディスク方式特有の高速な画像処理により、光刺激や蛍光褪色の反応をリアルタイムで観察できる共焦点顕微鏡を実現することを目的とするものである。

このような課題を達成するために、本発明の構成は次の通りである。
（１）顕微鏡ユニットとニポウディスク方式の共焦点スキャナユニットから構成され、試料に照射される画像計測用光ビームの戻り蛍光を結像させた共焦点画像により前記試料の観察を行う共焦点顕微鏡において、
前記試料に刺激を与える刺激用光ビームのスポットを前記試料上に結像させる刺激用光ビーム出力手段を具備し、
該刺激用光ビーム出力手段は、
前記スポットを前記試料上で走査して任意の形状で刺激を与える、ガルバノミラースキャン機構で構成された走査手段と、
前記画像計測用光ビームの途中に設けられていて、この画像計測用光ビームを透過させると共に前記刺激用光ビームを反射させるダイクロイックミラーと、
を備えると共に、前記共焦点スキャナユニットと一体に形成されていることを特徴とする共焦点顕微鏡。

（２）前記刺激用光ビーム出力手段の光源は、発光ダイオードまたはレーザ光源であることを特徴とする（１）に記載の共焦点顕微鏡。

（３）前記刺激用光ビーム出力手段は、その光源を前記共焦点スキャナユニット内に備えることを特徴とする（１）または（２）に記載の共焦点顕微鏡。

（４）前記画像計測用光ビームの波長をλ１、前記刺激用光ビームの波長をλ２とするとき、λ１＞λ２の関係を有することを特徴とする（１）乃至（３）のいずれかに記載の共焦点顕微鏡。

（５）前記刺激用光ビームは、前記試料に対するフォトアクチベーションまたは蛍光褪色観察に用いられることを特徴とする（１）乃至４のいずれかに記載の共焦点顕微鏡。

以上説明したことから明らかなように、本発明によれば次のような効果がある。

（１）本発明によれば、ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡に光刺激用の刺激用光ビームを照射する機能を備えることによって、フォトアクチベーションやＦＲＡＰが可能となる。また、蛍光観察、即ち画像計測は、ニポウディスク式焦点スキャナで行なうことで高速性（例えば１０００フレーム／秒のスキャンスピード）が実現できるため、光刺激や蛍光褪色に係わる高速反応をリアルタイムで観察することができる。

更に、試料に刺激を与える刺激用光ビームのスポットを試料上に結像させるための刺激用光ビーム出力手段を、共焦点スキャナユニットと一体に形成することによって、蛍光共焦点イメージング用の画像計測用光ビームと、刺激用光ビームの２つのスキャン機構を一体化でき、一体化のため、２つのビームの焦点合わせを簡単にできる。

一体化の結果、顕微鏡ユニットとの接続ポートを１つにでき、顕微鏡ユニットに簡単にアドオンできる。顕微鏡ユニット側の第２ポートに刺激用光ビーム出力手段を接続する分離構造比較して小型・省スペースであり、顕微鏡の存在性をなくすことができる。

（２）本発明によれば、光刺激用の刺激用光ビームの２次元走査により、試料の形状に合わせた光刺激を可能とし、走査手段としてガルバノミラースキャン機構を用いることで、刺激用光ビームのスポットを高精度で位置決め制御することができる。

（３）本発明によれば、画像計測用光ビームの途中に画像計測用光ビームを透過させるダイクロイックミラーを備え、このダイクロイックミラーで刺激用光ビームを反射させることにより、共焦点スキャナユニット内でシンプルな光学系により画像計測用光ビームと刺激用光ビームを合成することができる。

（４）本発明によれば、刺激用光ビームの光源として発光ダイオードを用いることで、光源を共焦点スキャナユニットの筐体に内蔵することが可能となり、共焦点顕微鏡の小型・省スペース・コストダウンに貢献することができる。

以下、本発明を図面により詳細に説明する。図１は本発明を適用した共焦点顕微鏡の一実施形態を示す構成図である。図３で説明した従来の共焦点顕微鏡と同一要素には同一符号を付して説明を省略する。以下、本発明の特徴部につき説明する。

図１において、共焦点スキャナユニット１１０は、顕微鏡ユニット１２０のポート１２２に接続されており、レーザ光１１１を試料１４０に照射する共焦点顕微鏡の構成は、従来の共焦点顕微鏡と同一である。画像計測するために試料１４０に照射する光を画像計測用光ビームとする。

共焦点スキャナユニット１１０に入射した波長λ１の画像計測用光ビーム１１１は、マイクロレンズディスク１１２のマイクロレンズ１１７により個別の光束に集光され、ダイクロイックミラー１１３を透過後、ニポウディスク１１４の個々のピンホール１１６を通過し、ポート１２２を通過して顕微鏡ユニット１２０に入り、対物レンズ１２１により、ステージ１２３上の試料１４０に集光される。

この第１の画像計測用光ビームの照射により試料１４０が蛍光する。試料１４０からの戻り蛍光は、再び対物レンズ１２１を通り、ニポウディスク１１４の個々のピンホール上に集光される。個々のピンホールを通過した戻り蛍光は、ダイクロイックミラー１１３で反射され、リレーレンズ１１５を介してイメージセンサ１３１に結像される。

共焦点スキャナユニット１１０において、鎖線で示すブロック２００は刺激用光ビーム出力手段であり、試料に刺激を与える刺激用光ビームのスポットを前記試料上に結像させるために、波長λ２の刺激用光ビームを出力する。この刺激用光ビーム出力手段２００は、共焦点スキャナユニット１１０と一体に形成されている。画像計測用光ビームの波長λ１と刺激用光ビームの波長λ２との関係は、λ１＞λ２に選定されている。

２０１は、波長λ２の刺激用光ビームを発生する光源である。この光源２０１としては、一般的には外部のレーザ光源より共焦点スキャナユニット１１０に導く構成をとるが、試料に刺激を与える刺激用光ビームは蛍光発生を目的とする画像計測用光ビームのような電力を必要とないので、波長の条件（λ１＞λ２）を満足すれば発光ダイオード（青色発光ダイオード）のビームを利用することが可能である。

光源２０１からの刺激用光ビーム２０２は、レンズ系（コリメータレンズ）２０３を介して走査手段を形成するガルバノミラースキャン機構２０４に導かれる。２０５はダイクロイックミラーであり、画像計測用光ビームの途中に設けられてこの画像計測用光ビームを透過させると共にガルバノミラースキャン機構２０４からの刺激用光ビームを反射させ、２つのビームを合成して試料１４０に照射する。試料１４０において、ＳＰは刺激用光ビームによるスポット結像である。

試料１４０上において、ＳＰは刺激用光ビームによるスポット結像を示す。ガルバノミラースキャン機構２０４は、ＤＣモータにより縦・横方向に回転できる機構になっていて、制御ユニット（図示せず）からの信号によりＤＣモータを制御してガルバノミラーを回転させて試料１４０上のスポットＳＰを任意の位置に位置決め制御できる。このスポットの複数プロットにより、任意形状の刺激範囲を設定することが可能である。

本発明は、試料に刺激を与える刺激用光ビームのスポットを試料上に結像させるための刺激用光ビーム出力手段２００を、共焦点スキャナユニット１１０と一体に形成することによって、蛍光共焦点イメージング用の画像計測用光ビームと、刺激用光ビームの２つのスキャン機構を一体化でき、２つのビームの焦点合わせが容易にできる。

一体化構造のため、画像計測用光ビームの途中に画像計測用光ビームを透過させるダイクロイックミラー２０５を設けることができ、このダイクロイックミラーで刺激用光ビームを反射させることにより、共焦点スキャナユニット内でシンプルな光学系により画像計測用光ビームと刺激用光ビームを合成することができる。

更に、一体化構造をとることにより、顕微鏡ユニット１１０との接続を、ポート１２２の１つとすることができ、共焦点スキャナユニット１１０を顕微鏡ユニット１２０に簡単にアドオンできる。顕微鏡ユニット側の第２ポートに刺激用光ビーム出力手段を接続する分離構造に比較して小型・省スペースであり、顕微鏡の存在性をなくすことができる。

図２は、本発明を適用した共焦点顕微鏡の他の実施形態を示す構成図である。図１の構成との相違点は、刺激用光ビームの光源２０１として発光ダイオードを用い、この光源を共焦点スキャナユニット１１０の筐体に内臓した点にある。このような光源内蔵構造をとることにより、刺激用光ビーム出力手段２００全体を共焦点スキャナユニット１１０の筐体に収容することが可能となり、共焦点顕微鏡の小型・省スペース・コストダウンに貢献することができる。

なお、本発明は、上記実施形態に制限されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形を含むものである。

発明を適用した共焦点顕微鏡の一実施形態を示す構成図である。 本発明を適用した共焦点顕微鏡の他の実施形態を示す構成図である。 従来の共焦点顕微鏡の一例を示した構成図である。

符号の説明

１１０ 共焦点スキャナユニット
１１１ レーザ光（画像計測用光ビーム）
１１２ ダイクロイックミラーマイクロレンズディスク
１１３ ダイクロイックミラー
１１４ ニポウディスク
１１５ リレーレンズ
１１６ ピンホール
１１７ マイクロレンズ
１２０ 顕微鏡ユニット
１２１ 対物レンズ
１２２ ポート
１２３ ステージ
１３１ イメージセンサ
１４０ 試料
２００ 刺激用光ビーム出力手段
２０１ 光源
２０２ 刺激用光ビーム
２０３ レンズ系
２０４ ガルバノミラースキャン機構
２０５ ダイクロイックミラー

Claims (5)

1. 顕微鏡ユニットとニポウディスク方式の共焦点スキャナユニットから構成され、試料に照射される画像計測用光ビームの戻り蛍光を結像させた共焦点画像により前記試料の観察を行う共焦点顕微鏡において、
   前記試料に刺激を与える刺激用光ビームのスポットを前記試料上に結像させる刺激用光ビーム出力手段を具備し、
   該刺激用光ビーム出力手段は、
   前記スポットを前記試料上で走査して任意の形状で刺激を与える、ガルバノミラースキャン機構で構成された走査手段と、
   前記画像計測用光ビームの途中に設けられていて、この画像計測用光ビームを透過させると共に前記刺激用光ビームを反射させるダイクロイックミラーと、
   を備えると共に、前記共焦点スキャナユニットと一体に形成されていることを特徴とする共焦点顕微鏡。
2. 前記刺激用光ビーム出力手段の光源は、発光ダイオードまたはレーザ光源であることを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
3. 前記刺激用光ビーム出力手段は、その光源を前記共焦点スキャナユニット内に備えることを特徴とする請求項１または２に記載の共焦点顕微鏡。
4. 前記画像計測用光ビームの波長をλ１、前記刺激用光ビームの波長をλ２とするとき、λ１＞λ２の関係を有することを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の共焦点顕微鏡。
5. 前記刺激用光ビームは、前記試料に対するフォトアクチベーションまたは蛍光褪色観察に用いられることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の共焦点顕微鏡。

Images